CN103361420A

CN103361420A - 检测microRNA-122的试剂盒及方法

Info

Publication number: CN103361420A
Application number: CN2013101921875A
Authority: CN
Inventors: 夏涵; 梁盼盼; 黄庆; 府伟灵
Original assignee: First Affiliated Hospital of TMMU
Current assignee: First Affiliated Hospital of TMMU
Priority date: 2013-03-12
Filing date: 2013-08-27
Publication date: 2013-10-23
Anticipated expiration: 2033-08-27
Also published as: CN103361420B

Abstract

本发明公开了检测microRNA-122的试剂盒及方法。本发明所提供的检测microRNA-122的试剂盒，包括SEQ ID NO1和SEQ IDNO2所示的非对称发夹探针。与传统的RT-PCR、northern杂交等技术相比，该试剂盒具有更为突出的优点：（1）液相杂交反应。更加接近分子反应的自然状态，克服了固相杂交存在的空间位阻大的问题，提高了杂交反应的效率。（2）检测效率高，检测速度快。传统核酸检测技术通常需要几小时甚至十几小时，而该技术同时进行分子识别和级联信号放大，可在10分钟内完成核酸检测，无需预先对样本进行RT-PCR反转录扩增。（3）反应体系简单，无需酶反应，成本低廉。

Description

检测microRNA-122的试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及生物领域，尤其涉及检测microRNA-122的试剂盒及方法。

背景技术

microRNAs是在多种真核细胞及病毒中发现的一类来源内源性染色体上的非编码单链小分子RNA，其长度为21～25nt，在进化上具有高度的保守性，能够通过与其目标mRNA分子的3′端非编码区域(3′unt ranslated region,3′UTR)互补导致该mRNA分子的翻译受到抑制。miRNA参与调控真核生物超过1/3以上基因的表达、抑制靶基因的翻译、引起mRNA的降解等，具有非常重要的生物学功能。进一步研究表明，miRNAs在细胞增殖、分化和凋亡、神经元的极性、胰岛素分泌、大脑形态形成、心脏形成、胚胎发育，生物个体死亡等过程中发挥着关键性的作用，这些最新的研究发现为我们提供了全新的疾病发生、发展调控网络，拓展了我们对疾病发生机制的理解和认识。

miRNAs可存在于人体的多种体液中，具有严格的时空性和组织特异性。循环miRNAs是正常细胞或肿瘤细胞释放到血清/血浆的miRNAs，与目前临床常用的蛋白质类、激素类标志物相比，可更早预测和发现疾病发生发展状态。循坏miRNAs是基因表达水平的新型疾病相关特异性生物标志物，在临床实验诊断领域具有巨大的潜能和优势，无疑将极大地提高重大疾病的诊断和治疗水平。

快速、准确、灵敏的miRNAs检测技术是确保循坏miRNAs生物标志物成功应用于临床的关键环节。目前，检测miRNAs的方法主要有Northern印迹分析、基因芯片和实时定量PCR等，但是，由于上述方法都需要预先对样本进行反转录和PCR扩增，才能完成检测，这样既大为增加了检测复杂性和检测时间，又一定程度上干扰了miRNAs的定量检测，同时预扩增存在的实验室污染问题也极大地影响了这些检测方法的准确性，使得这些方法的临床实际应用受到了极大的限制。因此，针对上述问题，如能开发出一种基于新型探针技术，可避免反转录扩增和PCR扩增，直接对多种miRNAs进行并行定量检测的快速、特异、简便的miRNAs检测方法，对于miRNAs的基础研究和临床实际检测，显然都具有十分重要的意义。

microRNA-122（miR-122）在肝脏中高度表达，在其它器官组织中的表达很低甚至检测不到，其表达量占了肝脏中所有miRNA的70%以上，miR-122位于18号染色体上，定位于18q21.31。大量研究表明，miR-122在肝细胞生长、应激反应、脂质代谢、病毒感染、细胞增殖、基因表达、肝细胞表型维持以及肝细胞肝癌等多种生物学过程方面起调控作用，是肝脏重要的调控因子之一。目前，还没有一种快速、特异、简便的检测miR-122的试剂盒及方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测miR-122的试剂盒。

一种试剂盒，包括如下结构的两条探针，

所述非对称发夹探针1，包括回文序列C、两条茎臂B和b、以及连接于茎臂B上的粘性末端A，所述两条茎臂B和b连接于回文序列C的两端且具有互补的核酸序列，所述回文序列C为无关序列，所述茎臂B与其连接的粘性末端A具有靶序列的互补核酸序列；

所述非对称发夹探针2，包括回文序列a、两条茎臂B和b、和连接于茎臂B上的粘性末端c，所述两条茎臂B和b连接于回文序列a的两端且具有互补的核酸序列，所述回文序列a与其相连的一条茎臂b具有靶序列，粘性末端c具有和非对称发夹探针1中所述的无关序列C互补的核酸序列；

所述microRNA-122的靶序列为：

ACUGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG。

优选：所述非对称发夹探针1的核苷酸序列为：CAAACA CCATTGTCACACTCCAGT CAAAGTACTGGAGTGTGACAATGG

所述非对称发夹探针2的核苷酸序列为：ACTGGAGTGTGACAATGG TGTTTGCCATTGTCACACTCCAGT ACTTTG。

一种杂交链反应体系，包括上述非对称发夹探针1和非对称发夹探针2。

所述反应体系还包括待测microRNA-122的靶序列。

本发明还提供一种检测microRNA-122方法。

一种检测microRNA-122方法，包括以下步骤：

（1）将上述非对称发夹探针1和非对称发夹探针2以及待测microRNA-122加入到杂交链反应体系中进行反应，得到反应产物；

（2）对所述步骤（1）得到的反应产物进行电泳检测；

其反应时的条件为99℃，8分钟；50℃，1小时。

我们设计的非对称发夹探针链反应技术，巧妙地结合了分子杂交的高特异性和链式聚合的高效性，通过DNA聚合释放的自由能驱动分子级联放大，其基本原理是：两条特异性自组装探针由靶核酸特异序列和一回文序列组成，在无靶序列存在的情况下，处于亚稳定的发夹结构，而一旦加入待测靶序列，即触发无需酶参与的链式聚合反应，此时特异性自组装探针的靶核酸特异序列部分与对应靶核酸位点结合，其余探针则两两复性成两端均为回文序列的部分双链探针，在分子识别杂交的同时大幅度地增强检测信号，从而实现了待测靶序列的快速检测。与传统的PCR、固相核酸杂交等技术相比，该技术具有更为突出的优点：（1）液相杂交反应。更加接近分子反应的自然状态，克服了固相杂交存在的空间位阻大的问题，提高了杂交反应的效率。（2）检测效率高，检测速度快。传统核酸检测技术通常需要几小时甚至十几小时，而该技术同时进行分子识别和级联信号放大，可在10分钟内完成核酸检测，无需预先对样本进行PCR扩增。（3）反应体系简单，成本低廉。无需酶及其他复杂的分子生物学试剂，反应体系更为简单，试剂可制备成干粉运输及保存。（4）级联放大效率高，能够检测低拷贝核酸。（5）单管反应，操作简便。所有检测在单一闭管中进行，操作步骤简单，并且有效地避免了PCR等传统技术存在的实验室污染问题。（6）适合与其他检测方法整合。该技术的理论基础和技术优势提示我们，非对称发夹探针链反应探针与靶序列杂交结合时不考虑靶序列的性质（DNA或RNA），因此检测RNA链时不再需要预先进行RNA的逆转录，此外得到的短链miRNAs恰好符合促发非对称发夹探针链反应的靶序列长度。本发明优选了靶序列，使其反应非常灵敏，特异性高。针对目标miRNAs设计的多重非对称发夹探针链反应特异性发夹探针，结合一种高效、灵敏的信号检测方法，就可实现快速并行检测多种miRNAs的目的。

附图说明

图1为非对称发夹探针链反应技术原理图，其中，H1、H2、I：发夹探针、发夹探针、待检测microRNA序列；A和a、B和b、C和c为互补核酸序列。

图2为不同长度探针的非对称发夹探针链反应电泳结果图，其中，M：DL2，000DNAmaker；-：空白对照。

图3为探针浓度梯度实验结果图，其中，M：DL2，000DNA maker；-：空白对照。

图4为非对称发夹探针链反应温度梯度实验结果图，其中，M：DL2，000DNA maker；-：空白对照。

图5为探针灵敏度检测结果图，其中，M：DL2，000DNA maker；-：空白对照。

图6为探针特异性检测结果图，其中，M：DL2，000DNA maker；+：阳性对照；-：空白对照。

具体实施方式

实施例1、检测microRNA-122的发夹探针及试剂盒

1、检测靶序列的选择及非对称发夹探针的设计

（1）根据miRNA的分子生物学特点选择检测的靶序列。

通过文献或Genbank数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）查获与癌症相关的人源miRNA序列，将其确定检测靶序列。

（2）特异性非对称发夹探针的设计

采用Array Designer4.0软件针对靶序列设计非对称发夹式探针，设计的备选探针序列提交Genbank数据库进行特异性分析。将设计出的非对称发夹探针提交至The DINAMelt WebServer（http://mfold.rna.albany.edu//?q=DINAMelt/Hybrid2）进行二级结构分析和探针间、探针与靶序列的互补性分析，确认发夹结构及回文序列符合探针设计的需求。

表1检测microRNA-122的发夹探针及靶序列设计

非对称发夹探针链反应技术原理图如图1所示，H1、H2、I：发夹探针、发夹探针、待检测microRNA序列；A和a、B和b、C和c为互补核酸序列；(A)待测靶序列I从探针H1的粘性末端开始发生严格碱基配对的链置换反应从而打开探针的发夹结构，产生新的粘性末端；(B)H1的粘性末端与H2的粘性末端发生反应继续打开探针的发夹结构，继而探针H1和H2之间发生交替杂交反应，形成链式聚合体大幅度放大信号。

2、非对称发夹探针链反应条件的优化

（1）不同长度探针的非对称发夹探针链反应

设计不同长度探针，使探针loop长度分别为4bp、6bp、8bp，分别进行非对称发夹探针链反应实验。体系中探针浓度为1uM。

反应条件为：99℃，8min；50℃，1h；4℃保存。非对称发夹探针链反应产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳，每孔3.5μl上样。

结果如图2所示（M：DL2，000DNAmaker；-：空白对照）。

（2）探针浓度梯度实验

使体系中探针终浓度分别为0.25、0.5、1、2uM，进行非对称发夹探针链反应实验。

结果如图3所示（M：DL2，000DNAmaker；-：空白对照）。

（3）非对称发夹探针链反应温度梯度实验

12μl非对称发夹探针链反应体系包括：40uM的探针H10.3μl；40uM的探针H20.3μl；3×HBN buffer 4μl；无菌水3.4μl；不同浓度的靶序列I4μl。

反应条件如下：99℃，8min；50℃/55℃/60℃，1h；4℃保存。非对称发夹探针链反应产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳，每孔3.5μl上样。

结果如图4所示（M：DL2，000DNAmaker；-：空白对照）。

电泳结果显示可见所设计的非对称发夹探针链反应特异性探针均可成功启动杂交链反应，使得发夹探针结构打开，在无需酶作用的链式反应，因而形成长度不一的聚合DNA片段，在电泳图中显示为较离散的电泳条带。

（1）探针长度实验结果表明：设计的探针环上碱基数越多，反应灵敏度越高，但特异性越差，碱基数位6bp时为最适探针长度。

（2）探针浓度梯度实验结果表明：反应体系中探针浓度越高，非对称发夹探针链反应特异性越差，最终选定1uM为最佳探针终浓度。

（3）温度梯度实验结果表明：杂交温度为50℃时，反应特异性及灵敏度均达到最佳，所以选择50℃为最适反应温度。

3、检测灵敏度的研究

12μl反应体系包括：40uM的探针H10.3μl；40uM的探针H20.3μl；3×HBNbuffer4μl；无菌水3.4μl；不同浓度的靶序列4μl。

反应条件如下：99℃，8min；50℃，1h；4℃保存。非对称发夹探针链反应产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳，每孔3.5μl上样。

实验结果如图5所示（M：DL2，000DNAmaker；-：空白对照）。

实验结果表明：

反应体系中靶序列浓度低于0.05uM时，电泳无法检测出目的条带，说明反应灵敏度为0.05uM。

4、探针特异性研究

12μl非对称发夹探针链反应体系包括：40uM的探针MIR-H1-1220.3μl；40uM的探针MIR-H2-1220.3μl；3×HBN buffer4μl；无菌水3.4μl；分别加入另一组浓度分别为0.5uM，0.1uM，0.05uM，0.01uM的靶序列（序列表中序列4）各4.0μl。阳性对照为本组0.05uM靶序列（TmiR-122）。空白对照为无靶序列对照。

实验结果如图6所示（M：DL2，000DNA maker；+：阳性对照；-：空白对照）：

实验结果表明：

除了阳性对照，其余泳道均无条带，说明两组探针之间无交叉反应，探针特异性较好。

Claims

1.一种试剂盒，包括如下结构的两条探针，

所述microRNA-122的靶序列为：

ACUGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，

所述非对称发夹探针1的核苷酸序列为：

CAAACACCATTGTCACACTCCAGTCAAAGTACTGGAGTGTGACAATGG，

所述非对称发夹探针2的核苷酸序列为：

ACTGGAGTGTGACAATGGTGTTTGCCATTGTCACACTCCAGTACTTTG。

3.一种杂交链反应体系，包括权利要求1或2中的非对称发夹探针1和非对称发夹探针2。

4.根据权利要求3所述的杂交链反应体系，还包括权利要求1或2中的待测microRNA-122的靶序列。

5.一种检测microRNA-122方法，包括以下步骤：

（1）将权利要求1或2中的非对称发夹探针1和非对称发夹探针2以及待测microRNA-122的靶序列加入到杂交链反应体系中进行反应，得到反应产物；

（2）对所述步骤（1）得到的反应产物进行电泳检测。

6.根据权利要求5所述的方法，其反应时的条件为99℃，8分钟；50℃，1小时。