CN113502351B

CN113502351B - 一种crRNA及用于CRISPR-Cas12a检测人腺病毒核酸的方法

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Publication number: CN113502351B
Application number: CN202110726441.XA
Authority: CN
Inventors: 邱少富; 刘鸿博; 宋宏彬; 王立贵; 杜昕颖; 向莹; 杨明娟; 杨超杰; 刘洪波; 王辉; 王琪
Original assignee: Chinese Pla Center For Disease Control & Prevention
Current assignee: Chinese Pla Center For Disease Control & Prevention
Priority date: 2021-06-29
Filing date: 2021-06-29
Publication date: 2023-11-21
Anticipated expiration: 2041-06-29
Also published as: CN113502351A

Abstract

本发明提供了一种crRNA分子及用于CRISPR‑Cas12a检测人腺病毒核酸的方法。本发明提供的crRNA用于CRISPR‑Cas12a技术检测人腺病毒核酸的方法简便、易行、快速，当结合PCR扩增技术时，灵敏度为10⁰copies/μl，相比于其它在临床和实验室中容易造成干扰的病原微生物检测方法，本发明方法显示出了具有极高的特异性。

Description

一种crRNA及用于CRISPR-Cas12a检测人腺病毒核酸的方法

技术领域

本发明公开了一种crRNA分子及检测人腺病毒核酸的方法，属于核酸检测技术领域。

背景技术

人腺病毒(human adenovirus,HAdV)感染人体可引起多种疾病。呼吸道是腺病毒侵袭并引发症状的常见部位，造成发热、肺炎、支气管炎等症状。呼吸道腺病毒在人群中普遍易感，在临床上常见，一年四季均可流行，在我国北方以冬春季常见，南方以春夏季常见。人腺病毒在密闭、拥挤和潮湿的环境，如军营、学校、托幼机构、医疗机构等常可引起暴发流行。能引起人呼吸道感染的人腺病毒主要包括B、C、E三个亚群，其中B群包括腺病毒3、7、14、55型等，C群包括腺病毒的1、2、 5、6型，E群的4型。其中人腺病毒B群中的HAdV-3和HAdV-7型是我国最主要流行的人腺病毒型别；B群的HAdV-55型已在我国发现容易引发重症病例。其它型别的呼吸道HAdV出现的频率较低或引起症状较轻。

呼吸道疫情发生后，进行针对腺病毒的快速诊断是十分必要的。核酸检测具有灵敏、快速、准确等特点，是重要且常用的呼吸道腺病毒检测技术之一，包括PCR、荧光定量PCR等。

CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 全称为“簇状、规律间隔的、短回文重复序列”，随着CRISPR-Cas机理和新Cas酶的逐步揭示，研究人员发现这个系统非常强大，不仅可以精准高效地实现基因编辑，新发现的Cas12a还可以用于核酸检测，实现病原体的快速诊断。CRISPR-Cas12a系统通过转录表达形成Cas12a-crRNA复合体，crRNA引导cas12a核酸酶特异性识别并剪切双链DNA，随后Cas12a 的非特异剪切活性被立即激活，随机剪切降解单链DNA。基于该原理，将单链DNA制备成荧光淬灭探针，可以通过荧光信号的释放实现对目的序列的特异性检测。加州大学伯克利分校的研究员Jennifer Doudna将核酸扩增技术和基于CRISPR-Cas12a的核酸检测技术进行结合，将核酸扩增的结果进一步放大，实现检测灵敏度的倍增。由于CRISPR-Cas12a的 crRNA对目的序列的识别受PAM序列(TTTN或TTN)和碱基互补配对原则的双重限制，因此CRISPR-Cas12a在发挥高灵敏度检测功能的同时还能够保证高特异度。该技术在Science上公布后立即引发世界范围内高度关注。美国国防高级研究计划局(DARPA)计划将基于CRISPR系统核酸检测技术应用于病原体的快速甄别。

可以预见，基于CRISPR-Cas12a系统的高灵敏、高特异核酸检测技术将在病原体诊断领域发挥巨大作用。2019年中国疾病预防控制中心组织多学科专家，制定了《人腺病毒呼吸道感染预防控制技术指南(2019 年版)》，并发布于《中华预防医学杂志》上。该指南明确将核酸检测作为诊断腺病毒的主要方式之一。鉴于我国主要流行的人腺病毒以B亚群为主，本发明的目的就是提供一种针对B亚群中3、7、14、55型人腺病毒的高敏感、高特异PCR-Cas12a核酸检测技术，为人呼吸道腺病毒的检测和监测提供新方法。

发明内容

基于上述目的，本发明首先提供了一种用于CRISPR-Cas12a技术检测人腺病毒核酸的crRNA分子，所述crRNA分子的序列如SEQ ID NO.1 所示。

其次，本发明还提供了一种应用上述crRNA分子基于非诊断目的的 CRISPR-Cas12a技术检测人腺病毒核酸的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)制备样本核酸模板；

(2)使步骤(1)获取的核酸模板，Cas12a蛋白、荧光基团和荧光淬灭基团双标记的单链DNA探针，以及所述crRNA分子在CRISPR-Cas12a 技术检测体系里反应；

(3)对步骤(2)的反应体系进行荧光强度的检测。

在一个优选的实施方案中，步骤(1)所述的样本核酸模板由PCR 扩增方法制备。

在一个更为优选的实施方案中，所述PCR扩增的上游引物的序列含有SEQ ID NO.8所示的序列，所述PCR扩增的下游引物的序列含有SEQ ID NO.9所示的序列。

更为优选的，所述PCR扩增的上游引物的序列由SEQ ID NO.8所示，所述PCR扩增的下游引物的序列由SEQ ID NO.9所示。

在一个优选的实施方案中，步骤(2)所述CRISPR-Cas12a检测体系中，所述DNA探针的序列如SEQ ID NO.11所示，在一个更为优选的实施方案中，所述荧光基团为FAM，所述荧光淬灭基团为BHQ。

第三，本发明还提供了一种CRISPR-Cas12a技术检测试剂盒，所述试剂盒包括上述的crRNA分子，Cas12a蛋白、荧光基团和荧光淬灭基团双标记的单链DNA探针，以及序列含有SEQ ID NO.8所示序列的PCR 扩增上游引物，序列含有SEQ ID NO.9的PCR扩增的下游引物。

在一个更为优选的实施方案中，所述PCR扩增的上游引物的序列由 SEQ ID NO.8所示，所述PCR扩增的下游引物的序列由SEQ ID NO.8所示。

在一个优选的实施方案中，所述试剂盒中的DNA探针的序列如SEQ ID NO.11所示。

第四，本发明提供了一种用于制备上述crRNA分子的上游DNA单链和下游DNA单链，所述上游DNA单链的序列如SEQ ID NO.12所示，所述下游DNA单链的序列如SEQ ID NO.13-15任一所示。

最后，本发明提供了一种用于制备上述crRNA分子的方法，在所述方法中，先使序列如SEQ ID NO.12所示或其互补序列的上游DNA单链和序列如SEQ ID NO.13-15中任一所示或其互补序列的下游DNA单链进行杂交制备DNA体外转录模板，再根据所述DNA体外转录模板制备所述crRNA。

本发明提供的CRISPR-Cas12a技术检测人腺病毒核酸的方法简便易行快速，针对样本核酸一步即可完成检测，仅需30-45min便于基层的快速检测。当结合PCR扩增技术时，即PCR-Cas12a检测技术放大了PCR 核酸扩增信号，灵敏度为10⁰copies/μl，优于PCR核酸检测的10⁴copies/μl，以及荧光定量PCR核酸检测的10⁵copies/μl，因此本发明方法具有极高的检测灵敏度。采用本发明提供的HAdV B组PCR-Cas12a 检测体系分析肺炎链球菌、肺炎克雷伯杆菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、甲型流感、乙型流感、绿脓杆菌时，各病原核酸样本检测结果与阴性对照检测结果之间的差异无统计学意义。腺病毒核酸样本的荧光信号强度明显高于其它各组，证明本发明的方法具有极高的特异性。

附图说明

图1.不同引物组合的PCR扩增凝胶电泳鉴定图谱；

图2.优选的引物组合的PCR扩增凝胶电泳鉴定图谱；

图3.Cas12a-crRNA检测Hexon基因PCR产物的荧光强度时间曲线图；

图4.PCR检测灵敏度凝胶电泳鉴定图谱；

图5.CRISPR-Cas12a技术荧光强度分析柱状图；

图6.PCR-Cas12a检测特异性荧光强度分析柱状图；

图7.相同PCR产物的荧光定量PCR检测灵敏度分析曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的权利要求所限定的保护范围构成任何限制。

实验材料

LbCas12a蛋白(广州博徕斯生物科技股份有限公司)，B组人腺病毒样本(解放军疾病预防控制中心保存)，pUC57-Hexon7质粒(北京天一辉远公司合成)，病毒核酸提取试剂盒(Life)，TaqDNA聚合酶mix，T7 启动子DNA单链(北京天一辉远公司合成)，crRNA转录模板DNA单链(北京天一辉远公司合成)，RNA体外转录试剂盒(NEB)，RNA纯化试剂盒(NEB)，DNA荧光探针(北京天一辉远公司合成)。

实施例1.CRISPR-Cas12a检测系统的设计和实施

1、B组人腺病毒CRISPR-Cas12a系统靶点的设计

从NCBI数据库中查阅B组人腺病毒(3，7，14，55型)基因组测序数据，查找编码六邻体蛋白编码基因Hexon，并下载所有的B组完整 Hexon基因序列，用mafft软件比对所有下载的Hexon基因序列，分析保守区。从保守区序列中查找以TTTN或TTN为标志的PAM序列，并向PAM序列下游延伸20bp作为CRISPR-Cas12a系统识别靶点。如序列为： 5’-TTTGAGGTGGATCCCATGGATGAG-3’，即PAM序列为TTTG，20bp 靶点序列为：AGGTGGATCCCATGGATGAG。共筛选了3个识别靶点，分别为：

AdV-B1：TTTGAGGTGGATCCCATGGATGAG

AdV-B2：TTGACTTGCAGGACAGAAACACA

AdV-B3：TTCCCCATGGCCCACAACACCGC

2、特异性crRNA DNA体外转录模板的制备

crRNA DNA体外转录所需的上游DNA单链和下游DNA单链设计如下：

(1)上游DNA单链为T7启动子，即T7-Foward：

TAATACGACTCACTATAGGG(SEQ ID NO.12)(Chen J S et al. Science,2018,360(6387):436-439.)。

(2)下游DNA单链设计上涵盖crRNA spacer区转录模板、crRNA repeat区转录模板、T7启动子互补序列，具体结构为：20bp spacer+21bprepeat+20bp T7启动子互补序列。

根据呼吸道腺病毒Hexon基因保守区靶点序列设计并合成下游DNA 单链：

AdV-B1-T7-Reverse(SEQ ID NO.13)：

CTCATCCATGGGATCCACCTATCTACACTTAGTAGAAATTACCC TATAGTGAGTCGTATTA

AdV-B2-T7-Reverse(SEQ ID NO.14)：

TGTGTTTCTGTCCTGCAAGTATCTACACTTAGTAGAAATTACCC TATAGTGAGTCGTATTA

AdV-B3-T7-Reverse(SEQ ID NO.15)：

GTCATTCCGCAGCATGGCTTATCTACACTTAGTAGAAATTACCC TATAGTGAGTCGTATTA

结构为：20bp Hexon保守区靶点spacer+21bp repeat+20bp T7启动子互补序列。

采用退火的方式制备特异性crRNA的DNA体外转录模板，在PCR 管中配置如下退火体系：

PCR管放置于PCR仪中，95℃孵育10min，而后立即关闭PCR仪，使双链在室温下缓慢降温，90min后置于冰上5min。

3、特异性crRNA的制备

采用NEB生产的RNA体外转录试剂盒中的T7转录酶，在PCR管中配置转录体系如下：

无核酸酶水	16μl
		NTP Buffer Mix	10μl
DNA模板	2μl
		T7 RNA Polymerase Mix	2μl
总体积	30μl

将转录体系置于37℃培养箱中过夜孵育。用NEB生产的RNA纯化回收试剂盒进行crRNA的回收。回收的crRNA序列如下：

AdV-B1-crRNA(SEQ ID NO.1):

uaauuucuacuaaguguagauagguggaucccauggaugag

AdV-B2-crRNA(SEQ ID NO.2):

uaauuucuacuaaguguagauacuugcaggacagaaacaca

AdV-B3-crRNA(SEQ ID NO.3):

uaauuucuacuaaguguagaucccauggcccacaacaccgc

4、设计并筛选HAdV B组Hexon保守区PCR引物

由于HAdv序列变异较多，引入兼并碱基(下划线)，设计多条正反向引物序列如下：

AdVB1-F.1:TTCTCBAGCAACTTCATGTC(SEQ ID NO.4)

AdVB1-F.2:TCBAGCAACTTCATGTCYAT(SEQ ID NO.5)

AdVB1-F.3:TCBAGCAACTTCATGTC(SEQ ID NO.6)

AdVB1-F.4:CKCTGGACATGACYTTTGAG(SEQ ID NO.7)

AdVB1-F.5:TATGCCAACTCRGCYCATGC(SEQ ID NO.8)

AdVB1-R:GCACTCTGACCACGTCGAA(SEQ ID NO.9)

AdVB1-R.1:TGCACTCTGACCACGTCGAA(SEQ ID NO.10)

配置PCR体系如下：

反应条件如下：

首先95℃预变性2min，接着进入循环扩增模式，95℃，15s；56℃， 15s；72℃，30s；共30个循环；然后72℃，3min，最后，4℃，24h。 DNA凝胶电泳结果如图1所示。图1中，1-3、4-6、7-9和10-12泳道分别为AdVB1-F.1(SEQ ID NO.4)、AdVB1-F.2(SEQ ID NO.5)、 AdVB1-F.3(SEQ ID NO.6)和AdVB1-F.4(SEQ ID NO.7)与AdVB1-R (SEQ ID NO.9)组合后，对55型腺病毒样本进行PCR核酸扩增得到的产物进行0、2、4倍稀释的结果；其中AdVB1-F.4(SEQ IDNO.7)与 AdVB1-R(SEQ ID NO.9)组合扩增效果较好。

对扩增效果较好的引物再次进行筛选。

DNA凝胶电泳结果如图2所示。图2为AdVB1-F.4(SEQ ID NO.7)、 AdVB1-F.5(SEQID NO.8)分别与AdVB1-R(SEQ ID NO.9)、AdVB1-R.1 (SEQ ID NO.10)交叉组合后扩增梯度稀释的55型腺病毒核酸样本的电泳鉴定图，其中AdVB1-F.5(SEQ ID NO.8)与AdVB1-R(SEQID NO.9) 的组合扩增效果较好，无明显非特异性扩增。

最终，选用AdVB1-F.5(SEQ ID NO.8)与AdVB1-R(SEQ ID NO.9) 作为腺病毒B群靶点1的PCR核酸扩增引物。

5、Cas12a-crRNA检测Hexon基因的PCR产物

合成FAM基团、BHQ基团双标记的单链DNA探针，序列为：5’FAM- TTTTTTTTTTTT-BHQ3’(SEQ ID NO.11)。

配置CRISPR-Cas12a检测体系：

Cas12a蛋白浓度(1μM)	5μl
		crRNA(500-1000ng/μl)	1μl
10×反应缓冲液	5μl
		腺病毒核酸	5μl
DNA探针(10μM)	5μl
		ddH₂O	29μl
总反应体积	50μl

将检测体系置于96孔培养皿，将培养皿放置于酶标仪中，以激发光 495nm、发射光520nm进行荧光强度检测，每隔3min检测一次，37℃下连续检测60min。结果如图3所示。图3中在反应30分钟时，靶点1的荧光强度值已到峰值；而靶点2和靶点3的荧光强度值在整个反应过程中持续上升，在反应60分钟时也未能达到峰值，且低于靶点1的荧光强度值；阴性对照的荧光强度值维持在低水平。最终，选择靶点1，即AdV-B1 作为腺病毒B群的通用检测靶点。

实施例2.PCR-Cas12a检测灵敏度分析

合成55型HAdV Hexon基因并构建于pUC57载体，得到 pUC57-Hexon55质粒。用去核酸酶的ddH₂O稀释pUC57-Hexon55质粒分别至10⁹、10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹、10⁰copies/μl浓度。

以梯度浓度的pUC57-Hexon55质粒为模板，采用前述引物 (AdVB1-F.5与AdVB1-R)和条件进行PCR扩增，电泳检测PCR产物。扩增结果见图4。图4中，1-10泳道分别为10⁹、10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、 10³、10²、10¹、10⁰copies/μl浓度的pUC57-Hexon55质粒PCR扩增后得到产物进行DNA凝胶电泳的结果。结果显示，在质粒浓度为10⁴copies/μl 时电泳条带亮度已非常微弱，质粒浓度更低时，结果不可见。

以上述PCR产物为检测模板，采用CRISPR-Cas12a技术进行荧光强度分析。结果见图5。图5的荧光检测结果显示：质粒浓度为10²copies/μl 时，检测结果与阴性对照相比仍有数量级的差别。且质粒浓度为10⁰ copies/μl时，实验组荧光强度与对照组之间依然存在统计学差异。

以上述PCR产物为检测模板，根据新发布的《人腺病毒呼吸道感染预防控制技术指南(2019年版)》，使用B群腺病毒通用的引物和探针进行荧光定量PCR检测。结果如图7所示。图7荧光定量PCR结果显示：质粒浓度为10⁹-10⁵copies/μl时，与阴性对照相比呈现阳性结果。

PCR-Cas12a检测技术放大了PCR核酸扩增信号，灵敏度优于PCR 核酸检测和荧光定量PCR核酸检测。

实施例3.PCR-Cas12a检测特异度分析

采用本发明提供的HAdV B组PCR-Cas12a检测体系分析肺炎链球菌、肺炎克雷伯杆菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、甲型流感、乙型流感、绿脓杆菌等核酸样本是否会出现假阳性检测结果。分析结果如图6 所示，各病原核酸样本检测结果与阴性对照检测结果之间的差异无统计学意义。腺病毒核酸样本的荧光信号强度明显高于其它各组.PCR-Cas12a检测体系的特异性良好。

序列表

<110> 中国人民解放军疾病预防控制中心

<120> 一种crRNA及用于CRISPR-Cas12a检测人腺病毒核酸的方法

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 41

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

uaauuucuac uaaguguaga uagguggauc ccauggauga g 41

<210> 2

<211> 41

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

uaauuucuac uaaguguaga uacuugcagg acagaaacac a 41

<210> 3

<211> 41

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

uaauuucuac uaaguguaga ucccauggcc cacaacaccg c 41

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Human adenovirus

<400> 4

ttctcbagca acttcatgtc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Human adenovirus

<400> 5

tcbagcaact tcatgtcyat 20

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> Human adenovirus

<400> 6

tcbagcaact tcatgtc 17

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Human adenovirus

<400> 7

ckctggacat gacytttgag 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Human adenovirus

<400> 8

tatgccaact crgcycatgc 20

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> Human adenovirus

<400> 9

gcactctgac cacgtcgaa 19

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Human adenovirus

<400> 10

tgcactctga ccacgtcgaa 20

<210> 11

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tttttttttt tt 12

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

taatacgact cactataggg 20

<210> 13

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ctcatccatg ggatccacct atctacactt agtagaaatt accctatagt gagtcgtatt 60

a 61

<210> 14

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tgtgtttctg tcctgcaagt atctacactt agtagaaatt accctatagt gagtcgtatt 60

a 61

<210> 15

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gtcattccgc agcatggctt atctacactt agtagaaatt accctatagt gagtcgtatt 60

a 61

Claims

1. 一种用于CRISPR-Cas12a技术检测人腺病毒核酸的crRNA分子，所述crRNA分子的序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种应用权利要求1所述crRNA分子基于非诊断目的的CRISPR-Cas12a技术检测人腺病毒核酸的方法，所述方法包括以下步骤：

（1）制备样本核酸模板；

（2）使步骤（1）获取的核酸模板，Cas12a蛋白、荧光基团和荧光淬灭基团双标记的单链DNA探针，以及所述crRNA分子在CRISPR-Cas12a技术检测体系里反应；

（3）对步骤（2）的反应体系进行荧光强度的检测。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述的样本核酸模板由PCR扩增方法制备。

4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增方法的上游引物的序列含有SEQ ID NO. 8所示的序列，所述PCR扩增方法的下游引物的序列含有SEQ ID NO.9所示的序列。

5. 根据权利要求2-4任一所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述单链DNA探针的序列如SEQ ID NO.11所示。

6. 一种CRISPR-Cas12a技术检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的crRNA分子，Cas12a蛋白、荧光基团和荧光淬灭基团双标记的单链DNA探针，以及序列含有SEQ ID NO. 8所示序列的PCR扩增上游引物，序列含有SEQ ID NO. 9的PCR扩增的下游引物。

7. 根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增的上游引物的序列由SEQID NO. 8所示，所述PCR扩增的下游引物的序列由SEQ ID NO.9所示。

8. 根据权利要求6或7任一所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA探针的序列如SEQ IDNO.11所示。

9. 一种用于制备权利要求1所述crRNA的引物，其特征在于，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的序列如SEQ ID NO.12所示，所述下游引物的序列如SEQ IDNO.13-15任一所示。

10. 一种用于制备权利要求1所述crRNA的方法，其特征在于，先使序列如SEQ IDNO.12所示的上游引物和序列如SEQ ID NO.13-15中任一所示的下游引物进行杂交制备DNA体外转录模板，再根据所述DNA体外转录模板制备所述crRNA。