CN111334613A

CN111334613A - 用于检测犬腺病毒的rpa引物对、探针、试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN111334613A
Application number: CN202010301308.5A
Authority: CN
Inventors: 练月晓; 丛锋; 黄韧; 朱才毅
Original assignee: Guangzhou Qianxun Biotechnology Co ltd; Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute
Current assignee: Guangzhou Qianxun Biotechnology Co ltd; Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute
Priority date: 2020-04-16
Filing date: 2020-04-16
Publication date: 2020-06-26
Anticipated expiration: 2040-04-16
Also published as: CN111334613B

Abstract

本发明公开了一种用于检测犬腺病毒的RPA引物对、探针、试剂盒及检测方法，属于分子生物学检测技术领域。本发明提供的犬腺病毒RPA实时荧光检测方法，扩增特异性强，且敏感度高，灵敏度可以达到10²拷贝。本发明的引物对和探针是针对犬腺病毒(CAV)E3基因序列设计筛选获得的，因此扩增更高效，特异性更强。本发明RPA方法简单，对温度和机器要求低，用时短，适合实验室或现场快速检测，为犬腺病毒快速检测诊断及防控提供了技术参考。

Description

用于检测犬腺病毒的RPA引物对、探针、试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及一种用于检测犬腺病毒的RPA引物对、探针、试剂盒及检测方法，属于分子生物学检测技术领域。

背景技术

犬腺病毒可分为犬腺病毒1型(Canine adenovirus type 1，CAV-1)和犬腺病毒2型(Canine adenovirus type 2，CAV-2)，犬腺病毒1型又称传染性肝炎、狐脑炎病毒、罗巴斯病病毒，是由犬腺病毒1型引起犬等动物的一种急性败血性传染病。主要发生于犬，也可见于其他犬科、鼬科、熊科动物。在犬主要表现肝炎和循环障碍，在狐狸、熊则表现为脑炎。犬腺病毒在分类上属于腺病毒科(Adenoviridae)，哺乳动物腺病毒属(Mastadenovirus)。犬腺病毒自然感染潜伏期6-9天，最急性病例，在呕吐，腹痛和腹泻等症状出现后数小时内死亡。急性型病例，患犬怕冷，体温升高(39.4-41.1℃)，精神抑郁，食欲废绝，渴欲增加，呕吐，腹泻，粪中带血。亚急性病例症状轻微咽炎和喉炎可致扁桃体肿大；颈淋巴结发炎可致头颈部水肿。特征性症状是角膜水肿，即“蓝眼”病。眼疼痛反射通常在角膜完全浑浊后逐渐减弱，但若发展为青光眼或角膜穿孔则病情加剧。慢性病例多发于老疫区或疫病流行后期，多不死亡，可以治愈。犬腺病毒对犬尤其是1年内的幼犬有严重危害，能引起犬的肝、胆、肾、淋巴器官的病变。还能引起犬的血象变化，如白细胞和血小板减少等，可对相关实验数据造成误差。此外，大剂量接种可使豚鼠感染，以豚鼠作为实验动物也存在潜在影响。犬腺病毒2型(Canine adenovirus type 2，CAV-2)可引起犬的传染性喉气管炎，临床表现为持续高热、咳嗽、浆液-黏液性鼻漏、扁桃体炎、喉气管炎和肺炎，还能引起腹泻。犬腺病毒2型代表株多伦多A26/61的基因组大小为31323bp，与犬腺病毒1型的同源性为89％，基因组分区和犬腺病毒1型相似，犬腺病毒1型和2型的E3区两侧的基因高度同源，表现在犬腺病毒2型的E3区比犬腺病毒1型长500bp。犬腺病毒对幼犬的危害非常大，感染率近几年有上升的趋势，因此建立一种及时、准确的检测技术，对该病的防控具有十分重要的意义。

目前，诊断犬腺病毒的实验方法有病毒分离法、PCR法，包括普通PCR方法和荧光定量PCR方法、间接免疫荧光法、琼脂扩散试验法(AGP)、HA/HI、补体结合实验、中和试验和ELISA方法，还有最近发展的环介导等温扩增方法(LAMP)。其中，PCR方法因其简便快捷而被广泛使用的检测方法，传统诊断犬腺病毒的方法依赖于PCR检测方法。但操作时间过长且对操作要求高。LAMP方法是一种等温扩增利用2对引物的方法，但引物设计麻烦且假阳性率高。

重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification RPA)是近年来发展起来的一种快速诊断不同病原的方法，已广泛用于病毒、细菌、寄生虫诊断中。RPA利用重组酶蛋白与引物形成复合物；该复合物促进引物与双链DNA的同源靶序列的结合，聚合酶进行后续的合成，整个过程仅需在37-42℃下反应20-30分钟即可。与普通PCR方法和荧光定量PCR方法相比，整个过程不需要高温变性和低温退火步骤，操作简单，不需要昂贵的仪器。与传统的CAV诊断方法相比，反应时间快。RPA引物比一般PCR引物长，通常需要达到30-35个碱基，扩增产物在300bp以内。

目前国内外尚无采用实时荧光RPA检测CAV的报道，因此建立快速准确的检测犬腺病毒CAV的RPA方法非常有必要。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明提供一种用于检测犬腺病毒的RPA引物对、探针、试剂盒及检测方法。本发明针对犬腺病毒的E3序列，设计特异引物对、探针，建立了实时荧光RPA检测方法，为犬腺病毒的快速诊断及防控提供了技术参考。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种用于检测犬腺病毒的RPA引物对，所述RPA引物对上、下游引物序列分别如SEQID No.1和SEQ ID No.2所示：

F:5′-TAATTTCATTACCTTCAACATAACTGTACC-3′(SEQ ID No.1)；

R:5′-TTTAAACAGAGTCCATTCCATAAAACTGTC-3′(SEQ ID No.2)。

本发明还提供一种用于检测犬腺病毒的RPA荧光探针，其序列如SEQ ID No.3所示：

5′-CAACTGGCAACAAAATCTAGTAGCCATATTT_FNAT_QCAACACGAGCCCCCAAAAATG-3′(SEQ IDNo.3)。

其中T_F表示连接有荧光基团的T，T_Q表示连接有淬灭基团的T，T_F和T_Q之间的碱基N用四氢呋喃残基THF替换，3′末端标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团。

所述荧光基团为FAM、HEX、TET、JOE或VIC中的任一种；所述荧光淬灭基团为BHQ1、BHQ2或BHQ3中的任一种。

优选地，修饰后的探针序列为：CAACTGGCAACAAAATCTAGTAGCCATATT[FAM-dT][THF]A[BHQ1-dT]CAACACGAGCCCCCAAAAATG(C3spacer)。

在RPA体系中引入一个带有荧光标记的探针，一方面可以提高RPA检测的特异性，另一方面还能实现对RPA扩增进行实时监控。

本发明还提供一种用于检测犬腺病毒的RPA试剂盒，包含上述的RPA引物对和RPA荧光探针。

所述的RPA试剂盒，还包括其他重组酶聚合酶扩增(RPA)所需试剂：酶、dNTP、Buffer、MgOA等；

所述的RPA试剂盒，还包括其阴性对照和阳性对照；所述阴性对照品为水空白对照；所述阳性对照品为犬腺病毒，浓度是1μg/mL。

所述的RPA试剂盒中的试剂还可以采用市售商品试剂。

本发明还提供一种用于检测犬腺病毒的实时荧光RPA方法，步骤如下：

(1)提取待测样本DNA作为模板；

(2)用本发明的引物对及荧光探针对步骤(1)所得模板及对照样品进行RPA扩增；

(3)根据荧光信号即可快速实现病毒检测。

优选地，所述步骤(2)用本发明所述的RPA引物对及RPA荧光探针对步骤(1)所得模板及对照样品进行RPA扩增；具体地，采用50uL反应体系进行RPA反应：反应体系包括420nM正向引物，420nM反向引物，120nM探针，1uL病毒DNA和280mM镁离子。RPA反应在39℃下在实时恒温荧光检测器中扩增20-30分钟。

所述样本取自血液、咽拭子、肺部组织、肠内容物、粪便、直肠拭子等。

本发明具有如下有益效果：

1、本发明首次采用实时荧光RPA检测CAV。本发明提供的犬腺病毒RPA实时荧光检测方法，扩增特异性强，且敏感度高。本发明检测方法的灵敏度可以达到10²拷贝。

2、本发明的引物对和探针是针对犬腺病毒E3基因序列设计筛选获得的，因此扩增更高效，特异性更高。

3、本发明RPA实时荧光检测方法简单，对温度和机器要求低，用时短，适合实验室或现场快速检测。本发明为犬腺病毒快速检测诊断及防控提供了技术参考。

附图说明

图1为实施例1用于检测犬腺病毒的RPA引物对筛选结果。

图2为本发明检测犬腺病毒的RPA方法特异性试验结果。

图3为本发明检测犬腺病毒的RPA方法灵敏度试验结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明做进一步说明，但本发明不限于此。本发明中所涉及的方法，如无特殊说明均为本领域常用方法，所涉及的试剂，如无特殊说明均可以从商业途径获得。

实施例1.用于检测犬腺病毒的RPA引物对、探针的设计及筛选

1.病毒DNA的提取

按TIANGEN公司TIANamp Genomic DNAKit血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒说明书对CAV进行DNA提取。将200μL病毒溶液加入1.5mL离心管中，加入20μL蛋白酶K和200μL buffer GB，摇动混合物并混合。在56℃水浴15分钟后，加入200μL无水乙醇，转移到管中，并以8000转/分钟离心1分钟。将洗涤溶液洗涤两次，然后加入TE，在室温下放置5分钟并离心以获得DNA。

2.目的基因的克隆

使用PCR方法扩增E3基因，扩增体系为：95℃/15min预变性，94℃/30Sec，55℃/30Sec和72℃/90Sec 35个循环，72℃延伸10分钟。通过琼脂糖凝胶电泳回收PCR目的产物，按照OMEGA公司

Gel Extraction Kit试剂盒说明书进行回收。

将4.5μL回收产物与0.5μLpMD-18T vector、5μL solution I总体积共10μL混匀，放4℃连接过夜克隆到pMD-18T载体中，构建质粒。

将10μL连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞中：将10μL连接产物加入100μL感受态细胞中轻轻混匀，冰浴30min；金属浴42℃热激90Sec后冰浴5min；加入1mL LB培养基后在200rpm，37℃的摇床上摇1h；涂布含有氨苄抗性的平板，挑取阳性菌落扩大培养。

按照OMEGA公司的

PlasmidMini Kit I试剂盒说明书进行提取。

3.RPA引物和探针的设计

根据TwistDX设计指南的建议，从NCBI下载CAV序列(登录号:KU755728.1)并使用DNA star基于E3基因序列设计CAV特异性RPA引物和探针。设计引物的长度范围为30至35个碱基，探针长度范围为48至52个碱基。RPA探针应该有四个基团，包括荧光基团，猝灭基团，四氢呋喃(THF)和3端封闭(C3spacer)。所有引物和探针均在设计完成后由上海生工生物工程有限公司合成。

根据引物设计和筛选原则，筛选出1组引物对和1条探针，如下表1：

表1

从图1看出引物对1的扩增效果好，扩增开始时间最快且扩增曲线呈现“S”曲线。

实施例2.用于检测犬腺病毒的RPA方法的建立

使用TwistAmp^TM试剂盒(TwistDX，Cambridge，United Kingdom)以50uL体积进行RPA反应。包括420nM正向引物，420nM反向引物，120nM荧光探针，1uL病毒DNA和280mM镁离子。RPA反应在39℃下在实时恒温荧光检测器(DEAOU Biotechnology，China)中扩增30分钟。

从图1看出本发明RPA方法扩增效果好。

实施例3、本发明检测犬腺病毒的RPA方法特异性试验与灵敏度试验

3.1方法

特异性试验：通过测试含有阳性核酸的CAV以及来自其他病原体的其他核酸，包括犬冠状病毒CCV，犬细小病毒CPV，犬瘟热病毒CDV来确定构建的实时RPA方法的特异性。灵敏度试验：使用质粒稀释的标准品，用easy dilution以10倍的比例稀释至4个浓度，模板为1*10⁵copies/μL至1*10²copies/μL进行方法的灵敏度分析。

3.2结果

通过检测CAV阳性核酸以及其它病原病毒(CDV、CCV、CPV)来检测构建的实时RPA方法的特异性，ddH₂O做空白对照。从图2显示，除了CAV扩增之外，其他阴性核酸没有扩增，证明该方法特异性良好，与其他病原没有交叉反应。

CAV阳性标准品10倍比例稀释用做模板进行RPA检测，模板浓度从1*10⁵copies/μL～1*10²copies/μL，共4个梯度，ddH₂O做空白对照，检测方法的灵敏度。从图3可以看出，最低检测值为1*10²copies/μL。

实施例4、本发明检测犬腺病毒的RPA方法用于临床样品的检测实验

为了评估构建的CAV实时RPA方法的实用性，检测23例疑似CAV感染的临床样本，同时使用常规实时PCR测定法。结果显示，23例疑似CAV感染的临床样本中采用本发明RPA方法的阳性检出率为22％(5/23)，与常规实时PCR的阳性检出率一致。说明两种方法的阳性样品和阴性样品的一致性为100％，证明本发明方法可替代常规实时PCR方法对犬腺病毒进行快速、准确检测。

表2

实施例5、一种检测犬腺病毒的RPA试剂盒

该试剂盒包括：

(1)序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的引物对和序列如SEQ ID No.13所示的探针。

(2)阳性对照、阴性对照及RPA扩增试剂。

所述RT-RPA扩增试剂包括：酶、dNTP、Buffer、MgOA等；所述阴性对照品为水空白对照；所述阳性对照品为犬腺病毒，浓度是1μg/mL。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东省实验动物监测所

广州千寻生物技术有限公司

<120> 用于检测犬腺病毒1型的RPA引物对、探针、试剂盒及检测方法

<130>

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 1

taatttcatt accttcaaca taactgtacc 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 2

tttaaacaga gtccattcca taaaactgtc 30

<210> 3

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<220>

<221> misc_feature

<222> (32)..(32)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 3

caactggcaa caaaatctag tagccatatt tnatcaacac gagcccccaa aaatg 55

Claims

1.一种用于检测犬腺病毒的RPA引物对，其特征是，所述RPA引物对上、下游引物序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。

2.一种用于检测犬腺病毒的RPA荧光探针，其序列如SEQ ID No.3所示：

5′-CAACTGGCAACAAAATCTAGTAGCCATATTT_FNAT_QCAACACGAGCCCCCAAAAATG-3′；其中T_F表示连接有荧光基团的T，T_Q表示连接有淬灭基团的T，T_F和T_Q之间的碱基N用四氢呋喃残基THF替换，3′末端标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团。

3.如权利要求2所述的用于检测犬腺病毒的RPA荧光探针，其特征是，所述荧光基团为FAM、HEX、TET、JOE或VIC中的任一种；所述荧光淬灭基团为BHQ1、BHQ2或BHQ3中的任一种。

4.如权利要求3所述的用于检测犬腺病毒的RPA荧光探针，其特征是，所述探针序列为：CAACTGGCAACAAAATCTAGTAGCCATATT[FAM-dT][THF]A[BHQ1-dT]CAACACGAGCCCCCAAAAATG-C3spacer。

5.一种用于检测犬腺病毒的RPA试剂盒，其特征是，包含权利要求1所述的RPA引物对和权利要求2-4任一所述的RPA荧光探针。

6.如权利要求5所述的RPA试剂盒，其特征是，所述试剂盒还包括酶、dNTP、Buffer、MgOA及其他RPA所需试剂。

7.如权利要求5或6所述的RPA试剂盒，其特征是，所述试剂盒还包括阴性对照和阳性对照；所述阴性对照品为水空白对照；所述阳性对照品为犬腺病毒。

8.一种用于检测犬腺病毒的实时荧光RPA方法，其特征是，步骤如下：

(1)提取待测样本DNA作为模板；

(2)权利要求1所述的引物对及权利要求2-4任一所述的荧光探针对步骤(1)所得模板及对照样品进行RPA扩增；

(3)根据荧光信号即可快速实现病毒检测。

9.如权利要求8所述的方法，其特征是，所述步骤(2)采用50uL反应体系进行RPA反应：反应体系包括420nM正向引物，420nM反向引物，120nM探针，1uL病毒DNA和280mM镁离子；RPA反应在39℃下在实时恒温荧光检测器中扩增20-30分钟。

10.如权利要求8所述的方法，其特征是，所述样本取自血液、咽拭子、肺部组织、肠内容物、粪便、直肠拭子等。