CN114317681B - 基于CRISPR/Cas12a系统创新激活方式检测核酸标志物RNA病毒的方法 - Google Patents
基于CRISPR/Cas12a系统创新激活方式检测核酸标志物RNA病毒的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114317681B CN114317681B CN202210002404.9A CN202210002404A CN114317681B CN 114317681 B CN114317681 B CN 114317681B CN 202210002404 A CN202210002404 A CN 202210002404A CN 114317681 B CN114317681 B CN 114317681B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cas12a
- dna
- crispr
- rna
- crrna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 title claims abstract description 17
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 108700004991 Cas12a Proteins 0.000 title claims abstract description 17
- 230000004913 activation Effects 0.000 title claims abstract description 13
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 11
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 11
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 11
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 title claims abstract description 10
- 239000003550 marker Substances 0.000 title claims abstract description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 44
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims abstract description 33
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 11
- 101150059443 cas12a gene Proteins 0.000 claims description 30
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 claims description 7
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 claims description 7
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 7
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 6
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 claims description 6
- 238000010791 quenching Methods 0.000 claims description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 abstract description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 2
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 abstract 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 12
- 238000013461 design Methods 0.000 description 10
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 108091007780 MiR-122 Proteins 0.000 description 2
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000000439 tumor marker Substances 0.000 description 2
- 101100385358 Alicyclobacillus acidoterrestris (strain ATCC 49025 / DSM 3922 / CIP 106132 / NCIMB 13137 / GD3B) cas12b gene Proteins 0.000 description 1
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 description 1
- 208000031229 Cardiomyopathies Diseases 0.000 description 1
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 238000007397 LAMP assay Methods 0.000 description 1
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 description 1
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002074 deregulated effect Effects 0.000 description 1
- 230000003831 deregulation Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开基于CRISPR/Cas12a系统创新激活方式检测核酸标志物RNA病毒的方法。首先，以一种新的CRISPR/Cas12a系统的激活方式激活酶的活性，当有目标物DNA或RNA和CRISPR/Cas12a系统的crRNA及其配对的DNA结合该系统被激活去不加选择的水解单链信标分子DNA。不管是DNA还是RNA的高效、快捷、灵敏度高、特异性强的检测，该方法具有良好的特异性、灵敏度以及抗干扰能力，为建立灵敏而特异的重大疾病的核酸标志物和RNA病毒检测方法提供了新方向,并且当检测RNA时不需要逆转录等繁琐的步骤，只需要设计好CRISPR/Cas12a系统的固定DNA就可以实现特异性检测目标物。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于CRISPR/Cas12a系统创新激活方式检测核酸标志物RNA病毒的方法。
背景技术
一种通用、准确、灵敏的核酸检测方法可辅助医护点的病原检测、基因分型和疾病监测，在临床诊断中具有重要价值。最近，CRISPR-Cas系统在核酸诊断领域引起了广泛关注，因为发现了II类V型和VI型Cas蛋白，包括Cas13a、Cas12a、Cas12b和Cas14的侧切活性。其中CRISPR/Cas12a系统能够不加选择的水解单链DNA。
RNA是很多疾病的标志物，常见的miRNA是一种核苷酸序列长度在19到24nt之间的单链RNA分子，一般是通过顺序切割一级转录物(pre-miRNA)和发环前体(pre-miRNA)生成，20％的miRNA在原始生物之间具有高度保守相似性。目前一些研究发现哺乳动物细胞具有高丰度表达量的miRNA，因此有科学家推断人体内大于60％的人类基因是由miRNA靶向介导转录的，当miRNA表达量出现失调时，也会影响人体正常基因的转录，导致机体的一些异常情况。目前，越来越多的病理和miRNA研究数据证明相关miRNA表达量的失调与各种疾病(如癌症、神经退行性疾病、心肌疾病和病毒感染等)的发生发展密切相关。还有一些RNA病毒，例如：新型冠状病毒(COVID-19)、SARS病毒、艾滋病病毒等，也会引起一些重大疾病。所以开发一种直接检测RNA的方法是非常重要的，我们所建立的方法基于CRISPR/Cas12a系统建立的检测方法无需逆转录RNA也无需扩增就可以达到直接检测目标物的效果。
传统的RNA检测方法由于RNA含量少、易降解等特点一般采用不同的扩增方法，例如：聚合酶链反应(PCR)、环介导等温扩增反应(LAMP)等，需要复杂的操作流程；有的还需要将RNA逆转录为DNA，这些操作过程都是相当繁琐的。
发明内容
我们研发了一种基于CRISPR/Cas12a系统的创新激活方式检测疾病核酸标志物RNA病毒的方法。
首先，在EP管里加入cas12a酶的反应buffer，双蒸水，设计好的crRNA以及配对的DNA，cas12a酶，分子信标FQ(10个T碱基的单链DNA，一端修饰FAM，一端修饰Quench)；或者是crRNA正常配对的DNA设计一半，当有目标物RNA结合crRNA激活cas12a酶，再加入目标物RNA(以miRNA21为例)在实时荧光定量PCR仪器中实现了目标物的高效、快捷、灵敏度高、特异性强的检测，该方法具有良好的特异性、灵敏度以及抗干扰能力，为建立灵敏而特异的标志物RNA检测方法提供了新方向。
本发明的技术方案为实现对目标物RNA的高效、快捷、灵敏度、特异性的检测，提出了基于CRISPR/Cas12a系统创新激活方式检测核酸标志物RNA病毒的方法，包括如下步骤：
1)加入cas12a酶的反应buffer，双蒸水，设计好的crRNA以及配对的DNA，cas12a酶，分子信标FQ，10个T碱基的单链DNA，一端修饰FAM，一端修饰Quench；
或者是crRNA正常配对的DNA设计一半；
2)当有目标物RNA结合crRNA激活cas12a酶，再加入目标物RNA；
3)在实时荧光定量PCR仪器中实现了目标物的检测；
其中，设计好的crRNA以及配对的DNA序列如下：
Cr RNA:5’UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCGUCGCCGUC3’
配对DNA:5’TCAACATCAGTCTGATAAGCTAGACGGCGACG3’
miRNA-21:5’UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA3’。
具体如下：
1)在100μl EP管里加入cas12a酶的反应buffer 1xNEB 2.1，双蒸水，设计好的1-10μM crRNA以及配对的1-10μM DNA，0.1μM cas12a酶，1μM分子信标FQ，10个T碱基的单链DNA，一端修饰FAM，一端修饰Quench；
或者是crRNA正常配对的DNA设计一半；
2)当有目标物RNA结合crRNA激活cas12a酶，加入待检物1μM miRNA-21或者mRNA或者病毒RNA；
3)在实时荧光定量PCR仪器中检测每一圈的荧光变化来反应目标物的浓度。
本发明中，用miRNA122代替miRNA-21。
本发明用于检测肿瘤标志物microRNA或者mRNA或者病毒RNA结合cas12a系统。
且用于检测RNA的方法不需要扩增或者逆转录成DNA，加到cas12a的反应体系直接检测，只需要设计crRNA或者其配对的DNA就可以特异性检测RNA。
优选地，检测时间1.5-2h，最佳时间1.5h。
在本发明中，设计了一种基于CRISPR/Cas12a系统的创新激活方式检测核酸。该方法改变了原有的cas12a酶的激活方式，通过我们建立的创新激活方式用于检测目标RNA。
首先我们在crRNA和其配对的DNA中提出了Nick位点(核苷酸之间没有磷酸二酯键连接)，基于此我们发现crRNA或者配对DNA存在Nick的时候仍然能活cas12a酶的活性，随后我们设计了检测目标RNA的方法。我们还发现crRNA配对的DNA有一部分是RNA的时候也是能激活该酶的系统。
该方法最大的创新性是通过建立了一个CRISPR/Cas12a系统的新的激活方式，基于此我们发现可用于检测目标物RNA，不管是肿瘤标志物miRNA还是RNA病毒的RNA，利用此方法都能更便捷的得到检测。
附图说明
图1反应原理图；
图2可行性图；
图3优化crRNA、DNA和cas12a的最适浓度；
图4检测其它miRNA(122)的可行性；
图5改变RNA(a)与crRNA(b)结合配对的位置；
图6设计循环扩增；
图7设计底下DNA nick激活cas12。
具体实施方式
下面的实施例中将对本发明作进一步的阐述，但本发明不限于此。
本发明的具体步骤如下：
(1)设计crRNA和配对的DNA
在美国Integrated DNA Technologies(IDT)公司官网设计引物：
Cr RNA:5’UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCGUCGCCGUC3’
配对DNA:5’TCAACATCAGTCTGATAAGCTAGACGGCGACG3’
miRNA-21:5’UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA3’。
(2)构建CRISPR/Cas12a系统
在100μl EP管里加入cas12a酶和1x NEB 2.1反应buffer，双蒸水，1nM配对的DNA，分子信标FQ以及设计好的crRNA(或者是设计好的配对DNA)。
(3)加入1μM目标物miRNA-21
加入目标物RNA，在实时荧光定量PCR中检测荧光变化。
(4)实验优化及数据处理
分别对整个流程中crRNA的设计、配对DNA的设计、对该反应酶的用量、反应时间、温度等参数进行优化，最终得到该方法的最佳条件。
图1为本发明的反应原理可行性图。
(1)可行性实验：为了实验顺利进行，需要探究crRNA和配对DNA有Nick存在的时候是否能正常的激活cas12a如图1所示。
在100μl EP管里加入cas12a酶和1x NEB 2.1反应buffer，双蒸水，配对的DNA，miRNA21，分子信标FQ以及设计好的crRNA；在涡旋仪上低速旋转使其混匀；
放入实时荧光定量PCR中检测荧光变化，37度2h。
结果如图2所示可以激活cas12a，反应参数在表格1中。
表1
(2)为了更好的激活cas12a，我们优化了crRNA,DNA和cas12a的浓度比；
反应参数见表2，结果在图3中。
表2
(3)选用其它miRNA是否适用
如图4所示，操作步骤和(1)相同，换用miRNA122依旧可激活cas12a，
表示方法的可行性，参数见表3。
表3
(4)改变RNA与crRNA结合配对的碱基
如图5所示，当RNA左右两端翘出来不配对的时候依旧可以激活cas12a，方法步骤和(1)相同。
(5)设计循环扩增原理图
如图6所示，设计了一个DNA和RNA的茎环结构来循环放大cas12a的激活系统，茎环结构茎的RNA部分是激活cas12a和DNA配对的地方，当茎环中的环被切，茎解开成单链去再次和crRNA结合配对的DNA再次激活cas12a，起到一个循环放大的作用。
(6)设计底下DNA nick激活cas12a
(1)—(5)设计的都是crRNA中有nick可以激活cas12a，如图7所示，配对的DNA有nick，当DNA多出来不配对的时候可以激活，后半部分DNA换成RNA也同样能激活cas12a。
Claims (3)
1.基于CRISPR/Cas12a系统激活方式检测核酸标志物RNA病毒的方法，所述方法为非诊断目的,其特征在于，包括如下步骤：
1）加入cas12a酶的反应buffer，双蒸水，设计好的crRNA以及配对的DNA，cas12a酶，分子信标FQ，10个T碱基的单链DNA，一端修饰FAM，一端修饰Quench；
2）加入目标物miRNA-21；
3）在实时荧光定量PCR仪器中实现目标物的检测；
其中，设计好的crRNA以及配对的DNA序列如下：
Cr RNA: 5’UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCGUCGCCGUC3’
配对DNA:5’TCAACATCAGTCTGATAAGCTAGACGGCGACG3’
miRNA-21:5’UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA3’。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
1）在100μl EP管里加入cas12a酶的反应buffer 1xNEB 2.1，双蒸水，设计好的0.5-10µM crRNA以及配对的0.1-10µM DNA，0.1µM cas12a酶，1μM分子信标FQ，10个T碱基的单链DNA，一端修饰FAM，一端修饰Quench；
2）加入目标物1μM miRNA-21；
3）在实时荧光定量PCR仪器中检测每一圈的荧光变化来反映目标物的浓度。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，检测时间1.5-2h。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210002404.9A CN114317681B (zh) | 2022-01-04 | 2022-01-04 | 基于CRISPR/Cas12a系统创新激活方式检测核酸标志物RNA病毒的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210002404.9A CN114317681B (zh) | 2022-01-04 | 2022-01-04 | 基于CRISPR/Cas12a系统创新激活方式检测核酸标志物RNA病毒的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114317681A CN114317681A (zh) | 2022-04-12 |
| CN114317681B true CN114317681B (zh) | 2024-07-09 |
Family
ID=81023285
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210002404.9A Active CN114317681B (zh) | 2022-01-04 | 2022-01-04 | 基于CRISPR/Cas12a系统创新激活方式检测核酸标志物RNA病毒的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114317681B (zh) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110453011A (zh) * | 2019-07-19 | 2019-11-15 | 中山大学 | 一种基于CRISPR/Cas12a快速精准检测非洲猪瘟病毒的方法及应用 |
| CN111187804A (zh) * | 2020-02-20 | 2020-05-22 | 国家卫生健康委科学技术研究所 | 一种基于CRISPR/Cas12a的肺炎支原体核酸快速检测试剂盒及其检测方法 |
-
2022
- 2022-01-04 CN CN202210002404.9A patent/CN114317681B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110453011A (zh) * | 2019-07-19 | 2019-11-15 | 中山大学 | 一种基于CRISPR/Cas12a快速精准检测非洲猪瘟病毒的方法及应用 |
| CN111187804A (zh) * | 2020-02-20 | 2020-05-22 | 国家卫生健康委科学技术研究所 | 一种基于CRISPR/Cas12a的肺炎支原体核酸快速检测试剂盒及其检测方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114317681A (zh) | 2022-04-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN112708699B (zh) | 一种病毒样本灭活裂解试剂盒及其应用 | |
| US9315863B2 (en) | Sequence-specific methods for homogeneous, real-time detection of lamp products | |
| CN112375847B (zh) | 一种基于CRISPR/Cas13a系统的乙型肝炎病毒基因分型检测方法 | |
| EP0562056A1 (en) | Amplification of nucleic acid molecules | |
| CN103773895B (zh) | 一种同时检测水生动物五种dna病毒的多重荧光pcr试剂盒 | |
| JP2022538010A (ja) | ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベース診断 | |
| RU2650806C2 (ru) | Субстраты нуклеиновых кислот с ферментативной активностью | |
| KR20070090230A (ko) | 시토신의 화학적 변형에 의한 미생물 핵산의 단순화 방법 | |
| CN111733293A (zh) | 一种检测sars-cov-2的双链引物探针、试剂盒及多重pcr方法 | |
| CN113502351B (zh) | 一种crRNA及用于CRISPR-Cas12a检测人腺病毒核酸的方法 | |
| CN104789667A (zh) | 一种基于无偏识别与恒温扩增的小rna检测试剂盒及定量方法 | |
| US20220228145A1 (en) | A Ribozyme Comprising a Target-Binding Domain | |
| CN112501257B (zh) | 一种基于核酸自组装无酶催化的circRNA活细胞内成像的可视化传感器 | |
| US20230167511A1 (en) | An ultrasensitive rapid and portable case13d-based diagnostic assay | |
| CN104342487B (zh) | 支原体核酸恒温扩增方法 | |
| CN114317681B (zh) | 基于CRISPR/Cas12a系统创新激活方式检测核酸标志物RNA病毒的方法 | |
| US11814689B2 (en) | Nucleic acid detection using type III CRISPR complex | |
| Petershofen et al. | Detection of nucleic acid sequences from bacterial species with molecular genetic methods | |
| CN103361421B (zh) | 检测microRNA-155的试剂盒及方法 | |
| CN110835643A (zh) | Ebv病毒检测试剂盒 | |
| CN103361420A (zh) | 检测microRNA-122的试剂盒及方法 | |
| WO2022244104A1 (ja) | 等温遺伝子増幅方法、遺伝子検出方法、ウイルスの検出方法及びそれらに使用するキット | |
| CN111492434B (zh) | 核酸比值确定 | |
| CN102618531A (zh) | 确定病毒rna分子3’末端序列的方法 | |
| CN117660609B (zh) | 基于LwaCas13a的非扩增核酸检测组合物、试剂盒和方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |