KR101320633B1

KR101320633B1 - 실시간 중합반응을 이용한 암의 진단을 위한 정보제공방법 및 이를 위한 암 진단용 키트

Info

Publication number: KR101320633B1
Application number: KR1020110049725A
Authority: KR
Inventors: 이혜영; 김승일; 박상정
Original assignee: 엠앤디 (주)
Priority date: 2011-05-25
Filing date: 2011-05-25
Publication date: 2013-10-30
Also published as: KR20120132592A; JP2012244989A; US20120244531A1; WO2012161385A1

Abstract

본 발명은 실시간 역전사효소 중합반응을 이용한 암의 진단을 위한 정보제공방법 및 이를 위한 암 진단용 키트에 관한 것이다.

Description

실시간 중합반응을 이용한 암의 진단을 위한 정보제공방법 및 이를 위한 암 진단용 키트{Method of providing information for diagnosis of cancer using quantitative realtime PCR and diagnostic kit comprising thereof}

본 발명은 실시간 중합반응을 이용한 암의 진단을 위한 정보제공방법 및 이를 위한 암 진단용 키트에 관한 것이다.

암은 현재 우리나라 사망률에서 1위를 차지 하고 있을 정도로 중요한 질병으로서 해마다 암 발생자 수는 증가하고 있으며 2008년 국내 암 발생률은 10만명 당 300명 이상을 나타내고 있다(Jemal, A.; Siegel, R.; Xu, J.; Ward, E., Cancer statistics, 2010. CA Cancer J Clin 2010, 60, (5), 277-300).

초기 암의 경우는 간단한 수술이나 약물 치료로 인하여 대부분의 악성종양을 치유 할 수 있지만 전이가 일어나는 경우에는 그 치료가 매우 어려워지고 또한 환자의 예후와 5년 이후 생존률도 감소하고 있다. 이러한 전이성 종양의 경우 초기 고형암에 존재하는 암세포가 원래의 병변을 일으킨 부위에서 떨어져 나와 림프절이나 순환 혈액 혹은 골수를 통하여 다른 장기에 정착하여 전이성 암을 유발하게 된다. 이렇게 순환혈액에 존재하는 암세포를 혈중 종양 세포라고 한다(Ross, J. S.; Slodkowska, E. A., Circulating and disseminated tumor cells in the management of breast cancer. Am J Clin Pathol 2009, 132, (2), 237-45).

혈중 종양 세포는 1차적인 종양조직에서 떨어져 나와 혈류를 타고 돌아다니는 소수의 종양세포를 말하며 이들은 혈액 속을 떠돌다가 2차적인 부위에 전이성 종양을 일으킬 수 있다. 따라서 이러한 혈중 종양 세포의 진단은 초기 암 환자에 있어서 전이의 여부를 판별하기에 유용하게 사용될 수 있다. 일반적으로 전이성 암을 가진 환자의 경과는 불량하게 치료에 대한 반응이 좋지 않으며 수술 후 예후도 나쁜 것으로 알려져 있기 때문에, 이러한 혈중 종양 세포의 진단은 환자가 추후 전이성 암으로 발전할 수 있는지 여부를 판단하는데 도움을 줄 수 있어 환자의 경과나 예후 판별에 있어서 좋은 마커가 되고 있다(Meng, S.; Tripathy, D.; Frenkel, E. P.; Shete, S.; Naftalis, E. Z.; Huth, J. F.; Beitsch, P. D.; Leitch, M.; Hoover, S.; Euhus, D.; Haley, B.; Morrison, L.; Fleming, T. P.; Herlyn, D.; Terstappen, L. W.; Fehm, T.; Tucker, T. F.; Lane, N.; Wang, J.; Uhr, J. W., Circulating tumor cells in patients with breast cancer dormancy. Clin Cancer Res 2004, 10, (24), 8152-62;Pachmann, K., Longtime recirculating tumor cells in breast cancer patients. Clin Cancer Res 2005, 11, (15), 5657; author reply 5657-8).

또한 암세포의 경우 일반 세포와는 다르게 현저하게 빠른 세포의 분화 속도를 나타낸다. 따라서 세포 분열 시 사용되는 마커를 이용하여 더 빠른 분화속도를 나타내는 경우 어떤 질병이나 질환을 가지고 있다는 것을 알 수 있게 된다.

현재 전이성 종양의 진단 방법은 림프절 침습에 의한 검사법이나 MRI와 PET과 같은 영상 장비를 이용한 암세포의 존재 유무에 관하여 진단이 이루어 지고 있다. 그러나 이러한 검사법의 경우 이미 전이가 되어 자리 잡은 경우에만 가능하다는 단점이 있다. 하지만 혈중 종양세포의 유무를 검사함으로써 전이가 발생하지 않은 초기 암 환자 중 전이의 가능성이 있는 환자를 진단함으로써 암환자에 대한 예후 관리가 신중하게 이뤄질 수 있다.

혈중 종양 세포를 진단하는 방법으로는 혈구세포와 암세포의 표면항원 차이에 의한 항원항체 검사법이 주를 이루고 있다. 암세포의 표면에는 혈구세포와 구별되는 상피성 항원을 가지고 있다. 이러한 항원은 대부분 상피세포에 존재하는 항원으로써 혈관 내벽이나 혈구세포에는 존재하지 않는 특성을 지니고 있다. 이러한 항원 중 특히 Cytokeratin 19의 경우 유방암과 방광암, 자궁경부암, 대장암, 폐암, 췌장암, 위암 등에서 발현하는 것으로 알려져 있다(Karantza, V., Keratins in health and cancer: more than mere epithelial cell markers. Oncogene 2011, 30, (2), 127-38). 따라서 현재 Cytokeratin 19 항원을 이용하여 혈중 종양 세포를 진단 하는 방법이 사용되고 있다. 현재 사용되고 있는 검사 법으로는 Veridex 사의 CellSearch^®을 가장 많이 사용하고 있는데, 이 방법은 형광이 표지된 항체를 이용하여 항원-항체 결합 반응을 통해 EpCAM 양성이면서 CD45 음성인 세포를 판별한 후 Pan-Cytokeratin 항체를 이용하여 혈중 암세포의 유무를 검사하는 방법이다(Allard, W. J.; Matera, J.; Miller, M. C.; Repollet, M.; Connelly, M. C.; Rao, C.; Tibbe, A. G.; Uhr, J. W.; Terstappen, L. W., Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases. Clin Cancer Res 2004, 10, (20), 6897-904). 하지만 현재 국내에서는 이 기술이 도입되지 못하고 있고, 값비싼 기계가 필요하다는 단점을 가지고 있다. 또한 현재 개발되어있는 RT-PCR을 기초로 하여 혈중 종양 세포를 진단하는 방법은 전기영동을 하여 증폭산물의 밴드를 확인 하는 것이기 때문에 특이도가 떨어지게 되고, 실험과정이 복잡해지며, 정량적인 결과를 도출하기 어려운 측면이 존재한다. 따라서 본 발명자들은 이러한 기술을 대체 하기 위하여 항원 항체 반응이 아닌 mRNA를 타깃으로 하여 간편하고 정량적인 결과를 도출 할 수 있는 새로운 방법의 Real-Time RT-PCR 법을 기초로 하는 혈중 종양 세포 진단 방법을 발명하였다.

본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 Real-Time RT-PCR 법을 기초로 하는 혈중 종양 세포 진단 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 혈중 종양 세포 진단용 키트를 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 a) 암 의심환자의 혈액에서 얻은 세포(적혈구를 제외한 모든 세포)로부터 전장 RNA를 분리하는 단계;b) 상기 분리된 전장 RNA로부터 cDNA를 합성하는 단계;c) 상기 합성된 cDNA를 사이토케라틴 19를 증폭할 수 있는 프라이머쌍 및 프로브, Ki67를 증폭할 수 있는 프라이머쌍 및 프로브, 및 TBP를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍 및 프로브로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머쌍 및 프로브를 이용하여 실시간-PCR을 수행하는 단계; 및 d) 상기 증폭된 양을 정상인에 대해 증폭된 양과 비교하는 단계;를 포함하는 암의 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.

일반적으로 사용되는 전장 RNA(Total RNA)를 분리하는 방법 및 이로부터 cDNA를 합성하는 방법은 공지된 방법을 통해 수행될 수 있으며, 이 과정에 대한 자세한 설명은 Joseph Sambrook 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001); 및 Noonan, K. F. 등에 개시되어 있어 본 발명의 참조로서 삽입될 수 있다.

본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예: 아크리딘, 프소랄렌 등), 킬레이트화제(예: 금속, 방사성 금속,철, 산화성 금속 등), 및 알킬화제를 함유할 수 있다. 본 발명의 핵산 서열은 또한 검출 가능한 시그널을 직접 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 표지의 예로는 방사성 동위원소, 형광성 분자, 바이오틴 등이 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열(사이토케라틴 19, Ki67 등 유전자)은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광, 화학발광단 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 루오리신(fluorescein), 피코에리트린 (phycoerythrin), 로다민, 리사민 (lissamine) Cy-5 또는 Cy-3일 수 있다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단 및/또는 3' 말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 real-time RT-PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다.

또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 real-time RT-PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용할 수 있다.

표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션 (nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법 (Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법 (Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.

본 발명의 한 측면에 따르면, 본 발명에서는 RT-PCR을 통해 mRNA 수준에서 발현수준을 측정하게 된다. 이를 위하여 상기 사이토케라틴 19, Ki67, 및 TBP 유전자에 특이적으로 결합하는 신규한 프라이머 쌍과 형광이 표지된 프로브가 요구되며, 본 발명에서 특정한 염기서열로 특정된 해당 프라이머 및 프로브를 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 이들 유전자에 특이적으로 결합하여 검출가능한 시그널을 제공하여 real-time RT-PCR을 수행할 수 있는 것이면, 제한 없이 사용될 수 있다. 상기에서 FAM과 BHQ1은 형광염료를 의미한다.

본 발명에 적용되는 real-time RT-PCR 방법은 당업계에서 통상적으로 사용되는 공지의 과정을 통해 수행될 수 있다.

mRNA 발현수준을 측정하는 단계는 통상의 mRNA 발현수준을 측정할 수 있는 방법이면 제한 없이 사용될 수 있으며, 사용한 프로브 표지의 종류에 따라 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 real-time RT-PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 real-time RT-PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일구현예에 따르면, 상기 realtime RT-PCR을 통해 증폭된 PCR 산물에 형광이 표지된 프로브가 붙어 특정 파장의 형광을 내게 되고, 증폭과 동시에 realtime PCR 장치의 형광 측정기에서 본 발명의 유전자들의 mRNA 발현수준을 실시간으로 측정하고, 측정된 값이 계산되어 PC를 통해 시각화 되게 되어 검사자는 쉽게 그 발현정도를 확인할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 증폭된 양을 정상인에 대해 증폭된 양과 비교하는 단계는 표준 또는 컷오프 값에 의하여 수행되는 것이 바람직하고, 상기 컷오프 값은 Ct값(Threshold Cycle)이 34.0인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 사이토케라틴 19를 증폭할 수 있는 프라이머쌍은 서열번호 1 및 2에 기재되고, 프로브는 서열번호 3에 기재된 염기서열을 가지는 것이 바람직하고,

상기 Ki67을 증폭할 수 있는 프라이머쌍은 서열번호 4 및 5에 기재되고, 프로브는 서열번호 6에 기재된 염기서열을 가지는 것이 바람직하며,

상기 TBP를 증폭할 수 있는 프라이머쌍은 서열번호 7 및 8에 기재되고, 프로브는 서열번호 9에 기재된 염기서열을 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 사이토케라틴 19를 증폭할 수 있는 서열번호 1 및 2에 기재된 프라이머쌍과 서열번호 3에 기재된 프로브; Ki67을 증폭할 수 있는 서열번호 4 및 5에 기재된 프라이머쌍과 서열번호 6에 기재된 프로브; 및 TBP를 증폭할 수 있는 서열번호 7 및 8에 기재된 프라이머쌍과 서열번호 9에 기재된 프로브로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머쌍 및 프로브를 포함하는 암의 진단을 위한 프라이머쌍 및 프로브를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 프라이머 쌍 및 프로브를 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 암은 유방암, 방광암, 자궁경부암, 대장암, 폐암, 췌장암, 위암, 난소암, 혈액암, 간암, 전립선암, 또는 두경부암인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 조성물을 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 다른 측면에 따르면 상기 진단 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 암 진단용 키트일 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 상기 본 발명의 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함할 수 있다. 프라이머는 각 마커 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오타이드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp 의 길이일 수 있으며 보다 바람직하게는 서열번호 1 및 2로 표시되는 신규한 프라이머 쌍 및 서열번호 3으로 표시되는 형광표지된 프로브;서열번호 4 및 5로 표시되는 신규한 프라이머 쌍 및 서열번호 6으로 표시되는 형광표지된 프로브;및/또는 서열번호 7 및 8로 표시되는 신규한 프라이머 쌍 및 서열번호 9로 표시되는 형광표지된 프로브를 포함할 수 있다.

그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어 "암 진단을 위한 정보제공방법"은 진단을 위한 예비적 단계로서 암의 진단을 위하여 필요한 객관적인 기초정보를 제공하는 것이며 의사의 임상학적 판단 또는 소견은 제외된다.

용어 "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시할 수 있다. 본 발명의 프라이머는, 각 마커 유전자 특이적인 프라이머로 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산이다. 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다.

용어 "프로브"는 단일 연쇄 핵산 분자이며, 타깃 핵산 서열에 상보적인 서열을 포함한다.

용어 "실시간 역전사 중합효소 반응(realtime RT-PCR)"이라 함은 역전사효소를 이용하여 RNA를 상보적인 DNA(cDNA)로 역전사 시킨 후에 만들어진 cDNA를 주형(template) 으로하여 타겟 프라이머와 표지를 포함하는 타겟 프로브를 이용해 타겟을 증폭함과 동시에 증폭된 타겟에 타겟 프로프의 표지에서 발생하는 신호를 정량적으로 검출해 내는 분자생물학적 중합방법이다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명자들은 암 환자에게서 한 튜브의 혈액을 채취하여 혈중 종양 세포의 유무를 검사함으로써, 기존에 사용되는 영상장비로 검출할 수 없었던 현재 전이성 암의 가능성이 있는 환자들을 판별할 수 있는 검사법을 제공하고자 한다. 특히 상피성 항원인 Cytokeratin 19와 세포분열 마커인 Ki67의 mRNA를 이용한 유전자 증폭 방법을 이용하기 때문에 단백질을 검출하는 방법보다 눈에 보이지 않은 정도의 양도 검출할 수 있는 장점을 제공하고 항원 항체 반응을 사용하지 않기 때문에 값싼 검사 방법을 제공할 수 있다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

각각의 Cell line 으로 부터의 Cytokeratin 19과 Ki67 의 발현 여부 확인

각각의 암세포에 해당하는 Cell line을 이용하여 Cytokeratin 19과 Ki67의 발현여부를 확인 하였다. 각각에 이용된 Cell line은 유방암 Cell line 세 종류 (MCF7, SKBR3, MDA-MB 231), 폐암 Cell line (A549), 자궁 경부암 Cell line (HeLa), 난소암 Cell line (SKOV3)을 이용하였고 사람의 단구세포 Cell line (THP-1)을 음성 대조군으로 이용하였다.

각 Cell line의 세포 수는 100,000개로 유지하여 Cell line 별 Cytokeratin 19의 발현 양상을 살펴 보았다. 그 결과 유방암 Cell line과 폐암 Cell line에서는 높은 Cytokeratin 19의 발현 양상을 나타내는 것을 확인할 수 있었고, 난소암 Cell line과 단구세포 Cell line에서는 Cytokeratin 19가 발현되지 않는 것을 확인할 수 있었다. Ki67의 경우 모든 암세포화 된 경우 발현되는 것을 확인할 수 있었다.

표 1은 세포주 별 Cytokeratin 19의 발현 양상을 나타낸 표이다.

표 2는 세포주 별 Ki67 발현양상을 나타낸 표이다.

Cytokeratin 19 발현의 민감도 및 Cut - off value 의 설정 및 Ki67 발현여부 확인

암이 존재하지 않는 건강한 사람의 혈액을 10ml을 채혈하여 유방암 Cell line인 MCF7을 10⁵부터 1 세포까지 단계적으로 혈액에 섞어 임의적으로 혈중 종양 세포의 모델을 만든 후 그 민감도를 확인하였다. 또한 암이 없는 건강한 사람의 혈액을 이용하여 실험상의 Cut-off value를 설정하였다. 그 결과 임의적으로 만든 혈중 종양 세포 모델에서 10ml 당 10개까지 검출이 가능하였고 또한 Ct 값의 Cut-off value는 34.0에서 설정할 수 있었다.

Ki67의 경우 TBP(TATA BOX BINDING Protein)와 Ki67을 각각 증폭시킨 후 Ct value를 구하여 정상인 4를 기준으로 하여 발현양상을 살펴 보았다. 발현양상은 1.0부터 3.27까지 확인되었다.

본 발명에서 TBP는 Internal control로 사용한 것으로, Ki67의 경우 Cytokeratin 19와는 달리(Cytokeratin 19의 발현 여부는 혈중 종양 세포 모델을 Standard로 하여 정량곡선을 그려서 상대적인 세포 수를 확인) 기준을 잡기위해 TBP를 항상 넣어주며 정상인의 발현량을 비교하기위해서 정상인의 TBP의 Ct값과 동일한 농도의 DNA를 기준으로하여 TBP와 Ki67을 항상 넣어주며, TBP의 기준을 1로 잡은후 10배이상이 발현될 경우에 양성으로 판정하였다.

표 3은 혈중 종양 세포 모델의 민감도를 확인한 표이다.

표 4는 정상인에서의 Ki67 발현을 나타낸 표이다.

전이성 유방암을 가진 환자에서의 혈중 Cytokerain 19와 Ki67 의 확인

신촌 세브란스 병원에서 전이성 유방암을 가진 환자의 혈액을 받아 Cytokeratin 19의 발현 여부를 확인 하였다. 앞서 이용한 임의적인 혈중 종양 세포 모델을 Standard로 하여 정량곡선을 그린 후 상대적인 세포 수를 확인 하였다. 그 결과 총 6명의 환자 중에서 10개 이상의 혈중 종양 세포가 검출 된 환자가 1명 있었고, 10개 이상은 아니지만 Cut-off Value 이하의 값을 나타내는 환자가 2명이 존재하는 것을 확인하였다.

또한 Ki67의 경우도 Cytokeratin19이 많이 발현한 환자 군에서 정상인에 비하여 높은 비율로 발현하는 것을 확인할 수 있었다. 정상인의 발현비율의 최대가 3.29였던 것을 감안하면 환자군 4번과 환자군 6번에서 각각 높은 비율로 Ki67이 발현 된 것을 확인할 수 있었다. 따라서 두 가지의 마커를 이용하여 동시에 검출할 경우 더 양성율을 높일 수 있기 때문에 전이성 암으로 발전할 수 있는 환자의 관찰에 더 용이하게 사용될 수 있다.

표 5는 전이성 유방암 환자에서의 혈중 종양 세포 검출표이다.

표 6은 환자군에서의 Ki67 발현양상을 나타낸 표이다.

기존의 알려진 RT - PCR method 와의 비교

기존에 이미 알려진 RT-PCR법을 이용한 혈중 종양 세포 검출법과의 비교를 위하여 이미 다른 특허에서 사용된 Primer Set와 비교 실험을 수행하였다. 그 결과 기존에 알려진 primer 세트의 경우 정상인 4번 검체에서 Cytokeratin 19의 밴드와 같은 크기의 밴드를 확인할 수 있었으나 이번 발명에 사용된 Real-time PCR 방법을 이용하였을 경우에는 발현 여부를 확인할 수 없었기 때문에 새로 개발 된 primer와 probe 세트가 기존에 알려진 RT-PCR 법에 비하여 더 특이도가 좋다는 것을 확인할 수 있었고, 또한 전기 영동을 이용하여 밴드를 확인하는 단계가 없기 때문에 더 손쉽게 결과를 확인할 수 있다는 장점을 확인할 수 있었다.

본 발명은 암 환자에게서 한 튜브의 혈액을 채취하여 혈중 종양 세포의 유무를 검사함으로써, 기존에 사용되는 영상장비로 검출할 수 없었던 현재 전이성 암의 가능성이 있는 환자들을 판별할 수 있으며, 특히 상피성 항원인 Cytokeratin 19와 세포분열 마커인 Ki67의 mRNA를 이용한 유전자 증폭 방법을 이용하기 때문에 단백질을 검출하는 방법보다 눈에 보이지 않은 정도의 양도 검출할 수 있고, 항원 항체 반응을 사용하지 않기 때문에 값싼 검사 방법을 제공할 수 있다. 또 기존에 알려진 RT-PCR 법에 비하여 더 특이도가 좋다는 것을 확인할 수 있었고, 또한 전기 영동을 이용하여 밴드를 확인하는 단계가 없기 때문에 더 손쉽게 결과를 확인할 수 있다.

도 1은 세포주 별 Cytokeratin 19 발현 여부를 나타내는 그림, A ; MCF7, B ; SKBR3, C ; MDA-MB 231, D ; A549, E ; HeLa, F : SKOV3, G ; THP-1, H ; 브랭크 대조군을 나타냄.
도 2는 세포주 별 Ki67 발현양상을 나타낸 그림, A ; MCF7, B ; SKBR3, C ; MDA-MB 231, D ; A549, E ; HeLa, F : SKOV3, G ; THP-1, H ; 브랭크 대조군을 나타냄.
도 3은 전이성 유방암 환자에서의 Cytokeratin 19 검출을 나타낸 그림, 빨간 사각형 ; Standard 곡선 (Blood + MCF7 10⁵-1), 파란 사각형 ; 환자군을 나타냄.
도 4는 Cytokeratin 19 RT-PCR법의 특이도 및 민감도 확인을 나타낸 그림, 유방암 세포인 MCF7을 건강한 사람 혈액 10ml에 10⁵부터 1 세포까지 단계적으로 희석하여 실험 한 결과 1세포 까지 검출이 가능하였음. 또한 각 암세포 Cell line에서 발현 양상을 확인 한 결과 단구세포에서는 발현이 되지 않는 것을 확인하였고 각각의 암세포 Cell line에서는 Cytokeratin 19의 밴드를 확인할 수 있었다. ① THP-1(단구세포), ② SKOV3 (난소암 Cell line) ③ HeLa (자궁경부암 Cell line) ④~⑥ 유방암 Cell line (MDA-MB 231, MCF7, SKBR3) ⑦ Blank control, 또한 환자군 (P1-P6)의 경우에서도 6개 검체 모두에서 Cytokeratin 19의 밴드가 확인되었고, 정상인 (N1-N4)에서도 한 검체에서 밴드가 확인되었다.
도 5는 기존 방법과 현재 방법의 Primer 위치 확인 그림, 빨간 색은 기존 방법에서 사용한 Primer 위치 (516-675), 파란 색은 이번 방법에서 사용한 Primer 위치 (1012-1107), 초록 색 이번 방법에서 사용한 Probe 위치 (1037-1059)를 나타냄.

이하, 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.

실시예 1: 환자의 혈액에서 세포의 분리

암 환자의 정맥에서 혈액을 EDTA 튜브에 채취한다. 상피세포로부터의 오염을 방지 하기 위하여 처음 채취한 5 ml은 버리고 나중에 채취한 10 ml을 검사법에 이용한다. 환자 혈액으로부터 mRNA 손상을 방지하기 위하여 혈액 채취 후 4 시간 이내에 첫 실험 과정인 적혈구 용해 과정을 시작하여야 한다. 혈액으로부터 적혈구를 용해 하기 위해서는 NH₄Cl 154 mM, KHCO₃ 9 mM, EDTA 0.1 mM이 포함된 적혈구 용해 용액으로 5배 부피를 넣어 주고 vortex 후 상온에서 10분간 정치 후 10분간 4℃ 600g 에서 원심분리를 수행하고 상등액은 조심스럽게 버린다. 여분의 적혈구를 제거하기 위해 10 ml의 RBC lysis buffer를 넣고 5분간 ice에서 정치시킨 후 2분간 4℃ 3000rpm 에서 원심분리를 재차 수행하고 상등액을 조심스럽게 버리고 1 ml PBS넣고 pellet을 재 부유시킨 후 혈중에 있는 자유 핵산을 제거해주기 위하여 RNase A (100 ug/ml)를 5분간 처리 해 준다.

실시예 2: 분리된 세포로부터 Total RNA 분리

재 부유시킨 pellet 다시 2분간 4℃ 3000 rpm 에서 원심분리를 하고 상등액은 pipetting 으로 버린 후 Trizol reagent (Invitorogen) 1ml을 넣고 제조 업체의 프로토콜에 따라 Total RNA를 분리하였다.

실시예 3: 분리된 Total RNA 로부터 cDNA 제작 및 Real - time PCR 수행

1) cDNA 합성

분리된 total RNA 2 ug, random primer (Invitrogen) 0.25 ug, dNTP(Cosmo gene tech) 250 uM, Tris-HCl(pH 8.3) 50 mM, KCl 75 mM, MgCl₂ 3 mM, DTT 8 mM 와 MMLV 역전사 중합효소 200 units (Invitrogen)을 첨가하고 최종부피를 20 ul가 되도록 DEPC 처리된 DW를 넣고 잘 섞은 후 합성 반응액을 thermocycler (ABI)에서 25℃에서 10 분, 37℃에서 50 분, 70℃에서 15 분간 반응시켜 cDNA를 합성한다.

2) Real-time PCR 수행

Real-time PCR의 반응물의 조성은 25 mM TAPS (pH 9.3, 25°C), 50 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 1 mM 2-mercaptoethanol, 200 μM each dNTP, 1 unit Taq polymerase (TAKARA)와 Forward primer와 Reverse primer를 각각 1pmole을 넣어주고, 프로브 또한 1pmole을 넣어 주고, 합성된 cDNA를 2ul를 넣고 최종 부피를 20ul가 되게 수행한다. 각각의 프라이머와 프로브의 염기서열은 다음과 같다.

Cytokeratin 19 primer 와 프로브 (증폭산물 96bp)

Forward : 5'GATGAGCAGGTCCGAGGTTA-3'(서열번호 1)

Reverse : 5'TCTTCCAAGGCAGCTTTCAT-3'(서열번호 2)

Probe : 5'FAM-CTGCGGCGCACCCTTCAGGGTCT-BHQ1-3'(서열번호 3)

Ki67 Primer와 프로브

Forward : 5'TAATGAGAGTGAGGGAATACCTTTG-3(서열번호 4)

Reverse : 5'AGGCAAGTTTTCATCAAATAGTTCA-3(서열번호 5)

Probe : 5'FAM-GGCGTGTGTCCTTTGGTGGGCA-BHQ1-3(서열번호 6)

TBP Primer와 프로브

Forward : 5'CACAGTGAATCTTGGTTGTAAACTTGA-3(서열번호 7)

Reverse : 5'AAACCGCTTGGGATTATATTC G-3(서열번호 8)

Probe : 5'FAM-AAGACCAATGCACTTCGTGCCCGA-BHQ1-3(서열번호 9)

PCR 반응은 ABI 7500Fast (Applied Biosystem) 이용하여 변성 온도 94℃에서 5분 동안 1회 수행하고, 변성 온도 95℃에서 30초, 어닐링 온도 55℃에서 20초인 사이클을 40회 반복하여 수행하였다. 또한 각각의 어닐링 과정 후 형광을 측정하는 과정을 추가 하여, 각 사이클 별로 증가되는 형광 값을 측정하였다.

실시예 4:결과의 분석

각 실험의 결과는 7500 software v2.0.4 (Applied Biosystem)을 이용하여 분석 하였다. Cytokeratin 19의 경우 정상인의 혈액 10ml에 유방암 세포인 MCF7을 10⁵ 부터 1세포 까지 단계적으로 희석하여 상대적 정량 곡선을 그려서 상대적인 혈중 종양 세포의 양을 Ct value를 이용하여 측정할 수 있었다. Ki67경우 정상인의 혈액에서 발현되는 Ki67의 발현 양을 기준으로 하여 환자군의 Ki67 발현양을 비교 정량하여 발현율을 살펴 보았다. 이때 하우스 키핑 유전자인 TBP의 발현양을 기준으로 하여 각각의 Ki67이 발현양을 비교 하였다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

a) 암 의심환자의 전혈에서 얻은 세포로부터 전장 RNA를 분리하는 단계;
b) 상기 분리된 전장 RNA로부터 cDNA를 합성하는 단계;
c) 상기 합성된 cDNA를 사이토케라틴 19를 증폭할 수 있는 서열번호 1 및 2에 기재된 프라이머쌍 및 서열번호 3에 기재된 프로브, Ki67를 증폭할 수 있는 서열번호 4 및 5에 기재된 프라이머쌍 및 서열번호 6에 기재된 프로브, 및 서열번호 7 및 8에 기재된 TBP를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍 및 서열번호 9에 기재된 프로브로 구성된 프라이머쌍 및 프로브를 이용하여 실시간-PCR을 수행하는 단계; 및
d) 상기 발현된 양을 정상인에 대해 발현된 양과 비교하는 단계;를 포함하는 암의 진단을 위한 정보제공방법
제 1항에 있어서, 상기 발현된 양을 정상인에 대해 발현된 양과 비교하는 단계는 표준 또는 컷오프 값에 의하여 수행되는 것을 특징으로 하는 암의 진단을 위한 정보제공방법.
제 2항에 있어서, 상기 컷오프 값은 사이토케라틴 19에 대해서 Ct값(Threshold Cycle)이 34.0인 것을 특징으로 하는 암의 진단을 위한 정보제공방법.
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사이토케라틴 19를 증폭할 수 있는 서열번호 1 및 2에 기재된 프라이머쌍과 서열번호 3에 기재된 프로브;
Ki67을 증폭할 수 있는 서열번호 4 및 5에 기재된 프라이머쌍과 서열번호 6에 기재된 프로브; 및
TBP를 증폭할 수 있는 서열번호 7 및 8에 기재된 프라이머쌍과 서열번호 9에 기재된 프로브로 구성된 프라이머쌍 및 프로브를 포함하는 암의 진단을 위한 프라이머쌍 및 프로브를 포함하는 암 진단용 조성물.
삭제
제 7항에 있어서, 상기 암은 유방암, 방광암, 자궁경부암, 대장암, 폐암, 췌장암, 위암, 난소암, 혈액암, 간암, 전립선암, 또는 두경부암인 것을 특징으로 하는 암 진단용 조성물.
제7항에 있어서, 상기 암은 전이성 암인 것을 특징으로 하는 암 진단용 조성물.
제7항의 조성물을 포함하는 암 진단용 키트.