CN114317681A - 基于CRISPR/Cas12a系统创新激活方式检测核酸标志物RNA病毒的方法 - Google Patents
基于CRISPR/Cas12a系统创新激活方式检测核酸标志物RNA病毒的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开基于CRISPR/Cas12a系统创新激活方式检测核酸标志物RNA病毒的方法。首先，以一种新的CRISPR/Cas12a系统的激活方式激活酶的活性，当有目标物DNA或RNA和CRISPR/Cas12a系统的crRNA及其配对的DNA结合该系统被激活去不加选择的水解单链信标分子DNA。不管是DNA还是RNA的高效、快捷、灵敏度高、特异性强的检测，该方法具有良好的特异性、灵敏度以及抗干扰能力，为建立灵敏而特异的重大疾病的核酸标志物和RNA病毒检测方法提供了新方向,并且当检测RNA时不需要逆转录等繁琐的步骤，只需要设计好CRISPR/Cas12a系统的固定DNA就可以实现特异性检测目标物。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于CRISPR/Cas12a系统创新激活方式检测核酸标志物RNA病毒的方法。
背景技术
一种通用、准确、灵敏的核酸检测方法可辅助医护点的病原检测、基因分型和疾病监测，在临床诊断中具有重要价值。最近，CRISPR-Cas系统在核酸诊断领域引起了广泛关注，因为发现了II类V型和VI型Cas蛋白，包括Cas13a、Cas12a、Cas12b和Cas14的侧切活性。其中CRISPR/Cas12a系统能够不加选择的水解单链DNA。
RNA是很多疾病的标志物，常见的miRNA是一种核苷酸序列长度在19到24nt之间的单链RNA分子，一般是通过顺序切割一级转录物(pre-miRNA)和发环前体(pre-miRNA)生成，20％的miRNA在原始生物之间具有高度保守相似性。目前一些研究发现哺乳动物细胞具有高丰度表达量的miRNA，因此有科学家推断人体内大于60％的人类基因是由miRNA靶向介导转录的，当miRNA表达量出现失调时，也会影响人体正常基因的转录，导致机体的一些异常情况。目前，越来越多的病理和miRNA研究数据证明相关miRNA表达量的失调与各种疾病(如癌症、神经退行性疾病、心肌疾病和病毒感染等)的发生发展密切相关。还有一些RNA病毒，例如：新型冠状病毒(COVID-19)、SARS病毒、艾滋病病毒等，也会引起一些重大疾病。所以开发一种直接检测RNA的方法是非常重要的，我们所建立的方法基于CRISPR/Cas12a系统建立的检测方法无需逆转录RNA也无需扩增就可以达到直接检测目标物的效果。
传统的RNA检测方法由于RNA含量少、易降解等特点一般采用不同的扩增方法，例如：聚合酶链反应(PCR)、环介导等温扩增反应(LAMP)等，需要复杂的操作流程；有的还需要将RNA逆转录为DNA，这些操作过程都是相当繁琐的。
发明内容
我们研发了一种基于CRISPR/Cas12a系统的创新激活方式检测疾病核酸标志物RNA病毒的方法。
首先，在EP管里加入cas12a酶的反应buffer，双蒸水，设计好的crRNA以及配对的DNA，cas12a酶，分子信标FQ(10个T碱基的单链DNA，一端修饰FAM，一端修饰Quench)；或者是crRNA正常配对的DNA设计一半，当有目标物RNA结合crRNA激活cas12a酶，再加入目标物RNA(以miRNA21为例)在实时荧光定量PCR仪器中实现了目标物的高效、快捷、灵敏度高、特异性强的检测，该方法具有良好的特异性、灵敏度以及抗干扰能力，为建立灵敏而特异的标志物RNA检测方法提供了新方向。
本发明的技术方案为实现对目标物RNA的高效、快捷、灵敏度、特异性的检测，提出了基于CRISPR/Cas12a系统创新激活方式检测核酸标志物RNA病毒的方法，包括如下步骤：
1)加入cas12a酶的反应buffer，双蒸水，设计好的crRNA以及配对的DNA，cas12a酶，分子信标FQ，10个T碱基的单链DNA，一端修饰FAM，一端修饰Quench；
或者是crRNA正常配对的DNA设计一半；
2)当有目标物RNA结合crRNA激活cas12a酶，再加入目标物RNA；
3)在实时荧光定量PCR仪器中实现了目标物的检测；
其中，设计好的crRNA以及配对的DNA序列如下：
Cr RNA:5’UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCGUCGCCGUC3’
配对DNA:5’TCAACATCAGTCTGATAAGCTAGACGGCGACG3’
miRNA-21:5’UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA3’。
具体如下：
1)在100μl EP管里加入cas12a酶的反应buffer 1xNEB 2.1，双蒸水，设计好的1-10μM crRNA以及配对的1-10μM DNA，0.1μM cas12a酶，1μM分子信标FQ，10个T碱基的单链DNA，一端修饰FAM，一端修饰Quench；
或者是crRNA正常配对的DNA设计一半；
2)当有目标物RNA结合crRNA激活cas12a酶，加入待检物1μM miRNA-21或者mRNA或者病毒RNA；
3)在实时荧光定量PCR仪器中检测每一圈的荧光变化来反应目标物的浓度。
本发明中，用miRNA122代替miRNA-21。
本发明用于检测肿瘤标志物microRNA或者mRNA或者病毒RNA结合cas12a系统。
且用于检测RNA的方法不需要扩增或者逆转录成DNA，加到cas12a的反应体系直接检测，只需要设计crRNA或者其配对的DNA就可以特异性检测RNA。
优选地，检测时间1.5-2h，最佳时间1.5h。
在本发明中，设计了一种基于CRISPR/Cas12a系统的创新激活方式检测核酸。该方法改变了原有的cas12a酶的激活方式，通过我们建立的创新激活方式用于检测目标RNA。
首先我们在crRNA和其配对的DNA中提出了Nick位点(核苷酸之间没有磷酸二酯键连接)，基于此我们发现crRNA或者配对DNA存在Nick的时候仍然能活cas12a酶的活性，随后我们设计了检测目标RNA的方法。我们还发现crRNA配对的DNA有一部分是RNA的时候也是能激活该酶的系统。
该方法最大的创新性是通过建立了一个CRISPR/Cas12a系统的新的激活方式，基于此我们发现可用于检测目标物RNA，不管是肿瘤标志物miRNA还是RNA病毒的RNA，利用此方法都能更便捷的得到检测。
附图说明
图1反应原理图；
图2可行性图；
图3优化crRNA、DNA和cas12a的最适浓度；
图4检测其它miRNA(122)的可行性；
图5改变RNA(a)与crRNA(b)结合配对的位置；
图6设计循环扩增；
图7设计底下DNA nick激活cas12。
具体实施方式
下面的实施例中将对本发明作进一步的阐述，但本发明不限于此。
本发明的具体步骤如下：
(1)设计crRNA和配对的DNA
在美国Integrated DNA Technologies(IDT)公司官网设计引物：
Cr RNA:5’UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCGUCGCCGUC3’
配对DNA:5’TCAACATCAGTCTGATAAGCTAGACGGCGACG3’
miRNA-21:5’UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA3’。
(2)构建CRISPR/Cas12a系统
在100μl EP管里加入cas12a酶和1x NEB 2.1反应buffer，双蒸水，1nM配对的DNA，分子信标FQ以及设计好的crRNA(或者是设计好的配对DNA)。
(3)加入1μM目标物miRNA-21
加入目标物RNA，在实时荧光定量PCR中检测荧光变化。
(4)实验优化及数据处理
分别对整个流程中crRNA的设计、配对DNA的设计、对该反应酶的用量、反应时间、温度等参数进行优化，最终得到该方法的最佳条件。
图1为本发明的反应原理可行性图。
(1)可行性实验：为了实验顺利进行，需要探究crRNA和配对DNA有Nick存在的时候是否能正常的激活cas12a如图1所示。
在100μl EP管里加入cas12a酶和1x NEB 2.1反应buffer，双蒸水，配对的DNA，miRNA21，分子信标FQ以及设计好的crRNA；在涡旋仪上低速旋转使其混匀；
放入实时荧光定量PCR中检测荧光变化，37度2h。
结果如图2所示可以激活cas12a，反应参数在表格1中。
表1
(2)为了更好的激活cas12a，我们优化了crRNA,DNA和cas12a的浓度比；
反应参数见表2，结果在图3中。
表2
(3)选用其它miRNA是否适用
如图4所示，操作步骤和(1)相同，换用miRNA122依旧可激活cas12a，
表示方法的可行性，参数见表3。
表3
(4)改变RNA与crRNA结合配对的碱基
如图5所示，当RNA左右两端翘出来不配对的时候依旧可以激活cas12a，方法步骤和(1)相同。
(5)设计循环扩增原理图
如图6所示，设计了一个DNA和RNA的茎环结构来循环放大cas12a的激活系统，茎环结构茎的RNA部分是激活cas12a和DNA配对的地方，当茎环中的环被切，茎解开成单链去再次和crRNA结合配对的DNA再次激活cas12a，起到一个循环放大的作用。
(6)设计底下DNA nick激活cas12a
(1)—(5)设计的都是crRNA中有nick可以激活cas12a，如图7所示，配对的DNA有nick，当DNA多出来不配对的时候可以激活，后半部分DNA换成RNA也同样能激活cas12a。
Claims (6)
1.基于CRISPR/Cas12a系统创新激活方式检测核酸标志物RNA病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)加入cas12a酶的反应buffer，双蒸水，设计好的crRNA以及配对的DNA，cas12a酶，分子信标FQ，10个T碱基的单链DNA，一端修饰FAM，一端修饰Quench；
或者是crRNA正常配对的DNA设计一半；
2)当有目标物RNA结合crRNA激活cas12a酶，再加入目标物RNA；
3)在实时荧光定量PCR仪器中实现目标物的检测；
其中，设计好的crRNA以及配对的DNA序列如下：
Cr RNA:5’UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCGUCGCCGUC3’
配对DNA:5’TCAACATCAGTCTGATAAGCTAGACGGCGACG3’
miRNA-21:5’UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA3’。
2.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas12a系统创新激活方式检测核酸标志物RNA病毒的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
1)在100μl EP管里加入cas12a酶的反应buffer 1xNEB 2.1，双蒸水，设计好的0.5-10μM crRNA以及配对的0.1-10μM DNA，0.1μM cas12a酶，1μM分子信标FQ，10个T碱基的单链DNA，一端修饰FAM，一端修饰Quench；
或者是crRNA正常配对的DNA设计一半；
2)当有目标物RNA结合crRNA激活cas12a酶，加入待检物1μM miRNA-21或者mRNA或者病毒RNA；
3)在实时荧光定量PCR仪器中检测每一圈的荧光变化来反应目标物的浓度。
3.根据权利要求2所述的基于CRISPR/Cas12a系统创新激活方式检测核酸标志物RNA病毒的方法，其特征在于，用miRNA122代替miRNA-21。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，用于检测肿瘤标志物microRNA或者mRNA或者病毒RNA结合cas12a系统。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，用于检测RNA的方法不需要扩增或者逆转录成DNA，加到cas12a的反应体系直接检测，只需要设计crRNA或者其配对的DNA就可以特异性检测RNA。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，检测时间1.5-2h。
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