CN110499393A

CN110499393A - 犬腺病毒、犬腺病毒i型和犬腺病毒ii型的实时荧光定量pcr检测及鉴别引物和探针

Info

Publication number: CN110499393A
Application number: CN201910813832.8A
Authority: CN
Inventors: 王艳杰; 魏学峰; 刘国英; 范秀丽; 张贵刚; 王玉雯; 陈君彦; 刘建奇; 王秀明; 刘亭岐; 孔彩平; 巨敏莹; 刘东霞; 苏日娜
Original assignee: Jinyu Baoling Bio-pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Jinyu Baoling Bio-pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2019-08-30
Filing date: 2019-08-30
Publication date: 2019-11-26

Abstract

本发明公开了一种犬腺病毒、I型和II型犬腺病毒的实时荧光定量PCR检测及鉴别引物和探针，并基于该引物和探针提供用于同时鉴别检测犬腺病毒、I型和II型犬腺病毒的试剂盒，属于生物检测技术领域。利用该试剂盒的检测操作简便、特异性强、灵敏度高、重复性好，不仅可用于犬腺病毒的检测，还可实现I型和II型犬腺病毒的鉴别，更可以实现I型和II型犬腺病毒的准确定量，将在犬腺病毒、I型和II型犬腺病毒的检测及疫苗生产过程中的质量监控和合理化配苗中发挥重要作用。

Description

犬腺病毒、犬腺病毒I型和犬腺病毒II型的实时荧光定量PCR 检测及鉴别引物和探针

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，涉及一种用于对犬腺病毒、犬腺病毒I型和犬腺病毒II型进行定性、定量和鉴别检测的实时荧光定量PCR检测试剂盒及其专用引物和TaqMan探针。

背景技术

犬腺病毒(Canine adenovirus,CAV)

犬腺病毒(CAV)属腺病毒科，哺乳动物腺病毒属，为双股，线状DNA病毒。CAV是哺乳动物腺病毒属中致病性最强的一种病毒，与人腺病毒具有相似的基因结构。根据其血凝和中和试验等特性不同可将CAV分为I型和II型，CAV-I型和CAV-II型之间纤突蛋白的核苷酸同源性约为80％。纤突蛋白在病毒吸附到细胞表面受体的感染过程中起着决定性作用，CAV-I型与CAV-II型纤突基因的不同性预示着两者在毒力和对不同细胞亲嗜性上存在着差异，CAV-I型对血管内皮细胞有较强的亲嗜力，因此引起犬的致死性肝炎，其临床表现是抑郁、厌食、鼻出血、呕吐、腹痛、血性腹泻、粘膜充血、黄疸、肾小球性肾炎、前葡萄膜炎和角膜水肿，出现蓝眼睛的特征性临床症状，而脑炎是野生犬种CAV-I感染的主要病理学发现；CAV-II型则引起上呼吸道感染和肠道感染，临床症状主要引起与呼吸道疾病和肠炎相关的犬接触性呼吸道疾病，但不引起肺炎症状，可引起幼犬咳嗽又叫犬窝咳。

CAV-I型在世界上分布范围较广泛，在澳大利亚、美国、丹麦、加拿大和英国等国家普遍存在，在饲养犬、狐狸、熊、土狼、红狐狸等其他肉食动物中流行。CAV-I型于1925年首次被发现，1947年CAV-I型被认定为犬病原体，1984年，在我国首次分离到该病毒。Pintore MD等人发现CAV-I型病毒和巴斯德氏杆菌共感染，并在臭鼬、浣熊、狐狸和猫鼬中检测到CAV-II型的天然存在的抗体，该病毒可通过与污染的唾液，尿液和粪便直接接触进入宿主。CAV-I型主要发生于1岁以内的幼犬，并且CAV-I和CAV-II型的病毒共感染频率较高，在相同的生物学基质中均可检测到两种CAV类型，两者存在免疫学交叉反应，近年来犬类感染CAV-I型时较多表现为无明显症状，故迫切需要一种可快速、高敏感度、特异性的CAV检测技术和鉴别CAV-I和CAV-II型的鉴别检测方法。

现有学者建立了用于同时检测犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬腺病毒(不区分I型和II型)的多重PCR检测引物，鉴别犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒和犬腺病毒2型的四重PCR检测方法，犬瘟热病毒、犬腺病毒Ⅱ型和犬副流感病毒的多重PCR检测引物组以及用于鉴别犬瘟热病毒野毒株与疫苗株的TaqMan探针荧光定量PCR检测试剂盒及应用，但均不涉及用于犬腺病毒I型和II型鉴别的研究。

在利用CAV病毒进行疫苗生产过程中，其原材料如细胞、培养基等不能含有CAV病毒，同时制作疫苗的CAV种毒必须是背景清晰，备案的病毒，而来源于原材料中的CAV病毒有可能是背景不清晰的野毒株，会影响生产的疫苗的安全性；尤其是CAV病毒中I型属于强毒株，不能用于疫苗生产，所以必须排除原材料中可能含有的CAV病毒，尤其是I型CAV病毒对种毒纯净性的干扰，因此，有必要对犬腺病毒、犬腺病毒I型和犬腺病毒II型进行检测与鉴别，以保证疫苗生产的安全性。

实时荧光定量PCR技术(Quantitative Real-time PCR，qPCR)是1996年由美国Applied Biosystems公司推出的，该技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析(Heid CA,Stevens J,Livak KJ,Williams PM.Real time quantitative PCR.Genome Res.1996Oct；6(10):986-94.)。实时荧光定量PCR技术是一种对病毒基因组进行检测的相对定量技术，与普通PCR技术相比，增加了一个两端带有荧光标记的寡核苷酸探针，具有灵敏度高、特异性强、重复性好、定量准确的优点，可以利用多种荧光基团实现多种基因的检测，并可利用中间的寡核苷酸探针实现相似性较高基因的鉴别。目前，该方法已广泛用于人类传染病的诊断和病原定量、以及动物病原体的检测、畜禽产品的检验检疫、生物制品的鉴定等领域(Jozefczuk J,Adjaye J.Quantitative real-time PCR-based analysis of geneexpression.Methods Enzymol.2011；500:99-109.)。

发明内容

针对现有技术中存在的问题的一个或多个，本发明一个方面提供一种用于对I型和II型犬腺病毒进行实时荧光定量PCR检测及鉴别的引物和TaqMan探针组，包含：

用于检测I型犬腺病毒和/或II型犬腺病毒的上游引物(CAV-I/II-F)和下游引物(CAV-I/II-R)，其中所述上游引物(CAV-I/II-F)的核苷酸序列如SED ID NO：3所示，所述下游引物(CAV-I/II-R)的核苷酸序列如SED ID NO：4所示；

用于对I型犬腺病毒进行实时荧光定量检测的TaqMan探针(CAV-I-P)，所述TaqMan探针(CAV-I-P)的核苷酸序列如SED ID NO：6所示；

用于对II型犬腺病毒进行实时荧光定量检测的TaqMan探针(CAV-II-P)，所述TaqMan探针(CAV-II-P)的核苷酸序列如SED ID NO：7所示；

所述TaqMan探针为经过荧光标记的，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团；且对两种病毒检测时探针所标记的荧光报告基团不相同；所述探针的3’端经磷酸化处理；

优选地，所述TaqMan探针(CAV-I-P)的荧光报告基团为ROX，荧光淬灭基团为BHQ2；所述TaqMan探针(CAV-II-P)的荧光报告基团为FAM，荧光淬灭基团为BHQ2。

本发明另一方面提供一种用于对I型和II型犬腺病毒进行实时荧光定量PCR检测及鉴别的试剂盒，包含：

上述的引物和TaqMan探针组；

使用所述试剂盒时的25μL实时荧光定量PCR检测体系中所述引物和TaqMan探针的用量优选为：CAV-I/II-F(10μM)1.0μL，CAV-I/II-R(10μM)1.0μL，CAV-I-P(10μM)0.75μL，CAV-II-P(10μM)0.75μL；

优选地，所述试剂盒中还包括阳性对照品和阴性对照品，阳性对照品为I型和II型犬腺病毒DNA，各阳性对照品为单一包装或混合包装，阴性对照品为不含I型和II型犬腺病毒的反应体系，如H₂O(双蒸水、无菌去离子水等)；使用所述试剂盒对I型和II型犬腺病毒进行实时荧光定量PCR检测时，将单一包装的阳性对照品混合或直接使用混合包装的阳性对照品；

进一步优选地，所述试剂盒中还包括标准品，其为分别携带I型和II型犬腺病毒检测基因的重组质粒pCR TOPO-CAV-I和pCR TOPO-CAV-II；各标准品为单一包装或等浓度混合包装；使用所述试剂盒对I型和II型犬腺病毒进行实时荧光定量PCR检测时，将单一包装的标准品等浓度混合或直接使用混合包装的标准品。

本发明另一方面提供一种用于对犬腺病毒、I型和II型犬腺病毒进行三重实时荧光定量PCR检测及鉴别的引物和TaqMan探针组合，包含：

用于检测犬腺病毒的上游引物(CAV-F)和下游引物(CAV-R)，其中所述上游引物(CAV-F)的核苷酸序列如SED ID NO：1所示，所述下游引物(CAV-R)的核苷酸序列如SED IDNO：2所示；

用于对犬腺病毒进行实时荧光定量检测的TaqMan探针(CAV-P)，所述TaqMan探针(CAV-P)的核苷酸序列如SED ID NO：5所示；所述TaqMan探针为经过荧光标记的，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团；优选地，所述TaqMan探针(CAV-P)的荧光报告基团为HEX，荧光淬灭基团为BHQ2；和

上述的用于对I型和II型犬腺病毒进行实时荧光定量PCR检测及鉴别的引物和TaqMan探针组。

本发明又一方面提供一种用于对犬腺病毒、I型和II型犬腺病毒进行三重实时荧光定量PCR检测及鉴别试剂盒，包含：

上述的引物和TaqMan探针组合；

使用所述试剂盒时的25μL实时荧光定量PCR检测体系中所述引物和TaqMan探针的用量优选为：CAV-F(10μM)1.0μL，CAV-R(10μM)1.0μL，CAV-I/II-F(10μM)1.0μL，CAV-I/II-R(10μM)1.0μL，CAV-P(10μM)0.75μL，CAV-I-P(10μM)0.75μL，CAV-II-P(10μM)0.75μL。

上述试剂盒中还包括阳性对照品和阴性对照品，阳性对照品为I型和II型犬腺病毒DNA，各阳性对照品为单一包装或混合包装，阴性对照品为不含I型和II型犬腺病毒的反应体系，如H₂O(双蒸水、无菌去离子水等)；使用所述试剂盒对犬腺病毒、I型和II型犬腺病毒进行三重实时荧光定量PCR检测时，将单一包装的阳性对照品混合或直接使用混合包装的阳性对照品；

优选地，所述试剂盒中还包括标准品，其为分别携带犬腺病毒、I型和II型犬腺病毒检测基因的重组质粒pCR TOPO-CAV、pCR TOPO-CAV-I和pCR TOPO-CAV-II；各标准品为单一包装或等浓度混合包装；使用所述试剂盒对犬腺病毒、I型和II型犬腺病毒进行三重实时荧光定量PCR检测时，将单一包装的标准品等浓度混合或直接使用混合包装的标准品。

上述的引物和TaqMan探针组、引物和TaqMan探针组合或上述的试剂盒在对犬腺病毒、I型和II型犬腺病毒进行非疾病诊断目的的检测中的应用也属于本发明的内容。

上述应用为用实时荧光定量PCR技术对犬腺病毒、I型和II型犬腺病毒进行非疾病诊断目的的定性、定量检测方法，包括以下步骤：

1)建立标准曲线：将分别携带犬腺病毒、I型和II型犬腺病毒的检测基因的重组质粒pCR TOPO-CAV、pCR TOPO-CAV-I和pCR TOPO-CAV-II的单一包装的标准品等浓度混合或直接使用等浓度混合包装的标准品，按照10倍梯度将混合液中各标准品浓度稀释至1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10¹copies/μL；以不同浓度的标准品混合液作为模板，在上述的引物和TaqMan探针组合的引导下进行三重实时荧光定量PCR检测，检测结束后，以各标准品的浓度Log值(X轴)对其相应Ct值(Y轴)作图，绘制标准曲线；

2)提取待测样品的基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板，在上述的引物和TaqMan探针组合的引导下进行三重实时荧光定量PCR检测；

3)用得到的CT值或荧光信号的变化实现对犬腺病毒、I型和II型犬腺病毒的定性检测，再根据荧光信号的强度和步骤1)中的标准曲线，得出待检测样品中所含犬腺病毒、I型和II型犬腺病毒的拷贝数，实现定量检测。

上述步骤1)和步骤2)中的25μL实时荧光定量PCR检测体系包括：模板5μL，实时荧光定量PCR反应液2×AceQ qPCR Probe Master Mix 12.5μL，CAV-F(10μM)1.0μL，CAV-R(10μM)1.0μL，CAV-I/II-F(10μM)1.0μL，CAV-I/II-R(10μM)1.0μL，CAV-P(10μM)0.75μL，CAV-I-P(10μM)0.75μL，CAV-II-P(10μM)0.75μL，RNA-free H₂O1.25μL。

上述步骤1)和步骤2)中的三重实时荧光定量PCR检测条件为：先95℃10min；然后94℃5s，56℃30s，45个循环。

上述步骤3)中的判定方法为：

若样品在CAV-P的5’端所标记的荧光报告基团所对应的通道在35个循环内(不包括第35个循环)出现“S”型扩增曲线，则确认为CAV阳性(样品中含有I型和/或II型犬腺病毒)；若样品还在CAV-I-P的5’端所标记的荧光报告基团所对应的通道在35个循环内(不包括第35个循环)出现“S”型扩增曲线，则确认为CAV-I阳性(样品中含有的犬腺病毒为I型犬腺病毒)；若样品还在CAV-II-P的5’端所标记的荧光报告基团所对应的通道在35个循环内(不包括第35个循环)出现“S”型扩增曲线，则确认为CAV-II阳性(样品中含有的犬腺病毒为II型犬腺病毒)；若样品在CAV-I-P的5’端所标记的荧光报告基团和CAV-II-P的5’端所标记的荧光报告基团所对应的通道在35个循环内(不包括第35个循环)均出现“S”型扩增曲线，则确认样品中含有I型犬腺病毒和II型犬腺病毒；

若样品在CAV-P的5’端所标记的荧光报告基团所对应的通道在38个循环以上(包括第38个循环)未出现“S”型扩增曲线，则确认为CAV阴性(样品中不含有I型和/或II型犬腺病毒)；

若样品在CAV-P的5’端所标记的荧光报告基团所对应的通道在35-38个循环内出现“S”型扩增曲线，则判定为可疑，需重检；

优选地，若HEX通道在35个循环内出现“S”型扩增曲线，则确认样品中含有犬腺病毒，若FAM通道在35个循环内出现“S”型扩增曲线，则确认待测样品中含有的犬腺病毒为II型犬腺病毒，若ROX通道在35个循环内出现“S”型扩增曲线，则确认待测样品中含有的犬腺病毒为I型犬腺病毒，若ROX通道和FAM通道在35个循环内均出现“S”型扩增曲线，则确认待测样品中含有犬腺病毒I型和II型；

若HEX通道在38个循环以上未出现“S”型扩增曲线，则确认为CAV阴性；若HEX通道在35-38个循环之间出现“S”型扩增曲线，则判定为可疑，需重检。

上述应用为用实时荧光定量PCR技术对I型和II型犬腺病毒进行非疾病诊断目的的定性、定量检测方法，包括以下步骤：

1)建立标准曲线：将分别携带I型和II型犬腺病毒的检测基因的重组质粒pCRTOPO-CAV-I和pCR TOPO-CAV-II的单一包装的标准品等浓度混合或直接使用等浓度混合包装的标准品，按照10倍梯度将混合液中各标准品浓度稀释至1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10¹copies/μL；以不同浓度的标准品混合液作为模板，在权利要求1所述的引物和TaqMan探针组的引导下进行实时荧光定量PCR检测，检测结束后，以各标准品的浓度Log值(X轴)对其相应Ct值(Y轴)作图，绘制标准曲线；

2)提取待测样品的基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板，在权利要求1所述的引物和TaqMan探针组的引导下进行实时荧光定量PCR检测；

3)用得到的CT值或荧光信号的变化实现对I型和II型犬腺病毒的定性检测，再根据荧光信号的强度和步骤1)中的标准曲线，得出待检测样品中所含I型和II型犬腺病毒的拷贝数，实现定量检测。

上述步骤1)和步骤2)中的25μL实时荧光定量PCR检测体系包括：模板5μL，实时荧光定量PCR反应液2×AceQ qPCR Probe Master Mix 12.5μL，CAV-I/II-F(10μM)1.0μL，CAV-I/II-R(10μM)1.0μL，CAV-I-P(10μM)0.75μL，CAV-II-P(10μM)0.75μL，RNA-free H₂O 4μL。

上述步骤1)和步骤2)中的实时荧光定量PCR检测条件为：先95℃10min；然后94℃5s，56℃30s，45个循环。

上述步骤3)中的判定方法为：

若样品在CAV-I-P的5’端所标记的荧光报告基团所对应的通道在35个循环内(不包括第35个循环)出现“S”型扩增曲线，则确认为CAV-I阳性(样品中含有I型犬腺病毒)；若样品在CAV-II-P的5’端所标记的荧光报告基团所对应的通道在35个循环内(不包括第35个循环)出现“S”型扩增曲线，则确认为CAV-II阳性(样品中含有II型犬腺病毒)；若样品在CAV-I-P的5’端所标记的荧光报告基团和CAV-II-P的5’端所标记的荧光报告基团所对应的通道在35个循环内(不包括第35个循环)均出现“S”型扩增曲线，则确认样品中含有I型犬腺病毒和II型犬腺病毒；

若样品在CAV-I-P的5’端所标记的荧光报告基团和CAV-II-P的5’端所标记的荧光报告基团所对应的通道在38个循环以上(包括第38个循环)未出现“S”型扩增曲线，则确认为CAV阴性(样品中不含有犬腺病毒)；

若样品在CAV-I-P的5’端所标记的荧光报告基团或CAV-II-P的5’端所标记的荧光报告基团所对应的通道在35-38个循环内出现“S”型扩增曲线，则判定为可疑，需重检；

优选地，若FAM通道在35个循环内出现“S”型扩增曲线，则确认待测样品中含有II型犬腺病毒，若ROX通道在35个循环内出现“S”型扩增曲线，则确认待测样品中含有I型犬腺病毒，若ROX通道和FAM通道在35个循环内均出现“S”型扩增曲线，则确认待测样品中含有犬腺病毒I型和II型；

若ROX通道和FAM通道在38个循环以上均未出现“S”型扩增曲线，则确认为CAV阴性；若若ROX通道或FAM通道在35-38个循环之间出现“S”型扩增曲线，则判定为可疑，需重检。

上述待测样品包括用于疫苗生产的原料、疫苗半成品及成品。

基于以上技术方案提供的用于鉴别检测犬腺病毒、I型犬腺病毒和II型犬腺病毒的实时荧光定量PCR检测试剂盒及其专用引物、TaqMan探针能对犬腺病毒、I型和II型犬腺病毒实施快速准确检测和鉴别，可为疫苗生产过程中的质量监控和合理化配苗(如评估配制疫苗抗原的准确含量，为疫苗抗原含量提供数据基础)提供有力依据，确保疫苗接种的安全性和合理性，对犬腺病毒I型和II型疫苗的生产具有指导作用；还可以对犬只源细胞质量进行监控，并为后续处置提供客观数据，以保证犬只及其制品的安全性。本发明的试剂盒和检测方法操作简便、特异性强、灵敏度高、重复性好，不仅可用于I型和/或II型犬腺病毒的检测，还可实现I型和II型犬腺病毒的鉴别检测，更可以实现I型和II型犬腺病毒的准确定量，将在I型和II型犬腺病毒的检测(包括临床诊断中临床病料或培养物中I型和II型犬腺病毒的准确检测)及疫苗生产和犬只制品生产(非诊断目的的应用)中发挥重要作用，应用前景广阔。

附图说明

图1为本发明用实时荧光定量PCR技术对犬腺病毒(CAV)、I型和II型犬腺病毒进行定性、定量、鉴别检测的技术路线；

图2为本发明用于对犬腺病毒、I型和II型犬腺病毒进行实时荧光定量PCR检测的标准品的扩增曲线；

图3为本发明用于对犬腺病毒、I型和II型犬腺病毒进行实时荧光定量PCR检测的标准曲线；

图4为犬腺病毒、I型和II型犬腺病毒的实时荧光定量PCR检测方法的特异性检测结果；

图5为犬腺病毒、I型和II型犬腺病毒的实时荧光定量PCR检测方法的灵敏度检测结果；

图6为犬腺病毒、I型和II型犬腺病毒的实时荧光定量PCR检测方法的重复性检测结果。

具体实施方式

生物基因组是直接反应生物基本信息的一个最客观的指标，不同的病毒所含有的基因组信息不同，通过基因组信息可将不同的病毒分类至不同的族群，利用基因组碱基互补配对的原则，可实现特异位点基因序列的大量扩增。

本发明基于以上基本原理设计了2对特异性引物和3条寡核苷酸探针，利用碱基互补配对的原理，建立了一种特异性检测犬腺病毒、I型和II型犬腺病毒的实时荧光定量PCR检测方法，并基于设计得到的特异性引物和探针提供一种能同时检测和鉴别犬腺病毒、I型和II型犬腺病毒的实时荧光定量PCR检测试剂盒。图1示出了本发明用实时荧光定量PCR检测方法对犬腺病毒、I型和II型犬腺病毒进行定性、定量、鉴别检测的技术路线。

通过以下具体实施方式详细说明本发明。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《分子克隆实验指南》(《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》Sambrook，J.，Russell，DavidW.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。

所述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。

实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

所用引物由上海生工有限公司合成；所用探针由上海生工基因公司合成。

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但不应作为对本发明内容的限制。

实施例1、引物和TaqMan探针设计

1.1、引物和TaqMan探针设计

本实施例旨在确定用于对犬腺病毒、I型和II型犬腺病毒进行实时荧光定量PCR检测和鉴别的引物和TaqMan探针，不仅仅确定了用于检测犬腺病毒是否存在的通用检测序列，还通过创造性努力在I型和II型CAV病毒的核苷酸序列Hexon基因差异比较小的情况下，寻找一个好的位点同时进行I型和II型CAV的鉴别检测。发明人从NCBI的核酸数据库GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)检索获得CAV I型和II型的hexon区域基因(CAVI型GenBank号：KP840549.1，序列表中SED ID NO：8，CAV II型GenBank号：EU717145.1，序列表中SED ID NO：9)的序列，用DNA Man软件进行比对后，根据引物、TaqMan探针设计原则，选取CAV I型和II型的hexon区域基因并将优选的特异性保守序列作为CAV I型和II型的通用检测序列，该通用检测序列为I型和II型CAV hexon基因5’端第170-301位碱基(序列表中SEQ ID NO:11)；同时选取CAV I型和II型的hexon区域基因并将优选的特异性保守序列作为鉴别检测序列，该鉴别检测序列为I型和II型CAV hexon基因5’端第1765-1951位碱基(序列表中SED ID NO：10)。

用Primer Express 6.0软件基于所确定的通用检测序列(序列表中SEQ ID NO:11)设计得到并最终确定了一组(组A)检测犬腺病毒的通用引物和TaqMan探针，序列如下：

CAV-F(上游引物)：5’-CCACTGARAGGTCKCAGCGC-3’(其中R＝A/G；K＝G/T；SED IDNO：1)

CAV-R(下游引物)：5’-AGTARGTACTGGCCATGTCCAG-3’(其中R＝A/G；SED ID NO：2)；

CAV-P(TaqMan荧光探针)：5’-HEX-GATGGCCAGTACACTTACAAAACCCG-BHQ2-3’(SEDID NO：5)。CAV-P的报告荧光基团为HEX，荧光淬灭基团为BHQ2。

用Primer Express 6.0软件基于所确定的鉴别检测序列(序列表中SED ID NO：10)设计得到并最终确定了一组(组B)对CAV I型和II型进行检测和鉴别的引物及TaqMan探针，序列如下：

CAV-I/II-F(上游引物)：5’-GATGTAAATGACCAGTCCTTTGC-3’(SED ID NO：3)

CAV-I/II-R(下游引物)：5’-AGTAGGGGTCGTAAGGTGAGC-3’(SED ID NO：4)；

CAV-I-P(TaqMan荧光探针)：5’-ROX-GTCTGCCGCCAACATGCTTTATCCG-BHQ2-3’(SEDID NO：6)。CAV-I-P的报告荧光基团为ROX，荧光淬灭基团为BHQ2。

CAV-II-P(TaqMan荧光探针)：5’-FAM-GTCTTCTGCCAACATGCTTTATCCC-BHQ2-3’(SEDID NO：7)。CAV-II-P的报告荧光基团为FAM，荧光淬灭基团为BHQ2。

为防止PCR扩增时被延伸，以上所有探针的3’端已经磷酸化处理。

将以上组A、组B的引物和TaqMan探针组合即为用于对犬腺病毒、I型和II型犬腺病毒进行三重实时荧光定量PCR检测的引物和TaqMan探针。单独利用组B的引物和TaqMan探针也能用于对犬腺病毒、I型和II型犬腺病毒进行实时荧光定量PCR检测和鉴别。

实施例2：犬腺病毒、犬腺病毒I型和犬腺病毒II型的三重实时荧光定量PCR检测

一、提取待测样品基因组DNA

按照Axyprep^TMBody Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit(AXYGEN公司)说明书从I型和II型犬腺病毒细胞培养物(金宇保灵公司疫苗毒株细胞培养物)提取DNA作为标准品和阳性对照品以及从待测样品中提取基因组DNA作为检测样；具体包括以下步骤：

(1)按试剂盒说明书，预先配制含1％冰乙酸的异丙醇和在试剂Buffer W1A和Buffer W2中添加指定浓度的无水乙醇；

(2)在1.5mL离心管中加入200μL的待提取样品，并加入200μL Buffer V-L，漩涡震荡混匀后，静置5min；

(3)在步骤(2)的混合有样品及试剂的1.5mL离心管中加75μL Buffer V-N，漩涡震荡混匀，12000g离心5min；

(4)将上清转移至2mL离心管(试剂盒内提供)中，加300μL异丙醇(1％冰乙酸)，上下倒置6-8次，混合均匀；

(5)将制备管(试剂盒内提供)置于另一2mL离心管中，取步骤(4)的混合液移入制备管中，6000g离心1min；

(6)弃滤液，将制备管置回至步骤(5)的2mL离心管中，加500μL Buffer W1A，室温静置1min，12000g离心1min；

(7)弃滤液，将制备管置回至步骤(5)的2mL离心管中，加800μL Buffer W2，12000g离心1min；

(8)弃滤液，将制备管置回到步骤(5)的2mL离心管中，12000g离心1min；

(9)将制备管置于另一洁净的1.5mL离心管(试剂盒内提供)中，在制备管膜中央加40μL无酶水，室温静置1min，12000g离心1min，洗脱得到DNA。

从待测样品中提取的DNA作为检测样；从I型和II型犬腺病毒细胞培养物中提取的DNA作为阳性对照样；按照下述二的方法将从I型和II型犬腺病毒细胞培养物中提取的DNA制备得到标准品。

二、建立I型和II型犬腺病毒的三重实时荧光定量PCR检测的标准曲线

1、PCR扩增犬腺病毒、I型和II型犬腺病毒Hexon区域基因

分别以步骤一提取的I型和II型犬腺病毒基因组DNA为模板，在引物对CAV-F和CAV-R或引物对CAV-I/II-F和CAV-I/II-R的引导下按照下表1所述的PCR扩增体系(25μL)扩增得到犬腺病毒、I型和II型犬腺病毒Hexon区域基因的目的片段；其中PCR反应程序为：预变性95℃10min；PCR扩增程序：95℃15s，56℃30s，72℃45s，35个循环，72℃7min。

表1犬腺病毒、I型和II型犬腺病毒Hexon区域基因的PCR扩增体系

2、制备标准品

将上述步骤1获得的犬腺病毒、I型和II型犬腺病毒的Hexon区域含检测基因的目的片段克隆至pCR TOPO载体(购自Invitrogen公司)中，构建成重组质粒，并筛选阳性重组质粒送上海生工公司测序，验证质粒构建是否成功。测序结果表明获得了序列正确的携带犬腺病毒、I型和II型犬腺病毒Hexon区域基因的重组质粒，分别命名为pCR TOPO-CAV/pCRTOPO-CAV-I/pCR TOPO-CAV-II，即CAV(犬腺病毒)、CAV-I(犬腺病毒I型)和CAV-II(犬腺病毒II型)的标准品。用Qubit3.0分别测定上述各标准品的浓度，并计算各标准品的拷贝(copies)数。

3、建立实时荧光定量PCR标准曲线

利用上述步骤2获得的各标准品制备得到pCR TOPO-CAV、pCR TOPO-CAV-I、pCRTOPO-CAV-II重组质粒浓度均为1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10¹copies/μL的10倍梯度标准品混合液，以不同浓度的标准品混合液作为模板，在实施例1所示引物和探针的引导下进行三重实时荧光定量PCR检测，25μL实时荧光定量PCR的反应体系如下表2所示，实时荧光定量PCR反应程序为(定量PCR仪，型号CFX96，购自美国伯乐)：预变性95℃10min；PCR扩增条件：94℃5s，56℃30s，45个循环。

表2犬腺病毒、I型和II型犬腺病毒Hexon基因的三重实时荧光定量PCR反应体系

各标准品的实时荧光定量PCR扩增曲线如图2所示，标准品扩增曲线为平滑的“S”形曲线(阳性)，图2中八组带◇线条从左向右对应的是CAV-I标准品(pCR TOPO-CAV-I)，其浓度分别为：1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10¹copies/μL；图2中八组带○线条从左向右对应的是CAV-II标准品(pCR TOPO-CAV-II)，其浓度分别为：1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10¹copies/μL；图2中八组带×线条从左向右对应的是CAV标准品(pCR TOPO-CAV)，其浓度分别为：1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10¹copies/μL；

检测结束后，以各标准品的浓度的Log值作为X轴，以循环数(Ct值)作为Y轴作图，绘制标准曲线，标准曲线如图3所示，其中CAV、CAV-I和CAV-II的相关系数分别为R²＝0.997(CAV)、R²＝0.994(CAV-I)、R²＝0.994(CAV-II)，因此误差较小，绘制得到的标准曲线可用于对CAV、CAV-I和CAV-II进行三重实时荧光定量PCR检测，由标准曲线得到的线性方程分别为：y＝-3.378x+41.587(CAV)；y＝-3.283x+43.014(CAV-I)；y＝-3.396x+42.143(CAV-II)。

三、对CAV、CAV-I和CAV-II进行多重实时荧光定量PCR检测

用本发明的三重实时荧光定量PCR检测方法对从10份犬源疫苗原料(待测样品)中提取的基因组DNA(检测样)进行检测，以实施例2中从I型和II型犬腺病毒细胞培养物中提取的DNA为阳性对照，以无酶水为阴性对照，根据实时荧光定量PCR检测结果，对待测样品中I型和II型犬腺病毒进行判定，并对病毒的拷贝数进行定量。

具体检测方法包括以下步骤：

1)以从待测样品中提取的基因组DNA为模板，在实施例1所示的引物和探针的引导下进行三重实时荧光定量PCR检测，25μL实时荧光定量PCR的检测体系包括：模板5μL，2×AceQ qPCR Probe Master Mix 12.5μL，CAV-F(10μM)1.0μL，CAV-R(10μM)1.0μL，CAV-I/II-F(10μM)1.0μL，CAV-I/II-R(10μM)1.0μL，CAV-P(10μM)0.75μL，CAV-I-P(10μM)0.75μL，CAV-II-P(10μM)0.75μL，RNA-free H₂O 1.25μL。实时荧光定量PCR的反应程序为(定量PCR仪，型号CFX96，购自美国伯乐)：预变性95℃10min；PCR扩增程序：94℃5s，56℃30s，45个循环。在每个循环的退火结束时进行荧光信号检测。

2)用得到的CT值或荧光信号的变化实现对CAV、CAV-I和CAV-II的定性和定量鉴别检测。结果判定：HEX通道出现“S”型扩增曲线表明待测样品中含有犬腺病毒，在此基础上，若FAM通道出现“S”型扩增曲线表明待测样品中含有的犬腺病毒为II型犬腺病毒，若ROX通道出现“S”型扩增曲线表明待测样品中的犬腺病毒为I型犬腺病毒，若ROX通道和FAM通道均出现“S”型扩增曲线表明待测样品中含有犬腺病毒I型和II型。

具体判定方法：35个循环内若出现“S”型扩增曲线，则确认为CAV阳性(样品中含有I型和/或II型犬腺病毒)，38个循环以上(包括38个循环)未出现“S”型扩增曲线，则确认为CAV阴性(样品中不含有I型和II型犬腺病毒)，35-38个循环之间判定为可疑，需重检。

3)对步骤2)中确定为某病毒阳性的待测样品，再根据该荧光信号的强度和之前确定的相应标准曲线，得出待测样品中所含的对应病毒的拷贝数，实现该病毒定量检测。

检测结果如下表3所示，所检测的10份待测样中有7份为CAV阴性(没有I型和II型犬腺病毒)，2份样品判定为CAV-I型阳性(存在I型犬腺病毒)，1份样品判定为CAV-II型阳性(存在II型犬腺病毒)，循环数均小于35，且其拷贝数大于10¹拷贝，因此这三份待测样品含有背景不清楚的I型犬腺病毒或II型犬腺病毒，不能用作犬腺病毒疫苗生产的原料以排除疫苗生产原料中存在的CAV病毒对种毒纯净性的干扰。

表3 10份待测样品进行CAV、CAV-I和CAV-II三重实时荧光定量PCR检测结果

实施例3、对CAV、CAV-I和CAV-II进行三重实时荧光定量PCR检测的灵敏度、特异性和重复性

3.1、特异性检测

按照实施例2中的方法对I型和II型犬腺病毒(CAV)、犬细小病毒(CPV)分别提取DNA，对犬瘟热病毒(CDV)、犬副流感病毒(CPIV)分别提取RNA，同时以灭活的I型和II型犬腺病毒(CAV)细胞培养物提取的DNA为阳性对照，以无酶水为阴性对照，在实施例1所示的引物和探针的引导下进行三重实时荧光定量PCR检测，25μL实时荧光定量PCR的检测体系包括：模板5μL，2×AceQ qPCR Probe Master Mix 12.5μL，CAV-F(10μM)1.0μL，CAV-R(10μM)1.0μL，CAV-I/II-F(10μM)1.0μL，CAV-I/II-R(10μM)1.0μL，CAV-P(10μM)0.75μL，CAV-I-P(10μM)0.75μL，CAV-II-P(10μM)0.75μL，RNA-free H₂O 1.25μL。实时荧光定量PCR的反应条件为(定量PCR仪，型号CFX96，购自美国伯乐)：预变性95℃10min；PCR扩增条件：94℃5s，56℃30s，45个循环。

检测结果如图4所示，可见仅有CAV-I型和CAV-II型(样品和阳性对照)出现特定的“S”型扩增曲线，结果阳性，其它样品未出现特定的“S”型扩增曲线，结果阴性。检测结果表明用本发明的方法可特异性地检测出犬腺病毒、I型和II型犬腺病毒。

3.2、灵敏度检测

按照实施例2中的方法，将携带犬腺病毒、犬腺病毒I型和II型的Hexon基因的pCRTOPO-CAV/pCR TOPO-CAV-I/pCR TOPO-CAV-II标准品重组质粒等浓度混合，随后按照10倍梯度分别稀释至1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10¹copies/μL的标准品混合液，以不同浓度的标准品混合液作为模板，在实施例1中的引物和TaqMan探针的引导下进行实时荧光定量PCR检测，PCR反应体系及反应条件参照上述步骤3.1，以验证该方法的灵敏度。

检测结果如图5所示，显示本发明犬腺病毒的实时荧光定量PCR检测方法可以检测至1×10¹copies/μL，I型犬腺病毒的实时荧光定量PCR检测方法可以检测至1×10²copies/μL，II型犬腺病毒的实时荧光定量PCR检测方法可以检测至1×10¹copies/μL，与普通PCR检测方法相比，敏感度具有显著提高。并且本发明引入了双重确认系统，即CAV-I型和II型通用检测和CAV-I型和CAV-II型鉴别检测，双重检测以防止漏检。本发明采用的方法为多重实时荧光定量PCR方法，用于单重PCR检测的引物和探针组合在用于进行多重实时荧光定量PCR时，会由于不同引物和探针进行相互干扰造成其检测敏感性下降，也即是说能够用于单重实时荧光定量PCR检测的引物和探针组合不一定能够用于多重PCR检测。

3.3、重复性检测

按照实施例2中的方法，将携带犬腺病毒、犬腺病毒I型和II型的Hexon基因的pCRTOPO-CAV/pCR TOPO-CAV-I/pCR TOPO-CAV-II标准品重组质粒等浓度混合，随后按照10倍梯度分别稀释至1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10¹copies/μL的标准品混合液，每个梯度重复三次，以不同浓度的标准品混合液作为模板，在实施例1中引物和探针的引导下进行多重实时荧光定量PCR检测，PCR反应体系及反应条件参照上述步骤3.1。

检测结果如图6和表4所示，从图6中可见每一个浓度梯度的扩增曲线较聚拢，表4可见循环数无明显差距，循环数变异系数均小于2％，表明本发明犬腺病毒、I型和II型犬腺病毒三重实时荧光定量PCR检测方法的重复性较好。

表4犬腺病毒、犬腺病毒I型和II型三重实时荧光定量PCR检测方法的重复性结果

实施例4、犬腺病毒I型和犬腺病毒II型的定量检测和鉴别

参考实施例2步骤三的方法，本实施例单独使用组B的引物(引物对CAV-I/II-F和CAV-I/II-R)和TaqMan探针(CAV-I-P和CAV-II-P)，对I型和II型犬腺病毒进行实时荧光定量PCR检测和鉴别。其中，25μL实时荧光定量PCR的检测体系包括：模板5μL，2×AceQ qPCRProbe Master Mix 12.5μL，CAV-I/II-F(10μM)1.0μL，CAV-I/II-R(10μM)1.0μL，CAV-I-P(10μM)0.75μL，CAV-II-P(10μM)0.75μL，RNA-free H₂O 4μL。实时荧光定量PCR的反应程序为(定量PCR仪，型号CFX96，购自美国伯乐)：预变性95℃10min；PCR扩增程序：94℃5s，56℃30s，45个循环。在每个循环的退火结束时进行荧光信号检测。

结果判定为：在35个循环内(不包括第35个循环)，若FAM通道出现“S”型扩增曲线表明待测样品中含有II型犬腺病毒，若ROX通道出现“S”型扩增曲线表明待测样品中含有I型犬腺病毒，若ROX通道和FAM通道均出现“S”型扩增曲线表明待测样品中含有犬腺病毒I型和II型。以上任一判定均确认为CAV阳性，如此可以省略使用针对犬腺病毒的通用检测引物和探针(组A)。若38个循环以上(包括38个循环)通道中均未出现“S”型扩增曲线，则确认为CAV阴性。若任一通道在35-38个循环(包括第35个循环，不包括第38个循环)出现“S”型扩增曲线，则判定为可疑，需重检。

实施例5、CAV、CAV-I和CAV-II的实时荧光定量PCR检测试剂盒

一、本实施例提供的CAV、CAV-I和CAV-II的三重实时荧光定量PCR检测及鉴别试剂盒包括：

实施例1中所示的用于对CAV、CAV-I和CAV-II进行三重实时荧光定量PCR检测的引物(CAV-F、CAV-R、CAV-I/II-F和CAV-I/II-R)和TaqMan探针(CAV-P、CAV-I-P和CAV-II-P)。

具体地，CAV、CAV-I和CAV-II的三重实时荧光定量PCR检测试剂盒包括以下用于25μL三重实时荧光定量PCR检测体系的试剂：2×AceQ qPCR Probe Master Mix 12.5μL，CAV-F(10μM)1.0μL，CAV-R(10μM)1.0μL，CAV-I/II-F(10μM)1.0μL，CAV-I/II-R(10μM)1.0μL，CAV-P(10μM)0.75μL，CAV-I-P(10μM)0.75μL，CAV-II-P(10μM)0.75μL，RNA-free H₂O 1.25μL。

为方便检测，试剂盒中还可包括阳性对照品和阴性对照品，阳性对照品为犬腺病毒I型和II型基因组DNA，其中各阳性对照品可以单一包装，也可以为混合包装；阴性对照为不含I型和II型犬腺病毒的反应体系，如H₂O(双蒸水、无菌去离子水等)。使用该试剂盒对CAV、CAV-I和CAV-II进行三重实时荧光定量PCR检测时，将单一包装的阳性对照品混合或直接使用混合包装的阳性对照品。

为方便检测，试剂盒中还可包括标准品，其为分别携带CAV、CAV-I和CAV-II的目标检测基因Hexon基因的pCR TOPO-CAV/pCR TOPO-CAV-I/pCR TOPO-CAV-II重组质粒(参见实施例2)，各标准品可为单独包装，也可等浓度混合包装；使用该试剂盒对CAV、CAV-I和CAV-II进行三重实时荧光定量PCR检测时，将单一包装的标准品等浓度混合或直接使用混合包装的标准品。

为方便检测，试剂盒中还可包括实施例2获得的标准曲线和说明书，该说明书内容包括PCR反应程序：预变性95℃10min；PCR扩增程序：94℃5s，56℃30s，45个循环。

二、本实施例提供的CAV-I和CAV-II的实时荧光定量PCR检测及鉴别试剂盒包括：

实施例1中所示的用于对CAV-I和CAV-II进行实时荧光定量PCR检测和鉴别的引物(CAV-I/II-F和CAV-I/II-R)和TaqMan探针(CAV-I-P和CAV-II-P)。

使用该试剂盒时的25μL实时荧光定量PCR的检测体系包括：模板5μL，2×AceQqPCR Probe Master Mix 12.5μL，CAV-I/II-F(10μM)1.0μL，CAV-I/II-R(10μM)1.0μL，CAV-I-P(10μM)0.75μL，CAV-II-P(10μM)0.75μL，RNA-free H₂O 4μL。

为了方便检测，所述试剂盒中还包括阳性对照品和阴性对照品，阳性对照品为I型和II型犬腺病毒DNA，各阳性对照品为单一包装或混合包装，阴性对照品为不含I型和II型犬腺病毒的反应体系，如H₂O(双蒸水、无菌去离子水等)；使用所述试剂盒对I型和II型犬腺病毒进行实时荧光定量PCR检测时，将单一包装的阳性对照品混合或直接使用混合包装的阳性对照品；

为了方便检测，所述试剂盒中还包括标准品，其为分别携带I型和II型犬腺病毒检测基因的重组质粒pCR TOPO-CAV-I和pCR TOPO-CAV-II；各标准品为单一包装或等浓度混合包装；使用所述试剂盒对I型和II型犬腺病毒进行实时荧光定量PCR检测时，将单一包装的标准品等浓度混合或直接使用混合包装的标准品。

为方便检测，试剂盒中还可包括PCR反应程序：预变性95℃10min；PCR扩增程序：94℃5s，56℃30s，45个循环，以及实施例4的判定方法。

实施例6、疫苗生产过程中对疫苗半成品中抗原的实时荧光定量PCR检测

使用实施例5的试剂盒对CAV疫苗生产中半成品样品中疫苗抗原CAV、I型和II型CAV含量进行检测。待检样品为CAV疫苗半成品1-14号，检测结果如下表5所示。

表5 14份CAV疫苗半成品样品检测结果

根据上表5的定量检测结果，拷贝数达到10⁵的半成品苗可进行成品苗的配制，而拷贝数低于10⁵或无拷贝数的样品(S10、S12、S13、S14)病毒含量不足，不能进行成品苗的配制；且S1-S6为CAV-II型，属于弱毒株，可用于配制成品苗，S7-S9、S11为CAV-I型，属于强毒株，不能用于疫苗生产。因此，基于本发明提供的鉴别检测犬腺病毒I型和II型的多重实时荧光定量的引物和探针，可以保证疫苗生产的质量以及安全。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 金宇保灵生物药品有限公司

<120> 犬腺病毒、犬腺病毒I型和犬腺病毒II型的实时荧光定量PCR检测及鉴别引物和探针

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ccactgarag gtckcagcgc 20

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agtargtact ggccatgtcc ag 22

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gatgtaaatg accagtcctt tgc 23

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agtaggggtc gtaaggtgag c 21

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gatggccagt acacttacaa aacccg 26

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gtctgccgcc aacatgcttt atccg 25

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gtcttctgcc aacatgcttt atccc 25

<210> 8

<211> 2718

<212> DNA

<213> 犬腺病毒I型(Canine adenovirus type 1)

<400> 8

atggcaactc cgtcgatgct gccacaatgg tcttacatgc acattgctgg ccaggacgcc 60

gccgaatact tgtctcccgc cctggttcag tttgcccaag caaccagttc ttactttaag 120

ttggacaaca agttcagaaa ccccactgtg gcccccactc acgatgtaac cactgaaagg 180

tctcagcgct tgcagttgcg ctttgtgcca gttatgcaag aagatggcca gtacacttac 240

aaaacccggt tccaattggc agtgggagat aacagggttc tggacatggc cagtacctac 300

tttgacatta ggggcaccct agacagaggc ccctccttca agccctacag tgggacggct 360

tacaatgctc tcgctcccag agctggggct aataactgcc tatttaatgg atcaggtgcc 420

aacattaaca ctttagccca agtgccattt gcgggcgcca ttaccgttaa tggtcaagcc 480

gcagtcacag acaacaccta ccagccagag ccccagctgg gccctgaaag ttgggtggat 540

ggcaccttgg cagacctagg agatgcgtct ggccgcgccc tgaaagcatc gaccccacgc 600

atgccttgct acggttctta tgctcccccc accaatgaaa acggaggtca agcaactggg 660

gccgtggaac gaagattcta taaagtgacc accaacaata ataatgaagc tgatgcccta 720

ctatatacag aagatgtgaa cctccaaacc ccagacaccc acttggtgca tcaggtgtca 780

gacgatcagg ttacaggtgt acagggactg gggcaacaag ctgccccaaa caggccaaat 840

tacattggct ttagagataa ctttataggt ttaatgtatt acaatagtaa tggaaaccta 900

ggggtgctgg cgggtcaatc gtctcaacta aatgccgtgg tggacttgca agacagaaac 960

acagagcttt cttatcagct gttgctagat gcccttacag acaggtctcg ctacttttcc 1020

atgtggaacc aggcagtaga tagctatgac caggatgtca ggattattga caatcacggc 1080

gtggaagacg acatgccaaa ctattgcttc ccactgagcg gcatgggacc attaactaac 1140

atgacagcta tgaaggtcaa tagtcaaaac tttcaaacgg acaacactaa cgtgggtccc 1200

attcaaaaga ttggtttcgg aaatgttgag gccatggaga taaatctcaa tgctaacctc 1260

tttaaaggtt ttctctactc caatgtggcc ctatacctac ctgatgccta taaatacaca 1320

cctgataaca ttgtagctcc tgctaatgca aatacctatg cttacatgaa tgtgagattg 1380

cccgctgcta accttataga cacatttgta aatattggcg ccagatggtc acctgatgta 1440

atggactctg ttaatccttt taaccaccac agaaatgcag gactccgcta ccgatcacag 1500

ctgcttggca atggccgcta ttgctcgttc catattcagg tccctcaaaa attttttgca 1560

atcaaaaatc ttctccttct accgggtacg tacacgtacg agtggtcttt caggaaggat 1620

gtaaacatga tccttcagag cagcttgggc aatgacctcc gagtggatgg agcctctatc 1680

aacattcaaa gcatcaacct atatgccagc tttttcccca tggcacacaa cacagcctcc 1740

actttggaag ccatgctgcg caatgatgta aatgaccagt cctttgcaga ctacctgtct 1800

gccgccaaca tgctttatcc gatccctgcc aacactacaa acctaccaat ctccattcct 1860

gccagaaatt gggccggatt cagagggtgg agctttacca gaattaagca gcgggaaact 1920

ccagccctgg gctcacctta cgacccctac tttacttact cgggtagcat tccctacctg 1980

gattcaactt tctatcttag ccacaccttc agaagagtct ccatcatgtt tgactcttct 2040

gtatcttggc cgggtaatga caggctcctc actccaaatg agtttgagat taaaaggtat 2100

gtggacggtg aaggctacaa cgtggcccag tccaacatga caaaagattg gtttctggtt 2160

caaatgctgg ctcattacaa cattggctat caaggctacc acttgcccga gagctacaaa 2220

gacagaatgt actcattcct cagaaatttt gagcccatgt gcagacaatt ggtagatgta 2280

actaactatg ctacctacca gtcagtcacc gtaggtcacc agcataacaa ttctggatat 2340

gctagcgccc tttcaacctt taacccaagg gagggtcacc cctatccggc aaactggcct 2400

tatcccctaa tcggggtcaa tgctgtgcct actgttaccc aaaaaaagtt cctttgtgac 2460

agaaccctat ggcgcatccc cttctcttcc aactttatgt ctatgggcac cctcactgac 2520

cttggtcaaa acctgctgta ctccaactcc gctcacgccc ttgacatgac tttcgaggtt 2580

gatgccatga atgagcccac tctgttgtac gttttgtttg aagtgttcga cgtggcacgt 2640

gttcatcaac cccaccgagg ggtgattgaa gtagtgtacc tcagaactcc cttctccgcc 2700

ggcaacgcca cgacctaa 2718

<210> 9

<211> 2718

<212> DNA

<213> 犬腺病毒II型(Canine adenovirus type 2)

<400> 9

atggcaaccc cgtcgatgct gccacaatgg tcttacatgc acattgctgg ccaggacgcc 60

gccgaatact tgtctcccgc cctggttcag tttgcccaag caaccagttc ttactttaag 120

ttggacaaca agttcagaaa ccccactgtg gcccccaccc acgatgtgac cactgagagg 180

tcgcagcgct tgcagctgcg ctttgtgcca gtcatgcaag aggatggcca gtacacttac 240

aaaacccgct tccagcttgc ggtgggagac aacagggtgc tggacatggc cagtacttac 300

ttcgatatca ggggtaccct agacagaggc ccctccttca agccttacag cggcaccgcc 360

tacaatgccc tcgcccccaa ggccggggct aacaactgtc tttttaatgg acagggtgcc 420

aatattaaca ctttagccca ggtgccctct gcaggtgcca taactgtgaa tggccaagct 480

gctgtcacaa acaataccta ccagccagag ccccagctgg gccctgaaag ctgggtcgat 540

ggcagcctaa cagagctggg agatgcgtct ggccgtgccc ttaaggcttc aaccccgcgc 600

atgccttgct atggttccta tgctcccccc accaacgaaa atggaggtca agcaactggt 660

ccagtggaat ccagatttta taaggtgacc accaacaata acaatgaagc agatgccatg 720

ctatacactg aagatgtaaa cctgcaggcc ccagacaccc acctggtgca ccaagtgcca 780

gagggtcagg ttacaggggt gcaagggctg ggccagcagg ctgcgcccaa caggccgaac 840

tacataggct tcagggacaa cttcataggc ctcatgtact acaatagtaa tggaaaccta 900

ggggtgctgg cgggtcagtc atctcagctc aatgccgtgg tggacttgca agacagaaac 960

acagagctct cttaccagct gctgctggat gccctcacag acaggtcccg ctacttttcc 1020

atgtggaacc aggctgtaga tagctatgac caggatgtta ggattattga caaccatggc 1080

gtggaagatg atatgcccaa ctattgctac ccactgagcg gcatggggcc cctaacaaac 1140

atgaccacca tgaaggttaa caaccaaaac tttcaggcag aaaataccaa tgtggggccc 1200

attcaaaaga ttggttttgg aaatgttgag gccatggaaa tcaacctcaa tgccaacctc 1260

ttcaaaagct tcctttactc caatgtggcc ttatacttgc ctgatgcctt taaatacaca 1320

cctgaaaaca ttgtggcccc tgccaatgtg aatacctatg cttacatgaa tgttagatta 1380

cccgccgcca accttataga taccttcgta aatattggcg ccagatggtc accagatgta 1440

atggacactg ttaatccttt caaccaccac agaaatgcag gactccgcta ccgttcacaa 1500

ctgcttggca atggccgcta ttgctcgttc catattcagg tccctcaaaa attttttgca 1560

atcaaaaatc tcctcctact gcctggaacg tacacgtacg agtggtcttt cagaaaggat 1620

gtaaacatga tccttcaaag cagcttgggc aatgacctcc gagtggatgg ggccaccatc 1680

aacattcaga gcatcaacct atatgcaagc ttttttccaa tggcacacaa cactgcctcc 1740

actctggaag ccatgctgcg caacgatgta aatgaccagt cctttgcaga ctacctgtct 1800

tctgccaaca tgctttatcc catccctgcc aacactacta acctgccaat ttccattccc 1860

gctagaaact gggcgggatt tagagggtgg agctttacca gaattaagca acgagaaact 1920

cctgccctgg gctcgcctta tgatccctac ttcacttact cgggcagtat tccatatctg 1980

gatgcaactt tttacctcag ccacaccttt agaagagttt ccatcatgtt tgactcttca 2040

gtgtcttggc ctggcaatga caggctgctt acccccaatg agtttgagat taaaaggtat 2100

gtagacggtg aaggttacaa tgtggcccag tccaacatga caaaagactg gtttatggtt 2160

caaatgctag cccactacaa catcggctac caaggctacc acctgccaga aagctacaag 2220

gacagaatgt actccttcct aagaaacttt gagcccatgt gcagacagtt ggtggacgtg 2280

gccaactatg ctgcgtacca gccagttacc gtgggccacc agcataacaa ttctggttat 2340

gctagcgccc tttcggcctt taacccacgt gagggacacc catacccagc aaactggcct 2400

tacccactca ttggagccaa tgcagtaccc actgtcaccc agaaaaagtt tctctgcgac 2460

aggtccctgt ggcgcatccc attctcctcc aactttatgt ctatgggaac ccttactgac 2520

ctgggccaaa acctgctgta ctctaactcc gcccacgccc ttgacatgac ttttgaggtt 2580

gatgccatga atgagcccac tctgttgtac gttttgtttg aagtgttcga cgtggcacgc 2640

gtccatcagc cccaccgggg ggtgattgag gtagtgtacc tcagaactcc cttctccgcc 2700

ggcaacgcca ccacctaa 2718

<210> 10

<211> 187

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gatgtaaatg accagtcctt tgcagactac ctgtctgccg ccaacatgct ttatccgatc 60

cctgccaaca ctacaaacct accaatctcc attcctgcca gaaattgggc cggattcaga 120

gggtggagct ttaccagaat taagcagcgg gaaactccag ccctgggctc accttacgac 180

ccctact 187

<210> 11

<211> 132

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ccactgagag gtcgcagcgc ttgcagctgc gctttgtgcc agtcatgcaa gaggatggcc 60

agtacactta caaaacccgc ttccagcttg cggtgggaga caacagggtg ctggacatgg 120

ccagtactta ct 132

Claims

1.用于对I型和II型犬腺病毒进行实时荧光定量PCR检测及鉴别的引物和TaqMan探针组，其特征在于，包含：

2.用于对I型和II型犬腺病毒进行实时荧光定量PCR检测及鉴别的试剂盒，其特征在于：

包括权利要求1所述的引物和TaqMan探针组；

3.用于对犬腺病毒、I型和II型犬腺病毒进行三重实时荧光定量PCR检测及鉴别的引物和TaqMan探针组合，其特征在于，包含：

用于检测犬腺病毒的上游引物(CAV-F)和下游引物(CAV-R)，其中所述上游引物(CAV-F)的核苷酸序列如SED ID NO：1所示，所述下游引物(CAV-R)的核苷酸序列如SED ID NO：2所示；

权利要求1所述的用于对I型和II型犬腺病毒进行实时荧光定量PCR检测及鉴别的引物和TaqMan探针组。

4.用于对犬腺病毒、I型和II型犬腺病毒进行三重实时荧光定量PCR检测及鉴别试剂盒，其特征在于：

包括权利要求3所述的引物和TaqMan探针组合；

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括阳性对照品和阴性对照品，阳性对照品为I型和II型犬腺病毒DNA，各阳性对照品为单一包装或混合包装，阴性对照品为不含I型和II型犬腺病毒的反应体系，如H₂O(双蒸水、无菌去离子水等)；使用所述试剂盒对犬腺病毒、I型和II型犬腺病毒进行三重实时荧光定量PCR检测时，将单一包装的阳性对照品混合或直接使用混合包装的阳性对照品；

6.权利要求1所述的引物和TaqMan探针组、权利要求3所述的引物和TaqMan探针组合或权利要求2、4或5所述的试剂盒在对犬腺病毒、I型和II型犬腺病毒进行非疾病诊断目的的检测中的应用。

7.根据权利要求6所述的检测应用，其特征在于：

为用实时荧光定量PCR技术对犬腺病毒、I型和II型犬腺病毒进行非疾病诊断目的的定性、定量检测方法，包括以下步骤：

1)建立标准曲线：将分别携带犬腺病毒、I型和II型犬腺病毒的检测基因的重组质粒pCR TOPO-CAV、pCR TOPO-CAV-I和pCR TOPO-CAV-II的单一包装的标准品等浓度混合或直接使用等浓度混合包装的标准品，按照10倍梯度将混合液中各标准品浓度稀释至1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10¹copies/μL；以不同浓度的标准品混合液作为模板，在权利要求3所述的引物和TaqMan探针组合的引导下进行三重实时荧光定量PCR检测，检测结束后，以各标准品的浓度Log值(X轴)对其相应Ct值(Y轴)作图，绘制标准曲线；

2)提取待测样品的基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板，在权利要求3所述的引物和TaqMan探针组合的引导下进行三重实时荧光定量PCR检测；

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：

所述步骤1)和步骤2)中的25μL实时荧光定量PCR检测体系包括：模板5μL，实时荧光定量PCR反应液2×AceQ qPCR Probe Master Mix 12.5μL，CAV-F(10μM)1.0μL，CAV-R(10μM)1.0μL，CAV-I/II-F(10μM)1.0μL，CAV-I/II-R(10μM)1.0μL，CAV-P(10μM)0.75μL，CAV-I-P(10μM)0.75μL，CAV-II-P(10μM)0.75μL，RNA-free H₂O 1.25μL；

所述步骤1)和步骤2)中的三重实时荧光定量PCR检测条件为：先95℃10min；然后94℃5s，56℃30s，45个循环。

9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于：

所述步骤3)中的判定方法为：

10.根据权利要求6所述的检测应用，其特征在于：

为用实时荧光定量PCR技术对I型和II型犬腺病毒进行非疾病诊断目的的定性、定量检测方法，包括以下步骤：

1)建立标准曲线：将分别携带I型和II型犬腺病毒的检测基因的重组质粒pCR TOPO-CAV-I和pCR TOPO-CAV-II的单一包装的标准品等浓度混合或直接使用等浓度混合包装的标准品，按照10倍梯度将混合液中各标准品浓度稀释至1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10¹copies/μL；以不同浓度的标准品混合液作为模板，在权利要求1所述的引物和TaqMan探针组的引导下进行实时荧光定量PCR检测，检测结束后，以各标准品的浓度Log值(X轴)对其相应Ct值(Y轴)作图，绘制标准曲线；

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于：

所述步骤1)和步骤2)中的25μL实时荧光定量PCR检测体系包括：模板5μL，实时荧光定量PCR反应液2×AceQ qPCR Probe Master Mix 12.5μL，CAV-I/II-F(10μM)1.0μL，CAV-I/II-R(10μM)1.0μL，CAV-I-P(10μM)0.75μL，CAV-II-P(10μM)0.75μL，RNA-free H₂O 4μL；

所述步骤1)和步骤2)中的实时荧光定量PCR检测条件为：先95℃10min；然后94℃5s，56℃30s，45个循环。

12.根据权利要求10或11所述的应用，其特征在于：

所述步骤3)中的判定方法为：

13.根据权利要求7-12中任一项所述的应用，其特征在于，所述待测样品包括用于疫苗生产的原料、疫苗半成品及成品。