CN110106285B

CN110106285B - 一种快速检测3型人腺病毒的含内参双重等温核酸扩增方法

Info

Publication number: CN110106285B
Application number: CN201910209269.3A
Authority: CN
Inventors: 马学军; 申辛欣; 王智宏; 应清界; 张益�; 王佶; 李鑫娜; 王瑞欢
Original assignee: Jiangsu Qitian Gene Biotechnology Co ltd; National Institute for Viral Disease Control and Prevention Chinese Center for Disease Control and Prevention
Current assignee: Jiangsu Qitian Gene Biotechnology Co ltd; National Institute for Viral Disease Control and Prevention Chinese Center for Disease Control and Prevention
Priority date: 2019-03-19
Filing date: 2019-03-19
Publication date: 2022-06-03
Anticipated expiration: 2039-03-19
Also published as: CN110106285A

Abstract

本发明提供了一种快速检测3型人腺病毒的含内参双重等温核酸扩增方法，属于等温核酸扩增技术领域。本发明首先通过对3型人腺病毒(HAdV‑3)基因测序和比对，设计了用于检测HAdV‑3的特异性引物对和探针，并设计了内参探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1‑4所示，在此基础上建立了含内参的双重等温核酸扩增体系，进一步构建了用于检测3型腺病毒的试剂盒。本发明方法在等温条件下进行，5‑20min内可实现同时对3型腺病毒和内参DNA的扩增，灵敏度高、特异性好、内参的加入排除了假阴性和无效结果，更适合应用于有大量样品的检测，便于临床上的应用，该方法适用于对3型腺病毒的快速检测。

Description

一种快速检测3型人腺病毒的含内参双重等温核酸扩增方法

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及用于检测3型人腺病毒的靶序列、特异性引物和靶探针，本发明还涉及利用特异性引物、靶探针、内参探针进行双重等温核酸扩增检测3型腺病毒的方法和试剂盒。

背景技术

人腺病毒(HAdV)常引起呼吸道系统感染、腹泻疾病、眼部感染以及生殖道和泌尿系统的感染等，不同亚属的病毒可引起不同的疾病，其中A、F和G主要引起消化道感染以呼吸道感染为主，B、C和E主要引起呼吸道感染，D亚属常常眼部结膜组织的感染。B和C亚属是世界范围内引起急性呼吸道感染的常见病原体，其中我国腺病毒感染暴发流行的主要型别是B亚属的HADV-3,也是全球最普遍流行的HAdV型别，几乎在各个国家都有其暴发或流行的报道。飞沫通过空气传播是腺病毒的主要传播途径，另外可通过粪口传播和接触传播。虽然腺病毒普遍易感，但HAdV-3是我国非缺陷儿童和成人的腺病毒重症肺炎的首要病原菌，通常引起的病情较重，甚至有生命危险，因此腺病毒的分型检测显得尤为重要。

人腺病毒是属于腺病毒科乳腺动物腺病毒属的一种无包膜球形的双链DNA病毒，目前对腺病毒的检测方法主要分为免疫学方法、病毒培养法和分子生物学检测法等方法。免疫学方法包括直接荧光法(DFA)和双抗体夹心酶链免疫法(ELISA)，两种方法都对设备等要求条件较低，可以快速检测出病毒，所以得到了较为广泛的应用，但却具有对于早期未产生抗体时的病情无法诊断和采血对人体造成创伤等缺点。病毒分离法是通过观察特征性细胞致病作用(CPE)来分离腺病毒，被认为是诊断腺病毒的“金标准”，即使病毒有变异也能很好的分离检测，但其培养细胞耗时较长，成本较高，对技术水平要求较高，不能满足临床快速诊断的需求，也不适用于现场的疾病快速诊断。

目前常用的分子生物学技术是以聚合酶链反应(PCR)为基础的变温扩增技术，包括PCR、实时荧光定量PCR、巢式PCR和温度恒定的等温扩增技术，包括LAMP、RPA、NASBA等，国内外围绕这些技术建立一些较为成熟的腺病毒检测方法。PCR方法可以实现快速检测，具有高灵敏度和特异性等优点，即便核酸含量较少也能检测，但其操作过程繁琐，且对仪器设备要求较高，无法实现现场的快速检测，尤其对农村或者发生疫情等条件艰苦的地区所发生的疫情难以发挥其优势。基于上述方法用于检测通用型腺病毒的报道已有很多，但用于分型的检测方法很少，目前还没有等温扩增检测3型人腺病毒的方法被报道。

由于现存HAdV-3病毒检测方法的不足以及HAdV-3病毒快速实地检测的需求，因此研究一种能在基层应用，可在常温下快速检测HAdV-3病毒的扩增方法非常有必要。

重组酶介导扩增技术(Recombinase-aided amplification assay，RAA)是一种新型恒温核酸扩增检测技术。反应体系由大肠杆菌重组酶UvsX、单链结合蛋白、DNA聚合酶、缓冲液等组分组成，反应在39-42℃恒温下30min即可完成。在以往的RAA研究中，RAA检测技术的一个主要缺点是它们不包含内参。内参是存在于同一样品管中的非靶DNA序列，它与靶序列同时被扩增。在没有内参的RAA反应中，阴性反应(没有带或无信号)可能意味着反应中没有靶序列。但是，这也可能意味着由于温度不当、RAA反应体系混合物不正确、DNA聚合酶活性差或样品基质中存在抑制物质，从而使反应受到了抑制，而导致了假阴性结果。相反，在含有内参的RAA反应中，即使没有靶序列，也应该始终产生控制信号。本发明基于RAA技术，在反应体系中加入了内参，实现对反应体系及反应过程进行监测，进一步确保了检测结果的准确性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测结果准确、无假阴性的灵敏、特异、快速的检测3型腺病毒的方法。

为实现上述目的，发明人根据HAdV-3病毒基因组序列，寻找同源性高的保守序列，设计适用于等温核酸扩增技术的特异性引物对和靶探针。

经过对比和筛选，本发明首先提供一条用于检测3型人腺病毒的靶序列，其具有SEQ ID NO.6所示的序列或其特异性片段。其在GenBank登录号EF564601.1公开的序列第18764-18959bp位。

发明人在HAdV-3病毒基因组序列间，根据GC含量在40％-60％之间、没有长的同序列的碱基、尽量没有正向/反向重复序列、回文序列等的原则，寻找高度保守序列作为目标区域；选择好区域后，再根据引物长度为30-35bp、5’端(3-5bp)避免出现重复G、GC含量不要大于70％或小于30％、引物间避免形成二级结构、引物二聚体等原则设计适用于等温核酸扩增技术的特异性引物对；又根据探针长度一般为46-52个碱基、5’端到THF位点至少要30个碱基、THF位点到3’端至少要15个碱基的原则设计特异性靶探针；为避免出现假阴性，发明人进一步设计了一条内参探针。

经过对比和筛选，本发明首先提供一条用于检测3型腺病毒的靶序列，其具有SEQID NO.6所示的序列或其特异性片段。

根据上述靶序列精心设计了特异性引物对和靶探针，其核苷酸序列分别如SEQ IDNO.1-3所示。该发明的探针和引物适用检测HAdV-3。本发明探针类型为exo探针，5’标记荧光基团，3’标记淬灭基团。

进一步地，本发明设计的内参探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。该内参探针类型为exo探针，5’标记与靶探针荧光颜色不同的荧光基团，3’标记淬灭基团。

本发明提供了所述的靶序列在采用等温核酸扩增技术检测3型腺病毒中的应用。

具体地，本发明提供了适用于等温核酸扩增技术检测3型腺病毒的引物探针组合，该组合含有一对特异性引物对和一条靶探针，所述特异性引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO.1-2所示，所述靶探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

优选地，本发明的引物探针组合还含有一条内参DNA和一条内参探针，所述内参DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述内参探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明提供了所述引物探针组合在制备快速检测3型腺病毒的试剂盒中的应用。

进一步，本发明提供了含有所述引物探针组合的快速检测3型腺病毒的试剂盒。

本发明实施例中，本发明提供的快速检测3型腺病毒的试剂盒含有等温核酸扩增体系，该体系具体配置如下：

该体系中，靶探针和内参探针分别标记荧光色不同的荧光基团，所述荧光基团包括FAM、HEX、ROX、TET、JOE、CY3、CY5、TAMRA、VIC。

本发明的试剂盒在工作时，在等温核酸扩增体系中加入样品DNA和内参DNA，混合均匀后进行等温核酸扩增检测，扩增检测温度为35-45℃，优选39℃，扩增检测时间为15-20min，优选20min。

本发明提供了一种适用于等温核酸扩增方法检测目标生物的内参DNA，该内参DNA由非人类基因组DNA片段和检测目标生物的靶序列重组而成，所述目标生物的靶序列为所设计的特异性引物对扩增目标生物靶片段的序列，用非人类基因组序列替换靶序列中的靶探针结合区得到。

本发明实施例所采用的内参DNA为发明人设计并制备的重组DNA，由植物病毒片段和靶标片段(本发明为HAdV-3片段)组成。重组DNA保留了本发明HAdV-3片段相同的引物序列(SEQ ID NO.1-2)，且靶标片段上的其他序列作为主干，而只有与HAdV-3探针(SEQ IDNO.3)结合区被植物病毒片段所替换。在这种情况下，除了探针结合区有差异外，重组DNA序列与HAdV-3靶标的引物和模板序列完全相同，随后该重组DNA片段构建成质粒作为竞争性内参DNA。最终设计的重组DNA内参序列如SEQ ID NO.5所示。

结果判读：将反应管中置于恒温荧光检测仪或荧光PCR仪中，实时读取荧光信号，根据HAdV 3靶标和内参DNA检测结果进行判断:

HAdV 3靶标和内参DNA检测结果均出现扩增荧光信号，检测结果为阳性；

HAdV 3靶标检测结果未出现扩增荧光信号内参DNA检测结果出现扩增荧光信号，检测结果为阴性；

HAdV 3靶标检测结果出现扩增荧光信号内参DNA检测结果未出现扩增荧光信号，检测结果为阳性；

HAdV 3靶标和内参DNA检测结果均未出现扩增荧光信号，检测结果为可能为假阴性，建议重复实验或重新提取RNA进行检测。

本领域技术人员可以理解，基于非疾病诊断目的，本发明还提供了一种快速检测3型腺病毒的含内参双重等温核酸扩增方法，以本发明上述含内参探针的引物探针组合对待测样品模板DNA进行等温核酸扩增检测，所述引物探针组合中的3型腺病毒内参DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明提供的双重等温核酸扩增检测HAdV-3的方法，灵敏度可达到5拷贝/μl，能检测出CT值大于35的弱阳性临床标本；对其他型别的腺病毒和呼吸道病毒检测均无交叉反应，特异性好，易于大范围推广应用，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。

附图说明

图1为实施例1筛选最佳引物探针组合实验结果图，图中1指代SEQ ID NO.1，2，3组合的扩增荧光信号；2指代SEQ ID NO.1，8，3组合的扩增荧光信号；3指代SEQ ID NO.2，2，3组合的扩增荧光信号；4指代SEQ ID NO.2，8，3组合的扩增荧光信号；5指代SEQ ID NO.1，9，3组合的扩增荧光信号；6指代SEQ ID NO.2，9，3组合的扩增荧光信号；阴性：阴性对照。

图2A-图2B为实施例2的方法对HAdV-3和内参DNA的实时荧光检测扩增曲线图，图2A为HAdV-3阳性扩增荧光信号图，图2B为内参DNA的扩增荧光信号图。

图3A-图3B为实施例3的方法对HAdV-3和内参DNA的实时荧光检测扩增曲线图，图3A为HAdV-3阳性扩增荧光信号图，图3B为内参DNA的扩增荧光信号图。

图4A-图4B为实施例4的方法对不同浓度的HAdV-3质粒和内参DNA的实时荧光检测扩增曲线图，图4A为不同浓度(1copy/μl～10⁴copy/μl)的HAdV-3阳性实时荧光定量RAA扩增荧光信号图，图4B为不同浓度的HAdV-3阳性质粒对应内参DNA的实时荧光定量RAA扩增荧光信号图。

图5A-图5B为实施例5的方法对HAdV-3、其他型别腺病毒和呼吸道病毒的实时荧光RAA检测扩增曲线图，图5A为HAdV-3、其他型别腺病毒和呼吸道病毒的扩增荧光信号图，图中1：HAdV-3扩增曲线；2：其他型别腺病毒和呼吸道病毒扩增曲线；图5B不同病毒对应的内参DNA的扩增荧光信号图。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1适用用于等温核酸扩增检测3型腺病毒的特异性引物对、靶探针、内参探针的设计和确定

下载全部HAdV-3病毒全基因组序列，进行序列比对，寻找同源性高的保守区域，确定一条适用于检测HAdV-3的靶序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。在保守区域设计多条特异性引物和靶探针。

RAA引物设计原则：一是引物长度，RAA引物比典型的PCR引物更长，一般要求为30-35bp；二是引物序列，5’端(3-5bp)避免出现重复G，最好为C或T；3’端(后3个碱基)最好有G和C；GC含量不要大于70％或小于30％；引物间避免形成二级结构、引物二聚体等。RAA探针设计原则：RAA荧光探针(exo探针)主要包括四个特殊部分，3'末端的阻断物(通常为C3-spacer)，脱碱基核苷酸类似物(四氢呋喃[THF]残基，有时称为“dSpacer”)及位于THF两侧的荧光基团(dT-荧光基团)和淬灭基团(dT-淬灭基团)，且两基团之间相距约2-5bp。探针一般为46-52个碱基，5’端到THF位点至少要30个碱基，THF位点到3’端至少要15个碱基。

本发明经过大量实验发现并非只要满足引物、探针设计原则所设计出的引物、探针进行扩增效果就必然好，在研究对比中，本发明发现有非常符合上述设计原则的引物探针组合并没有出现很好的扩增效果，反倒是不符合以上引物探针设计原则的引物探针组合反而扩增的效果很好。因此在满足上述一般设计原则的基础上，本发明进行了优化设计和大量引物探针组合的筛选对比，以下为本申请设计的大量候选引物探针组合的部分罗列及效果说明。

候选的引物核苷酸序列见SEQ ID NO.1-2，7-9。使用HAdV-3阳性临床样本筛选灵敏度高、特异性好的最佳引物和探针组合，根据起峰时间和荧光强度进行筛选，筛选结果图1。

正向引物序列：5’-ATTCCGGCACAGCTTACAATTCACTCGCTCC-3’，(SEQ ID NO.1)

5’-GCACAGCTTA CAATTCACTCG CTCCTAAGGG-3’(SEQ ID NO.7

反向引物序列：5’-TCAGTAGTGGTAATGTCTTTCCCAATTTGC-3’。(SEQ ID NO.2)

5’-TCTTTCCCAATTTGCAAACCTTCTTTAGTAA-3’(SEQ ID NO.8)

5’-TTGCAAACCTTCTTTAGTAATATTGTCTCCC-3’(SEQ ID NO.9)

靶探针序列为：5’-GATAGTTACAACGAATCGAGACAATGCAGTAACTACCACCACAAACA-3’(SEQ ID NO.3)

内参探针序列为：5’-

GTAAGGTGCTAGACTAAAATTGTTGGGACTTTGAATCTCTGAAGTAAAAGG-3’(SEQ ID NO.4)

对以下引物探针组合进行检测和筛选：

第1组：SEQ ID NO.1，2，3组合；

第2组：SEQ ID NO.1，8，3组合；

第3组：SEQ ID NO.2，2，3组合；

第4组：SEQ ID NO.2，8，3组合；

第5组：SEQ ID NO.1，9，3组合；

第6组：SEQ ID NO.2，9，3组合；

在图1可以看出，在相同的条件下，SEQ ID NO.1，2，3的引物探针组合，阳性阈值时间及荧光信号值优于其他组合，阳性阈值时间早，荧光强度高，因此本发明将该组合选为最佳引物探针组合。最终确定本发明适用于等温核酸扩增方法的检测HAdV-3病毒的引物和探针如下：

正向引物序列：5’-ATTCCGGCACAGCTTACAATTCACTCGCTCC-3’，(SEQ ID NO.1)

反向引物序列：5’-TCAGTAGTGGTAATGTCTTTCCCAATTTGC-3’。(SEQ ID NO.2)

内参探针序列为：5’-

GTAAGGTGCTAGACTAAAATTGTTGGGACTTTGAATCTCTGAAGTAAAAGG-3’(SEQ ID NO.4)

内参DNA的序列如SEQ ID NO.5所示，3型腺病毒的靶序列如SEQ ID NO.6所示。

实施例2检测3型腺病毒的含内参双重等温核酸扩增方法(1)

1、样品来源及HAdV-3的RNA提取

病毒样品系湖南省疾病预防控制中心从不同患者灌洗液中收集的含有HAdV-3活病毒的标本，DNA提取采用天隆提取试剂盒，DNA提取设备为天隆全自动核酸提取仪。

2、引物和探针采用实施例1确定的适用于等温核酸扩增方法的检测HAdV-3病毒的引物和探针(SEQ ID NO.1-4)，其中靶探针标记HEX荧光基团，内参探针标记FAM荧光基团。

3、配制扩增体系：在200μL离心管中按以下的配比进行等温核酸扩增体系配制(体积为50μL)：

将以上配制好的扩增体系在冷冻干燥机中负压冷冻干燥成为粉未状扩增体系。也可现配现用。

4、HAdV-3检测

向离心管中加入终浓度为6％(w/v)的，分子量为35000的聚乙二醇作为反应缓冲液将体系重新溶解成为48μl。再加入制备好的1μL HAdV-3 DNA和1μL内参DNA，使用奇天仪器恒温振荡混匀仪均匀混合4min，瞬时离心，放入到可检测FAM和HEX荧光的仪器中，在39℃反应20min。(注：为确保实验准确性，设置不加模板的体系作为阴性对照)。结果显示，在2min之后开始显示扩增的荧光信号。如图2A-图2B所示。重复以上实施例，能得到相同的扩增荧光信号，重复性好。

实施例3检测3型腺病毒的含内参双重等温核酸扩增方法(2)

方法参见实施例2，不同之处在于50μL的等温核酸扩增体系中，正、反向引物的浓度分别为300nM，其他参数、步骤与实施例2相同。结果显示，在2min后开始显示扩增的荧光信号，不同的是靶序列扩增曲线的峰值有稍微的降低。如图3A-图3B所示。重复以上实施例，能得到相同的扩增荧光信号，重复性好。

实施例4本发明检测方法的灵敏度、特异度及检出限评价

1.灵敏度评价

将HAdV-3阳性质粒DNA进行10倍系列稀释，浓度范围为10⁰～10⁴拷贝/μl，用系列稀释后的DNA模板参照实施例2的方法进行扩增，再加入相同浓度的内参质粒，结果如图4A-图4B所示，重复8次试验，计算出本发明检测方法的检出限为5拷贝/μl。

2.特异度评价

用实施例1筛选出的引物和探针分别检测HAdV-3和其他型别的HAdV，包括A(HHAdV31),B(HAdV 7,14,55),C(HAdV 1,2,5,6,57),E(HAdV 4)和其他呼吸道病毒，包括甲型和乙型流感病毒、鼻病毒、副流感病毒、人博卡病毒、冠状病毒、人偏肺病毒、呼吸道合胞病毒，结果如图5A-图5B所示。检测结果显示本发明方法只能特异性检测HADV-3，并不与其他病毒发生交叉反应。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所

<120> 一种快速检测3型人腺病毒的含内参双重等温核酸扩增方法

<130> KHP191110996.7

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

attccggcac agcttacaat tcactcgctc c 31

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcagtagtgg taatgtcttt cccaatttgc 30

<210> 3

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gatagttaca acgaatcgag acaatgcagt aactaccacc acaaaca 47

<210> 4

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtaaggtgct agactaaaat tgttgggact ttgaatctct gaagtaaaag g 51

<210> 5

<211> 275

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gaggtcctag cttcaagcca tattccggca cagcttacaa ttcactcgct cctaagggcg 60

cgcccaatac atctcagtgg atagttacaa cgaatcgagg taaggtgcta gactaaaatt 120

gttgggactt tgaatctctg aagtaaaagg gaagggagac aatattacta aagaaggttt 180

gcaaattggg aaagacatta ccactactga aggagaagaa aagcccattt atgccgataa 240

aacatatcag ccagagcctc aagttggaga agaat 275

<210> 6

<211> 270

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gaggtcctag cttcaagcca tattccggca cagcttacaa ttcactcgct cctaagggcg 60

cgcccaatac atctcagtgg atagttacaa cgaatcgaga caatgcagta actaccacca 120

caaacacatt tggcattgct tccatgaagg gagacaatat tactaaagaa ggtttgcaaa 180

ttgggaaaga cattaccact actgaaggag aagaaaagcc catttatgcc gataaaacat 240

atcagccaga gcctcaagtt ggagaagaat 270

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcacagctta caattcactc gctcctaagg g 31

<210> 8

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tctttcccaa tttgcaaacc ttctttagta a 31

<210> 9

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ttgcaaacct tctttagtaa tattgtctcc c 31

Claims

1.核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的靶序列在非疾病诊断目的的采用等温核酸扩增技术检测3型腺病毒中的应用。

2.适用于等温核酸扩增技术检测3型腺病毒的引物探针组合，其特征在于，含有一对特异性引物对和一条靶探针，所述特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示，所述靶探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.如权利要求2所述的引物探针组合，其特征在于，还含有一条内参DNA和内参探针，所述内参DNA为非人类基因组序列的重组DNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述内参探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

4.权利要求2或3所述引物探针组合在制备快速检测3型腺病毒的试剂盒中的应用。

5.含有权利要求2或3所述引物探针组合的快速检测3型腺病毒的试剂盒。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，含有等温核酸扩增体系如下：

Tris缓冲液 0~60mM

醋酸钾 50~150mM

醋酸镁 5~30mM

二硫苏糖醇 1~10mM

聚乙二醇 1.5%~7.8%（w/v）

ATP 1~5mM

dNTPs 0.1~0.4mM

磷酸肌酸 20~100μg/U

单链结合蛋白 500~1000 ng/μL

重组酶 50~400 ng/μL

UvsY蛋白 50~200 ng/μL

DNA聚合酶 30~150 ng/μL

核酸外切酶 30~200ng/μL

靶探针 50~150nM

内参探针 50~150nM

正向引物 300~600nM

反向引物 300~600nM。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，靶探针和内参探针分别标记荧光色不同的荧光基团，所述荧光基团包括FAM、HEX、ROX、TET、JOE、CY3、CY5、TAMRA、VIC；所述试剂盒在工作时，在等温核酸扩增体系中加入样品DNA和内参DNA，混合均匀后进行等温核酸扩增检测，扩增检测温度为35-45℃，扩增检测时间为5-20min。

8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述扩增检测温度为39℃，扩增检测时间为20min。

9.一种非疾病诊断目的的快速检测3型腺病毒的含内参双重等温核酸扩增方法，其特征在于，以权利要求3所述引物探针组合对待测样品模板DNA进行等温核酸扩增检测，所述引物探针组合中的3型腺病毒内参DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。