KR101336862B1

KR101336862B1 - 실시간 역전사효소 중합반응을 이용한 결핵의 진단을 위한 정보제공방법 및 이를 위한 결핵 진단용 키트

Info

Publication number: KR101336862B1
Application number: KR1020110033865A
Authority: KR
Inventors: 이혜영; 김성현; 조상래; 김태우
Original assignee: 연세대학교 원주산학협력단
Priority date: 2011-03-10
Filing date: 2011-04-12
Publication date: 2013-12-04
Also published as: KR20120103387A

Abstract

본 발명은 종래의 결핵 진단용 키트에 비하여 사용되는 혈액량 및 처리시간이 현저하게 저감된 결핵의 진단을 위한 정보제공방법 및 이를 위한 결핵 진단용 키트에 관한 것이다.

Description

실시간 역전사효소 중합반응을 이용한 결핵의 진단을 위한 정보제공방법 및 이를 위한 결핵 진단용 키트{Method of providing information for diagnosis of tuberculosis using quantitative realtime PCR and diagnostic kit comprising thereof}

본 발명은 결핵의 진단을 위한 정보제공방법 및 이를 위한 결핵 진단용 키트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 종래의 결핵 진단용 키트에 비하여 검사 시간, 절차 및 필요한 채혈량이 현저하게 저감되어 보다 편리하고 쉽게 결핵의 진단을 할 수 있는 정보제공방법 및 이를 위한 결핵 진단용 키트에 관한 것이다.

결핵은 마이코박테리움. 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis)로 감염되어 유발되는 만성 감염성 질병으로, 개발도상국에서 주요 질병일 뿐 아니라 세계 선진국에서도 그 심각성이 증가하고 있으며, 매년 약 8백만명의 환자가 새로 발병하며 약 3백 만명의 환자가 사망한다. 결핵은 감염되어도 상당한 시간 동안 증상이 없을 수 있지만, 이 질병은 가장 통상적으로 폐의 급성 염증으로 나타나서 열 및 비생산적 기침을 초래하며, 이를 치료하지 않으면, 통상적으로 심각한 합병증을 초래하고 사망에 이르게 된다.

따라서, 결핵의 조기 진단 및 치료가 무엇보다도 중요하며, 종래에 결핵균 감염의 모니터링에는 투베르쿨린 피부반응검사(Tuberculin Skin Test; TST)가 전 세계적으로 통용되어 왔다. TST는 결핵균 배양액을 가열 멸균한 후 여과하여 얻은 배양액을 정제한 투베르쿨린을 주사하고 2-3일 이후에 주사부위에 나타나는 반응(지연형 과민반응)의 정도를 측정하는 항원특이 반응이다. 그러나 TST는 비결핵항산균(NTM)에 감작되었던 사람들에게서 교차반응을 보이며, 우리나라와 같이 BCG 백신접종이 보편화되어 있는 경우에는 위양성의 확률이 매우 높다. 또한, 결핵환자 중에는 음성반응을 보이는 환자들도 있어 결핵 감염을 가리는 기준으로써 신빙성이 감소하였다. 그러나 특이도는 낮지만 민감도가 높고 저렴한 비용 때문에 아직도 개발도상국이나 후진국에서는 결핵균 감염을 검출하기 위한 방법으로써 널리 사용되고 있다.

통상적으로 많이 사용되던 방법은 배양법이다. 그러나 검사실에서 환자의 검체로부터 직접 균을 분리, 배양하여 검사를 할 경우 감염의 위험성이 매우 높으며, 결핵균이 자라는데 최소 4-6주 이상 소요되기 때문에 상당히 많은 시간과 비용이 소모되는 문제가 있었다.

반면에, 환자의 혈액을 이용한 검출방법은 결핵균이 아닌 결핵균 감염에 의한 면역반응을 보는 것이기 때문에 보다 안전하고, 빠르며, 또한 일반적인 임상 검사 시 필요한 혈액의 일부를 사용해 검사를 진행할 수 있기 때문에 환자와 검사자 입장에서 모두 편리한 방법이다.

현재까지 개발된 혈액을 대상으로 한 검사법에는 결핵균 항원에 대한 항체를 검출하는 혈청학적인 방법과, 결핵균 감염에 의해 분비되는 IFN-γ(NCBI ACCESSION NO : NM_000619)의 양을 검출하는 IGRA검사법이 있다. 구체적으로 혈청학적 진단법은 사용이 아주 간편하고 쉽고 빠르게 결과를 해석할 수 있다는 장점이 있으나 특이도와 민감도가 매우 낮고 정량적인 검사를 할 수 없다는 단점이 있다.

이에 결핵균 특이항원에 의해 자극된 T세포가 분비하는 IFN-γ 단백질을 정량적으로 분석하는 방법인 IGRA검사는 IFN-γ에 대한 단일항체를 이용한 ELISA법인 QuantiFERON과 ELISPOT법을 이용한 T-Spot.TB가 기존의 검사법에 비해 높은 특이도를 보이기 때문에 선진국을 중심으로 널리 사용되어 지고 있다.

그러나 IGRA검사는 세계적으로 상용화되기에 어려운 다음과 같은 단점들이 있다.

첫째, IGRA검사를 위해서는 환자의 전혈이 약 3ml 정도 필요하지만 이 정도 혈액량을 얻기 위해서는 주사기를 통해 혈액을 채취하여야 하기 때문에 채혈이 어려운 소아나 노인의 경우 검사에 필요한 혈액량을 얻기가 매우 어려울 뿐 아니라, 일반인들에게도 매우 번거로운 문제가 있었다.

둘째, 검사 시, 채취한 혈액에 결핵 특이 항원을 처리하는 시간이 16-24 시간 정도 소요되기 때문에 검사결과가 나오기까지 약 이틀의 시간이 소요된다.

셋째, 상업용 키트의 경우 전량 수입에 의존하고 있으며, 가격 역시 100테스트 당 500만원 정도로 현저하게 비싼 문제가 있다.

넷째, ELISA방법을 이용한 IGRA검사의 경우 검사시 마다 표준검량선 (standard)을 설정해야 하기 때문에, 적은 수의 검체를 검사하기에 비용적인 부담이 있고, 한 번에 많은 수의 검체를 검사할 때에는 검사에 사용되는 발색 시약의 작용이 지연될 수 있기 때문에 일정한 결과를 얻기 어려운 문제가 있다.

본 발명은 상술한 문제를 해결하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명의 첫번째 해결하려는 과제는 요구되는 혈액량을 현저하게 줄이면서도 검사시간을 획기적으로 저감할 수 있는 결핵의 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 두번째 해결하려는 과제는 종래의 결핵 진단용 키트보다 요구되는 혈액량은 적으면서 검사과정 및 시간을 획기적으로 낮출 수 있는 신규한 프라이머와 프로브가 포함된 결핵 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명은 상기 첫번째 과제를 달성하기 위하여, (1) 결핵 의심환자의 혈액을 채취하여 결핵균 특이항원을 처리하는 단계; (2) 상기 결핵균 특이항원이 처리된 혈액에서 전장 RNA를 분리하는 단계; (3) 상기 분리된 전장 RNA로부터 cDNA를 합성하는 단계; (4) 상기 합성된 cDNA를 IFN-γ를 증폭할 수 있는 제1 프라이머 쌍, 증폭된 부위에 결합할 수 있는 제1 프로브 및 IFN-γ의 발현량과 대비하기 위한 대조군 유전자를 증폭시킬 수 있는 제2 프라이머 쌍과 증폭된 대조군 유전자 부위에 결합할 수 있는 제2 프로브를 이용하여 realtime RT-PCR을 수행하는 단계; 및 (5) 상기 증폭된 IFN-γ의 mRNA 발현수준 및 대조군 유전자의 mRNA 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는 결핵의 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 혈액은 전혈일 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일 실시예에 따르면, 상기 (1) 단계 이전에 결핵 의심환자의 혈액을 채혈하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 채혈은 1㎖ 이하의 혈액을 채혈하는 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 0.3㎖의 혈액을 채혈할 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 (2) 단계의 결핵균 특이항원은 ESAT-6, CFP-10 및 TB7.7이 모두 포함될 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 대조군 유전자는 GAPDH일 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 GAPDH를 증폭할 수 있는 프라이머는 서열번호 4 및 5로 구성되는 프라이머쌍일 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 제2 프로브는 서열번호 6으로 표시되는 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 IFN-γ를 증폭할 수 있는 프라이머는 서열번호 1 및 2로 구성되는 프라이머쌍 또는 서열번호 7, 8로 구성되는 프라이머쌍을 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 제1 프로브는 서열번호 3 또는 서열번호 9로 표시되는 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 (5) 단계 이후, 대조군 유전자의 mRNA 발현수준을 기준으로 IFN-γ의 mRNA 발현수준을 상대적으로 비교하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 두번째 과제를 달성하기 위하여, 결핵의 진단을 위하여 IFN-γ를 증폭할 수 있는 서열번호 1 및 2로 구성되는 프라이머쌍 또는 서열번호 7 및 8로 구성되는 프라이머쌍을 포함하는 결핵 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 대조유전자의 mRNA 발현수준을 측정하기 위하여 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일 실시예에 따르면, 상기 대조유전자는 GAPDH일 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 프라이머는 서열번호 4 및 5로 구성되는 프라이머쌍을 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일 실시예에 따르면, 결핵의 진단을 위하여 IFN-γ를 증폭할 수 있는 서열번호 1 및 2로 구성되는 프라이머쌍; 상기 증폭된 IFN-γ에 결합할 수 있는 서열번호 3으로 표시되는 형광이 표지된 프로브, IFN-γ의 발현량과 대비하기 위한 GAPDH를 증폭할 수 있는 서열번호 4 및 5로 구성되는 프라이머 쌍 및 상기 증폭된 GAPDH에 결합할 수 있는 서열번호 6으로 표시되는 형광이 표지된 프로브를 포함하는 결핵 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일 실시예에 따르면, 결핵의 진단을 위하여 IFN-γ를 증폭할 수 있는 서열번호 7 및 8로 구성되는 프라이머쌍; 상기 증폭된 IFN-γ에 결합할 수 있는 서열번호 9로 표시되는 형광이 표지된 프로브, IFN-γ의 발현량과 대비하기 위한 GAPDH를 증폭할 수 있는 서열번호 4 및 5로 구성되는 프라이머 쌍 및 상기 증폭된 GAPDH에 결합할 수 있는 서열번호 6으로 표시되는 형광이 표지된 프로브를 포함하는 결핵 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 결핵 진단용 조성물을 포함하는 결핵 진단용 키트 및 이를 포함하는 realtime RT-PCR 키트을 제공한다.

이하, 본 발명에 사용된 용어를 설명한다.

용어 "실시간 역전사 효소 증폭법을 이용한 결핵 진단을 위한 정보제공방법"은 진단을 위한 예비적 단계로서 결핵의 진단을 위하여 필요한 객관적인 기초정보를 제공하는 것이며 의사의 임상학적 판단 또는 소견은 제외된다.

용어 "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시할 수 있다. 본 발명의 프라이머는, 각 마커 유전자 특이적인 프라이머로 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산이다. 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다.

용어 "프로브"는 단일쇄 핵산 분자이며, 타깃 핵산 서열에 상보적인 서열을 포함한다.

용어 "mRNA 발현수준 측정"이란 결핵을 진단하기 위한 정보를 제공하기 위하여 생물학적 시료에서 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정한다.

용어 "실시간 역전사 중합효소 반응(realtime RT-PCR)"이라 함은 역전사효소를 이용하여 RNA를 상보적인 DNA(cDNA)로 역전사 시킨 후에 만들어진 cDNA를 주형(template) 으로하여 타겟 프라이머와 표지를 포함하는 타겟 프로브를 이용해 타겟을 증폭함과 동시에 증폭된 타겟에 타겟 프로프의 표지에서 발생하는 신호를 정량적으로 검출해 내는 분자생물학적 중합방법이다.

종래의 IFN-γ 단백질을 검사하는 IGRA 방법은 최소 3㎖ 이상의 혈액을 요구하므로 채혈 시 노인이나 영유아에게 적용하는 것이 어렵지만 본 발명에서는 1㎖ (바람직하게는 0.5㎖ 이하)의 매우 적은 혈액만으로도 결핵검사가 가능하므로 보다 용이하게 소량의 혈액만으로 검사가 가능하여 환자의 부담을 현저하게 저감할 수 있다.

또한, 전기영동과 EtBr염색과정이 필요 없으므로, 기존 총 검사 시간을 줄일 수 있으므로, 보다 빠르게 결핵 환자를 판별해낼 수 있다. 또한 증폭된 산물에 표지된 프로브에 의해 나오는 신호를 기계가 민감하게 읽어냄으로써, 기존 검사에 비해 보다 민감도가 좋은 검사가 될 수 있다.

나아가, 추가로 형광 등이 표지된 프로브를 사용함으로써, 프라이머쌍에 의해 증폭된 부위의 내부에 또 다른 표지 프로브가 결합할 수 있으므로, 타겟에 대한 보다 높은 특이도를 가질 수 있다.

또한, 본 발명의 특정한 IFN-γ 프라이머와 프로브는 통상의 프라이머 및 프로브를 사용했을 때에 비하여 형광의 강도가 현저하게 증가하므로 발현양이 적은 검체를 분석하는 경우에도 보다 민감하고 정확한 결과를 제공할 수 있다.

도 1은 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 결핵의 진단을 위한 실시간 역전사 효소 증폭법의 정보제공방법을 나타내는 흐름도이다.
도 2는 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 realtime RT-PCR을 수행하기 위한 결핵균 특이항원이 포함된 튜브이다.
도 3a ~ 3e는 결핵환자 5명의 혈액을 이용해 본 발명의 realtime RT-PCR을 수행한 결과이다.
도 4a ~ 4e는 결핵이 아닌 사람 5명의 혈액을 이용해 본 발명의 realtime RT-PCR을 수행한 결과이다.
도 5는 기존의 IFN-r ELISA(상업킷트), RT-PCR 그리고 병원검사결과 양성과 음성이 나온 결핵환자의 혈액을 가지고 실험을 수행한 결과이다.
도 6은 동일한 검체 및 동일한 조건으로 realtime RT-PCR을 수행하고 형광이 세기를 측정한 그래프로서, 좌측 그래프는 서열번호 1, 2 IFN-γ 프라이머 쌍 및 서열번호 3의 프로브에 대하여 realtime RT-PCR을 수행하고 형광의 세기를 측정한 그래프이고, 우측은 서열번호 7, 8의 IFN-γ 프라이머 쌍 및 서열번호 9의 프로브, 우측은 에 대하여 realtime RT-PCR을 수행하고 형광의 세기를 측정한 그래프이다.
도 7은 동일한 검체 및 동일한 조건으로 realtime RT-PCR을 수행하고 형광이 세기를 측정한 그래프로서, 좌측 그래프는 서열번호 1, 2 IFN-γ 프라이머 쌍 및 서열번호 3의 프로브에 대하여 realtime RT-PCR을 수행하고 형광의 세기를 측정한 그래프이고, 우측은 서열번호 7, 8의 IFN-γ 프라이머 쌍 및 서열번호 9의 프로브, 우측은 에 대하여 realtime RT-PCR을 수행하고 형광의 세기를 측정한 그래프이다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

상술한 바와 같이 종래의 결핵의 진단을 위한 IGRA 검사는 요구되는 혈액량이 많고 검사시간이 최소 24시간 이상 소요될 뿐 아니라 제조된 키트의 가격이 현저하게 비싸 널리 활용되기 어려운 문제가 있었다.

이에 본 발명에서는, (1) 결핵 의심환자의 혈액을 채취하여 결핵균 특이항원을 처리하는 단계; (2) 상기 결핵균 특이항원이 처리된 혈액에서 전장 RNA를 분리하는 단계; (3) 상기 분리된 전장 RNA로부터 cDNA를 합성하는 단계; (4) 상기 합성된 cDNA를 IFN-γ를 증폭할 수 있는 제1 프라이머 쌍, 증폭된 부위에 결합할 수 있는 제1 프로브 및 IFN-γ의 발현량과 대비하기 위한 대조군 유전자를 증폭시킬 수 있는 제2 프라이머 쌍과 증폭된 대조군 유전자 부위에 결합할 수 있는 제2 프로브를 이용하여 realtime RT-PCR을 수행하는 단계; 및 (5) 상기 증폭된 IFN-γ의 mRNA 발현수준 및 대조군 유전자의 mRNA 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는 결핵의 진단을 위한 정보제공방법을 제공하여 상술한 문제의 해결을 모색하였다. 특히 IFN-γ을 단백질 발현수준이 아닌 mRNA 발현수준에서 정량적으로 분석하기 때문에 결핵검사 시 요구되는 혈액량, 검사시간 및 검사비용을 현저하게 저감할 수 있다.

먼저, (1) 단계로서 결핵 의심환자의 혈액을 채취하여 결핵균 특이항원을 처리한다. 종래의 IGRA 검사에서는 필요로하는 최소한의 혈액량이 3㎖ 이상이며 이 정도의 혈액을 채혈하기 위해서는 주사기를 통해 결핵 의심환자로부터 혈액을 채취하여야만 하였다. 상술한 채혈의 어려움으로 인하여 노인, 어린아이 및 여성들이 결핵검사를 받기 어려운 문제가 있었다. 그러나, 본 발명의 한 특징에 따르면 요구되는 혈액량이 1㎖ 이하로서 바람직하게는 0.3 ~ 0.5㎖를 통해 결핵여부를 판단할 수 있는 정보를 제공할 수 있으므로, 저용량의 blood collection tube를 이용한 방법으로 간편하게 채혈할 수 있어 채혈의 심리적 부담감을 상당부분 해소할 수 있다. 한편, 본 발명에 사용되는 혈액은 바람직하게는 전혈일 수 있다.

그 뒤, 혈된 결핵 의심환자의 혈액에 결핵균 특이항원을 처리한다. 이는 결핵균 특이항원에 반응한 T 세포가 분비하는 IFN-γ의 mRNA 발현수준을 통해 결핵을 판단하는 정보를 제공하기 위한 것으로서, 본 발명에서는 IFN-γ의 단백질의 발현수준의 정량이 아닌 IFN-γ mRNA 발현수준의 정량을 통해 결핵을 진단하기 위한 정보를 제공한다. 그러므로, 상기 (1) 단계에서 사용될 수 있는 결핵균 특이항원은 통상적으로 IGRA 검사에 사용될 수 있는 것으로서, 결핵균에만 특이하게 존재하며, 숙주에서 면역반응을 유도한다고 알려진 통상의 결핵균 특이항원은 모두 사용될 수 있다. 바람직하게는 결핵균 특이항원으로서 ESAT-6(NCBI ACCESSION NO : YP_178023), CFP-10(NCBI ACCESSION NO : NP_218391) 및 TB7.7(NCBI ACCESSION NO : NP_217171)를 약 4시간 이내로 혼합하여 처리할 수 있다. 한편,

한편, 환자들에게 채혈 후 곧바로 전장 RNA를 분리하지 않고 상기 결핵균 특이항원을 처리하여야 하는데 이는 결핵에 노출된 환자의 경우 기억 T 세포에서 결핵에대한 정보를 가지고 있기 때문에 결핵에 노출된 환자의 혈액에 결핵항원을 처리해주면 정상인에 비해 T cell이 기억하고 있다가 면역반응을 강하게 나타내기 때문에 더욱 많은 IFN-r를 발현해낼 수 있기 때문이다.

다음, (2) 단계 및 (3) 단계로서 구체적으로 상기 결핵균 특이항원이 처리된 혈액에서 전장 RNA(Total RNA)를 분리하는 단계, (3) 상기 분리된 전장 RNA로부터 cDNA를 합성하는 단계를 포함한다. 본 발명의 (2), (3) 단계는 real-time RT-PCR을 수행하기 위한 예비단계로서 일반적으로 사용되는 전장 RNA(Total RNA)를 분리하는 방법 및 이로부터 cDNA를 합성하는 방법은 공지된 방법을 통해 수행될 수 있으며, 이 과정에 대한 자세한 설명은 Joseph Sambrook 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001); 및 Noonan, K. F. 등에 개시되어 있어 본 발명의 참조로서 삽입될 수 있다.

한편, 본 발명에 사용되는 realtime RT-PCR에 비하여 RT-PCR에 비하여, 상용화되기 어려운 몇 가지 단점이 있다. 첫째, 증폭과정(PCR) 이후에 IFN-γ mRNA의 발현양을 분석하기 위해 아가로즈 젤 전기영동, EtBr 염색, densitometer (농도측정계) 측정의 과정들이 필요하므로 분석하는 시간이 지연될 수 있다. 둘째, 분석과정이 복잡하기 때문에, 검사를 위해 관련분야의 숙련자들이 필요하므로 검사의 재현성이 떨어질 수 있다. 셋째, 증폭된 증폭산물의 염색을 통한 분석이 이루어지기 때문에, 염색정도에 따른 결과의 민감도가 떨어질 수 있다.

이에 반하여, 본 발명에서 사용되는 realtime RT-PCR은 전기영동과 EtBr염색과정이 필요 없으므로, 기존 총 검사 시간을 줄일 수 있으므로, 보다 빠르게 결핵 환자를 판별해낼 수 있다. 또한 증폭된 산물에 표지된 프로브에 의해 나오는 신호를 기계가 민감하게 읽어 냄으로써, 기존 검사에 비해 보다 민감도가 좋은 검사가 될 수 있다. 나아가, 추가로 형광 등이 표지된 프로브를 사용함으로써, 프라이머쌍에 의해 증폭된 부위의 내부에 또 다른 표지 프로브가 결합할 수 있으므로, 타겟에 대한 보다 높은 특이도를 가질 수 있다.

이에, 본 발명에서는 다음, (4) 단계로서, 상기 합성된 cDNA를 IFN-γ를 증폭할 수 있는 제1 프라이머 쌍, 증폭된 부위에 결합할 수 있는 제1 프로브 및 IFN-γ의 발현량과 대비하기 위한 대조군 유전자를 증폭시킬 수 있는 제2 프라이머 쌍과 증폭된 대조군 유전자 부위에 결합할 수 있는 제2 프로브를 이용하여 realtime RT-PCR을 수행하여 상술한 문제를 해결하였다.

본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예: 아크리딘, 프소랄렌 등), 킬레이트화제(예: 금속, 방사성 금속,철, 산화성 금속 등), 및 알킬화제를 함유할 수 있다. 본 발명의 핵산 서열은 또한 검출 가능한 시그널을 직접 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 표지의 예로는 방사성 동위원소, 형광성 분자, 바이오틴 등이 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열(IFN-γ, 대조군 유전자)은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광, 화학발광단 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 루오리신(fluorescein), 피코에리트린 (phycoerythrin), 로다민, 리사민 (lissamine) Cy-5 또는 Cy-3일 수 있다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단 및/또는 3' 말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 real-time RT-PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다.

또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 real-time RT-PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용할 수 있다.

표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션 (nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법 (Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법 (Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.

본 발명의 한 측면에 따르면, IFN-γ는 결핵균 특이항원에 의해 자극된 T세포가 분비하는 단백질로서 본 발명에서는 RT-PCR을 통해 이를 단백질이 아닌 mRNA 수준에서 발현수준을 측정하게 된다. 이를 위하여 상기 IFN-γ 유전자에 특이적으로 결합하는 신규한 프라이머 쌍과 형광이 표지된 프로브가 요구되며, 본 발명에서는 전방 프라이머로서 [5' TGACCAGAGCATCCAAAAGA 3'(서열번호 1)] 및 후방 프라이머로서 [5' TGTATTGCTTTGCGTTGGAC 3'(서열번호 2)]인 신규한 프라이머 쌍을 이용할 수 있다. IFN-γ의 증폭부위에 결합하는 형광표지 프로브로서 [5'-FAM-TGGAGACCATCAAGGAAGACATGA-Quen-3'(서열번호 3)]을 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, IFN-γ에 특이적으로 결합하여 검출가능한 시그널을 제공하여 real-time RT-PCR을 수행할 수 있는 것이면, 제한 없이 사용될 수 있다. 상기에서 FAM과 Quen(Quencher)는 형광염료를 의미한다.

본 발명의 바람직한 일구현예에 따르면, 상기 IFN-γ 유전자에 특이적으로 결합하는 신규한 프라이머 쌍으로서 전방 프라이머로서 [5' tgaatgtccaacgcaaagca 3'(서열번호 7)] 및 후방 프라이머로서 [5' cgacctcgaaacagcatctga 3'(서열번호 8)]인 신규한 프라이머 쌍을 이용할 수 있다. IFN-γ의 증폭부위에 결합하는 형광표지 프로브로서 [5'-FAM-cgccagcagctaaaacagggaagcg-Quen-3'(서열번호 9)]을 사용할 수 있다. 이 경우 상술한 서열번호 1, 2의 프라이머 쌍 및 서열번호 3의 프로브를 사용하는 경우에 비하여 형광의 강도가 현저하게 증가하므로 발현양이 적은 검체를 분석하는 경우에도 보다 민감하고 정확한 결과를 제공할 수 있다 (실시예 6 참조).

본 발명의 다른 측면에 따르면, IFN-γ의 발현량과 대비하기 위한 대조군 유전자를 증폭시킬 수 있는 프라이머와 형광이 표지된 프로브를 이용하여 RT-PCR을 수행할 수 있다. 이 때 본 발명에 적용될 수 있는 대조군 유전자는 IFN-γ의 발현수준을 상대적으로 판단하기 위하여 기준이 되는 유전자로서, 본 발명에서는 상기 대조군 유전자의 일례로서 GAPDH 유전자(NCBI ACCESSION NO : NM_002046)를 사용하여 RT-PCR을 수행하여 mRNA를 발현시킬 수 있다. GAPDH 유전자는 housekeeping gene으로써 일반적으로 인체의 세포내에서 최소한의 기능을 유지하기 위해 일정한 양이 지속적으로 발현이 되고 있는 유전자로써, GAPDH 외에도 많은 유전자들이 존재하지만 정량적인 real-time RT-PCR분석에서는 GAPDH가 가장 많이 사용되고 있다. 그러므로 이에 제한되는 것은 아니며, IFN-γ의 발현수준을 상대적으로 판단하기 위하여 기준이 될 수 있는 유전자는 본 발명에 적용될 수 있다. 한편 본 발명에서는 대조 유전자로서 GAPDH 유전자를 사용하였으므로 상기 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머가 요구되며, 본 발명에서는 전방 프라이머로서 [5'-CCA TCTTCCAGGAGCGAGATCC-3'(서열번호 4)] 및 후방 프라이머로서 [5'-ATG GTGGTGAAGACGCCAGTG-3'(서열번호 5)]인 신규한 프라이머쌍과 형광표지 프로브로서 [5'-FAM-ACTGGCGTCTTCACCACCAT-Quen-3'(서열번호 6)] 을 사용할 수 있다. 본 발명에 적용되는 real-time RT-PCR 방법은 당업계에서 통상적으로 사용되는 공지의 과정을 통해 수행될 수 있다.

다음, (5) 단계로서 상기 증폭된 IFN-γ의 mRNA 발현수준 및 대조군 유전자의 mRNA 발현수준을 측정한다. 본 단계는 IFN-γ의 mRNA 및 대조군 유전자의 mRNA의 발현수준을 상대적으로 측정하기 위한 것으로서, 통상의 mRNA 발현수준을 측정할 수 있는 방법이면 제한 없이 사용될 수 있으며, 사용한 프로브 표지의 종류에 따라 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 real-time RT-PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 real-time RT-PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일구현예에 따르면, 상기 realtime RT-PCR을 통해 증폭된 PCR 산물에 형광이 표지된 프로브가 붙어 특정 파장의 형광을 내게 되고, 증폭과 동시에 realtime PCR 장치의 형광 측정기에서 IFN-γ의 mRNA 발현수준 및 대조군 유전자의 mRNA의 발현수준을 실시간으로 측정하고, 측정된 값이 계산되어 PC를 통해 시각화 되게 되어 검사자는 쉽게 그 발현정도를 확인할 수 있다.

다시 말해, 각각의 혈액 샘플(시료)마다 IFN-γ와 GAPDH mRNA의 발현량이 계산되고, IFN-γ의 mRNA 발현양을 GAPDH의 mRNA 발현양에 맞추어 그 값을 보정해 주고, 음성대조군인 Nil control에 비해 결핵균 특이 항원을 자극시킨 시료에서 IFN-γ mRNA의 발현이 얼마나 증가했고 감소하였는지의 정도를 배수로 몇배가 증가하고 감소하였는지 상대적으로 정량하는 방법을 통해 결핵환자임을 판별할 수 있는 정보를 제공할 수 있는 것이다.

본 발명의 다른 측면에 따르면 인간 IFN-γ 유전자의 mRNA 발현수준을 측정하기 위하여 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머와 형광이 표지된 프로브를 포함하는 결핵 진단용 조성물을 포함한다. 구체적인 일 양태로서, 상기 진단 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 결핵 진단용 키트일 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 상기 인간 IFN-γ 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함할 수 있다. 프라이머는 각 마커 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오타이드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp 의 길이일 수 있으며 보다 바람직하게는 서열번호 1 및 2로 표시되는 신규한 프라이머 쌍 및 서열번호 3으로 표시되는 형광표지된 프로브 또는 서열번호 7 및 8로 표시되는 신규한 프라이머 쌍 및 서열번호 9로 표시되는 형광표지된 프로브를 포함할 수 있다.

또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머와 프로브를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 GAPDH의 mRNA 발현수준을 측정하기 위하여 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머와 프로브를 더 포함할 수 있으며, 보다 바람직하게는 상기 프라이머는 서열번호 4 및 5로 구성되는 신규한 프라이머쌍 및 서열번호 6으로 표시되는 형광표지된 프로브를 포함할 수 있다.

그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.

결국, 종래의 IFN-γ 단백질을 검사하는 IGRA 방법은 최소 3㎖ 이상의 혈액을 요구하므로 보다 용량이 큰 blood cllection tube를 사용해 채혈하기 때문에 환자에게 부담이 될 수 있지만, 본 발명에서는 1㎖의 매우 적은 혈액만으로도 결핵검사가 가능하므로 보다 작은 blood collection tube를 사용함으로써 환자의 부담을 현저하게 저감할 수 있으며, 채혈이 힘든 노인환자나 어린아이에서 용이 하다. 또한 기존의 방법(16~24시간)에 비해 줄어든 항원처리 시간(4시간 이내)으로 인해 기존 총 검사 시간을 줄일 수 있으므로, 보다 빠르게 결핵 환자를 판별해낼 수 있다.

이하 실시예를 통하여 본 발명의 구성을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위가 하기 실시예의 내용으로 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 환자의 혈액(whole blood)에 결핵균 특이항원 처리

환자로부터 혈액을 채혈한 후, IGRA검사에 사용되는 항원이 포함된 튜브를 호주의 Cellestis 사에서 수입하여 각 3개의 튜브에 혈액을 1 ml을 넣었다(도 2). Nil tube는 아무런 항원을 포함하지 않는 튜브로써 IGRA검사에서 음성대조군으로 사용된다. TB antigen 튜브는 결핵균에만 특이하게 존재하면서 숙주에서 면역반응을 유도한다고 알려진 3가지항원 ESAT-6, CFP-10, TB7.7이 포함된 튜브이다. TB mitogen 튜브는 T세포의 분화를 돕는 mitogen 작용을 하는 phytohaemagglutinin (PHA)이 포함된 튜브로써 IGRA검사에서 양성대조로 사용하였다.

<실시예 2> 항원 처리된 혈액으로부터 total RNA의 분리

실시예 1에서 항원처리가 끝난 혈액을 약 5배의 RBC lysis buffer에 넣고 RBC를 모두 제거해준 후 남아있는 WBC로부터 QIAamp Blood RNA Mini kit (Qiagen)와 Easy-spin total RNA extraction kit (Intron)를 사용하여 total RNA를 분리하였다.

<실시예 3> 분리된 total RNA로부터 상보적인 cDNA의 합성

분리된 total RNA 9 ㎕, random primer(Invitrogen) 0.25ug, dNTP(Cosmo gene tech) 250uM, Tris-HCl(pH 8.3) 50mM, KCl 75mM, MgCl₂ 3mM, DTT 8mM 와 MMLV 역전사 중합효소 200units(Invitrogen)을 첨가하고 최종부피를 25 ul가 되도록 DEPC treated DW를 넣고 교반하였다. 그 뒤 cDNA 합성 반응액을 thermocycler(ABI)에서 25℃에서 10 분, 37℃에서 50 분, 70℃에서 15 분간 반응시켜 cDNA를 합성하였다.

<실시예 4> 합성된 cDNA를 주형으로 하여 IFN-γ 및 GAPDH 증폭

RT-PCR 반응물의 조성은 KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM(pH8.3), MgCl₂ 1.5 mM, 젤라틴 0.001%(w/v), 250 uM dNTP, 1 unit Tag DNA중합효소(Solgent)와 각각의 전방 프라이머와 후방 프라이머 10 pmole이다. 덧붙여 형광프로브가 표지된 올리고 프로브를 5pmole이 되게 첨가해준다. 여기에 합성된 cDNA 3 ㎕를 넣고 최종부피가 20 ㎕가 되도록 하였다. 첨가된 각각의 프라이머의 염기서열은 다음과 같다.

(1) IFN-γ primer(증폭산물의 크기-140bp)

Forward - 5' TGCAGGTCATTCAGATGTAGCGGATA 3'(서열번호 1)

Reverse - 5' TCATGTATTGCTTTGCGTTGGACA 3'(서열번호 2)

Probe - 5' FAM-TGGAGACCATCAAGGAAGACATGA-Quen 3' (서열번호 3)

(2) GAPDH primer(증폭산물의 크기-91bp)

Forward - 5' CGGGAAGCTTGTGATCAATGG 3'(서열번호 4)

Reverse - 5' GGCAGTGATGGCATGGACTG 3'(서열번호 5)

Probe - 5' FAM-ACTGGCGTCTTCACCACCAT-Quen 3' (서열번호 6)

Real-time RT-PCR 반응 (MJ opticon real time PCR system, Bio Rad)은 변성 온도 95℃에서 5분 동안 1회 수행하고, 변성 온도 95℃에서 30초, 어닐링 온도 60℃에서 30초인 사이클을 40회 반복 수행하였다.

<실시예 5> Softwear 분석을 통한 증폭여부 확인 및 증폭된 산물의 정량

Realtime RT-PCR이 끝난 후, Opticon monitor 3(Bio Rad) 시스템을 통해 산물의 증폭을 확인하였다. 그리고 PCR효율 및 cT값을 통해 결과를 분석 및 정량하였다.

한편 본 발명의 실시예에서 사용되는 세 가지 튜브인 TB mitogen튜브, TB antigen 튜브, Nil튜브로부터의 cT 값을 확인하였으며, real-time PCR의 특정유전자 발현량을 정량하는 방법 중 하나인 Comparative Ct Method를 이용하여 하기 관계식에 의거하여 측정하였다.

[관계식 1]

ΔΔCt= ΔCt(sample) - ΔCt(reference gene)

여기에서 Ct값이란 PCR과정중 증폭이 뚜렷하게 증가되기 시작한 Cycle의 수치를 나타낸다.

ΔΔCt는 하기 도 3 ~ 5 및 표 1에서 R값 즉 최종 발현양을 나타내는 수치이다.

[관계식 2]

양성대조군에서 IFN-r의 발현량 분석 관계식

Mitogen의 ΔCt 값 = Mitogen에서 IFN-r의 Ct 값 - Mitogen에서 reference gene (GAPDH)의 Ct 값

Nil의 ΔCt 값 = Nil에서 IFN-γ의 Ct 값 - Nil에서 reference (GAPDH) gene의 Ct 값

R (발현량) = Mitogen의 ΔCt값 - Nil의 ΔCt값

[관계식 3]

TB항원의 자극에 대한 IFN-r의 발현량 분석 관계식

TB항원에서의 ΔCt 값 = TB항원에서 IFN-r의 Ct 값 - IFN-r에서 reference (GAPDH) gene 의 Ct 값

R (발현량) = TB항원에서의 ΔCt값 - Nil의 ΔCt값

본 실험에서 사용된 reference gene의 Ct 값은 GAPDH에 대한 Ct값을 나타내며, reference gene이란 본 실험에 사용된 GAPDH이외에도 다른 house keeping gene이 포함될 수 있다.

TB mitogen : positive control 로써 실제로 발현량이 과발현 되었는지를 확인할 수 있다.

TB control 과 Nil control의 cT값의 차 : 결핵환자의 경우 cT값의 차가 평균 2이상 났으며, 정상에서의 대조군간의 cT값의 차는 2이하로 나타났다.

<평가예 1> 항원 처리된 혈액으로부터 분리된 IFN-r mRNA 정량을 통한 결핵진단법의 가능성 평가

연세대학교 원주기독병원으로부터 약 40개의 임상검체와 QuatiFERON(IFN-γELISA)검사결과를 제공받고 본 연구실에서 기존의 RT-PCR based IGRA를 통해 확인된 환자의 혈액(1ml)에 결핵 특이항원을 처리하여 본 발명의 Real time RT-PCR based IGRA assay를 수행하고 그 결과를 비교하였다(도 3, 도 4).

도 3은 결핵환자의 혈액을 이용해 본 발명의 realtime RT-PCR을 수행한 결과이다. 각각의 그래프(3a~3e)는 IFN- mRNA의 증폭에 따른 Ct 값을 나타내며, 그래프가 상승하는 지점부터 타겟의 발현양이 증가함을 보여주며 그 지점의 값이 Ct값인 것이다. 따라서 Ct 값이 낮을수록 적은 싸이클을 수행하였을 때도 발현양이 증가하였음을 보여주므로, 낮은 Ct값은 보다 높은 유전자의 발현양을 나타낸다.아래의 각각 그래프는 결핵환자 한명 한명의 결과를 나타내며, 그래프 내에서 두 라인이 존재한다. 앞에 있는 라인은 결핵균 항원을 처리했을 때의 Ct 값이고, 뒤에 있는라인은 결핵균 항원을 처리하지않은 nil control 의 값이다. 따라서 두 라인의 간격이 멀수록, 즉 Ct 값의 차이가 클수록 결핵균 항원에 대한 반응이 많이 증가한것을 알 수 있기 때문에 결핵에 노출된 환자의 경우 두 Ct 값의 차이가 크고, 정상인의 경우 두 Ct 값의 차이가 작기 때문에 따라서 도 3에 있는 그래프들은 모두 결핵환자임을 알 수 있다.

도 4는 결핵이 아닌 사람의 혈액을 이용해 본 발명의 realtime RT-PCR을 수행한 결과이다. 각각의 그래프에 있는 두 라인의 간격이 매우 좁은 것을 알 수있다. 이는 즉 앞, 뒤 두 라인의 Ct값의 차가 작을 수록 결핵항원에 대한 IFN- mRNA의 발현이 증가하지 않음을 나타내므로, 도 4에 존재하는 각각의 그래프는 정상인의 나타낸다. 도 3에 있는 그래프 내에 존재하는 두 라인간의 간격에 비해 매우 좁은 그래프 양상을 보여줌을 알 수 있다.

표 1은 기존의 IFN-r ELISA(상업킷트), RT-PCR 그리고 병원검사결과 양성과 음성이 나온 결핵환자의 혈액(도 3 및 도 4와 동일한 환자)을 가지고 상기 도 3 및 도 4와 같이 실험을 수행하여 얻은 Ct값으로 ABI사의 7500 v2.04 software 를 이용하여 비교정량한 값 즉 위의 관계식에 따른 R값을 도 5에서 그래프로 보기 쉽게 수치화하였으며, 환자의 경우 결핵환자에서의 결핵균 항원에 대한 IFN- mRNA의 발현양을 나타내며 그래프 상에서 높은 R값을 보여주며, non-TB의 경우 그래프 상에서 낮은 R값을 보여준다. R 값은 곧 IFN-의 발현양을 나타냄으로, R 값이 높게나온 좌측의 환자군이 결핵환자군임을 알 수 있다.

Sample	Expression rate with ABI 7500 (R)	Expression rate with RT-PCR	ELISA	Nil
TB1	51.04	12.1, +	positive	1
TB2	17.14	13.29, +	positive	1
TB3	94.25	3.43, +	positive	1
TB4	234.82	5.38, +	positive	1
TB5	16.19	7.28, +	positive	1
Normal1	1.82	0.53, -	negative	1
Normal2	1.08	0.52, -	negative	1
Normal3	6.95	0.85, -	negative	1
Normal4	0.66	0.64, -	negative	1
Normal5	1.65	0.75, -	negative	1

TB : 결핵환자

Normal : 결핵이 아닌 건강한 사람

그 결과, 기존의 상업적 킷트와 비교했을 때, 본 발명의 Real time RT-PCR based IGRA assay 가 기존의 상업적 킷트 및 최근 개발된 분자생물학적 검사와 동일한 검사 결과를 나타내는 것을 확인할 수 있다.

RNA 정량을 통한 결핵진단법의 가능성 평가해본 결과, 본 발명의 Real time RT-PCR을 이용한 IFN-γ mRNA정량을 통한 결핵 정보제공방법이 유의성이 있음을 확인할 수 있다.

<실시예 6>

IFN-γ를 증폭하기 위하여 실시예 4에서 사용된 서열번호 1, 2의 프라이머 및 서열번호 3의 프로브를 대신하여, 서열번호 7의 프라이머를 전방 프라이머로 사용하고 서열번호 8의 프라이머를 후방 프라이머로 사용하며, 서열번호 9의 프로브를 형광프로브로 사용한 것을 제외하고는 실시예 4와 동일하게 실시하여 real-time RT-PCR을 수행하였다. 그 뒤 실시예 5 및 평가예 1과 같이 2명의 환자의 샘플에 대하여 동일한 평가를 수행하여 그 결과를 도 6 및 도 7에 나타내었다. 도 6 및 도 7에서 델타 Rn 값으로 형광의 세기를 나타내며, 가로축은 PCR수행 cycle수를 나타내는 Ct값을 나타낸다. 또한 그래프의 두개의 선 중 윗선은 TB Ag을 처리한 대조군, 뒤의 한줄은 Nil대조군을 나타낸다. 도 6은 그래프에서 두개의 선의 높이 차이가 크므로 결핵환자임을 의미하고 도 7은 간격이 작으므로 정상인임을 의미한다.

도 6, 7에서 알 수 있듯이, 서열번호 1, 2의 프라이머 쌍 및 서열번호 3의 프로브를 사용하는 경우에 비하여 서열번호 7, 8의 프라이머 쌍 및 서열번호 9의 프로브를 사용하여 real-time RT-PCR을 수행하는 경우 형광의 강도가 현저하게 증가하므로 발현양이 적은 검체를 분석하는 경우에도 보다 민감하고 정확한 결과를 제공할 수 있다.

본 발명의 결핵의 진단을 위한 정보제공방법 및 이를 위한 결핵 진단용 키트는 매우 적은량의 혈액을 통해 짧은 시간내에 결핵을 진단할 수 있으므로 의료산업에 대단히 유용하다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

(1) 결핵 의심환자로부터 채취된 혈액에 대해서 결핵균 특이항원을 처리하는 단계;
(2) 상기 결핵균 특이항원이 처리된 혈액에서 전장 RNA를 분리하는 단계;
(3) 상기 분리된 전장 RNA로부터 cDNA를 합성하는 단계;
(4) 상기 합성된 cDNA를 IFN-γ를 증폭할 수 있는 제1 프라이머 쌍으로서 서열번호 7 및 8로 구성되는 프라이머쌍, 증폭된 부위에 결합할 수 있는 제1 프로브로서 서열번호 9로 표시되는 프로브 및 IFN-γ의 발현량과 대비하기 위한 대조군 유전자를 증폭시킬 수 있는 제2 프라이머 쌍과 증폭된 대조군 유전자 부위에 결합할 수 있는 제2 프로브를 이용하여 realtime RT-PCR을 수행하는 단계; 및
(5) 상기 증폭된 IFN-γ의 mRNA 발현수준 및 대조군 유전자의 mRNA 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는 결핵의 진단을 위한 정보제공방법.
제1항에 있어서,
상기 혈액은 전혈인 것을 특징으로 하는 결핵의 진단을 위한 정보제공방법.
제1항에 있어서, 상기 채취된 혈액은 1㎖ 이하의 부피를 갖는 것을 특징으로 하는 결핵의 진단을 위한 정보제공방법.
제1항에 있어서, 상기 채취된 혈액은 0.2 ~ 0.5㎖의 부피를 갖는 것을 특징으로 하는 결핵의 진단을 위한 정보제공방법.
제1항에 있어서,
상기 (2) 단계의 결핵균 특이항원은 ESAT-6, CFP-10 및 TB7.7 중 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 결핵의 진단을 위한 정보제공방법.
제1항에 있어서,
상기 대조군 유전자는 GAPDH인 것을 특징으로 하는 결핵의 진단을 위한 정보제공방법.
제6항에 있어서,
상기 GAPDH를 증폭할 수 있는 프라이머는 서열번호 4 및 5로 구성되는 프라이머쌍인 것을 특징으로 하는 결핵의 진단을 위한 정보제공방법.
제1항에 있어서,
상기 제2 프로브는 서열번호 6으로 표시되는 것을 특징으로 하는 결핵의 진단을 위한 정보제공방법.
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제1항에 있어서,
상기 (5) 단계 이후, 대조군 유전자의 mRNA 발현수준을 기준으로 IFN-γ의 mRNA 발현수준을 상대적으로 비교하는 단계를 더 포함하는 결핵의 진단을 위한 정보제공방법.
삭제
결핵의 진단을 위하여 IFN-γ를 증폭할 수 있는 서열번호 7 및 8로 구성되는 프라이머쌍을 포함하는 결핵 진단용 조성물.
제15항에 있어서, 대조유전자의 mRNA 발현수준을 측정하기 위하여 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머를 더 포함하는 결핵 진단용 조성물.
제16항에 있어서, 상기 대조유전자는 GAPDH인 것을 특징으로 하는 결핵 진단용 조성물.
제16항에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 4 및 5로 구성되는 프라이머쌍을 포함하는 결핵 진단용 조성물.
삭제
결핵의 진단을 위하여 IFN-γ를 증폭할 수 있는 서열번호 7 및 8로 구성되는 프라이머쌍; 상기 증폭된 IFN-γ에 결합할 수 있는 서열번호 9로 표시되는 형광이 표지된 프로브, IFN-γ의 발현량과 대비하기 위한 GAPDH를 증폭할 수 있는 서열번호 4 및 5로 구성되는 프라이머 쌍 및 상기 증폭된 GAPDH에 결합할 수 있는 서열번호 6으로 표시되는 형광이 표지된 프로브를 포함하는 결핵 진단용 조성물.
제2O항에 따른 조성물을 포함하는 결핵 진단용 키트.
제21항의 결핵진단용 키트를 포함하는 real-time RT-PCR 키트.