CN105219837B - 一种检测巴贝西虫的方法及其专用试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测巴贝西虫的方法及其专用试剂盒。本发明公开的一组DNA分子，由如下(1)‑(3)所示的DNA分子组成：(1)SEQ ID No.2所示的DNA分子；(2)SEQ ID No.3所示的DNA分子；(3)SEQ ID No.4所示的DNA分子。本发明公开的方法较之当前临床上采用的形态学、免疫荧光法，可大大提高检测巴贝西虫的灵敏度，具有快速、简便的特点，适合基层医院以及巴贝西虫病的传播媒介、动物宿主监测使用。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测巴贝西虫的方法及其专用试剂盒，属于生物技术领域。
背景技术
巴贝西虫病(Babesiosis)临床主要症状为高热、溶血性贫血、黄疸和血红蛋白尿，是一种可经媒介蜱叮咬、接触动物(血液)、输血以及母婴传播等独特方式传播的新发人兽共患病。近几年来，在世界各地人群感染病例不断发生，甚至在美国几个州爆发疫情，在我国山东、浙江、新疆、云南及北京等地不断发生巴贝西虫确诊/疑似病例，已成为一种“新的健康威胁”。目前全世界已相继报道了寄生于脊椎动物体内的巴贝西虫超过100种。感染人的巴贝西虫主要包括微小巴贝西虫、邓氏巴贝西虫、分歧巴贝西虫和猎户巴贝西虫、巴贝西虫KO1株等。由于该病存在相当比例的隐性或亚临床感染者，临床上极易误诊漏诊。临床上目前主要利用血涂片、血清学检查、补体结合试验(CFT)甚至动物接种试验来进行确诊。但由于形态学敏感性较低，血清学检测不适合早期诊断，动物接种后需经一定的潜伏期即可在末梢血涂片中查到虫体。受到很大限制。荧光PCR方法由于其操作步骤简单，反应时间更短，整个过程可在2h内完成，结果判定简单客观，灵敏特异且能应用在自动化分析系统中，故而适宜门诊就诊患者初查。Taqman探针带有一个荧光发光基团和一个荧光淬灭基团，完整的探针在特定光源激发下，发光基团所产生的荧光被淬灭基团全部吸收，样品无荧光。PCR过程中，Taq酶在延伸DNA链的同时，可通过自身的5’→3’核酸外切酶活性降解与模板结合的特异性荧光探针，使荧光报告基团与淬灭基团分离，分离后的荧光报告基团在特定光源激发下产生荧光。通过监测整个PCR过程荧光信号的变化，对未知模板进行定性分析。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测巴贝西虫的方法及其专用试剂盒，用本发明提供的方法检测巴贝西虫具有准确可靠、敏感性和特异性好的特点。
本发明提供一组DNA分子，由如下(1)-(3)所示的DNA分子组成：
(1)SEQ ID No.2所示的DNA分子；
(2)SEQ ID No.3所示的DNA分子；
(3)SEQ ID No.4所示的DNA分子。
一种检测样品中巴贝西虫含量的试剂盒也属于本发明的保护范围，该试剂盒包含如下(1)-(4)所示的分子：
(1)SEQ ID No.2所示的DNA分子；
(2)SEQ ID No.3所示的DNA分子；
(3)SEQ ID No.4所示的DNA分子，或5’端连接报告荧光基团，3’端连接淬灭荧光基团的SEQ ID No.4所示的DNA分子；
(4)SEQ ID No.5所示的DNA分子；
该试剂盒还包含使用说明书，说明书记载内容如下：以不同浓度的含有SEQ IDNo.5所示DNA片段的重组质粒为模板，以SEQ ID No.2所示的DNA分子和SEQ ID No.3所示的DNA分子为引物，以5’端连接报告荧光基团，3’端连接淬灭荧光基团的SEQ ID No.4所示的DNA分子为探针，进行实时荧光定量PCR扩增，以每个反应中重组质粒的拷贝数为横坐标，对应的Ct值为纵坐标，制作标准曲线，得到标准曲线公式；提取待检样品的DNA，以其为模板，按照上述方法，得到对应的Ct值，记作A；将A带入标准曲线公式，得到重组质粒的拷贝数，即为待检样品中的巴贝西虫含量；
所述SEQ ID No.5所示的DNA分子是位于重组质粒上的，所述重组质粒为将SEQ IDNo.5所述的DNA分子插入pMD18-T得到。
上述试剂盒中，所述巴贝西虫为双芽巴贝西虫(B.bigemina)、猎户巴贝西虫(B.venatorum)、分歧巴贝西虫(B.divergens)和/或鹿巴贝西虫(B.capreoli)。
一种检测样品中巴贝西虫含量的方法也属于本发明的保护范围，包括如下步骤：以不同浓度的含有SEQ ID No.5所示DNA片段的重组质粒为模板，以SEQ ID No.2所示的DNA分子和SEQ ID No.3所示的DNA分子为引物，以5’端连接报告荧光基团，3’端连接淬灭荧光基团的SEQ ID No.4所示的DNA分子为探针，进行实时荧光定量PCR扩增，以每个反应中重组质粒的拷贝数为横坐标，对应的Ct值为纵坐标，制作标准曲线，得到标准曲线公式；提取待检样品的DNA，以其为模板，按照上述方法，得到对应的Ct值，记作A；将A带入标准曲线公式，得到重组质粒的拷贝数，即为待检样品中的巴贝西虫含量；
所述SEQ ID No.3所示的DNA分子为四种引物的等浓度混合物；
所述报告荧光基团具体为FAM，所述淬灭荧光基团具体为TAMRA。
上述方法中，所述重组质粒为将SEQ ID No.5所述的DNA分子插入pMD18-T得到。
上述任一所述的方法中，所述实时荧光定量PCR的反应体系如下：2×Premix ExTaq10ul、浓度为10uM的SEQ ID No.2所示的DNA分子0.8ul、浓度为10uM的SEQ ID No.3所示的DNA分子0.8ul、浓度为10uM的5’端连接报告荧光基团，3’端连接淬灭荧光基团的SEQ IDNo.4所示的DNA分子0.4ul、模板2.5μL、ddH2O5.5
所述实时荧光定量PCR的反应程序如下：95℃10min；95℃15s，60℃30s，45个循环；50℃5min；
所述2×Premix Ex Taq购自宝生物工程(大连)有限公司，货号为DRR039A。
上述任一所述的方法中，所述标准曲线的制作过程中所述模板的浓度为4.4-4.4×104拷贝数/微升，具体为4.4、44、4.4×102、4.4×103、4.4×104拷贝数/微升。
上述任一所述的方法中，所述巴贝西虫为双芽巴贝西虫(B.bigemina)、猎户巴贝西虫(B.venatorum)、分歧巴贝西虫(B.divergens)和/或鹿巴贝西虫(B.capreoli)。
上述DNA分子或上述任一所述的试剂盒在制备检测巴贝西虫的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
上述应用中，所述巴贝西虫为双芽巴贝西虫(B.bigemina)、猎户巴贝西虫(B.venatorum)、分歧巴贝西虫(B.divergens)和/或鹿巴贝西虫(B.capreoli)。
本发明提供的方法中探针引物针对常见巴贝西虫18S rRNA高变区和保守区进行设计，在最大地保留检测敏感性的前提下，尽量减少其他近缘物种的交叉反应性，提高了检测的特异性。本发明利用实时荧光定量PCR-TaqMan探针法对巴贝西虫进行定量检测，较之当前临床上采用的形态学、免疫荧光法，可大大提高检测的灵敏度，具有快速、简便的特点，适合基层医院以及该病的传播媒介、动物宿主监测使用。
附图说明
图1为普通PCR扩增验证。
图2为采用ABI7500仪器检测的，以10倍梯度稀释的质粒pBabesi116为模板的实时荧光定量PCR扩增曲线和标准曲线。
图3为采用罗氏Lightcycle2.0仪器检测的，以10倍梯度稀释的质粒pBabesi116为模板的实时荧光定量PCR扩增曲线和结果。
图4为实时荧光定量PCR扩增得到的片断的比对结果。
图5为引物和探针的可靠性检测。
图6为实时荧光定量PCR扩增阳性患者的片段的测序结果。
图7为引物和探针的特异性检测。
图8为引物和探针的参数。
图9为上游引物、优化前下游引物和探针的敏感性和特异性。
图10为上游引物在巴贝西虫、近缘种以及啮齿动物和人源18s rRNA对应位置序列的比对结果。
图11为优化前下游引物在巴贝西虫、近缘种以及啮齿动物和人源18s rRNA对应位置序列的比对结果。
图12为探针在巴贝西虫、近缘种以及啮齿动物和人源18s rRNA对应位置序列的比对结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
2×Premix Ex Taq购自宝生物工程(大连)有限公司，货号为DRR039A。
严重联合免疫缺陷(severe combined immune deficiency,SCID)小鼠购自军事医学科学院实验动物中心。
人红细胞购自军事医学科学院附属307医院。
pMD18-T购自宝生物工程(大连)有限公司。
实施例1、引物和探针的设计
一、巴贝西虫的18s rRNA基因存在三个主要的高变区,第一个位于自5’末端起第100-200nt的位置，第二个位于550-660nt的位置，第三个位于1250-1300nt的位置。巴贝西虫不同种之间的差异在0.0％-11.2％之间，与啮齿动物以及人源的18s rRNA基因对应位置相差均接近30％。
根据引物设计原则，将包含巴贝西虫的18s rRNA基因第二高变区(自5’末端起第550-660位核苷酸)的一段406bp基因区域(SEQ ID No.1)(该序列来源于分歧巴贝西虫(Babesia divergens),GenBank中序列登记号GU057385)进行进一步分析，其中加粗部分为不同种巴贝西虫的变异区。
SEQ ID No.1:
5’-AATTACCCAATCCTGACACAGGGAGGTAGTGACAAGAAATAACAATACAGGGCAATTGTCTTGTAATTGGAATGATGGTGATGTAAACCCTCACCAGAGTAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAACTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAATTTTTGCGTGGTGTTAATCATGACTGATGTTTTGATTGCACTTCGCTTTTGGGATTTATCCCTTTTTACTTTGAGAAAATTAGAGTGTTTCAAGCAGACTTTTGTCTTGAATACTTCAGCATGGAATAATAGAGTAGGACTTTGGTTCTATTTTGTTGGTTTGTGAACCTTAGTAATGGTTAATAGGAACGGTTGGGGGCATTCGTATTT-3’
经过分析得到一套引物和探针，如下所示：
上游引物(F4)：5’-GCAACAAGTTTAATATACGCTATTGGA-3’(SEQ ID No.2)
下游引物(R4)：5’-TCTTGTAATTGGAATGATGGTGA(T/C)(G/C)T-3’(SEQ ID No.3)
探针(FP4)：5’-TGCTGGCACCAGACTTGCCCTCC-3’(SEQ ID No.4)
在探针(FP4)的5’端连接报告荧光基团，在3’端连接淬灭荧光基团，形成FAM_5’-TGCTGGCACCAGACTTGCCCTCC-3’_TAMRA完整的TaqMan探针。(下述实施例中所述的探针均为该5’端连接报告荧光基团，3’端连接淬灭荧光基团的探针FAM_5’-TGCTGGCACCAGACTTGCCCTCC-3’_TAMRA)
以分歧巴贝西虫的DNA为模板，以上游引物(F4)、下游引物(R4)(y＝t/c，s＝g/c，四种引物的等浓度混合物)为引物，以探针(FP4)为探针，进行PCR扩增得到目标扩增子序列。
目标扩增子序列如下：
5’-GCAACAAGTTTAATATACGCTATTGGAGCTGGAATTACCGCGGCTGCTGGCACCAGACTTGCCCTCCAATTGTTACTCTGGTGAGGGTTTACATCACCATCATTCCAATTACAAGA-3’(SEQ ID No.5)
实施例2、普通PCR扩增验证
一、合成SEQ ID No.1所示的片段，并将其插入质粒载体pMD18-T，得到重组质粒，将其命名为pBabesi406。将重组质粒pBabesi406送测序，结果正确。
二、以不同梯度稀释度的重组质粒pBabesi406为模板，以SEQ ID No.2和SEQ IDNo.3(y＝t/c，s＝g/c，四种引物的等浓度混合物)为引物，进行普通PCR扩增，得到各PCR扩增产物，各PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示。
图1中，1-5为各PCR扩增产物；M为DNA marker。
图1表明，PCR扩增可以得到约120bp的目的条带，将目的条带进行测序，结果与SEQID No.5序列一致。
实施例3、实时荧光定量PCR验证
一、将SEQ ID No.5所示的DNA片段插入pMD18-T，得到重组质粒，将其命名为pBabesi116。将pBabesi116送测序，结果正确。
二、根据重组质粒pBabesi116的碱基数(2692+116＝2808bp)、计算分子量(MW＝2808×660＝1853280Daltons)即1mol＝1.85328x106g。
测量pBabesi116的实际核酸浓度，重复三次，结果分别为147,133,127(ng/uL)，取平均值则为135.7ng/μL，作为标准品。
计算标准品拷贝数：(6.02x1023拷贝数/摩尔)x(1357x10-10克/微升)/(1.85328x106克/摩尔)＝4.4x1010copies/μL，将标准品进行不同梯度的稀释，同时计算相应的浓度，如表1所示。
三、以不同稀释度的标准品为模板进行PCR检测，每反应标准品的体积为2.5μL，每反应的标准品拷贝数如表1所示。同时以ddH2O为模板进行PCR扩增，作为阴性对照。
PCR反应体系(20ul)：2×Premix Ex Taq10ul、引物SEQ ID No.2(工作浓度10uM)0.8ul(终浓度0.4uM)、引物SEQ ID No.3(y＝t/c，s＝g/c，四种引物的等浓度混合物)(工作浓度10uM)0.8ul(终浓度0.4uM)、探针SEQ ID No.4(工作浓度10uM)0.4ul(终浓度0.2uM)、模板2.5μL、ddH2O5.5ul。
PCR反应程序：95℃10min；95℃15s，60℃30s，45cycles；50℃5min。
四、采用ABI7500仪器检测得到的扩增曲线如图2A所示。
图2A的各曲线从左至右依次为标准品稀释倍数为10-6-10-10时的实时荧光定量PCR检测曲线，当标准品稀释倍数为10-11以及以ddH2O为模板时没有显著上升的荧光曲线。当标准品的稀释倍数为10-10，即每个反应为11拷贝时，Ct值接近35。而当标准品的稀释倍数为10-11时，不能检出理论值1.1的拷贝数，表明检测阈值为35。
以稀释倍数为10-6-10-10时的标准品的质粒DNA拷贝数为横坐标(单位：个/反应)，以对应的Ct值为纵坐标，制作标准曲线，如图2B所示。
表1梯度稀释的模板浓度以及每反应的拷贝数
五、采用罗氏Lightcycle2.0仪器检测得到的扩增曲线如图3A所示。
图3A的各曲线从左至右依次为标准品稀释倍数为10-7-10-10时的实时荧光定量PCR检测曲线，当标准品稀释倍数为10-11以及以ddH2O为模板时没有显著上升的荧光曲线。图3A和3B表明，当标准品的稀释倍数为10-10，即每个反应为11拷贝时，Ct值接近35。而当标准品的稀释倍数为10-11时，不能检出理论值1.1的拷贝数，表明检测阈值为35。
步骤四和步骤五表明，以毛细管法为检测原理的ABI7500仪器和用PCR管或板为检测工具的罗氏Lightcycle2.0仪器两种检测仪器的检测敏感性和重复性一致。
将实时荧光定量PCR的扩增产物进行纯化，送测序，将得到的序列在美国国家生物技术信息中心GenBank数据库中人、鼠以及其他物种基因库中进行BLAST搜索，结果如下：在人、鼠基因组库中比较，最接近的序列同源性均为86％；在包括病原体的“other”库中，最接近的为B.sp,与其它巴贝虫种类的同源性在94％以上。在1000个序列中，最后与微小巴贝西虫(B.microti)和马泰勒虫(Theileria equi)同源性为93％，结果如图4所示。
实施例4、引物和探针的可靠性和特异性检测
一、可靠性检测
(一)将临床疑似患有巴贝虫病病人的血液标本经过荧光原位杂交(FISH)技术检测以及血涂片染色光学显微镜鉴定确定为阳性。
(二)提取步骤(一)的临床疑似患有巴贝虫病病人的全血标本的DNA，分别编号为409，39，58，47，B，分别以其为模板，以SEQ ID No.2和SEQ ID No.3(y＝t/c，s＝g/c，四种引物的等浓度混合物)为引物，SEQ ID No.4为探针，进行实时荧光定量PCR，同时以ddH2O(分别编号为NTC1和NTC2)和健康病人的全血标本的DNA(编号为988牡，该标本经过步骤(一)的方法，确定为阴性)为模板进行实时荧光定量PCR，作为阴性对照，以浓度为4.4x1010copies/μL的pBabesi116稀释为原浓度的10-8和10-6时的质粒为模板(分别编号为7和8)进行实时荧光定量PCR，作为阳性对照。实时荧光定量PCR的PCR反应体系和PCR反应程序同实施例3的步骤三。
实时荧光定量PCR结果如表2和图5A所示。
实时荧光定量PCR扩增曲线如图5B所示，图5B中各编号为标本的位置序号。
实时荧光定量PCR结果表明，患有巴贝虫病病人全血标本中带虫载量与稀释为原浓度的10-8的pBabesi116的质粒接近，为1000拷贝/反应左右。
表2检测样本和Ct值
(三)选取编号为409的实时荧光定量PCR扩增产物进行纯化后直接测序，结果表明，该产物如SEQ ID No.5所示，该产物的测序结果如图6所示。
二、特异性检测
(一)将步骤一中经过荧光原位杂交(FISH)技术检测以及血涂片染色光学显微镜鉴定阳性的巴贝西虫病患者全血标本分别接种严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠和含有人红细胞的培养基，分别进行体内、体外培养。采集鼠血和细胞培养物，提取DNA。另外对东北林区采集的全沟硬蜱(Ixodes persulcatus)提取DNA。分别以其为模板，以PIRO-A和PIRO-B引物(参考文献“Hilpertshauser et al.(2006)Babesia spp.identified by PCR in tickscollected from domestic and wild ruminants in southern Switzerland.ApplEnviron Microbiol72:6503-6507.”)进行普通PCR扩增，鉴定得到阳性样本。
(二)提取来源于野外采集野鼠动物的脾脏组织的DNA，以其为模板，经上述步骤(一)的PCR扩增，并将PCR扩增产物进行测序，得到确认为微小巴贝西虫(B.microti)的阳性标本。
(三)提取来源于野外采集的家畜动物羊血液的DNA，以其为模板，采用通用引物(参考文献“Schnittger L,et al.(2003)Phylogeny of sheep and goat Theileria andBabesia parasites.Parasitol Res91:398-406.”)进行PCR扩增，并将PCR扩增产物进行测序，得到确定为吕氏泰勒虫(Theileria luwenshuni)的阳性标本。
分别以上述经过荧光原位杂交(FISH)技术检测以及血涂片染色光学显微镜鉴定为阴性的巴贝西虫病患者的全血标本的DNA(编号分别为988，972，868)和鉴定为阳性的巴贝西虫病患者的全血标本的DNA(编号为Zheng)，以及步骤(一)鉴定得到的巴贝西虫感染阳性鼠血DNA(15-shu),巴贝西虫感染阳性的人红细胞培养物DNA为模板(45-cell-9.20)，蜱检测阳性标本(45-1-tick),以SEQ ID No.2和SEQ ID No.3(y＝t/c，s＝g/c，四种引物的等浓度混合物)为引物，以SEQ ID No.4为探针进行实时荧光定量PCR检测。同时分别以步骤(二)鉴定的微小巴贝西虫(B.microti)的阳性标本的DNA，步骤(三)鉴定的吕氏泰勒虫(Theileria luwenshuni)的阳性标本的DNA为模板，进行以SEQ ID No.2和SEQ ID No.3(y＝t/c，s＝g/c，四种引物的等浓度混合物)为引物，以SEQ ID No.4为探针进行实时荧光定量PCR检测。
上述实时荧光定量PCR的反应体系和反应程序如实施例3中步骤三。
实时荧光定量PCR扩增曲线和结果如图7所示。
图7表明，以SEQ ID No.2和SEQ ID No.3(y＝t/c，s＝g/c，四种引物的等浓度混合物)为引物，以SEQ ID No.4为探针，利用实施例3步骤三的实时荧光定量PCR方法进行样本的检测，对于微小巴贝西虫(B.microti)和吕氏泰勒虫(Theileria lunenshuni)没有扩增信号，为阴性。对于已经确认为阴性(988，972，868)和阳性(Zheng)巴贝西虫病患者，以及鉴定为巴贝西虫感染的阳性的鼠血DNA和细胞培养物DNA,阳性媒介蜱均检测到一致的结果。
以上实验表明，以SEQ ID No.2和SEQ ID No.3(y＝t/c，s＝g/c，四种引物的等浓度混合物)为引物，以SEQ ID No.4为探针，利用实施例3步骤三的实时荧光定量PCR方法进行样本的检测可以避免微小巴贝西虫(B.microti)和吕氏泰勒虫(Theileria luwenshuni)近缘种检测的干扰，该方法具有特异性。
实施例5、引物和探针的设计及优化过程
一、初始引物和探针
根据引物设计原则，将包含巴贝西虫的18s rRNA基因第二高变区(自5’末端起第550-660位核苷酸)的一段406bp基因区域(SEQ ID No.1)进行分析，得到以下引物和探针：
上游引物(F4)：5’-GCAACAAGTTTAATATACGCTATTGGA-3’(SEQ ID No.2)
优化前下游引物：5’-TCTTGTAATTGGAATGATGGTGATGT-3’(SEQ ID No.6)
探针(FP4)：5’-TGCTGGCACCAGACTTGCCCTCC-3’(SEQ ID No.4)
上游引物(F4)(图8中Fwd Primer)、优化前下游引物(图8中Rev Primer)和探针(FP4)(图8中Probe1)的参数如图8所示。
二、引物和探针的设计合理性分析
通过NCBI，将上游引物、优化前下游引物和探针分别在人基因组库、鼠基因组库中以及其他基因组数据库中进行BLAST搜索比较分析，结果如图9所示。
图9表明，上游引物、优化前下游引物和探针的敏感性好(可扩增多种巴贝西虫)，并且特异性较高(避开了人、鼠扩增标本中同源18s rRNA的可能)。
图9中Babe F、Babe R和Babe P分别代表上游引物、优化前下游引物和探针。
三、在此基础上，结合本实验是从蜱中获得巴贝西虫未定种(B.sp)基因组资源信息，分析上游引物和优化前下游引物对我国一些常见种，包括双芽巴贝西虫(B.bigemina)、猎户巴贝西虫(B.venatorum)、分歧巴贝西虫(B.divergens)、鹿巴贝西虫(B.capreoli)等，尤其是人、鼠同源基因进行比对，各基因组数据均在Genbank中得到。
(一)上游引物(F4)在巴贝西虫、近缘种以及啮齿动物和人源18s rRNA对应位置序列的blast比对结果如图10所示。
图10表明，上游引物在自5’末端起第4、8位核苷酸处巴贝西虫区别于人、鼠来源的18s rRNA。与马泰勒虫(Theileria equi)相同位置的基因没有差异，与微小巴贝西虫(B.microti)对应位置相差一个碱基。
(二)优化前下游引物在巴贝西虫、近缘种以及啮齿动物和人源18s rRNA对应位置序列的比对结果如图11所示。
图11表明，优化前下游引物在5’端(图11中的优化前下游引物的反向互补序列的3’端)与人、鼠相差2个碱基，与其它参考种类的一致；在3’端与双芽巴贝西虫(B.bigemina)更加同源，与B.venatorum,B.sp,B.capreoli,B.divergens巴贝西虫种类3’末端倒数2、3碱基有差异；与B.canis、B.microti相差3个碱基；与人鼠来源的相同位置相差9个碱基。
为了考虑到检测多种的敏感性，在下游引物的反向互补序列中加入简并引物A C/G A/G TCACCATCATTCCAATTACAAGA,可以更好的扩出B.venatorum,B.sp,B.capreoli,B.divergens；由于B.microti与马泰勒虫(Theileria equi)在这个下游引物的位置基本没有同源性，无法调整碱基同时扩增B.microti。
因此优化的下游引物如下：
下游Babe-R：5’-TCTTGTAATTGGAATGATGGTGA(T/C)(G/C)T-3’(SEQ ID No.3)
(三)探针(FP4)在巴贝西虫、近缘种以及啮齿动物和人源18s rRNA对应位置序列的比对结果如图12所示。图12表明，探针比较通用。
设计的探针和以及引物分析结论：可以扩增出：B.venatorum,B.divergens，B.bigemina,B.capreoli,等常见种类，可以排除扩增人、鼠同源基因的可能性,特异性较高。
Claims (9)
1.一组DNA分子，由如下(1)-(3)所示的DNA分子组成：
(1)SEQ ID No.2所示的DNA分子；
(2)SEQ ID No.3所示的DNA分子；
(3)SEQ ID No.4所示的DNA分子。
2.一种检测样品中巴贝西虫含量的试剂盒，该试剂盒包含如下(1)-(4)所示的分子：
(1)SEQ ID No.2所示的DNA分子；
(2)SEQ ID No.3所示的DNA分子；
(3)SEQ ID No.4所示的DNA分子，或5’端连接报告荧光基团，3’端连接淬灭荧光基团的SEQ ID No.4所示的DNA分子；
(4)SEQ ID No.5所示的DNA分子。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述巴贝西虫为双芽巴贝西虫(B.bigemina)、猎户巴贝西虫(B.venatorum)、分歧巴贝西虫(B.divergens)和/或鹿巴贝西虫(B.capreoli)。
4.一种检测样品中巴贝西虫含量的方法，包括如下步骤：以不同浓度的含有SEQ IDNo.5所示DNA片段的重组质粒为模板，以SEQ ID No.2所示的DNA分子和SEQ ID No.3所示的DNA分子为引物，以5’端连接报告荧光基团，3’端连接淬灭荧光基团的SEQ ID No.4所示的DNA分子为探针，进行实时荧光定量PCR扩增，以每个反应中重组质粒的拷贝数为横坐标，对应的Ct值为纵坐标，制作标准曲线，得到标准曲线公式；提取待检样品的DNA，以其为模板，按照上述方法，得到对应的Ct值，记作A；将A带入标准曲线公式，得到重组质粒的拷贝数，即为待检样品中的巴贝西虫含量；
所述SEQ ID No.3所示的DNA分子为四种引物的等浓度混合物；
所述报告荧光基团具体为FAM，所述淬灭荧光基团具体为TAMRA；
所述巴贝西虫为双芽巴贝西虫(B.bigemina)、猎户巴贝西虫(B.venatorum)、分歧巴贝西虫(B.divergens)和/或鹿巴贝西虫(B.capreoli)；
所述方法为非疾病诊断和治疗的方法。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述重组质粒为将SEQ ID No.5所述的DNA分子插入pMD18-T得到。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述实时荧光定量PCR的反应体系如下：2×Premix Ex Taq 10ul、浓度为10uM的SEQ ID No.2所示的DNA分子0.8ul、浓度为10uM的SEQ ID No.3所示的DNA分子0.8ul、浓度为10uM的5’端连接报告荧光基团，3’端连接淬灭荧光基团的SEQ ID No.4所示的DNA分子0.4ul、模板2.5μL、ddH2O 5.5ul；所述实时荧光定量PCR的反应程序如下：95℃10min；95℃15s，60℃30s，45个循环；50℃5min；
所述2×Premix Ex Taq购自宝生物工程(大连)有限公司，货号为DRR039A。
7.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述标准曲线的制作过程中所述模板的浓度为4.4-4.4×104拷贝数/微升。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述标准曲线的制作过程中所述模板的浓度为4.4、44、4.4×102、4.4×103、4.4×104拷贝数/微升。
9.权利要求1所述的DNA分子或权利要求2或3所述的试剂盒在制备检测巴贝西虫的产品中的应用；所述巴贝西虫为双芽巴贝西虫(B.bigemina)、猎户巴贝西虫(B.venatorum)、分歧巴贝西虫(B.divergens)和/或鹿巴贝西虫(B.capreoli)。
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