CN104263842A - 一种鱼源无乳链球菌的荧光定量pcr检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种鱼源无乳链球菌的荧光定量PCR检测方法，本发明方法步骤包括鱼源无乳链球菌DNA的提取、引物设计、标准质粒模板的制备、荧光定量PCR退火温度的优化、绘制标准曲线、敏感性和特异性检测。本发明可以灵敏、快速、定量、特异性的检测出水产养殖动物感染无乳链球菌，灵敏度可达8.6细菌基因组拷贝/μL，对鱼类无乳链球菌病的预防有重大意义。
Description
技术领域
本发明属于细菌检测技术领域，具体涉及一种鱼源无乳链球菌的荧光定量PCR检测方法。
背景技术
无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)，也称B族链球菌，是兼性的革兰氏阳性球菌，是一种重要的人、兽及鱼共患病致病菌。鱼源无乳链球菌可引起鱼类败血症和脑膜炎，具有较高的致病率和致死率。现有的鱼源无乳链球菌的检测方法主要有常规的细菌分离培养鉴定法、普通PCR检测法、环介导等温扩增技术(LAMP)检测法等。细菌分离培养方法存在耗时和受样品污染等诸多因素的影响；普通PCR既无法对病原定量，又需要凝胶电泳，容易对环境造成污染；LAMP法虽然灵敏性高，但不能对病原进行定量；而荧光定量PCR技术通过在PCR反应体系中加入可嵌入双链DNA的荧光燃料，利用相应软件实时监测整个PCR进程中的荧光信号积累情况，对未知模板可进行定性和定量分析，该方法可实时检测、速度快、高通量、定量准确、灵敏度高、特异性好、自动化程度高，在病原微生物检测方面已得到广泛应用，目前，尚无荧光定量PCR方法用于检测鱼源无乳链球菌的相关报道。近年来，鱼类无乳链球菌病大面积爆发流行，该病缺乏有效的治疗方法，防止无乳链球菌的传染和流行是当前采取的主要措施，早期快速检测该病原是减少损失的有效途径，荧光定量PCR技术应用于水产动物无乳链球菌的检测，对于疾病的预防意义重大。
发明内容
为解决背景技术中的检测临床样品中鱼源无乳链球菌的问题，本发明提供一种鱼源无乳链球菌的荧光定量PCR检测方法，该方法可以灵敏、快速、定量、特异性的检测出水产养殖动物感染无乳链球菌，为防止鱼源无乳链球菌的传染和流行提供技术支持。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：
(1)取患病鱼的组织50～100mg，称重后，放入组织匀浆器中研磨，加入1000μL TE缓冲液，制成组织匀浆液。取组织匀浆液180μL，加入20μL浓度为50mg/mL的溶菌酶，30℃孵育10min；后续的提取步骤按照细菌DNA提取试剂盒法的方法进行，即得到高纯度细菌基因组DNA，保存于-20℃备用。
(2)根据GenBank中的鱼源无乳链球菌16S-23S rRNA基因间区序列，设计一对特异性引物，序列如下：
上游引物ISR-s：5′GGAAACCTGCCATTTGCGTCT-3′；
下游引物ISR-a：5′AATCTATTTCTAGATCGTGGAAT-3′。
(3)使用上述特异性引物扩增出大小为190bp的片段；通过连接、转化将该片段插入18-T载体；最后对18-T重组质粒进行鉴定。
(4)提取经过测序鉴定正确的重组质粒，应用Thermo NanoDrop 2000进行质粒浓度检测，计算出重组质粒的拷贝数，将质粒进行10倍稀释法稀释成6.04×108～6.04×101拷贝/μL的8个浓度梯度，将其作为标准质粒模板。
(5)将标准质粒作为模板，构建反应体系，进行荧光定量PCR扩增，获得扩增曲线和标准曲线。
(6)将已经计算出拷贝数的重组质粒进行10倍梯度稀释，选取6.04×104～6.04×10-1拷贝/μL的6个浓度梯度，进行荧光定量PCR检测，以此确定荧光定量PCR所能检测的最低模板拷贝数，验证本发明方法的灵敏性。
(7)分别以无乳链球菌感染的罗非鱼、海豚链球菌、金黄色葡萄球菌、海分枝杆菌、鰤鱼诺卡氏菌、迟缓爱德华氏菌、哈维弧菌、美人鱼发光杆菌杀鱼亚种、健康罗非鱼和健康斑点叉尾鮰的DNA，以及人DNA标准品为模板，进行荧光定量PCR扩增，验证本发明方法的特异性。
其中本发明所述步骤5-7中，所述的荧光定量PCR反应体系如下：总反应体积20μL，其中SYBR Green I PCR Master Mix预混液(2×)10μL、10μM上、下游引物各0.5μL、模板DNA 1.0μL、无菌水8.0μL；反应程序为：预变性94℃，1min，1个循环；随后进行40个循环，程序为94℃，30sec，退火60.4℃，20sec，延伸72℃，20sec，同时设溶解曲线反应参数为94，15sec，60℃，30sec，94，15sec。
其中本发明中Ct值与质粒拷贝数的对数之间表现出良好的线性关系，相关系数R2＝0.990，截距为36.28，斜率为-3.195，扩增效率E＝106.0％，从而可以算出拷贝数X与Ct值之间的线性关系方程式：Ct＝-3.195logX+36.28，而待测样品的Ct值可以从实验结果中直接读取；把待测样品的Ct值代入方程式就可以算出无乳链球菌ISR的单拷贝数(X)。由于无乳链球菌的基因组内含有7个拷贝的ISR序列，则样品中的无乳链球菌基因组拷贝数＝X/7。
其中在反应结束后进行溶解曲线分析，扩增产物的溶解温度为90.8-91.2℃，无非特异性产物和引物二聚体的峰值出血标准品均一稳定。
其中分别以无乳链球菌感染的罗非鱼、海豚链球菌、金黄色葡萄球菌、海分枝杆菌、鰤鱼诺卡氏菌、迟缓爱德华氏菌、哈维弧菌、美人鱼发光杆菌杀鱼亚种、健康罗非鱼和健康斑点叉尾鮰的DNA，以及人DNA标准品为模板，进行荧光定量PCR扩增。无乳链球菌感染的罗非鱼DNA模板出现特异性扩增曲线，而其他样品均未出现相应的扩增曲线，同时将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，结果与上述一致，表明该方法具有较好的特异性。
附图说明
图1不同退火温度下的扩增结果，图上部分显示不同退火温度所对应Ct值，图下部分为不同退火温度下产物的琼脂糖凝胶电泳结果。
图2不同稀释浓度的阳性质粒为模板的荧光定量PCR扩增曲线。从左到右各条曲线代表6.04×1086.04×107、6.04×106、6.04×105、6.04×104、6.04×103、6.04×102、6.04×101质粒拷贝数/μL扩增曲线。
图3荧光定量PCR标准曲线结果，回归方程Ct＝-3.195logX+36.28，相关系数R2＝0.990，扩增效率E＝106.0％。
图4扩增产物的溶解曲线分析，溶解温度在90.8-91.2℃之间。
图5荧光定量PCR特异性检测。以不同样品的DNA模板，按照构建的荧光定量PCR方法进行扩增，将扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测。泳道M，DL2000marker；泳道1，无乳链球菌感染的罗非鱼DNA；泳道2，海豚链球菌DNA；泳道3，金黄色葡萄球菌DNA；泳道4，海分枝杆菌DNA；泳道5，鰤鱼诺卡氏菌DNA；泳道6，迟缓爱德华氏菌DNA；泳道7，哈维弧菌DNA；泳道8，美人鱼发光杆菌杀鱼亚种DNA；泳道9，斑点叉尾鮰DNA；泳道10，罗非鱼DNA；泳道11，人DNA标准品。
图6荧光定量PCR方法检测感染无乳链球菌的罗非鱼样品。横坐标代表用于感染罗非鱼的不同无乳链球菌菌株；纵坐标代表攻毒14天后，罗非鱼脑组织内的无乳链球菌基因组DNA载量。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例一荧光定量PCR检测无乳链球菌方法的建立
1.样品基因组DNA提取
(1)鱼(包括鱼体内细菌)基因组DNA提取：取鱼的组织50～100mg，称重后，放入组织织匀浆器中研磨，加入1000μLTE缓冲液，制成组织匀浆液。取组织匀浆液180μL，加入20μL浓度为50mg/mL的溶菌酶，30℃孵育10min；后续的提取步骤按照OMEGABacterial DNAKit细菌DNA提取试剂盒法的方法进行，即得到高纯度的鱼(鱼包括体内细菌)基因组DNA，保存于-20℃备用。其中OMEGA Bacterial DNA Kit试剂盒(OMEGA公司)购于广州飞扬生物工程有限公司。
(2)细菌基因组DNA提取：分别培养无乳链球菌、海豚链球菌、金黄色葡萄球菌、海分枝杆菌、鰤鱼诺卡氏菌、迟缓爱德华氏菌、哈维弧菌和美人鱼发光杆菌杀鱼亚种，按照OMEGA Bacterial DNA Kit细菌DNA提取试剂盒法的方法进行，得到高纯度的细菌基因组DNA，保存于-20℃备用。
2.引物设计与合成
根据GenBank中的鱼源无乳链球菌16S-23S rRNA基因间区序列(ISR)，通过PrimerPremier 6.0软件设计的，并按照本领域常规方法合成。引物序列如下：
上游引物ISR-s：5′-GGAAACCTGCCATTTGCGTCT-3′；
下游引物ISR-a：5′-AATCTATTTCTAGATCGTGGAAT-3′。
其中ISR-s/a预期片段为190bp。
3.标准品模板的制备：
以上述提取的无乳链球菌基因组DNA为模板，使用上述设计的特异性引物扩增出大小为190bp的片段；通过连接、转化将该片段插入18-T载体；最后对18-T重组质粒进行鉴定，命名为18-T-ISR。
阳性质粒(18-T-ISR)，交上海生工生物工程公司测序鉴定。用细菌质粒DNA小提试剂盒提取质粒DNA，用Thermo NanoDrop 2000检测质粒浓度，此质粒溶液即为本发明的标准品模板。
根据阿伏加德罗常数、碱基的平均分子量、重组质粒的长度及浓度计算单位体积质粒溶液内的拷贝数。其计算公式如下：每μL质粒溶液的拷贝数＝[质粒浓度(g/μL)×阿伏伽德罗常数]/[重组质粒分子量×660]。
经计算得18-T-ISR浓度为6.04×1010拷贝/μL，将质粒稀释成：6.04×108、6.04×107、6.04×106、6.04×105、6.04×104、6.04×103、6.04×102、6.04×101拷贝/μL的浓度，于-20℃保存备用。
4.荧光定量PCR反应条件及其优化
反应体系(20μL)为：SYBR Green I PCR Master Mix预混液(2×)10μL、10μM上、下游引物各0.5μL、模板DNA 1.0μL、无菌水8.0μL。本申请实施例中实际使用SYBR GreenI PCR Master Mix预混液(2×)(TOYOBO公司)购自广州美津生物技术有限公司；所使用引物为上述设计的特异性引物。
退火条件优化：预变性94℃，1min，1个循环；随后进行40个循环，程序为94℃，30sec，退火55.0～64.9℃，20sec，延伸72℃，20sec，同时设溶解曲线反应参数为94，15sec，60℃，30sec，94，15sec。本申请实施例中实际使用Eppendorf公司的Eppendorf Mastercyclerep realplex型荧光定量PCR仪记录结果。
最佳退火温度的确定：以实施例1中提取的无乳链球菌DNA为模板，按照上述反应体系和反应条件，比较不同退火温度下的扩增产物所对应Ct值，结合琼脂糖凝胶电泳结果，确定荧光定量PCR的最佳退火温度。反应的最佳退火温度为60.4℃(如附图1)。
5.方法学评价
(1)标准曲线制作.
将上述已定量的标准品(重组质粒)以10倍的倍比关系作一系列稀释，以不同稀释浓度的标准品作为模板，分别取1.0μL按照上面的反应体系和反应条件进行荧光定量PCR，制作标准曲线(如附图2)。荧光定量PCR标准曲线的回归方程Ct＝-3.195logX+36.28，相关系数R2＝0.990，扩增效率E＝106.0％，用阳性质粒所作的标准曲线的Ct值与初始浓度有较好的线性关系(如附图3)，标准品的溶解温度都在90.8-91.2℃之间(如附图4)。
(2)灵敏度测试
将已定量的标准品进行10倍稀释为6.04×104、6.04×103、6.04×102、6.04×101、6.04×100、6.04×10-1拷贝/μL，用建立的荧光定量PCR方法进行检测，以此确定检测的灵敏度。结果显示，当重组质粒浓度为60.4拷贝/μL，即8.6无乳链球菌基因组拷贝/μL时，仍能够获得扩增曲线和特异的溶解曲线。
(3)特异性验证
为了了解该方法的特异性，选用无乳链球菌感染的罗非鱼、海豚链球菌、金黄色葡萄球菌、海分枝杆菌、鰤鱼诺卡氏菌、迟缓爱德华氏菌、哈维弧菌、美人鱼发光杆菌杀鱼亚种、健康罗非鱼和健康斑点叉尾鮰的DNA，以及人DNA标准品为模板，进行荧光定量PCR扩增。在所检测的样品中，仅无乳链球菌感染的罗非鱼DNA样品结果为阳性，而其他样品的检测结果均为阴性。同时将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，结果与上述一致(如附图5)。表明建立的荧光定量PCR方法不会受这些水产动物病原菌的及宿主的干扰，也不会受操作过程中人的DNA的干扰。
(4)荧光定量PCR稳定性和重复性测试
在评价荧光定量PCR检测无乳链球菌方法的重现性和稳定性，用阳性样品和阴性样品，按照上述反应体系和反应条件，反复进行荧光定量PCR检测，每次试验的每个样品做8个平行反应管，重复6次，结果表明所建立的荧光定量PCR检测方法具有很好的稳定性和重复性。
(5)样品中的无乳链球菌定量
待测样品的Ct值可以在荧光定量PCR仪中直接读取，把待测样品的Ct值代入到标准曲线回归方程式可以算出无乳链球菌ISR的单拷贝数(X)。由于无乳链球菌的基因组内含有7个拷贝的ISR序列，则最终样品中的无乳链球菌拷贝数＝X/7。
实施例二用本发明建立的荧光定量PCR方法检测样品
选取10株不同毒力的无乳链球菌感染罗非鱼，攻毒后第14天采集样品。
1.分离培养法
将样品接种于血琼脂平板上，置28℃培养24-48h，观察菌落，如见形成灰白色、表面光滑、有乳光、圆形、β溶血的菌落，则进行革兰氏染色镜检，发现单个、成双、链状排列、长短不一，呈紫色的球菌。
2.荧光定量PCR法
(1)样品DNA提取
将样品称重后，放入组织织匀浆器中研磨，加入1000μLTE缓冲液，制成组织匀浆液。取组织匀浆液180μL，加入20μL浓度为50mg/mL的溶菌酶，30℃孵育10min；后续的提取步骤按照OMEGA Bacterial DNA Kit细菌DNA提取试剂盒法的方法进行，即得到高纯度的鱼(鱼包括体内细菌)基因组DNA。
(2)荧光定量PCR反应
将一系列不同稀释浓度的重组质粒标准品和提取的样品DNA作为模板，进行荧光定量PCR检测，同时设阴性对照。反应体系(20μL)为：SYBR Green I PCR Master Mix预混液(2×)10μL、10μM上、下游引物各0.5μL、模板DNA 1.0μL、无菌水8.0μL。放入EppendorfMastercycler ep realplex型荧光定量PCR仪。反应条件：预变性94℃，1min，1个循环；随后进行40个循环，程序为94℃，30sec，退火60.4℃，20sec，延伸72℃，20sec，同时设溶解曲线反应参数为94，15sec，60℃，30sec，94，15sec。反应结束后利用荧光定量PCR软件分析。
(3)结果计算
各扩增曲线与阈值线的交叉点对应的横坐标即为Ct值，根据标准曲线上浓度与Ct值的对应关系，可求出各待测样品中无乳链球菌ISR的单拷贝数(X)，则最终样品中的无乳链球菌拷贝数＝X/7。
(4)数据分析
采样EXCLE软件包，培养法和所建立的荧光定量PCR方法对样品检测结果阳性率的比较采样X2检验。
应用所建立的荧光定量PCR方法和培养法对人工感染无乳链球菌的罗非鱼30个样品进行检测，经统计分析发现，这两种方法有显著性差异(P＜0.05)。荧光定量PCR阳性检出率(100％)明显高于培养法(76.7％)。此外，荧光定量PCR还可对样品中无乳链球菌进行定量分析(图5)，判定无乳链球菌在鱼体内的定植情况。
综上所述，本发明的有益效果是：基于重组质粒18-T-ISR所建立的鱼源无乳链球菌实时定量PCR检测方法具有检测速度快(2个小时左右)、操作简便、结果可靠等特点，该方法具有较好的敏感性和特异性，不仅可提高检出率，还能定量出患病鱼的无乳链球菌的DNA载量，与传统方法相比，明显优于培养法。
Claims (3)
1.一种鱼源无乳链球菌的荧光定量PCR检测方法，其特征在于其检测方法的具体步骤如下：
(1)提取鱼组织内的无乳链球菌DNA，制备检测液。
(2)引物设计：根据GenBank中的鱼源无乳链球菌16S-23S rRNA基因间区序列，通过PrimerPremier6.0软件设计相应的特异性引物，序列如下：
上游引物ISR-s：5′-GGAAACCTGCCATTTGCGTCT-3′；
下游引物ISR-a：5′-AATCTATTTCTAGATCGTGGAAT-3′。
(3)标准品模板的制备：使用上述特异性引物扩增出大小为190bp的片段；通过连接、转化将该片段插入载体；最后对重组质粒进行鉴定。提取经过测序鉴定重组质粒，进行质粒浓度检测，计算出重组质粒的拷贝数，将质粒进行10倍稀释法稀释成6.04×108、6.04×107、6.04×106、6.04×105、6.04×104、6.04×103、6.04×102、6.04×101拷贝/μL的8个浓度梯度，将其作为标准质粒模板，其中单位体积质粒溶液内的拷贝数计算公式如下：每μL质粒溶液的拷贝数＝[质粒浓度(g/μL)×阿伏伽德罗常数]/[重组质粒分子量×660]。
(4)标准曲线制备：将标准质粒作为模板，构建反应体系，进行荧光定量PCR扩增，获得扩增曲线和标准曲线。
(5)将已经计算出拷贝数的重组质粒进行10倍梯度稀释，选取6.04×104、6.04×103、6.04×102、6.04×101、6.04×100、6.04×10-1拷贝/μL的6个浓度梯度，进行荧光定量PCR检测，以此确定荧光定量PCR所能检测的最低重组质粒拷贝数，验证本发明方法的敏感性。
(6)分别以无乳链球菌感染的罗非鱼、海豚链球菌、金黄色葡萄球菌、海分枝杆菌、鰤鱼诺卡氏菌、迟缓爱德华氏菌、哈维弧菌、美人鱼发光杆菌杀鱼亚种、健康罗非鱼和健康斑点叉尾鮰的DNA，以及人DNA标准品为模板，进行荧光定量PCR扩增，验证本发明方法的特异性。
(7)样品中的无乳链球菌定量计算方法：在荧光定量PCR仪中直接读取待测样品的Ct值，将Ct值代入到标准曲线回归方程式，计算出无乳链球菌ISR的单拷贝数(X)。由于无乳链球菌的基因组内含有7个拷贝的ISR序列，则最终样品中的无乳链球菌拷贝数＝X/7。
2.根据权利要求1所述的一种鱼源无乳链球菌的荧光定量PCR检测方法，其特征在于鱼组织内无乳链球菌DNA的提取方法为：取病鱼的组织50～100mg，称重后，放入组织织匀浆器中研磨，加入1000μL TE缓冲液，制成组织匀浆液。取组织匀浆液180μL，加入20μL浓度为50mg/mL的溶菌酶，30℃孵育10min后续的提取步骤按照常规试剂盒的提取方法进行，即得到高纯度的含细菌和鱼基因组DNA，保存于-20℃备用。
3.根据权利要求1所述的一种鱼源无乳链球菌的荧光定量PCR检测方法，其特征在于步骤4-6中所述的荧光定量PCR反应体系如下：总反应体积20μL，其中SYBR Green I PCR MasterMix预混液(2×)10μL、10μM上、下游引物各0.5μL、模板DNA1.0μL、无菌水8.0μL；荧光定量PCR反应程序为：预变性94℃，1min，1个循环；随后进行40个循环，程序为94℃，30sec，退火60.4℃，20sec，延伸72℃，20sec，同时设溶解曲线反应参数为94，15sec，60℃，30sec，94，15sec。
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