CN103940998B - 血清microRNA作为肝细胞癌转移的早期诊断标志物的应用 - Google Patents

血清microRNA作为肝细胞癌转移的早期诊断标志物的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了miR-107联合miR-1246作为肝细胞癌转移的早期诊断标志物的应用。本发明通过研究发现，血清miR-107联合miR-1246诊断早期肝癌转移优于AFP，具有较好的灵敏度和特异性，而且miR-107、miR-1246联合AFP诊断更优。对于低甲胎蛋白分泌肝癌(AFP<200)的转移诊断，miR-1246优于APF；miR-107联合miR-1246诊断明显优于APF；并且miR-107、miR-1246联合AFP更优。在此基础上，本发明开发了检测miR-107、miR-1246的引物、试剂盒及检测方法，具有较好的开发前景和临床应用价值。引物序列如SEQ？IDNO.3、4所示，试剂盒由特异性扩增引物以及PCR扩增所需试剂组成。

Description

血清microRNA作为肝细胞癌转移的早期诊断标志物的应用
技术领域
本发明涉及血清microRNA(miR-107联合miR-1246)作为肝细胞癌转移的早期诊断标志物的应用，属于生物技术和医学领域。
背景技术
肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)是世界范围内第五大常见消化系统恶性肿瘤，具有恶性程度高、转移率高、复发率高、预后极差等特点，发病率及死亡率呈逐渐上升趋势，是造成世界癌症相关死亡的第三大因素。
肝细胞癌复发率极高，国内报道肝癌患者的术后5年复发率高达61.5％，5年生存率仅为30％～40％。而肝癌细胞的易转移性是造成术后高复发率的重要因素，并与抗肿瘤治疗的失败密切相关，可以认为肝癌患者的重要死因是肝癌细胞的转移而非肝癌本身。
越来越多的研究表明，肿瘤细胞被释放于脉管系统的过程可发生于肿瘤发展的早期，即部分患者在检测到肝癌原发灶时，已发生了肝癌细胞转移。而目前，血清甲胎蛋白(AFP)检测、B超、CT、核磁共振等传统诊断技术的低敏感性无法满足临床需求。影像学方法作为诊断肝癌转移的唯一手段，无法检测到隐匿在原发灶以外组织的肿瘤微转移。即使通过手术切除原位肝癌组织，由于一些微小转移灶未被发现，存在术后复发的高隐患。且转移到异位的肝癌细胞常常对放疗、化疗等不敏感，极易逃逸常规治疗而获得长期存活。因此对于伴随有转移的患者，手术治疗弊大于利。
甲胎蛋白(alphafetoprotein，AFP)是当前用于肝癌诊断、判断病情进展和预测复发转移的最常见的血清学标志物。但是，在很多进展期肝癌患者中，AFP呈阴性或轻度升高，因此在这些病例中无法用AFP进行病情进展和转移复发的判断。并且，很多肝炎、肝硬化、结肠炎、结肠癌的患者中，AFP也呈中度升高。这些均给AFP用于临床肝癌的转移判断造成了极大的障碍。
因此，关于肝癌转移的早期有效诊断，将直接影响到治疗策略的制定和患者的预后，是降低肝癌患者死亡率的关键，具有极大的研究价值和临床应用前景。而目前尚无有效的肝细胞癌转移早期诊断和预测指标，尤其是对AFP呈阴性或轻度升高的患者，更无法对其转移和复发进行有效判断。因此，对新型的肝癌转移早期无创诊断技术的开发迫在眉睫。
微小RNA(microRNA或miRNA)是一类长度约18～25核苷酸的非编码小RNA，可与目标mRNA分子的3'端非编码区域(3'-UTR)互补配对，并根据序列互补程度的不同，抑制靶mRNA的翻译或将其直接切割降解，从而对靶基因进行转录后表达水平的调控。研究表明，根据靶基因对肿瘤的作用效应不同，microRNA可起到致癌基因或抑癌基因的作用，参与调控细胞周期、血管生成、凋亡、分化，侵袭和转移等一系列肿瘤细胞的生物学行为。miRNAs的遗传变异、基因沉默、缺失或扩增都可引起肿瘤的发生或个体对肿瘤的易感性增加。
大量的研究证实，在肿瘤进展的不同阶段中，具有不同的特征性microRNA表达，并形成独特的microRNA表达谱,与癌症(包括HCC)发展和患者预后密切相关。但是通过手术直接检测组织中microRNA来进行转移诊断的方法，创伤性大，对于伴随有转移的患者十分不利。而应用外周血的血清microRNA进行肿瘤的诊断和预后的判断是近年来新兴的一种判断疾病发生、进展和转归的新手段。
血清microRNA具有稳定性、灵敏性、检测的无创性和可参照性等特点。具体特点如下：(1)高度的稳定性。研究表明，血清中长期稳定存在大量处于循环状态的microRNA，其表达的稳定性高于组织和细胞中microRNA，耐RNA酶降解,耐煮沸，耐反复冻融和酸碱环境，长期保存仍能够获得稳定、高质量的microRNA。因此血清microRNA检测较便捷，成本低，可重复性强，可信度高。(2)高度的灵敏度。血清microRNA不仅具有组织特异性，并且在不同肿瘤以及肿瘤的不同分期中，microRNA的表达谱均不同，提示microRNA的表达谱能够动态反应疾病的进展和变化，能够作为疾病诊断、病程进展和转移的有效标记物。(3)检测的无创性。肿瘤组织中microRNA虽可作为一种新的肿瘤诊断和转移预测的标志物，但采集肿瘤组织microRNA的手术或穿刺均具有较大的创伤性。而相比而言，血清microRNA检测具有无创性、非侵入性和连续测量性的优势，临床上操作便捷，易于推广等特点，是优于手术获得组织microRNA的一种检测方法。(4)可参照性。研究表明，血清microRNA在不同的健康个体中均具有稳定表达的特点，不存在明显的性别差异和个体差异性，便于设定参照值以对比诊断。通过多个microRNA生物标志物联合应用可以快速、准确、低成本的早期预测和判断HCC患者的转移状况。
综上，血清microRNA是一种理想的肝细胞癌转移早期诊断标志物。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种应用血清microRNA作为肝细胞癌转移的早期诊断标志物的新方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明结合肝癌细胞抵抗失巢凋亡的肝癌转移的细胞模型和临床血清样本，利用microRNA表达谱芯片技术，分别比较伴有肝癌转移和未转移的肝癌患者血清microRNA表达谱，以及处于转移状态和未转移状态的细胞模型，取两者交集，筛选得到了表达水平与肝癌转移与否密切相关的关键microRNA。在此基础上利用Real-timePCR等技术检测大量临床样本血清中候选关键microRNA的表达水平。随后采用SPSS16.0软件(SPSSInc.,USA)分析发现：血清miR-107联合miR-1246诊断肝细胞癌转移优于AFP，具有较好的灵敏度和特异性，而且miR-107、miR-1246联合AFP诊断更优。对于低甲胎蛋白分泌肝癌(AFP<200)的转移诊断，miR-1246优于APF；miR-107联合miR-1246诊断明显优于APF；并且miR-107、miR-1246联合AFP更优。因此，miR-107联合miR-1246可以作为肝细胞癌转移的早期诊断标志物，用于肝细胞癌转移的早期诊断，具体应用时，检测待诊断患者外周血血清中miR-107、miR-1246的表达水平，对肝癌转移进行诊断。应用以下公式，对miR-107和miR-1246的表达量进行计算：
Logit(P)＝2.665+0.021*miR-107+0.039*miR-1246；
若计算值高于0.623，则判断为肝癌转移；若计算值低于0.623，则判断为肝癌预后较好，不转移。
所述miR-107的序列为AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUCA，如SEQIDNO.1所示。
所述miR-1246的序列为AAUGGAUUUUUGGAGCAGG，如SEQIDNO.2所示。
本发明还提供了用于检测miR-107、miR-1246的特异性引物，miR-107的上游特异性引物序列为：AGCAGCATTGTACAGGGCTATCA，如SEQIDNO.3所示；miR-1246上游特异性引物序列为AATGGATTTTTGGAGCAGG，如SEQIDNO.4所示。miR-107和miR-1246的下游引物均为通用的适配子引物。
本发明还提供了一种用于检测miR-107、miR-1246的试剂盒，试剂盒由上述特异性扩增引物以及PCR扩增所需试剂(核酸抽提试剂、聚合酶链式反应试剂等)组成。进一步地，试剂盒的组成如下(表1)：
表1试剂盒组成
其中，miR-107的上游特异性引物序列为：AGCAGCATTGTACAGGGCTATCA，，如SEQIDNO.3所示；miR-1246上游特异性引物序列为AATGGATTTTTGGAGCAGG，如SEQIDNO.4所示；逆向引物序列为通用的适配子引物。内参为U6基因，其上游引物序列为：GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT，如SEQIDNO.5所示；下游引物序列为：CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT，如SEQIDNO.6所示。
采用上述试剂盒检测miR-107、miR-1246的具体方法(即miR-107联合miR-1246作为肝细胞癌转移的早期诊断标志物进行诊断的方法)为：
(1)microRNA的提取：
①取待诊断患者的外周血血清400μl，加入750μl裂解液MRL，吹打几次，剧烈震荡混匀，在室温下孵育5min，小心吸取上清转入一个新的RNasefree的离心管中。
②加200μl氯仿，盖紧样品管盖，剧烈震荡15s并将其在室温下孵育3min。于4℃12000rpm离心10min；样品会分成3层，去上层水相，移到新的RNasefreeEP管中。
③加入0.6倍体积的70％乙醇，颠倒混匀，得到的溶液和可能沉淀一起转入吸附柱RA中。10000rpm离心45s。
④收集下滤液，加入2/3体积的无水乙醇，颠倒混匀，将混合液倒入吸附柱RB，10000rpm离心30s，弃掉废液。
⑤加入700μl漂洗液RW，12000rpm离心60s，弃掉废液。加入500μlRW，12000rpm离心60s，弃掉废液。
⑥将吸附柱RB放回空收集管，12000rpm离心2min，尽量除去漂洗液。取出RB，放入到一个新的RNasefreeEP管中。
⑦在吸附膜中间加15μlRNasefreewater，室温放置2min，12000rpm离心1,min。收集得到纯净microRNA。
(2)miR-107/miR-1246的检测：
①按照得到的RNA+逆转录缓冲液5μl+逆转录酶1μl+2.5U/μl聚合酶1μl+去RNA酶水补足到25μl。
②37℃水浴60min；85℃水浴5min后放于冰上，得到的microRNAcDNA。
③cDNA2μl+2xqPCR混合液10μl+上下游引物(2μM)2μl+通用引物(2μM)2μl+DDW4μl。
④预变性95℃10min→(变性10秒→退火60℃20秒→延伸72℃15秒)45个循环熔解曲线72℃-95℃0.5℃/10秒→冷却25℃30秒。
⑤根据得到的Ct值，减去内参基因，代入2-ΔΔCT，得到miR-3126-5p在该病人中的表达值。
本发明采用血清miR-107联合miR-1246诊断肝细胞癌转移，具有较好的灵敏度和特异性，可以推广应用。
附图说明
图1：microRNA芯片结果的cluster聚类分析结果图。聚类分析结果表明细胞模型可以很好地模拟临床检测结果，而且克服了临床样本个体差异性较大的问题，所以我们在进一步筛选过程中主要参考体外细胞模型进行筛选。
图2：三个肝癌细胞系BEL7402，SMMC7721，HepG2的细胞培养上清的差异miRNA检测结果。miRNA表达谱芯片显示，在发生失巢凋亡抵抗的细胞培养上清中上调的microRNA有miR-92a-3p，miR-16-2-3p，miR-17-5p，miR-486-5p，miR-16-5p。
图3：AFP和候选microRNA在肝癌不同进展时期的表达分布。应用Real-timePCR检测前期筛选的6个microRNA，根据扩增曲线Ct值，经U6均一化处理后，通过2-ΔΔCT方法计算得到目的miRNA的相对表达量。AFP和候选microRNA在肝癌进展不同时期的表达分布情况如图所示，其中，由上到下、由左到右依次为：AFP，miR-17-5p，miR-16-2-3p，miR-107，miR-92a-3p，miR-3126-5p，miR-1246。
图4：血清microRNA诊断早期肝细胞癌转移的价值(miR-107联合miR-1246；miR-107、miR-1246联合AFP)。如图所示，血清miR-107联合miR-1246(AUC为0.863)诊断肝细胞癌转移优于AFP(AUC为0.85)；而且miR-107、miR-1246联合AFP(AUC为0.915)诊断更优。
图5：血清microRNA对低甲胎蛋白分泌的肝癌转移的诊断价值。如图所示，对于低甲胎蛋白分泌肝癌(AFP<200)的转移诊断，miR-1246(AUC为0.66)优于APF(AUC为0.643)。
图6：血清miR-107联合miR-1246对低甲胎蛋白分泌肝癌转移的诊断价值(miR-107联合miR-1246；miR-107、miR-1246联合AFP)。(图中横坐标为判断转移的敏感性、纵坐标为判断转移的特异性)。如图所示，miR-107联合miR-1246(AUC为0.714)诊断明显优于APF(AUC为0.643)；并且miR-107、miR-1246联合AFP(AUC为0.73)更优。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1血清标本收集
血清标本共155例，其中62例伴转移患者血清、53例未转移患者血清，以及40例健康对照。血清来自山东大学省立医院感染科，血清在临床诊断时即收取，收取时间自2012年3月至2013年11月。血清收集于促凝管内，2000-3000rpm离心18-20min，吸取上清与离心管中，-80℃分装保存。患者临床病例特征如表1所示。
表1血清标本的临床资料
肿瘤分期按照巴塞罗那分级标准。
实施例2microRNA芯片的检测
1.Poly-HEMA板制备
用20mL95％的乙醇溶解2.4gPoly-HEMA粉末，65℃振荡混匀8h以上，制备成浓度为120mg/mL的Poly-HEMA储存液，于4℃密封保存。制板时用95％的乙醇稀释成工作液，在无菌条件下将工作液沿孔壁轻轻加入培养板孔的底部至覆盖整个孔底，紫外线照射过夜后置于4℃保存。使用前在紫外灯下照射0.5h，并用无菌PBS洗涤3遍。
2.肝癌细胞失巢模型的制备
肝癌细胞系HepG2，BEL7402和SMMC7721，以RPMll640加10％胎牛血清为培养液，在37℃、5％C02条件下培养至对数生长期。用O.25％的胰蛋白酶将对数期贴壁肝癌细胞消化成单细胞悬液，调整好浓度后，加入Poly-HEMA培养板中继续培养。
3.细胞培养上清的制备
肝癌细胞系HepG2，BEL7402和SMMC7721培养至对数生长期时，用0.25％的胰蛋白酶消化成单个细胞，用细胞计数板计数，将肝癌细胞按3x105/mL的浓度分别种到普通6孔板以及Poly-HEMA铺被的板中。培养24h后，贴壁细胞直接收集上清；在Poly-HEMA板中的细胞被强制不能贴壁，以成团生长的方式抵抗失巢凋亡。收集全部细胞和细胞培养液后，以1000rpm的转速进行4℃离心，收集到此种条件下的细胞培养上清，置于-80℃冻存备用。
在齐鲁医院收集3例原发性肝癌病人、3例肝癌转移病人、3例正常人的血清，1000rpm离心5min,并于-80℃冻存备用。
4.送检样品的编号及初步处理
进行microRNA芯片分析的15例样品编号原则如表2所示：
表2.microRNA芯片样本处理方式及编号
在贴壁培养24h的培养上清(E1、E2、E3)，脱离粘附基质后培养24h的培养上清(F1、F2、F3)；3例转移性肝癌患者外周血血清(M1、M2、M3)；3例原位肝癌患者血清(H1、H2、H3)；3例正常人外周血血清(N1、N2、N3)。
TRIzol(invitrogen)和miRNeasyminikit(QIAGEN)提取样品总RNA，NanoDrop1000检测RNA质量，利用miRCURYTMLNAArray(v.16.0)系统对microRNA表达进行分析。microRNA表达谱的检测委托康成生物公司进行。
实施例3血清microRNA的提取
(1)吸取400μl冻存的病人血清，加入750μl裂解液MRL，吹打几次；
(2)将匀浆样品剧烈震荡混匀，在室温下孵育5min，小心吸取上清转入一个新的RNasefree的离心管中。
(3)每750μl裂解液加200μl氯仿，盖紧样品管盖，剧烈震荡15s并将其在室温下孵育3min。
(4)于4℃12000rpm离心10min；样品会分成3层，去上层水相，移到新的RNasefreeEP管中。
(5)加入0.6倍体积的70％乙醇，颠倒混匀，得到的溶液和可能沉淀一起转入吸附柱RA中。
(6)10000rpm离心45s，收集下滤液，加入2/3体积的无水乙醇，颠倒混匀，将混合液倒入吸附柱RB，10000rpm离心30s，弃掉废液。
(7)加入700μl漂洗液RW，12000rpm离心60s，弃掉废液。
(8)加入500μlRW，12000rpm离心60s，弃掉废液。
(9)将吸附柱RB放回空收集管，12000rpm离心2min，尽量除去漂洗液。
(10)取出RB，放入到一个新的RNasefreeEP管中，在吸附膜中间加30μlRNasefreewater，室温放置2min，12000rpm离心1,min。收集得到纯净microRNA保存于-80℃。
实施例4microRNA逆转录
取2μgRNA，在室温解冻，解冻后迅速置于冰上。按照表3配制混合液。
表3逆转录体系
37℃.60min；85℃，5min后放于冰上，得到的microRNAcDNA可用于后续实验，或置于-20℃保存。
实施例5Real-timePCR检测基因表达
以上述逆转录反应得到的cDNA为模板，每个待测基因每个模板设置三个复孔，在冰上操作，反应体系配制如表4所示。
表4RealtimePCR反应体系
按照两步法PCR设定反应步骤。
反应结束，根据熔解曲线和Ct值，按照公式得到目的基因在这一模板中的相对表达值后进行分析。
实施例6候选microRNA的筛选策略
用于microRNA芯片分析的15例样品编号如表1。对芯片结果应用cluster软件进行聚类分析(结果见图1)。聚类分析结果表明细胞模型可以很好地模拟临床检测结果，而且克服了临床样本个体差异性较大的问题，所以我们在进一步筛选过程中主要参考体外细胞模型进行筛选。
正常上皮细胞在脱离基质附着后会启动失巢凋亡；肝癌细胞在脱离基质后，通过一系列机制逃避凋亡。肝癌细胞在发生发展过程中，经历了癌变的各个阶段，失巢凋亡是肝癌细胞存活的一个筛选压力。处于失巢状态的肝癌细胞，在获得抵抗失巢凋亡能力的同时，各种细胞的恶性行为也得到了升华，体现在抵抗失巢凋亡的肝癌细胞其侵袭力、转移力、抵抗外界刺激的能力都大大提高，能够逃逸包括放疗、化疗和凋亡诱导等治疗肿瘤的通用治疗策略，因此肝癌细胞的失巢模型代表了恶性程度更高的一类转移性肿瘤，体现了肿瘤在进展过程中所获得的恶性行为的提升。
在选择可以作为转移性肝癌血清诊断标记物的microRNA时，将能够抵抗失巢凋亡的恶性程度更高的转移性肝癌细胞同时进行检测和参考，为候选microRNA的筛选提供依据。miRNA表达谱芯片显示，在发生失巢凋亡抵抗的BEL7402，SMMC7721，HepG2的细胞培养上清中同时上调的microRNA有miR-92a-3p，miR-16-2-3p，miR-17-5p，miR-486-5p，miR-16-5p(可参见图2)。其中，miR-92a-3p，miR-16-2-3p，miR-17-5p，在转移性肝癌患者血清中也相应上调，所以在这一步分析中，将三者作为筛选结果。有文献报道miR-107[28]是一个重要的癌症相关microRNA，而芯片结果显示，miR-107在失巢的肝癌模型中的平均表达水平和肝癌患者血清中都出现显著性表达上调(P<0.05)(表5)，所以我们也将miR-107作为候选microRNA之一。
表5.细胞系和临床样本中共同上调miR的筛选
在临床标本中下调的microRNA中，miR-3126-5p和miR-1246在转移性肝癌细胞模型3中也有下调(表6)，因此进一步选择miR-3126-5p和miR-1246作为候选的miRNA进行扩大样本验证分析。
表6.细胞系和临床样本中共同下调miR的筛选
综上所述，我们根据芯片结果选取6个microRNA进行下一步的在大样本中进行检测、分析和验证。6个microRNA在肝癌各个时期中的表达分布图见图3。
实施例7统计学分析
数据分析采用SPSS16.0软件(SPSSInc.,USA)。连续变量采用中位数(Median)和平均值±标准差(Mean±SD)表示；计量资料间差异比较采用Mann-WhitneyUtest；通过绘制受试者工作特征(receiveroperatingcharacteristies，ROC)曲线和计算相应的曲线下面积(areasunderthecurves，AUC)来评价诊断能力。最佳cutoff值选取为灵敏度与特异性之和最大、误差[(1-灵敏性)2+(1-特异性)2的平方根]最小所对应的值。采用medcalel0.4.7.0软件比较曲线下面积AUC差异性。P＜0.05(双侧)为有统计学差异。采用R软件分析检验效能及样本大小，R≥0.8为具有检验效能。
实施例8microRNA对肝癌转移判断的logistic回归分析
单因素logistic回归分析结果显示：经过年龄和性别因素校正后，miR-17-5p、miR-92a-3p、miR-107、miR-1246、miR-3126-5p是判断肝癌转移的显著性因素(表7)；进一步的多因素回归分析显示，miR-107、miR-1246的联合因素与肝癌转移相关(表8)。由此可建立多因素回归模型Logit(P)＝2.665+0.021*miR-107+0.039*miR-1246。
表7单因素Logistic模型
表8多因素Logistic模型
实施例9血清miR-107、miR-1246对早期肝癌转移的诊断价值评估
本发明的发明人通过结果分析(如图4所示)，发现对于早期肝癌转移的判断，血清miR-107联合miR-1246(AUC为0.863)，诊断肝细胞癌转移优于AFP(AUC为0.85)；而且miR-107、miR-1246联合AFP(AUC为0.915)诊断更优。
实施例10血清miR-107、miR-1246对于低甲胎蛋白分泌肝癌(AFP<200)的转移诊断
对于低甲胎蛋白分泌肝癌(AFP<200)的转移诊断，miR-1246(AUC为0.66)优于APF(AUC为0.643)(如图5所示)；miR-107联合miR-1246(AUC为0.714)诊断明显优于APF(AUC为0.643)；并且miR-107、miR-1246联合AFP(AUC为0.73)更优(如图6所示)。
结论：作为一个新型肿瘤血清标志物，血清miR-107联合miR-1246对肝细胞癌转移具有诊断价值。

Claims (1)

1.检测miR-107与miR-1246组合的试剂在制备肝细胞癌早期转移的诊断试剂中的应用，所述miR-107的序列如SEQIDNO.1所示，所述miR-1246的序列如SEQIDNO.2所示。
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