CN103571929B - 无损检测细胞miRNA的表达量及确定细胞类型与状态的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种无损检测细胞miRNA的表达量及确定细胞类型与状态的方法，具体为利用细胞培养基中miRNA的表达量来判断细胞类型与状态的方法，包括培养不同类型的细胞，收集其培养基，提取培养基中的RNA，反转录，利用荧光定量PCR的方法检测细胞培养基中的miRNA，根据在对照不同细胞类型与状态下miRNA的表达量与所检到的miRNA表达量的关系来判断所检细胞的类型与状态。本发明的方法首次证明可通过检测培养基中miRNA的表达量判断细胞的类型与状态，包括干细胞的多能性水平和转分化获得的细胞状态等，从而避免对细胞的破坏，尤其适用于细胞数量有限的实验与临床方面的应用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种检测细胞中miRNA(microRNA)的表达量和确定细胞类型与状态的方法，尤其涉及一种快速、简便、对细胞无损并且可以在培养过程中持续检测干细胞多能性水平和其它细胞类型与状态的方法，具体为利用细胞培养基中微小RNA(microRNA，miRNA)的表达量来判断细胞类型与状态的方法，包括培养不同类型的细胞，收集其培养基，提取培养基中的RNA，反转录，利用荧光定量PCR的方法检测细胞培养基中的miRNA，从而根据标志miRNA的表达量判断干细胞的多能性水平或其他细胞的类型与状态。
背景技术
miRNA是真核生物基因组中广泛存在的大小约为21~25个碱基的非编码微小RNA。它一般由位于基因间区及内含子中的miRNA基因转录，形成原始miRNA，在动物细胞核内被加工成70nt左右的miRNA前体（pre-miRNA），再转运到胞质加工为成熟miRNA。成熟miRNA进入miRNA诱导的基因沉默复合物（miRNA-inducedsilencingcomplex;miRISC），与目标mRNA配对，通过降解目标mRNA或阻碍蛋白质翻译来负向调控基因表达（Valencia-Sanchez,M.A.,等,ControloftranslationandmRNAdegradationbymiRNAsandsiRNAs.GenesDev,2006.20(5):p.515-24）。目前的研究已发现人类miRNA有1900多种，这些miRNA参与了人类1/3基因的表达调控，涉及多种关键生命过程。
2008年，Chen等（Chen,X.,等,CharacterizationofmicroRNAsinserum:anovelclassofbiomarkersfordiagnosisofcancerandotherdiseases.CellRes,2008.18(10):p.997-1006）用Solexa测序技术证明了人、大鼠、小鼠、牛、马等物种的血清中可以检测到大量的miRNA。之后大量研究结果提示，血清miRNA与肿瘤组织中miRNA的表达谱相关（Ng,E.K.,等,DifferentialexpressionofmicroRNAsinplasmaofpatientswithcolorectalcancer:apotentialmarkerforcolorectalcancerscreening.Gut,2009.58(10):p.1375-81；Lawrie,C.H.,等,Detectionofelevatedlevelsoftumour-associatedmicroRNAsinserumofpatientswithdiffuselargeB-celllymphoma.BrJHaematol,2008.141(5):p.672-5；Lawrie,C.H.,等,MicroRNAexpressiondistinguishesbetweengerminalcenterBcell-likeandactivatedBcell-likesubtypesofdiffuselargeBcelllymphoma.IntJCancer,2007.121(5):p.1156-61；Zhu,W.,等,CirculatingmicroRNAsinbreastcancerandhealthysubjects.BMCResNotes,2009.2:p.89）。此外，Gilad等（Gilad,S.,等,SerummicroRNAsarepromisingnovelbiomarkers.PLoSOne,2008.3(9):p.e3148）发现利用实时定量PCR（QuantitativeReal-TimeRT-PCR，qRT-PCR）技术可以对人体的尿液、唾液、羊水及胸水中的miRNA进行定量。这些发现为研究miRNA开辟了新的途径，证明了体液中普遍含有miRNA。
目前研究细胞中miRNA的方法一般都是通过收集破坏细胞提取RNA来实现的。但由于胚胎干细胞、诱导多能性干细胞(inducedpluripotentstemcells,iPS细胞)等具有临床应用价值的细胞一般数量有限，并且需要在临床应用前对其细胞特性与状态等特征进行动态检测，收集破坏细胞的方法不仅造成的大量细胞损耗，而且检测结果与继续培养的细胞也具有不一致性，从而成为数量受限的细胞在基础研究与临床应用方面的一个重要瓶颈。针对这一问题，本发明首次证明细胞培养基中存在可检测的miRNA，并且其相对表达丰度与细胞中miRNA的相对表达丰度的变化趋势存在一致性。在检测方法方面，本发明利用TRIZOLLS进行小分子RNA提取，并利用糖原使RNA可见，从而最大限度地防止了RNA丢失。
利用不同手段转变细胞类型（如将分化的动物成体细胞转变为诱导多能性干细胞(iPS细胞)和不经过干细胞状态的成体细胞转分化）是细胞生物学研究的重要方向，也具有广阔的临床应用前景。但由于目前细胞命运转变方法的诱导周期普遍较长，成功率还很低，如果能够在诱导过程中动态地检测细胞的状态，则可在诱导早期对细胞的特性进行判断，有利于快速筛选出符合要求的目标细胞，具有重要的基础研究与临床应用价值。在本发明中，我们通过持续检测小鼠胚胎成纤维细胞（MEF细胞）诱导成为诱导多能性干细胞（iPS细胞）过程中细胞培养基中miRNA在每一天的表达变化情况，证明细胞培养基中miRNA的表达情况与细胞的类型与状态相一致，因此可以通过检测细胞培养基中miRNA的表达情况来判断细胞状态和监测细胞类型的转变。
发明内容
因而，本发明的目的是针对现有技术的不足，提出了一种检测细胞培养基中miRNA含量的方法，首次证明细胞培养基中miRNA的相对丰度与所培养细胞中miRNA的相对丰度的变化趋势存在一致性，因此可以通过检测细胞培养基中miRNA的表达情况来鉴定细胞的类型与状态，从而避免对细胞的破坏，尤其适用于细胞数量有限的基础研究与临床方面的应用。本发明还提供了不同发育潜能的多能性干细胞（2N-iPS细胞为部分多能性细胞，4N-iPS细胞为完全多能性细胞）以及他们的来源细胞培养基中miRNA的表达检测结果，证明培养基中特定miRNA的相对表达量可以指示细胞多能性水平的高低。其中2N-iPS细胞IP20D-3和IP36D-3，4NiPS细胞IP14D-1和IP14D-6来源于小鼠胚胎成纤维细胞（mouseembryofibroblast，MEF），4N-iPS细胞IP16DT-2A来源于小鼠尾尖成纤维细胞（tail-tipfibroblast，TTF），4N-iPS细胞IP14DN-5来源于小鼠神经前体细胞（小鼠AM1-3细胞）。
除非特别指明，本文中的“Ct值”是指“每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数”。
除非特别指明，本文中的“FBS”是指“胎牛血清（FetalBovineSerum）”。
除非特别指明，本文中的“EGF”是指“上表皮生长因子”。
除非特别指明，本文中的“bFGF”是指“碱性纤维生长因子”。
针对上述目的，本发明提供的技术方案如下：
一方面，本发明提供一种快速、简便、对细胞无损的检测细胞中miRNA的表达量的方法，其是通过检测培养基中的miRNA的表达量而进行的，所述细胞培养基中miRNA表达量的检测通过包括以下步骤的方法进行：
1）收集过夜培养细胞的培养基，离心，取上清，再将其过滤；
2）用步骤1）获得的过滤后的上清液提取RNA；
3）将步骤2）提取的RNA进行逆转录反应，得到cDNA溶液；
4）将步骤3）得到的cDNA溶液进行PCR扩增反应，再用荧光定量PCR仪检测，从而得出其miRNA表达量。
优选地，在步骤1）中，所述细胞选自人或动物胚胎成纤维细胞、人或动物诱导多能性干细胞（iPS细胞）、人或动物尾尖成纤维细胞、动物胚胎干细胞（ES细胞）、人或动物成体干细胞、转分化来源的人或动物细胞、人或动物的分化细胞、或肿瘤等疾病细胞或疾病干细胞中的一种或多种。
优选地，所述动物胚胎成纤维细胞可为小鼠胚胎成纤维细胞（mouseembryofibroblast，MEF）。
优选地，所述动物诱导多能性干细胞可选自2N-iPS细胞和4N-iPS细胞，更优选地，所述2N-iPS细胞包括细胞系IP20D-3和IP36D-3，所述4N-iPS细胞包括细胞系IP14D-1、IP14D-6、IP16DT-2A和IP14DN-5。
优选地，所述动物胚胎干细胞为小鼠胚胎干细胞ESC2和/或CL11。
优选地，所述人或动物的分化细胞可选自动物尾尖细胞和/或小鼠神经前体细胞。
优选地，所述动物尾尖成纤维细胞可为小鼠尾尖成纤维细胞（tail-tipfibroblast，TTF）。
优选地，所述神经前体细胞可为小鼠神经前体细胞（小鼠AM1-3细胞）。
优选地，所述肿瘤细胞可为人乳腺癌细胞（MCF-7）。
优选地，当所述细胞为MEF、TTF或MCF-7细胞时，所述培养细胞的培养基配方为450mlDMEM加入50mlFBS，5ml100x青链霉素的培养基。
优选地，当所述细胞为AM1-3时，所述培养细胞的培养基为加入EGF和bFGF（浓度均为20ng/ml）的N2B27培养基。
优选地，当所述细胞为小鼠胚胎干细胞或iPS细胞（诱导多能性干细胞）时，所述培养细胞的培养基为含15%FBS（胎牛血清,Gibco）的DMEM，并添加1000U的LIF（白血病抑制因子，Chemicon）、2mM的谷氨酰胺（glutamine，Sigma）、1mM的丙酮酸钠（sodiumpyruvate，Sigma）、以及0.1mM的β-巯基乙醇（β-mercaptoethanol，Sigma）、0.1mM的非必需氨基酸（non-essentialaminoacid，Gibco）等。
优选地，在步骤4）中，所述PCR扩增反应的上游引物为miRNA特异扩增的上游引物，所述下游引物为序列为通用引物（UniversalAdaptorPCRPrimer），优选地，所述通用引物为商品名AOMD-Q050，GeneCopoeia的通用引物。
优选地，所述miRNA的特异扩增的上游引物为miRNA-292-3P、miRNA-294-3P、miRNA-323-3P或miRNA-21-5P的特异扩增的上游引物。
优选地，所述miRNA-292-3P的特异扩增的上游引物为商品名为MmiRQP0944，GeneCopoeia的引物。
优选地，所述miRNA-294-3P的特异扩增的上游引物为商品名为MmiRQP0947，GeneCopoeia的引物。
优选地，所述miRNA-323-3P的特异扩增的上游引物为商品名为MmiRQP0410，GeneCopoeia的引物。
优选地，所述miRNA-21-5P的特异扩增的上游引物为商品名为HmiRQP0316，GeneCopoeia的引物。
优选地，所述步骤1）通过包括以下步骤的方法进行：收集过夜培养细胞的培养基5-10ml，于2000-3000rpm离心，取上清，再将其用0.45μm的过滤器过滤。
优选地，在步骤1）中，收集过夜培养细胞的培养基5ml，于2000rpm离心。
优选地，在步骤2）中，用TRIZOLLS试剂提取RNA。
优选地，在步骤3）中，用All-in-OneTMmiRNA反转录试剂盒进行逆转录反应。
另一方面，本发明提供一种快速、动态、对细胞无损伤的确定干细胞的多能性水平的检测方法，所述方法是通过上述方法检测干细胞培养基中miRNA的表达量而进行的。
再一方面，本发明提供一种快速、动态、对细胞无损伤的确定细胞类型与状态的检测方法，所述方法是通过上述方法检测细胞培养基中miRNA的表达量而进行的。
还一方面，本发明提供一种快速、动态、对细胞无损伤的鉴定用于临床治疗前细胞状态与性质的检测方法，所述方法是通过上述方法检测细胞培养基中miRNA的表达量而进行的。
因而，从技术层面：本发明提出的检测细胞培养基中miRNA含量的方法，首次证明细胞培养基中miRNA的相对丰度与所培养细胞中miRNA的相对丰度一致，因此可以通过检测细胞培养基中miRNA的表达情况来鉴定细胞的类型与状态，从而避免对细胞的破坏，尤其适用于细胞数量有限的基础研究与临床方面的应用。从应用层面：通过检测细胞培养基中miRNA的表达，可以实现：1）对不同类型干细胞多能性水平的检测；2）对不同时期iPS诱导细胞多能性水平的检测；3）对转分化来源与转分化过程中细胞类型与状态的检测；4）对通过其它方式改变细胞状态而获得的细胞或其它来源与类型的细胞状态的检测。发明人在小鼠和人的培养细胞获得一致的结果，说明本检测方法不具有物种局限性，可被应用于任何物种来源的细胞。总之，本发明提供了有效地提取细胞培养基中的miRNA，并通过对提取的miRNA进行定量PCR检测来判断细胞类型与状态的方法。本发明的方法首次实现在对细胞无创伤的情况下对细胞的类型和状态进行快速的分子水平判断，对于动态监测细胞类型改变、早期与快速的目标细胞筛选、临床应用前细胞状态监测具有重要应用价值。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为实施例1中通过本发明的方法利用PCR检测CL11细胞培养基中的miRNA-292-3P和miRNA-294-3P的扩增曲线，其中，图1A为CL11细胞培养基中的miRNA-292-3P的扩增曲线，图1B为CL11细胞培养基中的miRNA-294-3P的扩增曲线，图中dR表示基线校正的荧光值；
图2为实施例2中通过本发明的方法PCR检测iPS细胞诱导过程中细胞培养基中的miRNA-294-3P的表达结果，其中纵坐标表示以第1天的miRNA表达量为基准，在iPS细胞诱导过程中细胞培养基中，每天的miRNA-294-3P的表达量；
图3为实施例3中通过本发明的方法PCR扩增检测iPS细胞诱导过程中细胞中的miRNA-294-3P的表达结果，其中纵坐标表示以第1天的miRNA表达量为基准，在iPS细胞诱导过程中细胞中，每天的miRNA-294-3P的表达量；
图4为实施例4中通过本发明的方法PCR扩增检测不同细胞培养基中的miRNA-323-3P的表达结果，其中纵坐标表示以第一天的MEF细胞培养基中miRNA的表达量为基准，不同细胞培养基中的miRNA-323-3P的表达量；
图5为实施例5中通过本发明的方法PCR检测不同细胞中的miRNA-323-3P的表达结果，其中纵坐标表示以MEF细胞中miRNA的表达量为基准，不同细胞中的miRNA-323-3P的表达量。
图6为实施例6中通过本发明的方法PCR检测人乳腺癌MCF-7细胞培养基中的miRNA-21-5P的扩增曲线，图中dR表示基线校正的荧光值。
具体实施方式
除非特别指明，以下实施例中的MEF、TTF、AM1-3、IP20D-3、IP36D-3、IP14D-1、IP14D-6、IP16DT-2A、IP14DN-5、ESC2和人乳腺癌细胞系MCF-7均购自中国科学院动物研究所，CL11细胞购自北京生命科学研究所。
其中MEF、TTF和MCF-7细胞的培养基配方为450mlDMEM加入50mlFBS，5ml100x青链霉素。AM1-3培养基为N2B27培养基加入EGF和bFGF（浓度均为20ng/ml），小鼠ES细胞（胚胎干细胞）和iPS细胞（诱导多能性干细胞）培养基为含15%FBS（胎牛血清,Gibco）的DMEM，并添加1000U的LIF（白血病抑制因子，Chemicon）、2mM的谷氨酰胺（glutamine，Sigma）、1mM的丙酮酸钠（sodiumpyruvate，Sigma）、以及0.1mM的β-巯基乙醇（β-mercaptoethanol，Sigma）、0.1mM的非必需氨基酸（non-essentialaminoacid，Gibco）等。
除非特别指明，以下实施例中所用的荧光定量PCR仪型号为StratageneMx3000P荧光定量PCR仪，购自吉泰公司。
除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均为分析纯级的试剂，且可从常规渠道商购获得。
实施例1
a.收集培养基：收集过夜培养的小鼠胚胎干细胞CL11细胞的培养基5ml，2000rpm离心5分钟，取上清，用0.45μm的滤器过滤。
b.提取RNA：将收集的5ml培养基中加入15mlTRIZOLLS试剂(Invitrogen)，用力振荡混匀，冰中静置15分钟。加入4ml氯仿用力震荡均匀，静置15分钟。12000g离心15分钟，收集上清。加入等体积的异丙醇沉淀，1μl糖原，1h（-20℃），然后12000g离心20分钟，沉淀总RNA。用75%乙醇洗涤，干燥沉淀10分钟，用20μl无RNA酶的水溶解，测浓度，-80℃备用。
c.RNA逆转录：用All-in-OneTMmiRNA反转录试剂盒(GeneCopoeia)对步骤b获得的RNA进行逆转录反应，具体操作依该试剂盒说明书进行：在0.5ml离心管中加入18μl在步骤b中获得的RNA，再加入5μl逆转录反应液，1μlPolyA聚合酶，1μlRTasemix，37℃反应1小时，85℃5分钟，得到cDNA溶液。
d.PCR检测：用SYBRGreenPCR检测试剂盒对步骤c的cDNA溶液进行PCR扩增反应。上游引物为：miRNA-292-3P特异扩增的上游引物为商品名的MmiRQP0944，GeneCopoeia引物，miRNA-294-3P特异扩增的上游引物为商品名的MmiRQP0947，GeneCopoeia引物，小RNAU6特异扩增的上游引物为商品名的MmiRQP9002，GeneCopoeia引物，下游通用引物为UniversalAdaptorPCRPrimer（商品名：AOMD-Q050，GeneCopoeia）。在荧光定量PCR反应管中分别加入上下游引物各1μl，cDNA溶液9μl，SYBRGreenPCR反应缓冲液10μl。反应条件：95℃预变性10分钟，然后95℃30秒，60℃1分钟，共40个循环。再用荧光定量PCR仪检测，具体操作以检测试剂盒及荧光定量PCR仪说明书进行，分三次平行扩增胚胎干细胞CL11培养基。
通过检测不同细胞培养基中的miRNA和小RNAU6（内参值）的Ct值，就可根据公式△Ct=CtmiRNA-CtU6来计算该miRNA的△Ct值，根据△Ct值的大小就可以判断出该miRNA的相对表达量，△Ct值小，其对应的miRNA的表达水平高；而△Ct值大，其对应的miRNA的表达水平低。
miRNA-292-3P（SEQIDNO:1：AAAGUGCCGCCAGGUUUUGAGUGU）的扩增结果如图1A所示：图中为胚胎干细胞CL11培养基三次平行扩增miRNA-292-3P的扩增曲线，从扩增曲线可以得到三次平行扩增miRNA-292-3P的Ct值分别为：21.92，21.81，21.99。miRNA-294-3P的扩增结果如图1B所示：图中为胚胎干细胞CL11培养基三次平行扩增miRNA-294-3P的扩增曲线，从扩增曲线可以得到三次平行扩增miRNA-294-3P的Ct值分别为：21.31，21.49，22.15。以上结果说明：细胞培养基中存在miRNA，并且本检测方法存在一致性。
将上述实施例获得的PCR产物，送往中国科学院北京基因组研究所通过Sanger测序法进行测序，结果证明所得PCR产物为目的miRNA-292-3P。
实施例2
a.收集培养基：接种约1x104个MEF细胞，利用KOSM体系进行iPS细胞诱导，收集MEF诱导为iPS细胞过程中从第1天到第16天每天的培养基5ml，2000rpm离心5分钟，取上清，用0.45μm的滤器过滤。
b.提取RNA：将分离的5ml培养基中加入15mlTRIZOLLS试剂(Invitrogen)，用力振荡混匀，冰中静置15分钟。加入4ml氯仿用力震荡均匀，静置15分钟。12000g离心15分钟，收集上清。加入等体积的异丙醇和1μl糖原沉淀1h（-20℃），然后12000g离心20分钟。沉淀总RNA。用75%乙醇洗涤，干燥沉淀10分钟，用20μl无RNA酶的水溶解，测浓度，-80℃备用。
c.RNA逆转录：用All-in-OneTMmiRNA反转录试剂盒(GeneCopoeia)对步骤b获得的RNA进行逆转录反应，具体操作依该试剂盒说明书进行：在0.5ml离心管中加入18μl在步骤b中获得的RNA，再加入5μl逆转录反应液，1μlPolyA聚合酶，1μlRTasemix，37℃反应1小时，85℃5分钟。得到cDNA溶液。
d.PCR检测：用SYBRGreenPCR检测试剂盒对步骤c获得的cDNA溶液进行PCR扩增反应。上游引物为：miRNA-294-3P特异扩增的上游引物为商品名：MmiRQP0947，GeneCopoeia的引物，小RNAU6特异扩增的上游引物为商品名MmiRQP9002，GeneCopoeia的引物，下游通用引物为UniversalAdaptorPCRPrimer（商品名：AOMD-Q050，GeneCopoeia）。在荧光定量PCR反应管中分别加入上下游引物各1μl，cDNA溶液9μl，SYBRGreenPCR反应缓冲液10μl。反应条件：95℃预变性10分钟，然后95℃30秒，60℃1分钟，共40个循环。再用荧光定量PCR仪检测，具体操作以检测试剂盒及荧光定量PCR仪说明书进行。
通过检测不同诱导天数细胞培养基中的miRNA和小RNAU6的Ct值，就可根据公式△Ct=CtmiRNA-CtU6来计算该miRNA的△Ct值，根据△Ct值的大小就可以判断出该miRNA的相对表达量，△Ct值小，其对应的miRNA的表达水平高；而△Ct值大，其对应的miRNA的表达水平低。
培养基中miRNA-294-3P（SEQIDNO:2：AAAGUGCUUCCCUUUUGUGUGU）的相对表达量如图2所示：图中为荧光定量PCR结果经过上述公式计算后得到的各个样品中miRNA-294-3P的相对表达量，纵坐标为miRNA的相对表达量。可以看到：miRNA-294-3P为ES细胞特异表达的标记物（marker），因此在iPS细胞诱导过程中，随着诱导时间的增长，ES克隆逐渐增加，细胞培养基中的miRNA-294-3P的相对表达量也随着诱导时间的增长而增高。图中，以诱导第1天细胞培养基中的表达量为1，其他诱导时间的表达量均为与第1天相比而得到的相对表达量。
将上述实施例获得的PCR产物，送往中国科学院北京基因组研究所通过Sanger测序法进行测序，结果证明所得PCR产物为目的miRNA-294-3P。
实施例3
a.收集细胞：接种约1x104个MEF细胞，利用KOSM体系进行iPS细胞诱导，收集MEF诱导为iPS细胞过程中从第1天到第16天每天的细胞，冰PBS洗涤一遍。
b.提取RNA：将约1x104个细胞加入1mlTRIZOL试剂(Invitrogen)，用力振荡混匀，冰中静置15分钟。加入200μl氯仿用力震荡均匀，静置15分钟。12000g离心15分钟，收集上清。加入等体积的异丙醇沉淀1h（-20℃），然后12000g离心，20分钟。沉淀总RNA。用75%乙醇洗涤，干燥沉淀10分钟，用40μl无RNA酶的水溶解，测浓度，-80℃备用。
c.RNA逆转录：用All-in-OneTMmiRNA反转录试剂盒(GeneCopoeia)对步骤b获得的RNA进行逆转录反应，具体操作依该试剂盒说明书进行：在0.5ml离心管中加入18μl在步骤b中获得的RNA，再加入5μl逆转录反应液，1μlPolyA聚合酶，1μlRTasemix，37℃反应1小时，85℃5分钟。得到cDNA溶液。
d.PCR检测：用SYBRGreenPCR检测试剂盒对步骤c的cDNA溶液进行PCR扩增反应。上游引物：miRNA-294-3P的特异扩增的上游引物为商品名MmiRQP0947，GeneCopoeia的引物，小RNAU6的特异扩增的上游引物为商品名的MmiRQP9002，GeneCopoeia引物，下游通用引物为UniversalAdaptorPCRPrimer（商品名：AOMD-Q050，GeneCopoeia）。在荧光定量PCR反应管中分别加入上下游引物各1μl，cDNA溶液9μl，SYBRGreenPCR反应缓冲液10μl。反应条件：95℃预变性10分钟，然后95℃30秒，60℃1分钟，共40个循环。再用荧光定量PCR仪检测，具体操作以检测试剂盒及荧光定量PCR仪说明书进行。
通过检测不同细胞中的miRNA和小RNAU6的Ct值，就可根据公式△Ct=CtmiRNA-CtU6来计算该miRNA的△Ct值，根据△Ct值的大小就可以判断出该miRNA的相对表达量，△Ct值小，其对应的miRNA的表达水平高；而△Ct值大，其对应的miRNA的表达水平低。
细胞中miRNA-294-3P的相对表达量如图3所示：图中为荧光定量PCR结果经过上述公式计算后得到的各个样品中miRNA-294-3P的相对表达量，纵坐标为miRNA的相对表达量。可以看到：在iPS细胞诱导过程中，细胞中的miRNA-294-3P的相对表达量随着诱导时间的增长而增高。结果表示以诱导第1天细胞的表达量为1，其他诱导时间的表达量均为与第1天相比而得到的相对表达量。
miRNA-294-3P（SEQIDNO:2：AAAGUGCUUCCCUUUUGUGUGU）为ES细胞特异表达的标记物（marker），因此在iPS细胞诱导过程中，随着诱导时间的增长，ES细胞克隆逐渐增加，细胞中的miRNA-294-3P的相对表达量随着诱导时间的增长而增高。与图2相比表明，细胞培养基miRNA-294-3P的表达与所培养细胞状态的改变趋势相一致。
将上述实施例获得的PCR产物，送往中国科学院北京基因组研究所通过Sanger测序法进行测序，结果证明所得PCR产物为目的miRNA-294-3P。
实施例4
a.收集培养基：收集过夜培养MEF、TTF、AM1-3、IP20D-3、IP36D-3、IP14D-1、IP14D-6、IP16DT-2A、IP14DN-5、ESC2、CL11细胞的培养基各5ml，2000rpm离心5分钟，取上清，用0.45μm的滤器过滤。
b.提取RNA：将收集的5ml不同细胞培养基中分别加入15mlTRIZOLLS试剂(Invitrogen)，用力振荡混匀，冰中静置15分钟。加入4ml氯仿用力震荡均匀，静置15分钟。12000g离心15分钟，收集上清。加入等体积的异丙醇和1μl糖原沉淀1h（-20℃），然后12000g离心20分钟。沉淀总RNA。用75%乙醇洗涤，干燥沉淀10分钟，用20μl无RNA酶的水溶解，测浓度，-80℃备用。
c.RNA逆转录：用All-in-OneTMmiRNA反转录试剂盒(GeneCopoeia)对步骤b获得的RNA进行逆转录反应，具体操作依该试剂盒说明书进行：在0.5ml离心管中加入18μl在步骤b中获得的RNA，再加入5μl逆转录反应液，1μlPolyA聚合酶，1μlRTasemix，37℃反应1小时，85℃5分钟。得到cDNA溶液。
d.PCR检测：用SYBRGreenPCR检测试剂盒对步骤c的cDNA溶液进行PCR扩增反应。上游引物：所述miRNA-323-3P的特异扩增的上游引物为商品名MmiRQP0410，GeneCopoeia的引物，小RNAU6的特异扩增的上游引物为商品名的MmiRQP9002，GeneCopoeia引物，下游通用引物为UniversalAdaptorPCRPrimer（商品名：AOMD-Q050，GeneCopoeia）。在荧光定量PCR反应管中分别加入上下游引物各1μl，cDNA溶液9μl，SYBRGreenPCR反应缓冲液10μl。反应条件：95℃预变性10分钟，然后95℃30秒，60℃1分钟，共40个循环。再用荧光定量PCR仪检测，具体操作以检测试剂盒及荧光定量PCR仪说明书进行。
通过检测不同细胞培养基中的miRNA和小RNAU6的△Ct值，就可根据公式△Ct=CtmiRNA-CtU6来计算该miRNA的△Ct值，根据△Ct值的大小就可以判断出该miRNA的相对表达量，△Ct值小，其对应的miRNA的表达水平高；而△Ct值大，其对应的miRNA的表达水平低。
miRNA-323-3P（SEQIDNO:3：CACAUUACACGGUCGACCUCU）的相对表达量如图4所示：图中为荧光定量PCR结果经过上述公式计算后得到的各个细胞的培养基中miRNA-323-3P的相对表达量，纵坐标为miRNA的相对表达量。可以看到：miRNA-323-3P是干细胞多能性标志的标记物（marker），在多能性水平高的细胞中高表达，因此miR-323-3P在成纤维细胞（MEF、TTF）和4N-iPS细胞（IP14D-1、IP14D-6、IP16DT-2A、IP14DN-5）及ES细胞（ESC2、CL11）的培养基高表达，而在2N-iPS细胞（IP20D-3、IP36D-3）及神经前体细胞（AM1-3）的培养基表达很低或不表达。图中，以MEF细胞培养基中的表达量为1，其他细胞的表达量均为与MEF细胞相比而得到的相对表达量。
将上述实施例获得的PCR产物，送往中国科学院北京基因组研究所所通过Sanger测序法进行测序，结果证明所得PCR产物为目的miRNA-323-3P。
实施例5
a.收集细胞：收集MEF、TTF、AM1-3、IP20D-3、IP36D-3、IP14D-1、IP14D-6、IP16DT-2A、IP14DN-5、ESC2和CL11细胞各约1x106个，冰PBS洗涤一遍。
b.提取RNA：将不同细胞中分别加入1mlTRIZOL试剂(Invitrogen)，用力振荡混匀，冰中静置15分钟。加入200μl氯仿用力震荡均匀，静置15分钟。12000g离心15分钟，收集上清。加入等体积的异丙醇沉淀1h（-20℃），然后12000g离心20分钟。沉淀总RNA。用75%乙醇洗涤，干燥沉淀10分钟，用40μl无RNA酶的水溶解，测浓度，-80℃备用。
c.RNA逆转录：用All-in-OneTMmiRNA反转录试剂盒(GeneCopoeia)对步骤b获得的RNA进行逆转录反应，具体操作依该试剂盒说明书进行：在0.5ml离心管中加入18μl在步骤b中获得的RNA，再加入5μl逆转录反应液，1μlPolyA聚合酶，1μlRTasemix，37℃反应1小时，85℃5分钟。得到cDNA溶液。
d.PCR检测：用SYBRGreenPCR检测试剂盒对步骤c的cDNA溶液进行PCR扩增反应。扩增的上游引物为miRNA-323-3P和U6特异扩增的上游引物，miRNA-323-3P的上游引物为商品名MmiRQP0410，GeneCopoeia的引物，小RNAU6的特异扩增的上游引物为商品名MmiRQP9002，GeneCopoeia的引物，下游通用引物为UniversalAdaptorPCRPrimer（商品名：AOMD-Q050，GeneCopoeia）。在荧光定量PCR反应管中分别加入上下游引物各1μl，cDNA溶液9μl，SYBRGreenPCR反应缓冲液10μl。反应条件：95℃预变性10分钟，然后95℃30秒，60℃1分钟，共40个循环。再用荧光定量PCR仪检测，具体操作以检测试剂盒及荧光定量PCR仪说明书进行。
通过检测不同细胞中的miRNA和小RNAU6的Ct值，就可根据公式△Ct=CtmiRNA-CtU6来计算该miRNA的△Ct值，根据△Ct值的大小就可以判断出该miRNA的相对表达量，△Ct值小，其对应的miRNA的表达水平高；而△Ct值大，其对应的miRNA的表达水平低。
在各个细胞中miRNA-323-3P（SEQIDNO:3：CACAUUACACGGUCGACCUCU）的相对表达量如图5所示：图中为荧光定量PCR结果经过上述公式计算后得到的各个细胞中miRNA-323-3P的相对表达量，纵坐标为miRNA的相对表达量。可以看到：miRNA-323-3P在成纤维细胞（MEF、TTF）和4N-iPS细胞（IP14D-1、IP14D-6、IP16DT-2A、IP14DN-5）及ES细胞（ESC2、CL11）高表达，而在2N-iPS细胞（IP20D-3、IP36D-3）及神经前体细胞（AM1-3）表达很低或不表达。与相应细胞培养基中的表达趋势一致，图中以MEF细胞中的表达量为1，其他细胞的表达量均为与MEF细胞相比而得到的相对表达量。
将上述实施例获得的PCR产物，送往中国科学院北京基因组研究所通过Sanger测序法进行测序，结果证明所得PCR产物为目的miRNA-323-3P。
实施例6
a.收集培养基：收集过夜培养人乳腺癌细胞系MCF-7培养基5ml，2000rpm离心5分钟，取上清，用0.45μm的滤器过滤。
b.提取RNA：将收集的5ml培养基中加入15mlTRIZOLLS试剂(Invitrogen)，用力振荡混匀，冰中静置15分钟。加入4ml氯仿用力震荡均匀，静置15分钟。12000g离心15分钟，收集上清。加入等体积的异丙醇和1μl糖原沉淀1h（-20℃），然后12000g离心20分钟。沉淀总RNA。用75%乙醇洗涤，干燥沉淀10分钟，用20μl无RNA酶的水溶解，测浓度，-80℃备用。
c.RNA逆转录：用All-in-OneTMmiRNA反转录试剂盒(GeneCopoeia)对步骤b获得的RNA进行逆转录反应，具体操作依该试剂盒说明书进行：在0.5ml离心管中加入18μl在步骤b中获得的RNA，再加入5μl逆转录反应液，1μlPolyA聚合酶，1μlRTasemix，37℃反应1小时，85℃5分钟。得到cDNA溶液。
d.PCR检测：用SYBRGreenPCR检测试剂盒对步骤c的cDNA溶液进行PCR扩增反应。上游引物：所述miRNA-21-5P的特异扩增的上游引物为商品名为HmiRQP0316，GeneCopoeia的引物，小RNAU6的特异扩增的上游引物为商品名MmiRQP9002，GeneCopoeia的引物，下游通用引物为UniversalAdaptorPCRPrimer（商品名：AOMD-Q050，GeneCopoeia）。在荧光定量PCR反应管中分别加入上下游引物各1μl，cDNA溶液9μl，SYBRGreenPCR反应缓冲液10μl。反应条件：95℃预变性10分钟，然后95℃30秒，60℃1分钟，共40个循环。再用荧光定量PCR仪检测，具体操作以检测试剂盒及荧光定量PCR仪说明书进行，分三次平行扩增人乳腺癌细胞MCF-7细胞培养基。
通过检测细胞培养基中的miRNA和小RNAU6的△Ct值，就可根据公式△Ct=CtmiRNA-CtU6来计算该miRNA的△Ct值，根据△Ct值的大小就可以判断出该miRNA的相对表达量，△Ct值小，其对应的miRNA的表达水平高；而△Ct值大，其对应的miRNA的表达水平低。
miRNA-21-5P（SEQIDNO:4：UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA）的扩增结果如图6所示：图中为人乳腺癌细胞MCF-7培养基三次平行扩增miRNA-21-5P的扩增曲线，从扩增曲线可以得到三次平行扩增的Ct值分别为：27.01，26.98，27.35。以上结果说明：人乳腺癌细胞MCF-7细胞培养基中存在miRNA，并且本检测方法存在一致性。
将上述实施例获得的PCR产物，送往中国科学院北京基因组研究所通过Sanger测序法进行测序，结果证明所得PCR产物为目的miRNA-21-5P。
本发明涉及由本方法检测到ES细胞特异高表达的标记物（marker）—miRNA-292-3P和miRNA-294-3P以及Dlk1-Dio3印迹区的微小RNA—miRNA-323-3P，其中Dlk1-Dio3印迹区中的微小RNA在2N-iPS细胞中表达低而在4N-iPS细胞中表达高。在我们的结果中可以看到：1.在MEF诱导为iPS细胞的过程中，MEF为成纤维细胞，不表达ES细胞特异表达的miRNA-294-3P，而随着诱导时间的增加，ES细胞越来越多，miRNA-294-3P表达逐渐上升，第一时间观察到了细胞命运的转换。2.miRNA-323-3P在成纤维细胞（MEF、TTF），4N-iPS细胞（IP14D-1、IP14D-6、IP16DT-2A、IP14DN-5）及ES细胞（ESC2、CL11）中高表达，而在2N-iPS细胞（IP20D-3、IP36D-3）及神经前体细胞（AM1-3）中表达很低或不表达。可以通过检测培养基中miRNA的表达鉴定细胞的多能性水平。3.在人的细胞培养基中也可以检测到miRNA，说明本方法适用于多种属，为以后本方法应用于利用ES与iPS细胞进行临床治疗前细胞性质检测、转分化来源的细胞性质检测、临床对IVF胚胎植入前发育潜能的检测以及其它需要无损伤确定细胞状态的应用提供了很好的基础。通过本发明的方法首次检测到细胞培养基中的miRNA且证明培养基中的miRNA的表达趋势与所培养细胞中miRNA的表达趋势一致。首次证明可以通过检测培养基中miRNA的表达鉴定细胞的类型与状态，从而避免对细胞的破坏，尤其适用于细胞数量有限的基础研究与临床方面的应用。总之，本发明首次采用无损伤性的方法检测细胞在不同类型和状态下miRNA的表达水平，可为动态的无创性鉴定细胞类型和特性与观察细胞命运的转换提供了新的思路。
Claims (24)
1.一种快速、简便、对细胞无损地检测细胞中miRNA的表达量和确定细胞类型与状态的方法，其是通过检测细胞培养基中的miRNA的表达量而实现的，所述培养基中miRNA表达量的检测通过包括以下步骤的方法进行：
1)收集过夜培养细胞的培养基，离心，取上清，再将其过滤；
2)用步骤1)获得的过滤后的上清液提取RNA；
3)将步骤2)提取的RNA进行逆转录反应，得到cDNA溶液；
4)将步骤3)得到的cDNA溶液进行PCR扩增反应，再用荧光定量PCR仪检测，从而得到其中miRNA的表达量；
其中，依据培养基中miRNA的表达量，推算出细胞中miRNA的量，进而推断细胞的类型与状态，即，通过检测细胞培养基中miRNA的表达情况来鉴定细胞的类型与状态；
在步骤1)中，所述细胞选自人或动物胚胎成纤维细胞、人或动物诱导多能性干细胞、动物胚胎干细胞、人或动物成体干细胞、转分化来源的人或动物细胞、人或动物的分化细胞或肿瘤疾病细胞或疾病干细胞中的一种或多种；
其中所述方法不是用于疾病的诊断方法。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述动物诱导多能性干细胞选自2N-iPS细胞和4N-iPS细胞。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述2N-iPS细胞包括细胞系IP20D-3和IP36D-3，所述4N-iPS细胞包括细胞系IP14D-1、IP14D-6、IP16DT-2A和IP14DN-5。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述动物胚胎干细胞为ESC2和/或CL11。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述动物胚胎成纤维细胞为小鼠胚胎成纤维细胞。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，人或动物的分化细胞选自动物尾尖细胞和/或神经前体细胞。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述动物尾尖细胞为小鼠尾尖细胞；所述神经前体细胞为小鼠神经前体细胞。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述肿瘤疾病细胞为人乳腺癌细胞。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤1)中，当所述细胞为小鼠胚胎成纤维细胞、小鼠尾尖细胞或人乳腺癌细胞时，所述培养细胞的培养基为450mlDMEM加入50mlFBS，5ml100x青链霉素的培养基；或
当所述细胞为小鼠神经前体细胞时，所述培养细胞的培养基为添加有EGF和bFGF的N2B27培养基；或
当所述细胞为小鼠胚胎干细胞或小鼠iPS诱导多能性干细胞时，所述培养细胞的培养基为含15％FBS的DMEM培养基。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，当所述细胞为小鼠神经前体细胞时，所述N2B27培养基添加的EGF和bFGF的浓度均为20ng/ml。
11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，当所述细胞为小鼠胚胎干细胞或小鼠iPS诱导多能性干细胞时，所述DMEM培养基中还添加有1000U的白血病抑制因子、2mM的谷氨酰胺、1mM的丙酮酸钠、0.1mM的β-巯基乙醇和0.1mM的非必需氨基酸。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤4)中，所述PCR扩增反应的上游引物为miRNA特异扩增的上游引物，所述下游引物为通用引物。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述通用引物为商品名AOMD-Q050，GeneCopoeia的通用引物。
14.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述miRNA的特异扩增的上游引物为miRNA-292-3P、miRNA-294-3P、miRNA-323-3P或miRNA-21-5P的特异扩增的上游引物。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述miRNA-292-3P的特异扩增的上游引物为商品名为MmiRQP0944，GeneCopoeia的引物。
16.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述miRNA-294-3P的特异扩增的上游引物为商品名为MmiRQP0947，GeneCopoeia的引物。
17.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述miRNA-323-3P的特异扩增的上游引物为商品名为MmiRQP0410，GeneCopoeia的引物。
18.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述miRNA-21-5P的特异扩增的上游引物为HmiRQP0316，GeneCopoeia的引物。
19.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤1)通过包括以下步骤的方法进行：收集过夜培养细胞的培养基5-10ml，于2000-3000rpm离心，取上清，再将其用0.45μm的过滤器过滤。
20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，在步骤1)中，收集过夜培养细胞的培养基5ml，于2000rpm离心。
21.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，用TRIZOLLS试剂提取RNA。
22.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤3)中，用All-in-OneTMmiRNA反转录试剂盒进行逆转录反应。
23.一种确定细胞类型与状态和干细胞的多能性水平的方法，所述方法是通过权利要求1至22中任一项所述的方法检测细胞中miRNA的表达量而进行的。
24.一种鉴定用于临床治疗前细胞类型与状态的方法，所述方法是通过权利要求1至22中任一项所述的方法检测细胞中miRNA的表达量而进行的。
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