CN103436600A - 一种快速获取鹅oaz1基因全长cds序列及快速检测其表达规律的方法 - Google Patents

一种快速获取鹅oaz1基因全长cds序列及快速检测其表达规律的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN103436600A
CN103436600A CN2013101644529A CN201310164452A CN103436600A CN 103436600 A CN103436600 A CN 103436600A CN 2013101644529 A CN2013101644529 A CN 2013101644529A CN 201310164452 A CN201310164452 A CN 201310164452A CN 103436600 A CN103436600 A CN 103436600A
Authority
CN
China
Prior art keywords
oaz1
gene
goose
pcr
primer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN2013101644529A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103436600B (zh
Inventor
康波
姜冬梅
白林
马容
何珲
邹明峰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sichuan Agricultural University
Original Assignee
Sichuan Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sichuan Agricultural University filed Critical Sichuan Agricultural University
Priority to CN201310164452.9A priority Critical patent/CN103436600B/zh
Publication of CN103436600A publication Critical patent/CN103436600A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103436600B publication Critical patent/CN103436600B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

一种快速获取鹅OAZ1基因全长CDS序列及快速检测其表达规律的方法，包括以下步骤：提取鹅卵巢组织中的总RNA，然后将总RNA反转录为cDNA；分别以鸟类OAZ1和β-actin基因的保守区作为模板，设计OAZ1基因的全长CDS序列引物(OAZ1-L)，快速检测OAZ1基因表达规律的OAZ1和β-actin荧光定量特异性引物；通过RT-PCR扩增反应，PCR产物的回收纯化，DH5α感受态细胞的制备，目的基因的连接、连接产物的转化，阳性菌落的筛选，菌液测序获取全长OAZ1基因全长CDS序列，并测序鉴定所设计的荧光定量引物能特异性的扩增OAZ1和β-actin基因；然后再利用荧光定量PCR进一步鉴定，鉴定结果表明所建立的方法能快速、准确地检测鹅机体中OAZ1基因的表达规律。

Description

一种快速获取鹅OAZ1基因全长CDS序列及快速检测其表达规律的方法
技术领域
本发明涉及一个鹅OAZ1相关基因及其编码蛋白的应用，特别涉及一种快速获取鹅OAZ1基因全长CDS序列及快速检测其表达规律的方法。
背景技术
多胺是活细胞的必需组分，可以参与DNA复制，翻译，转录和细胞凋亡等多种生理活动。细胞内缺乏多胺将抑制细胞的生长，而多胺水平过高则会导致癌症的发生。鸟氨酸脱羧酶(Ornithine Decarboxylase，ODC)是多胺合成的限速酶，在维持细胞多胺稳态的过程中发挥重要作用。鸟氨酸脱羧酶抗酶(Ornithine Decarboxylase Antizyme，OAZ)是由OAZ基因通过特殊的阅读框移码机制翻译的蛋白质。目前已研究证实的OAZ基因家族的4个成员中OAZ1(Ornithine Decarboxylase Antizyme1，OAZ1)是调节ODC活性的重要成员，可介导ODC被26S蛋白酶体降解并且能抑制多胺的转运，负性调控细胞内多胺水平，从而使细胞内多胺浓度维持相对稳定。OAZ1还能通过介导Cyclin D1和Cyclin E1降解，抑制细胞周期。研究证实，在各种癌细胞中多胺水平均显著高于正常水平，细胞的多胺含量与多胺的合成、分解和运输相关，合理的调节这些途径可以抑制肿瘤细胞的生长。而研究表明，OAZ1可通过结合ODC并介导其降解来调节ODC活性，进而调节细胞内多胺水平，抑制肿瘤细胞生长。近年来研究表明，OAZ1还可参与动物繁殖功能的调节。籽鹅卵巢组织中的OAZ1的表达量显著高于产蛋前期，提示OAZ1能通过抑制多胺的生物合成来使卵泡发育处于静止状态。而我们前期研究表明产蛋期四川白鹅小黄卵泡中OAZ1基因的表达量显著高于F1级卵泡，提示OAZ1在卵泡发育过程中发挥重要作用。综上，OAZ1是参与调节细胞内多胺代谢的关键酶，阐明OAZ1基因的结构和功能，建立起OAZ1基因表达规律的快速检测方法具有重要理论意义和实际意义。
分段克隆：将目的基因分成几段来克隆，然后将所有分段的片段进行拼接，最终获得完整的目的片段。在进行分段克隆时需要设计多对引物，且每对引物必须有重叠，在将所有片段克隆出来后还需进行一次PCR反应检测所获取的片段是否为目的片段。
快速扩增cDNA末端技术：RACE技术是基于PCR技术基础之上，分别在cDNA序列的3’末端和5’末端设计特定引物，然后进行克隆，从而获得cDNA全长序列的方法。
但是分段克隆和RACE技术都需要做许多次的PCR和克隆工作，操作过程繁琐，工作量大，耗时长，且成本高。采用半定量反转录-聚合酶链式反应进行定量检测时，其技术原理为PCR反应的终点法，因此只能在PCR反应结束时，获得目的基因片段的拷贝数，不能了解定量过程中的准确变化，期间由于电泳操作的影响，会出现较大误差，不能十分准确的检测目的基因表达量。分段克隆和RACE技术都需要做许多次的PCR和克隆工作，操作过程繁琐，工作量大，耗时长，且成本高。
半定量反转录-聚合酶链式反应：首先将mRNA反转录成cDNA，再进行PCR扩增，取等量的PCR产物在同一块琼脂糖凝胶上电泳检测，然后采用生物信息学分析软件来比较电泳图中目的基因和内参基因条带的光密度值，最后计算目的基因表达量(或拷贝数)的定量检测技术。
采用半定量反转录-聚合酶链式反应进行定量检测时，其技术原理为PCR反应的终点法，因此只能在PCR反应结束时，获得目的基因片段的拷贝数，不能了解定量过程中的准确变化，期间由于电泳操作的影响，会出现较大误差，不能十分准确的检测目的基因表达量。
发明内容
本发明设计全长OAZ1基因的引物，通过RT-PCR扩增直接可以获取全长OAZ1序列，一次PCR和克隆过程就可以获得OAZ1的全长CDS区序列。相较于分段克隆和RACE技术，本方法大大的提高了试验的简便性，节省了试验时间，也很大程度上的降低了试验成本。
半定量法只能通过最终产物的电泳图来判断是否表达，表达量的高低，相当于终点法，这其中还有很多人为影响因素，特别是在进行凝胶电泳的时候加样量是否准确。而本发明采取SYBR-Green染料法进行QRT-PCR检测，设计特异性强的荧光定量PCR引物。在PCR反应过程中，可对整个扩增过程进行实时监测，连续地分析与扩增产物相关的荧光信号的变化，采用我们设计的方法(方案)可以直观并准确的测定OAZ1基因在不同组织和不同发育时期的表达规律。
本发明技术方案带来的有益效果：
本发明设计了全长OAZ1基因的引物，应用普通的RT-PCR技术即可获取全长的OAZ1序列，一次性克隆OAZ1的全长CDS序列。相较于以前的分段克隆和RACE技术，该方法能快速的获取OAZ1基因的全长CDS序列，大大的节省了试验时间和试验成本，也避免了分段克隆可能出现的拼接不成功的情况，提高了试验的准确性。另外，本发明设计了OAZ1的短片段荧光定量PCR检测所需的特异性强、PCR反应效率高的引物序列，该引物序列适合应用SYBR-Green染料进行快速检测不同组织和不同发育时期OAZ1基因mRNA表达规律的研究。在实时定量PCR检测过程中，可对整个反应扩增过程进行实时监测，连续地分析与扩增产物相关的荧光信号的变化。因此，该项发明技术为鹅OAZ1基因的结构和功能研究提供了一个快速获取OAZ1基因全长CDS序列的方法，并建立了一套快速、准确、省时省力的研究鹅OAZ1基因mRAN表达规律的方法。
附图说明
附图1OAZ1全长CDS序列PCR扩增电泳图
附图2OAZ1开放阅读框及其氨基酸序列图
附图3短片段OAZ1和β-actin基因PCR扩增电泳图
附图4β-actin荧光定量标准曲线
附图5β-actin荧光定量溶解曲线
附图6OAZ1荧光定量标准曲线
附图7OAZ1荧光定量溶解曲线
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步的详细说明。
实施案例1.
一种快速获取鹅OAZ1基因全长CDS序列及快速检测其表达规律的方法包括以下步骤：
1.取鹅卵巢组织中的总RNA，并将其反转录为cDNA；
2.设计OAZ1-L基因的引物，长度为874bp；
Forward：TGCGGGGTGTTCAAGATGT
Reverse：GAGGGAGAGGACCTGCAAAC
设计OAZ1-S基因的引物，长度为141bp；
Forward：ACTTCAGGAACCCTCGCATCAACT
Reverse：GCTGCCCTCATCTTTCTAATACGG
设计β-actin基因的引物，长度为222bp；
Forward：GCGGCATGCCACACCGTGCCCATCTATGAG
Reverse：GCGAAGCTTGGCCATCTCCTGCTCGAAGT
3.通过RT-PCR扩增反应、PCR产物的回收纯化、DH5α感受态细胞的制备、目的基因的连接、连接产物的转化、阳性菌落的筛选、菌液测序获取全长OAZ1序列。
4.应用实时荧光定量PCR技术构建OAZ1和β-actin荧光定量PCR引物的标准曲线和溶解曲线，进一步鉴定所设计的OAZ1和β-actin荧光定量引物的特异性和准确性。

Claims (3)

1.一种快速获取鹅OAZ1基因全长CDS序列及快速检测其表达规律的方法包括以下步骤：
1)取鹅卵巢组织中的总RNA，并将其反转录为cDNA；
2)设计OAZ1-L基因的引物，长度为874bp；
Forward：TGCGGGGTGTTCAAGATGT
Reverse：GAGGGAGAGGACCTGCAAAC
设计OAZ1-S基因的引物，长度为141bp；
Forward：ACTTCAGGAACCCTCGCATCAACT
Reverse：GCTGCCCTCATCTTTCTAATACGG
设计β-actin基因的引物，长度为222bp；
Forward：GCGGCATGCCACACCGTGCCCATCTATGAG
Reverse：GCGAAGCTTGGCCATCTCCTGCTCGAAGT
3)通过RT-PCR扩增反应、PCR产物的回收纯化、DH5α感受态细胞的制备、目的基因的连接、连接产物的转化、阳性菌落的筛选、菌液测序获取全长OAZ1序列。
4)应用实时荧光定量PCR技术构建OAZ1和β-actin荧光定量PCR引物的标准曲线和溶解曲线，进一步鉴定所设计的OAZ1和β-actin荧光定量引物的特异性和准确性。
2.一种如权利要求1所述的快速获取鹅OAZ1基因全长CDS序列及快速检测其表达规律的方法，其特征在于：设计了采用常规的RT-PCR方法进行一次性克隆即可快速获得OAZ1基因全长CDS序列的基因特异性引物。
3.一种采用权利要求1所述方法快速、直观并准确的测定OAZ1基因在不同组织和不同发育时期的表达规律。
CN201310164452.9A 2013-04-19 2013-04-19 一种快速获取鹅oaz1基因全长cds序列及快速检测其表达规律的方法 Expired - Fee Related CN103436600B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310164452.9A CN103436600B (zh) 2013-04-19 2013-04-19 一种快速获取鹅oaz1基因全长cds序列及快速检测其表达规律的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310164452.9A CN103436600B (zh) 2013-04-19 2013-04-19 一种快速获取鹅oaz1基因全长cds序列及快速检测其表达规律的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103436600A true CN103436600A (zh) 2013-12-11
CN103436600B CN103436600B (zh) 2016-01-20

Family

ID=49690314

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201310164452.9A Expired - Fee Related CN103436600B (zh) 2013-04-19 2013-04-19 一种快速获取鹅oaz1基因全长cds序列及快速检测其表达规律的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103436600B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103981208A (zh) * 2014-05-05 2014-08-13 四川农业大学 一种鹅突变型oaz1基因真核表达载体的构建方法
CN106008690A (zh) * 2016-05-17 2016-10-12 四川农业大学 鹅oaz1多肽抗原及其多克隆抗体制备方法和应用
CN108059664A (zh) * 2017-11-30 2018-05-22 天津市湖滨盘古基因科学发展有限公司 一种人的鸟氨酸脱羧酶抗酶突变蛋白及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006059081A2 (en) * 2004-11-30 2006-06-08 Imperial Innovations Limited Methods of treatment using melanopsin
CN102268437A (zh) * 2011-07-18 2011-12-07 四川农业大学 一种克隆山羊mc4r基因编码区全序列的方法
CN102796742A (zh) * 2012-07-19 2012-11-28 四川农业大学 一种一步法获取猪opn4基因的完整cds区序列的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006059081A2 (en) * 2004-11-30 2006-06-08 Imperial Innovations Limited Methods of treatment using melanopsin
CN102268437A (zh) * 2011-07-18 2011-12-07 四川农业大学 一种克隆山羊mc4r基因编码区全序列的方法
CN102796742A (zh) * 2012-07-19 2012-11-28 四川农业大学 一种一步法获取猪opn4基因的完整cds区序列的方法

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103981208A (zh) * 2014-05-05 2014-08-13 四川农业大学 一种鹅突变型oaz1基因真核表达载体的构建方法
CN106008690A (zh) * 2016-05-17 2016-10-12 四川农业大学 鹅oaz1多肽抗原及其多克隆抗体制备方法和应用
CN106008690B (zh) * 2016-05-17 2019-06-14 四川农业大学 鹅oaz1多肽抗原及其多克隆抗体制备方法和应用
CN108059664A (zh) * 2017-11-30 2018-05-22 天津市湖滨盘古基因科学发展有限公司 一种人的鸟氨酸脱羧酶抗酶突变蛋白及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN103436600B (zh) 2016-01-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Margue et al. Comparison of a healthy miRNome with melanoma patient miRNomes: are microRNAs suitable serum biomarkers for cancer?
CN102154505B (zh) 一种检测miRNA的方法及引物及其应用
CN110218770B (zh) 特异性检测人源性基因组dna引物及其应用
CN105821042B (zh) 人脐带血间充质干细胞基因组稳定性相关的miRNA及其应用
Liu et al. Low expression of miR-203 promoted diabetic nephropathy via increasing TLR4.
GB2570404A (en) Cell contamination assay
CN103436600A (zh) 一种快速获取鹅oaz1基因全长cds序列及快速检测其表达规律的方法
CN105420393A (zh) 检测brca1基因表达的引物、探针及试剂盒
CN101418343A (zh) miRNA在预测早期原发性肝癌病人术后复发的应用及其试剂盒
CN103740696A (zh) 一种快速获取鹅oaz2基因全长cds序列及快速检测其表达规律的方法
CN103555848A (zh) 小RNA的3’-5’-qPCR定量检测技术
US20160208346A1 (en) Method and composition for detection of oncogenic hpv
CN103571929B (zh) 无损检测细胞miRNA的表达量及确定细胞类型与状态的方法
CN103361420B (zh) 检测microRNA-122的试剂盒及方法
CN103320519B (zh) 定量检测microRNA的PCR分析方法
CN103173449A (zh) 与食管癌术后早期复发和预后相关的miRNA标志物及其应用
CN102899390A (zh) 小细胞肺癌标志物及其检测
CN102851352A (zh) 一种新型荧光实时定量检测miRNA的方法
Sun et al. Selection of stable reference genes for RT–qPCR in Salmo trutta
CN103602672B (zh) 检测基因表达量的引物、探针和试剂盒、及其使用方法
CN103361421A (zh) 检测microRNA-155的试剂盒及方法
Smith et al. Identification and detection of microRNA kidney disease biomarkers in liquid biopsies
CN203530311U (zh) 用于检测braf基因v600e突变的试剂盒
CN103882129A (zh) 一种人血浆中miR-9荧光定量PCR的检测方法和试剂盒
CN103409503A (zh) 一种快速检测血清中miRNA浓度的荧光试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20160120

Termination date: 20210419