CN101671728A - 一种检测癌胚抗原mRNA表达量的方法及专用试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测癌胚抗原mRNA表达量的方法及专用试剂盒。该试剂盒包括如下引物对：一条引物的序列如序列表中序列1所示，另一条引物的序列如序列表中序列2所示。本发明所提供的试剂盒和方法，可准确定量待测组织中癌胚抗原基因mRNA表达量，如可对肿瘤患者的外周血、骨髓中CEA mRNA的表达情况进行定性及定量分析，对判断胃癌、食道癌、结肠癌及直肠癌的发生、转移、复发，评价治疗效果及动态观察病情的具有重要意义。实验表明，本发明检测方法的特异性可达100％，而且本发明检测方法的灵敏度高，可达100拷贝/ml全血。因此，本发明将在医学检测领域发挥重要作用。

Description

一种检测癌胚抗原mRNA表达量的方法及专用试剂盒

技术领域

本发明涉及一种检测癌胚抗原mRNA表达量的方法及专用试剂盒。

背景技术

消化道肿瘤，包括食道癌、胃癌、直肠癌、结肠癌等，是危害人类健康的常见恶性肿瘤，世界各国因地理环境、生活习惯的不同，各种肿瘤的发病率有很大差异。以食道癌为例，全世界每年约30万人死于食道癌。我国是食道癌的高发地区，每年因食道癌死亡者约15万人，占全部恶肿瘤死亡总数近1/4。我国食道癌的发病率有明显的地区分布特点，如华北太行山地区和四川盆地西北部地区呈不规则同心圆的分布，圆心发病率最高，向四周递减。沿海地区由东北向西南发病率逐渐降低，地区变动，距离远近，食道癌的发病率高低相差可达数十倍。

消化道肿瘤的治疗方法有多种，如外科手术切除、放射治疗、化学治疗、中药治疗等。目前，手术切除为上述肿瘤综合治疗方法中的首选，然而在手术切除技术已达到相当成熟和普及的同时，肿瘤切除后的高复发和转移率已成为阻碍患者生存期提高的主要原因。手术前癌细胞由于自然或侵袭性医源性因素脱落至外周血并随血液转移至原发器官外，形成循环肿瘤细胞，但是由于受检测方法灵敏度及特异性较低的限制，该微量的癌细胞未能被检测到，这些癌细胞随血液到达外周组织并处于休眠状态，当患者机体免疫功能下降时，如大手术或移植后应用抗排斥免疫抑制剂等，休眠的癌细胞就有可能被激活，随血液循环返回到原发器官，并恢复增殖，从而导致了肿瘤的复发。肿瘤的转移是临床治疗的一大难题，也是肿瘤致死的一个重要原因。目前，肿瘤转移的发现和确定，主要根据影像学(X光片、CT、磁共振、PET等)或病理形态来诊断。影像学检查中，病灶或转移灶需要形成一定大小才能够被仪器成像和有效分辨；病理形态检查中，需要取到合适的检测标本，且有相当数量可观察到的肿瘤细胞存在。因此，无论是影像学诊断还是病理学诊断，都是肿瘤形成及转移后晚期、存在大量恶变细胞积累的阶段，如果在肿瘤发生转移的早期，能够发现并确定其转移，则可以指导临床治疗方案的设计，并提供有力的预后依据。血行播散是肿瘤转移的主要途径之一，所以在肿瘤患者外周血中进行肿瘤细胞基因表达、肿瘤特异性标记产物检测是了解肿瘤转移情况的一种有效方法，对肿瘤形成及转移的诊断具有极大的帮助，但是在肿瘤转移发生的早期，外周血中的肿瘤细胞一般很少，无法完全依赖病理形态检查，未形成转移灶或转移灶未达到一定体积时，影像学诊断也无能为力，因此，循环血中的微量肿瘤细胞基因表达和一些特异性产物检测的研究，引起了学者们的广泛关注。

外周血中肿瘤相关抗原基因mRNA的定量测定，有利于肿瘤的早期诊断，治疗方案的确定以及预后的判断。随着分子生物学技术的飞速发展及其在医学研究中的广泛应用，通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测外周血中微量肿瘤细胞已成为可能并被尝试。

实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入一对引物的同时加入一个特异性荧光探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程。目前常用的Taqman荧光探针为寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，故检测不到荧光；在PCR扩增过程中，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。在PCR扩增过程中，每个循环结束后检测一次荧光强度，整个反应结束后，便可得到一条工作曲线，根据该曲线可对未知模板进行定量分析。实时荧光定量PCR技术是一种能够准确定量mRNA的检测方法，通过检测肿瘤特异性基因mRNA的表达以判断循环肿瘤细胞的存在。

癌胚抗原(Carcinoembbryonic antigen，CEA)主要存在于直肠，结肠癌组织和胚胎肠粘膜上的一种糖蛋白抗原，是消化道肿瘤特异性较高的肿瘤相关抗原。大量研究结果显示，CEA基因在消化道肿瘤组织中特异性高表达，其他组织器官不表达或低表达，在正常人外周血及体液中无CEA mRNA表达；游离于细胞外的mRNA很不稳定，极易被RNA酶解，故在肿瘤患者外周血、胸腹水、穿刺液、骨髓等标本中若测得CEA mRNA，则提示在上述样品中存在有完整的癌细胞。(Lee JH，ChangJH.Diagnostic utility of serum and pleural fluid carcinoembryonic antigen，neuron-specific enolase，and cytokeratin 19 fragments in patients witheffusions from primary lung cancer.Chest.2005，128(4)：2298-2303.Liu Z，Jiang M，Yan F，et al.Multipoint quantification of multimarker genes inperipheral blood and micrometastasis characteristic in peri-operativeesophageal cancer patients.Cancer Lett.2008 Mar 8；261(1)：46-54.)因此，CEA mRNA是一项较好的血源性消化道肿瘤细胞的监测指标。

检测肿瘤患者外周血、胸腹水、穿刺液、骨髓等标本中有无CEA mRNA表达，可以确定各种消化道肿瘤是否发生转移及复发，并可为治疗方案的确定及疗效观察提供重要的依据。但目前的检测手段都存在阳性率低的问题，尚没有合适的检测技术，普通的RT-PCR检测只能对消化道肿瘤患者外周血CEA mRNA的表达进行定性检测，不能进行定量分析。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测癌胚抗原mRNA表达量的试剂盒。

本发明所提供的试剂盒包括如下引物对：一条引物的序列如序列表中序列1所示，另一条引物的序列如序列表中序列2所示。

所述试剂盒中还可包括核苷酸序列如序列表中序列3所示的探针。

所述试剂盒中还可包括尿嘧啶DNA糖基化酶。

所述试剂盒中还可包括如下组成的PCR反应缓冲液：由终浓度为18.0-19.0mmol/L的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、终浓度为2.60-2.85mmol/L的氯化镁和终浓度为90.5-95.1mmol/L的氯化钾组成，溶剂为水；其中，所述终浓度均为各物质在所述PCR反应缓冲液中的终浓度。

所述试剂盒中还可包括如下组成的PCR反应液：由所述PCR反应缓冲液、DNA聚合酶、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP、序列表中序列1和2所示引物对、序列表中序列3所示探针和尿嘧啶DNA糖基化酶组成，其余为水；

所述PCR反应缓冲液在所述PCR反应液中的浓度为0.9μl/μl；

所述DNA聚合酶在所述PCR反应液中的浓度为0.08-0.13U/μl；

所述dATP在所述PCR反应液中的浓度为380-410nmol/L；

所述dCTP在所述PCR反应液中的浓度为380-410nmol/L；

所述dGTP在所述PCR反应液中的浓度为380-410nmol/L；

所述dTTP在所述PCR反应液中的浓度为190-210nmol/L；

所述dUTP在所述PCR反应液中的浓度为380-410nmol/L；

每条所述引物在所述PCR反应液中的浓度为0.30-0.40μmol/L；

所述探针在所述PCR反应液中的浓度为0.18-0.23μmol/L；

所述尿嘧啶DNA糖基化酶在所述PCR反应液中的浓度为0.0150-0.0175U/ul。

所述试剂盒中还可包括逆转录酶；所述逆转录酶具体可以是莫洛尼氏鼠白血病病毒(M-MLV)逆转录酶。

所述试剂盒中还可包括反转录缓冲液；所述反转录缓冲液由如下物质组成：终浓度为8.5-9.5μmol/L的Oligo(dT)_12-18、终浓度为3.2-3.9U/μl的RNA酶抑制剂、终浓度为70.0-75.0mmol/L的二硫苏糖醇、终浓度为175-190mmol/L的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、终浓度为260-285mmol/L的氯化钾、终浓度为9.5-12.0mmol/L的氯化镁，其余为水；其中，所述终浓度均为各物质在所述反转录缓冲液中的浓度。

所述试剂盒中还可包括反转录反应液；所述反转录反应液由所述反转录缓冲液、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、逆转录酶组成；其余为水；

所述反转录缓冲液在反转录反应液中的浓度为0.786μl/μl；

所述dATP在反转录反应液中的浓度为1.35-1.55mmol/L；

所述dCTP在反转录反应液中的浓度为1.35-1.55mmol/L；

所述dGTP在反转录反应液中的浓度为1.35-1.55mmol/L；

所述dTTP在反转录反应液中的浓度为1.35-1.55mmol/L；

所述逆转录酶在反转录反应液中的浓度为12.0-16.0U/ul。

所述试剂盒中还可包括标准品；所述标准品为pMD18-CEA重组质粒；所述重组质粒是通过将序列表中序列4所示DNA与载体pMD18-T连接得到的。

本发明的另一个目的是提供一种检测癌胚抗原mRNA表达量的方法。

本发明所提供的检测癌胚抗原mRNA表达量的方法，可包括如下步骤：

1)提取离体样品中的总RNA；

2)用上述任一所述试剂盒对所述RNA进行反转录和实时荧光定量PCR检测；确定所述样品中癌胚抗原mRNA的表达量。

上述检测方法中，所述反转录的反应程序可为：37℃，20分钟→95℃，5分钟。

上述检测方法中，所述实时荧光定量PCR的反应程序可为：37℃，10分钟→95℃，15分钟→(95℃，15秒→60℃，1分钟)。括号内条件共重复45个循环。

上述检测方法中，所述样品可为外周血、胸腹水、穿刺液或骨髓。

实验表明，临床确诊消化道肿瘤并已发生远端转移的病例用本发明试剂盒可以检出阳性(表1结果)；临床上不能确诊是否已转移的消化道肿瘤病例用本发明试剂盒也可检测出部分阳性(表2结果)；临床上确诊应为阴性的，用本发明试剂盒检测也为阴性(表3结果)，所以本发明试剂盒及检测方法的准确性及特异性好，且比目前临床检验方法能更早的发现肿瘤细胞的扩散；另一方面，本发明试剂盒的灵敏度高，当样品中CEA mRNA的浓度≥100拷贝/ml全血时，本发明方法即可检出。本发明所提供的试剂盒和方法，可准确定量待测组织中癌胚抗原基因mRNA表达量，如可对肿瘤患者的外周血、骨髓中CEA mRNA的表达情况进行定性及定量分析，对判断胃癌、食道癌、结肠癌及直肠癌的发生、转移、复发，评价治疗效果及动态观察病情的具有重要意义。因此，本发明将在医学检测领域发挥重要作用。

附图说明

图1为标准品的荧光检测结果。

图2为标准品的标准曲线。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、试剂盒的组成及制备

试剂盒的组成及其制备方法如下：

1、细胞裂解液I

由终浓度为0.1mol/L的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、终浓度为0.1mol/L的氯化钠和终浓度为0.05mol/L的氯化镁组成；溶剂是水。其中，所述终浓度均为各物质在细胞裂解液I中的浓度。

细胞裂解液I在25℃条件下，pH值为7.6。

2、细胞裂解液II

由终浓度为3mol/L的异硫氰酸胍、终浓度为2mol/L的盐酸胍、终浓度为0.3mol/L的醋酸钠和终浓度为0.2％的十二烷基硫酸钠组成，溶剂是水。其中，所述终浓度均为各物质在细胞裂解液II中的浓度。

细胞裂解液II在25℃条件下，pH值为5.2。

3、RNA洗涤缓冲液I

由终浓度为0.2mol/L的醋酸钠、终浓度为0.1mol/L的氯酸钠和终浓度为0.1mol/L的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐组成，溶剂为水。其中，所述终浓度均为各物质在RNA洗涤缓冲液I中的浓度。

RNA洗涤缓冲液I在25℃条件下，pH值为7.6。

4、RNA洗涤缓冲液II

由终浓度为1.2mol/L的柠檬酸钠和终浓度为0.5mol/L的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐组成，溶剂是水。其中，所述终浓度均为各物质在RNA洗涤缓冲液II中的浓度。

RNA洗涤缓冲液II在25℃条件下，pH值为7.5。

5、无RNA酶的水

向去离子水中加入焦碳酸二乙酯(DEPC)(购自Biobasic公司)，至终浓度为0.05％(体积百分含量)，22-25℃放置10-12小时后，121℃高压灭菌20分钟，22-25℃放置备用。

6、DNA酶I储存液

由终浓度为50mmol/L的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、终浓度为25mmol/L的三羟甲基氨基甲烷-乙酰、终浓度为12.5mmol/L的氯化镁、终浓度为5.5mmol/L的氯化钙、终浓度为25％(体积百分含量)的甘油和终浓度为0.5U/μl的DNA酶I组成；溶剂是水。DNA酶I购自Fermentans公司，产品目录号为EN0521。

DNA酶I储存液在25℃条件下，pH值为7.5。

7、dNTP混合物

含dATP、dCTP、dGTP、dTTP，具体以其钠盐-水溶液形式保存，25℃条件下，pH值为7.0-7.5，四种dNTP在混合物中的终浓度均为10mmol/L。

8、逆转录酶储存液

逆转录酶具体是M-MLV逆转录酶，购自TAKARA公司，产品目录号为DRR037A。

逆转录酶具体以其储存液形式保存，储存液由终浓度为20mmol/L的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、终浓度为100mmol/L的氯化钠、终浓度为0.1mmol/L的乙二胺四乙酸、终浓度为1.0mmol/L的二硫苏糖醇、终浓度为50％(体积百分含量)的甘油、终浓度为0.01％(体积百分含量)的Nonidet p-40组成，溶剂是水；逆转录酶在储存液中的终浓度为200U/μl。

逆转录酶在25℃条件下，pH值为7.5。

9、反转录缓冲液

由终浓度为9.1μmol/L的Oligo(dT)_12-18、终浓度为3.6U/μl的RNA酶抑制剂、终浓度为72.7mmol/L的二硫苏糖醇、终浓度为182mmol/L的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、终浓度为273mmol/L的氯化钾、终浓度为11mmol/L的氯化镁组成，其余为水；其中，所述终浓度均为各物质在所述反转录缓冲液中的浓度。

反转录缓冲液在25℃条件下，pH值为8.3。

10、反转录反应液

反转录反应液由反转录缓冲液、dNTP、逆转录酶组成。具体可以是将上述反转录缓冲液、dNTP混合物和逆转录酶储存液按比例混合而成。

所述反转录缓冲液在反转录反应液中的浓度为0.786μl/μl；

所述dATP在反转录反应液中的浓度为1.43mmol/L；

所述dCTP在反转录反应液中的浓度为1.43mmol/L；

所述dGTP在反转录反应液中的浓度为1.43mmol/L；

所述dTTP在反转录反应液中的浓度为1.43mmol/L；

所述逆转录酶在反转录反应液中的浓度为14.3U/ul。

11、引物对

P1(上游引物)：5’-AATAACGGGACCTATGCCTGTTT-3’(SEQ ID NO：1)，

P2(下游引物)：5’-CCCCAACCAGCACTCCAAT-3’(SEQ ID NO：2)。

引物可溶于TE溶液中(TE溶液的组成为：10mmol/L三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐，1mmol/L乙二胺四乙酸，水)，引物浓度为5μmol/L。

12、探针

5’-FAM-CATCTGGAACTTCTCCTGGTCTCTCAGCTG-TAMRA-3’(SEQ ID NO：3)。

探针可溶于TE溶液中(TE溶液的组成为10mmol/L三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐，1mmol/L乙二胺四乙酸，水)，探针的浓度为2μmol/L。

上述引物和探针是以CEA全长cDNA序列(GenBank登录号为：NM_004363)为模板，使用ABI7000型实时荧光定量PCR仪随机软件分析TaqMan引物和探针位点，同时考虑CEA基因组DNA序列情况，从中选择最佳组合得到的。上述引物和探针由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

13、PCR反应缓冲液

由终浓度为18.5mmol/L的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、终浓度为2.78mmol/L的氯化镁和终浓度为92.6mmol/L的氯化钾组成，溶剂为水；其中，所述终浓度均为各物质在所述PCR反应缓冲液中的终浓度。

14、PCR反应液

由所述PCR反应缓冲液、Taq酶、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP、引物对、探针和尿嘧啶DNA糖基化酶组成，其余为水；

所述PCR反应缓冲液在所述PCR反应液中的浓度为0.9μl/μl；

所述Taq酶在所述PCR反应液中的浓度为0.1U/μl；

所述dATP在所述PCR反应液中的浓度为400nmol/L；

所述dCTP在所述PCR反应液中的浓度为400nmol/L；

所述dGTP在所述PCR反应液中的浓度为400nmol/L；

所述dTTP在所述PCR反应液中的浓度为200nmol/L；

所述dUTP在所述PCR反应液中的浓度为400nmol/L；

每条所述引物在所述PCR反应液中的浓度为0.37μmol/L；

所述探针在所述PCR反应液中的浓度为0.20μmol/L；

所述UNG酶在所述PCR反应液中的浓度为0.0167U/ul。

PCR反应液在25℃条件下，pH值为8.3。

15、尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)储存液

UNG酶以储存液形式保存；

UNG酶储存液由终浓度为50％(体积百分含量)的甘油、由终浓度为30mmol/L的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、由终浓度为150mmol/L的氯化钠、由终浓度为1.0mmol/L的乙二胺四乙酸、由终浓度为1.0mmol/L的二硫苏糖醇、由终浓度为0.05％(体积百分含量)的Tween20、由终浓度为1U/μl的尿嘧啶DNA糖基化酶组成；溶剂是水；其中，各物质的浓度均是其在尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)储存液中的终浓度。

UNG酶储存液在25℃条件下，pH值为7.5。

16、标准品

标准品为终浓度为2×10⁶拷贝数/μl的pMD18-CEA重组质粒，TE溶液溶解(TE溶液的组成为10mmol/L三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐，1mmol/L乙二胺四乙酸，水)。

标准品中插入的CEA片段(名称为CEA151)的DNA序列如序列表中SEQ ID NO：4所示。

pMD18-CEA重组质粒的构建方法如下：

1、细胞总RNA的提取

1)将人胃癌细胞SGC7901，用1640完全培养基(Gibco公司)按常规方法进行培养。

2)将培养的细胞用0.25％胰蛋白酶(质量百分含量)消化，1000rpm离心收集细胞，转移到1.5mL离心管中，每管1×10⁶个细胞。

3)提取细胞总RNA，具体过程如下：

①往沉淀的细胞中加入650μl细胞裂解液II(向细胞裂解液II中加入2-巯基乙醇，加入量为每1mL细胞裂解液II加入20μl浓度为14.5mol/L的2-巯基乙醇，分装2-巯基乙醇要在通风橱下进行)，漩涡振荡充分混匀。

②再加入650μl的70％乙醇，漩涡振荡混匀。

③把上述混合液(不包括沉淀)加入到固定在2mL收集管上的RNA分离柱内，10000g离心1分钟，弃去流出液体并继续进行步骤③的操作。

④向DNA酶I储存液管中加入400μl无RNA酶的水，混匀、短暂离心收集，吸取45μl该液体直接加到RNA分离柱滤膜上，室温放置15分钟。

⑤吸取700μl RNA洗涤缓冲液I加入到RNA分离柱上洗涤柱子，10000g离心1分钟，弃去2mL收集管。

⑥将RNA分离柱固定于另一新的2mL收集管上，加入500μl经稀释的RNA洗涤缓冲液II(RNA洗涤缓冲液II在使用前，每3mL加入12mL无水乙醇)，10000g离心1分钟，弃去流出液，该收集管可重复使用。

⑦再用500μl的RNA洗涤缓冲液II洗涤柱子，离心并弃去流出液。然后12000g离心1分钟，甩干RNA分离柱基质。

⑧把柱子转移到无RNA酶的1.5ml离心管，加入50μl无RNA酶的水，确保加入的无RNA酶的水直接加在柱基质上，10000g离心1分钟，洗脱RNA。将装有RNA溶液的离心管置于冰盒上，备用。

2、逆转录反应

反转录体系为：反转录反应液3.5ul、总RNA溶液4.0ul、无RNA酶的水2.5ul。

反转录反应条件为：37℃，20分钟→95℃，5分钟。

反应结束后，取出离心管置于冰盒上。

3、PCR扩增

用TaKaRa公司的普通PCR扩增试剂盒，参照试剂盒说明书进行操作。

PCR反应体系为：反转录产物5ul、10×PCR缓冲液5.0ul、dNTP混合物4.0ul、上、下游引物(P1、P2)各2.0ul、Taq酶0.5ul、水31.5ul。

PCR反应条件为：先94℃、3分钟→再94℃、30秒，60℃、45秒，72℃、50秒，共35个循环→最后72℃、7分钟。

4、CEA151扩增产物的获得

1)将PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下切取含151bp目的DNA片段的琼脂糖凝胶，用纸巾擦干后，切碎，称重，按照100mg＝100μl的比例确定胶的体积。

2)用DNA凝胶回收试剂盒(购自上海英俊生物技术有限公司)回收扩增产物

①按照试剂盒说明书中的比例在回收胶中加入DE-A液，60℃加热至完全熔化。

②加入0.5倍体积于DE-A液的DE-B液，混匀；加入异丙醇，使其终浓度为20％。

③将上述液体转入制备管中，5500rpm离心1分钟，弃滤液。

④加入0.5mL缓冲液W1后，5500rpm离心1分钟，弃滤液。

⑤加入0.7mL缓冲液W2，5500rpm离心1分钟，弃滤液。

⑥再加入0.7mL缓冲液W2，5500rpm离心1分钟，弃滤液；12000rpm，离心1分钟，以甩干滤膜基质。

⑦将制备管置于新的1.5mL离心管中，在滤膜中央加入25μl水，室温静置1分钟后，12000rpm，离心1分钟洗脱DNA。得到纯化后的PCR扩增产物。

5、CEA151的克隆及鉴定

1)重组载体的构建

①10μl体系中，加入1μl T载体(pMD18-T Vector)(TaKaRa)，4μl纯化后的PCR扩增产物，加入5μl连接缓冲液(100mmol/L三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、15mmol/L氯化镁、1.0mmol/L三磷酸腺苷、20mmol/L二硫苏糖醇(Invitrogen)、1U/μlDNA连接酶。连接缓冲液在25℃条件下，pH值为7.5。)，16℃反应14小时。

②取5μl连接产物，加入到100μl大肠杆菌DH5α感受态细菌中，混匀后冰浴40分钟，置于42℃水中热休克90秒；冰浴，2分钟。

③加入无抗生素的LB培养基400μl，于37℃摇床上以150rpm的速度混合振摇45分钟后，将离心管中液体均匀地涂布于LA平板上，37℃平放20分钟后，倒置培养12小时。

2)重组载体的鉴定

①观察LA平板上的菌落，随机挑取长得较好的菌落，分别转至装有5mL LA培养基的大试管中，编号后置37℃摇床中，250rpm，振摇8-14小时左右，至OD₆₀₀≈0.4。

②取1.5mL培养物至离心管中，4℃，11000rpm离心30秒，弃尽上清液。

③100μl预冷的裂解液I(500mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris.Cl(pH8.0，25℃)，10mmol/L EDTA(pH8.0，25℃)，水)重悬沉淀，剧烈振荡混匀后加入200μl新配制的裂解液II(200mmol/l NaOH，1％SDS，水)，混匀后，冰浴3分钟，再加入150μl预冷的裂解液III(3mol/L醋酸钾；pH5.2，25℃)，颠倒混匀后冰浴3-5分钟；4℃，11000rpm离心5分钟后将上清转移至另一离心管中。

④加入等体积的酚/氯仿(1∶1)，振荡后4℃，11000rpm离心2分钟，再将上清转移至另一离心管。

⑤加入1/10体积的3M NaAc溶液和2.5倍无水乙醇，混匀后，室温静置10分钟，4℃，11000rpm离心10分钟后弃上清。

⑥加入1mL 70％乙醇，振荡漂洗后4℃，11000rpm离心2分钟；弃去上层液体。

⑦加入少量无水乙醇，4℃，11000rpm离心2分钟，弃去乙醇后，室温倒置10分钟，加入30μl蒸馏水溶解质粒DNA。

⑧取适量的质粒DNA作为模板，在引物P1和P2的引导下，进行PCR鉴定，可扩增出151bp DNA片段的为阳性克隆质粒，从而筛选出目的菌落。

3)CEA151扩增产物的鉴定

①质粒的大量抽提

A)取1mL含目的菌落的菌液，加入到30mL LA培养基中，摇床培养至OD₆₀₀约为0.6。

B)取25mL上述菌液接种至300mL LA培养基中，37℃，250rpm培养10-14小时，然后4℃，4500rpm，20分钟离心收菌。

C)用200mL预冷的STE(10mmol/L Tris-HCl(PH8.0，25℃)，0.1mol/L NaCl，1mmol/L EDTA(PH8.0，25℃)，水)重悬菌体，4℃，4500rpm，20分钟离心收菌。

D)加入9mL Solution I(500mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris.Cl(pH8.0，25℃)，10mmol/L EDTA(pH8.0，25℃)，水)，混匀，再加入1mL用10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)新鲜配制的溶菌酶(10mg/mL)，再加入10mL新鲜配制的Solution II(200mmol/l NaOH，1％SDS，水)，轻轻混匀5-7次，室温静置5分钟。

E)加入7.5mL冰冷的SolutionIII(3mol/L醋酸钾；pH5.2，25℃)，轻轻混匀，冰浴10分钟；4℃，11000rpm离心10分钟，取上清。

F)加入2/3体积的异丙醇，混匀，室温静置10分钟，11000rpm离心10分钟，弃上清。

G)用70％乙醇洗涤沉淀，8000rpm，15分钟离心回收，用2mL TE溶解沉淀。

H)加入2mL 5mol/L的LiCl，混匀，10000g离心10分钟，弃去上清。

I)用70％乙醇洗涤沉淀，弃上清，尽量控干液体，室温静置至干燥。

J)加入300μl TER，溶解沉淀，转移至1.5mL离心管中，37℃水浴1-2小时。

K)加入300μl 1.6mol/L NaCl(含13％聚乙二醇)，混匀，4℃，12000rpm离心15分钟，弃上清。

L)250μl TE(pH8.0)溶解沉淀，分别用酚、酚/氯仿、氯仿各抽提一次。

M)取上清，加入60μl 10mol/L NH₄Ac及2倍体积的无水乙醇(或95％乙醇)，混匀，4℃，12000g离心5分钟，弃上清。

N)120μl 75％乙醇洗涤沉淀，4℃，12000g离心10分钟，弃上清，尽量控干液体，室温静置至干燥。

O)加入100μl三蒸水溶解沉淀，紫外分光光度计下检测质粒的浓度和纯度。

②质粒的序列测定

对含有目的基因片段的阳性克隆质粒用美国Applied Biosystems公司的377测序仪进行序列测定，结果重组载体中的插入片段CEA151具有序列表中SEQ ID NO：4的DNA序列，将该重组载体命名为pMD18-CEA151。将pMD18-CEA151作为标准品。

③将上述抽提得到的质粒pMD18-CEA151用TE溶液溶解(TE溶液的组成为10mmol/L三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐，1mmol/L乙二胺四乙酸，水)至终浓度为2×10⁶拷贝数/μl。

18、对照品

阳性对照品为人胃癌细胞SGC7901的总RNA；

阴性对照品为正常人外周血总RNA：取离体的正常人的外周血，分离有核细胞，按照标准品制备中提取人胃癌细胞SGC7901总RNA的方法进行制备；

将提取到得两种总RNA分别用无RNA酶的水溶解至终浓度为0.2ug/ul，取5ulRNA样品加入1ml无水乙醇中，-20℃保存。

本发明试剂盒中还可包括RNA分离柱(购于安徽优晶生物工程有限公司，产品目录号RX-2-1-3)、收集管(购于安徽优晶生物工程有限公司)、PCR管(购于美国Applied Biosystems(ABI)公司)。

实施例2、癌胚抗原基因mRNA表达量的检测

用实施例1制备的试剂盒检测下述实验组和对照组标本中的癌胚抗原基因mRNA表达量。

实验组：15例病理诊断确诊的胃癌患者，其中5例临床确诊已发生转移；10例病理诊断确诊的食道癌患者，其中4例临床确诊已发生转移；8例病理诊断确诊的结肠癌患者，其中3例临床确诊已发生转移。

对照组：10例结肠息肉患者，10胃溃疡患者及10例健康人。

所有样品的取得均在受试者同意的情况下进行。

一、实验准备

1、将细胞裂解液I按1∶9的比例用灭菌去离子水稀释成细胞裂解液I稀释液。

2、向细胞裂解液II中加入2-巯基乙醇，加入量为：每1mL细胞裂解液II中加入20μl浓度为14.5M的2-巯基乙醇，分装2-巯基乙醇要在通风橱下进行。

3、RNA洗涤缓冲液II稀释液：在使用之前，每毫升RNA洗涤缓冲液II中加入4mL无水乙醇。

4、配制70％的乙醇溶液10mL。

二、取样

取离体的新鲜的受试者静脉血3mL于无菌离心管中，使用EDTA作抗凝剂(1.44mg/mL全血)。样本采集后应立即使用，若不能立即使用，可在4℃保存1-2小时，但时间不宜过长，否则将影响测定结果。全血经处理后，得到的有核细胞可于-80℃或液氮中保存。得到实验组样品和对照组样品。

三、实验组样品和对照组样品的细胞总RNA的提取

1)取3mL步骤二中所述的新鲜抗凝血液加入到50mL无菌离心管后，再加入15mL的细胞裂解液I稀释液，漩涡振荡混匀。

2)冰浴15分钟后，在漩涡振荡器上迅速混匀两次，溶液变澄清表明红细胞已裂解。

3)4℃、450g离心10分钟沉淀有核细胞，完全弃去上清液。

4)用5mL的细胞裂解液I稀释液洗涤沉淀的有核细胞，漩涡振荡以完全悬浮细胞。

5)4℃、450g离心10分钟，并再次完全弃去上清。

6)向沉淀的有核细胞中加入1mL细胞裂解液I稀释液，漩涡振荡以完全悬浮细胞，将其转移至无菌的1.5mL离心管中，4℃、450g离心10分钟，完全弃去上清。

7)往沉淀的有核细胞中加入650μl细胞裂解液II(已加入2-巯基乙醇)，漩涡振荡充分混匀。

8)再加入650μl的70％乙醇，漩涡振荡混匀。

9)把上述混合液(不包括沉淀)加入到固定在2mL收集管上的RNA分离柱内(该柱最大结合能力是800μl，故每次加入量不宜超过750μl)，10000g离心1分钟，弃去流出液体并继续进行步骤9)的操作。

10)向DNA酶I储存液管中加入480μl无RNA酶的水，混匀、短暂离心收集，吸取45μl该液体直接加到RNA分离柱滤膜上，室温放置15分钟。

11)吸取700μl RNA洗涤缓冲液I加入到RNA分离柱上洗涤柱子，10000g离心1分钟，弃去2mL收集管。

12)将RNA分离柱固定于另一新的2mL收集管上，加入500μl RNA洗涤缓冲液II稀释液，10000g离心1分钟，弃去流出液。该收集管可重复使用。

13)再用500μl RNA洗涤缓冲液II稀释液洗涤RNA分离住，离心并弃去流出液。然后12000g离心1分钟，以甩干RNA分离柱基质。

14)将RNA分离柱转移至无RNA酶的1.5mL离心管上，取50μl无RNA酶的水加入到RNA分离柱基质上，10000g，离心1分钟。将装有RNA的离心管置于冰盒上，备用。得到实验组样品RNA和对照组样品RNA。

四、荧光定量PCR

1、实验组样品RNA、对照组样品RNA、阳性对照和阴性对照的反转录反应

反转录体系：反转录反应液3.5ul、总RNA溶液5.0ul、无RNA酶的水1.5ul。

反转录反应条件为：37℃，20分钟→95℃，5分钟。

反应结束后，将反应产物取出置于冰盒上。得到实验组样品反转录产物、对照组样品反转录产物、阳性对照反转录产物和阴性对照反转录产物。

2、标准品的处理

将标准品(2×10⁶拷贝数/ul)梯度稀释为2×10⁵，2×10⁴，2×10³，2×10²，2×10¹拷贝数/ul。

3、荧光定量PCR

在ABI公司7000型定量PCR仪上进行PCR扩增。

PCR反应体系为：模板5.0μl、PCR反应液15.0μl、水5.0μl。

其中，模板分别为实验组样品反转录产物、对照组样品反转录产物、阳性对照反转录产物、阴性对照反转录产物和标准品。

PCR反应条件为：37℃，10分钟→95℃，15分钟→(95℃，15秒→60℃，1分钟)。括号内条件共重复45个循环。

五、标准曲线的制作

标准品荧光定量PCR检测结果如图1所示。横坐标为PCR反应的循环数，纵坐标为检测器检测到的荧光值，图中曲线从左至右分别代表起始模板数为：1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²拷贝数。

根据检测结果绘制标准曲线，标准曲线如图2所示。横坐标为标准品起始拷贝数的对数值(Log₁₀)，纵坐标为Ct值。标准曲线的相关系数为0.998。

六、检测结果

选中上述所有样品检测孔，根据标准曲线进行相应分析，得出待测样品的起始模板数(M)。每毫升全血样本中CEA mRNA的拷贝数N＝M×6.6。

每毫升全血样本中CEA mRNA的拷贝数大于等于100时，确定为患病阳性。

具体结果如下：

1)5例临床确诊已转移的胃癌患者、4例临床确诊已转移的食道癌患者、3例临床确诊已转移的结肠癌患者检测结果均为阳性，具体结果如表1所示。

表1、临床确诊已转移的肿瘤患者CEA mRNA拷贝数的检测结果

编号	肿瘤类型	性别	年龄	标本	CEA mRNA(拷贝数/毫升全血)
						1	胃癌	男	48	外周血	2.1×105
2	胃癌	女	55	外周血	1.7×106
						3	胃癌	男	70	外周血	3.6×107
4	胃癌	男	57	外周血	8.1×105
						5	胃癌	女	60	外周血	1.5×104
6	食道癌	男	53	外周血	4.2×106
						7	食道癌	男	64	外周血	3.3×107
8	食道癌	女	47	外周血	2.6×105
						9	食道癌	女	69	外周血	3.9×104
10	结肠癌	男	75	外周血	7.3×105
						11	结肠癌	女	43	外周血	5.2×103

12

结肠癌

男

58

外周血

2.1×106

2)10例临床未确诊转移的胃癌患者中3例为阳性，其余7例为阴性。6例临床未确诊转移的食道癌患者中2例为阳性，其余4例为阴性。5例临床未确诊转移的结肠癌患者中2例为阳性，其余3例为阴性。阳性结果如表2所示。

表2、临床未确诊转移的肿瘤患者CEA mRNA拷贝数的阳性检测结果

编号	肿瘤类型	性别	年龄	标本	CEA mRNA(拷贝数/毫升全血)
						13	胃癌	男	48	外周血	4.5×105
14	胃癌	男	46	外周血	2.4×104
						15	胃癌	女	69	外周血	1.9×106
16	食道癌	男	66	外周血	1.0×104
						17	食道癌	女	52	外周血	6.0×105
18	结肠癌	男	55	外周血	4.8×104
						19	结肠癌	女	68	外周血	9.1×103

3)对照组：10例结肠息肉患者，10胃溃疡患者及10例正常健康人均为阴性，未检测到CEA mRNA的表达。

上述实验结果表明，临床确诊消化道肿瘤并已发生远端转移的病例用本发明方法可以检出阳性(表1结果)；临床上不能确诊是否已转移的消化道肿瘤病例用本发明方法也可检测出部分阳性(表2结果)；临床上确诊应为阴性的，本发明方法检测也为阴性(表3结果)，所以本发明方法检测的准确性及特异性好，且比目前临床检验方法更早的发现肿瘤细胞的扩散，表明本发明的试剂盒可对CEA mRNA的表达进行准确的定性及定量分析，检测特异性高、可达100％。

七、本发明检测方法灵敏度的鉴定

将已确定CEA mRNA含量的离体的人外周血样品进行倍比(10倍)稀释，按照实施例2中所述方法进行操作，分离有核细胞、提取细胞总RNA，并进行RT-PCR操作。实验结果表明，本发明试剂盒对CEA mRNA的检测灵敏度为≥100拷贝/ml全血。即当样品中CEA mRNA的浓度≥100拷贝/ml全血时，本发明方法即可检出，灵敏度高。

实施例3、试剂盒及其应用

一、试剂盒组成及制备方法

与实施例1中所述相同，不同的如下：

1、PCR反应缓冲液：由终浓度为18.0mmol/L的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、终浓度为2.60mmol/L的氯化镁和终浓度为90.5mmol/L的氯化钾组成，溶剂为水；其中，所述终浓度均为各物质在所述PCR反应缓冲液中的终浓度。

2、PCR反应液：由所述PCR反应缓冲液、Taq酶、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP、序列表中序列1和2所示引物对、序列表中序列3所示探针和尿嘧啶DNA糖基化酶组成，其余为水；

所述PCR反应缓冲液在所述PCR反应液中的浓度为0.9μl/μl；

所述Taq酶在所述PCR反应液中的浓度为0.08U/μl；

所述dATP在所述PCR反应液中的浓度为380nmol/L；

所述dCTP在所述PCR反应液中的浓度为380nmol/L；

所述dGTP在所述PCR反应液中的浓度为380nmol/L；

所述dTTP在所述PCR反应液中的浓度为190nmol/L；

所述dUTP在所述PCR反应液中的浓度为380nmol/L；

每条所述引物在所述PCR反应液中的浓度为0.30μmol/L；

所述探针在所述PCR反应液中的浓度为0.18μmol/L；

所述UNG酶在所述PCR反应液中的浓度为0.0150U/ul。

3、反转录缓冲液；所述反转录缓冲液由如下物质组成：终浓度为8.5μmol/L的Oligo(dT)_12-18、终浓度为3.2U/μl的RNA酶抑制剂、终浓度为70.0mmol/L的二硫苏糖醇、终浓度为175mmol/L的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、终浓度为260mmol/L的氯化钾、终浓度为9.5mmol/L的氯化镁，其余为水；其中，所述终浓度均为各物质在所述反转录缓冲液中的浓度。

4、反转录反应液：由所述反转录缓冲液、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、逆转录酶组成；其余为水；

所述反转录缓冲液在反转录反应液中的浓度为0.786μl/μl；

所述dATP在反转录反应液中的浓度为1.35mmol/L；

所述dCTP在反转录反应液中的浓度为1.35mmol/L；

所述dGTP在反转录反应液中的浓度为1.35mmol/L；

所述dTTP在反转录反应液中的浓度为1.35mmol/L；

所述逆转录酶在反转录反应液中的浓度为12.0U/ul。

二、用试剂盒对人外周血进行检测

实验方法与实施例2中所述相同，不同的是：所用的PCR反应缓冲液、PCR反应液、反转录缓冲液和反转录反应液为本实施例一中所述。

实验设3次重复，结果与实施例2中所述结果无显著差异，特异性100％，灵敏度为≥100拷贝/ml全血。

实施例4、试剂盒及其应用

一、试剂盒组成及制备方法

与实施例1中所述相同，不同的如下：

1、PCR反应缓冲液：由终浓度为19.0mmol/L的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、终浓度为2.85mmol/L的氯化镁和终浓度为95.1mmol/L的氯化钾组成，溶剂为水；其中，所述终浓度均为各物质在所述PCR反应缓冲液中的终浓度。

2、PCR反应液：由所述PCR反应缓冲液、Taq酶、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP、序列表中序列1和2所示引物对、序列表中序列3所示探针和尿嘧啶DNA糖基化酶组成，其余为水；

所述PCR反应缓冲液在所述PCR反应液中的浓度为0.9μl/μl；

所述Taq酶在所述PCR反应液中的浓度为0.13U/μl；

所述dATP在所述PCR反应液中的浓度为410nmol/L；

所述dCTP在所述PCR反应液中的浓度为410nmol/L；

所述dGTP在所述PCR反应液中的浓度为410nmol/L；

所述dTTP在所述PCR反应液中的浓度为210nmol/L；

所述dUTP在所述PCR反应液中的浓度为410nmol/L；

每条所述引物在所述PCR反应液中的浓度为0.40μmol/L；

所述探针在所述PCR反应液中的浓度为0.23μmol/L；

所述UNG酶在所述PCR反应液中的浓度为0.0175U/ul。

3、反转录缓冲液；所述反转录缓冲液由如下物质组成：终浓度为9.5μmol/L的Oligo(dT)_12-18、终浓度为3.9U/μl的RNA酶抑制剂、终浓度为75.0mmol/L的二硫苏糖醇、终浓度为190mmol/L的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、终浓度为285mmol/L的氯化钾、终浓度为12.0mmol/L的氯化镁，其余为水；其中，所述终浓度均为各物质在所述反转录缓冲液中的浓度。

4、反转录反应液：由所述反转录缓冲液、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、逆转录酶组成；其余为水；

所述反转录缓冲液在反转录反应液中的浓度为0.786μl/μl；

所述dATP在反转录反应液中的浓度为1.55mmol/L；

所述dCTP在反转录反应液中的浓度为1.55mmol/L；

所述dGTP在反转录反应液中的浓度为1.55mmol/L；

所述dTTP在反转录反应液中的浓度为1.55mmol/L；

所述逆转录酶在反转录反应液中的浓度为16.0U/ul。

二、用试剂盒对人外周血进行检测

实验方法与实施例2中所述相同，不同的是：所用的PCR反应缓冲液、PCR反应液、反转录缓冲液和反转录反应液为本实施例一中所述。

实验设3次重复，结果与实施例2中所述结果无显著差异，特异性100％，灵敏度为≥100拷贝/ml全血。

序列表

<110>中国科学技术大学

<120>一种检测癌胚抗原mRNA表达量的方法及专用试剂盒

<160>4

<210>1

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

aataacggga cctatgcctg ttt           23

<210>2

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

ccccaaccag cactccaat                19

<210>3

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

catctggaac ttctcctggt ctctcagctg    30

<210>4

<211>151

<212>DNA

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>4

aataacggga cctatgcctg ttttgtctct aacttggcta ctggccgcaa taattccata     60

gtcaagagca tcacagtctc tgcatctgga acttctcctg gtctctcagc tggggccact    120

gtcggcatca tgattggagt gctggttggg g                                   151

Claims (10)

1、一种检测癌胚抗原mRNA表达量的试剂盒，包括如下引物对：一条引物的序列如序列表中序列1所示，另一条引物的序列如序列表中序列2所示。

2、根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中包括核苷酸序列如序列表中序列3所示的探针。

3、根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中包括尿嘧啶DNA糖基化酶。

4、根据权利要求1、2或3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中包括如下组成的PCR反应缓冲液：由终浓度为18.0-19.0mmol/L的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、终浓度为2.60-2.85mmol/L的氯化镁和终浓度为90.5-95.1mmol/L的氯化钾组成，溶剂为水；其中，所述终浓度均为各物质在所述PCR反应缓冲液中的终浓度。

5、根据权利要求1-4中任一所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中包括如下组成的PCR反应液：由所述PCR反应缓冲液、DNA聚合酶、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP、权利要求1中所述引物对、权利要求2中所述探针和尿嘧啶DNA糖基化酶组成，其余为水。

6、根据权利要求1-5中任一所述的试剂盒，其特征在于：

所述PCR反应缓冲液在所述PCR反应液中的浓度为0.9μl/μl；

所述DNA聚合酶在所述PCR反应液中的浓度为0.08-0.13U/μl；

所述dATP在所述PCR反应液中的浓度为380-410nmol/L；

所述dCTP在所述PCR反应液中的浓度为380-410nmol/L；

所述dGTP在所述PCR反应液中的浓度为380-410nmol/L；

所述dTTP在所述PCR反应液中的浓度为190-210nmol/L；

所述dUTP在所述PCR反应液中的浓度为380-410nmol/L；

每条所述引物在所述PCR反应液中的浓度为0.30-0.40μmol/L；

所述探针在所述PCR反应液中的浓度为0.18-0.23μmol/L；

所述尿嘧啶DNA糖基化酶在所述PCR反应液中的浓度为0.0150-0.0175U/ul。

7、根据权利要求1-6中任一所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中包括反转录缓冲液；所述反转录缓冲液由如下物质组成：终浓度为8.5-9.5μmol/L的Oligo(dT)_12-18、终浓度为3.2-3.9U/μl的RNA酶抑制剂、终浓度为70.0-75.0mmol/L的二硫苏糖醇、终浓度为175-190mmol/L的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、终浓度为260-285mmol/L的氯化钾、终浓度为9.5-12.0mmol/L的氯化镁，其余为水；其中，所述终浓度均为各物质在所述反转录缓冲液中的浓度。

8、根据权利要求1-7中任一所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中包括反转录反应液；所述反转录反应液由所述反转录缓冲液、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、逆转录酶组成；其余为水；

所述反转录缓冲液在反转录反应液中的浓度为0.786μl/μl；

所述dATP在反转录反应液中的浓度为1.35-1.55mmol/L；

所述dCTP在反转录反应液中的浓度为1.35-1.55mmol/L；

所述dGTP在反转录反应液中的浓度为1.35-1.55mmol/L；

所述dTTP在反转录反应液中的浓度为1.35-1.55mmol/L；

所述逆转录酶在反转录反应液中的浓度为12.0-16.0U/ul。

9、一种检测癌胚抗原mRNA表达量的方法，包括如下步骤：

1)提取离体样品中的总RNA；

2)用权利要求1-8中任一所述试剂盒对所述RNA进行反转录和实时荧光定量PCR检测；确定所述样品中癌胚抗原mRNA的表达量。

10、根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述样品为外周血、胸腹水、穿刺液或骨髓。

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