CN100371459C

CN100371459C - 细胞角蛋白19(CK19)mRNA荧光定量RT-PCR检测试剂盒

Info

Publication number: CN100371459C
Application number: CNB2005100377808A
Authority: CN
Inventors: 田志刚; 魏海明; 程民; 朱聪杰
Original assignee: HEFEI ZHONGKEDA BIO-TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Anhui Jiyuan Bio-technology Co.,Ltd.
Priority date: 2005-02-01
Filing date: 2005-02-01
Publication date: 2008-02-27
Anticipated expiration: 2025-02-01
Also published as: CN1693479A

Abstract

本发明涉及一种细胞角蛋白19(CK19)mRNA荧光定量RT-PCR检测试剂盒，该试剂盒包含总RNA提取液(细胞裂解液I、细胞裂解液II、RNA洗涤缓冲液I、RNA洗涤缓冲液II和无RNA酶的水)，反转录反应液，dNTP混合物，逆转录酶，PCR反应液，探针，阳性标准品，对照品。本发明通过对新鲜抗凝外周血提取总RNA，并通过逆转录mRNA样品得到cDNA，再结合实时荧光定量PCR检测技术，可准确定量检测标本中CK19的mRNA的表达量。本发明所提供的试剂盒可用于临床及科研中检测肿瘤患者的外周血、骨髓、淋巴结及癌组织中CK19mRNA的表达，为各种乳腺癌、小细胞肺癌的早期诊断、转移、复发、治疗方案的确定及预后的判断提供重要的参考依据。

Description

细胞角蛋白19(CK19)mRNA荧光定量RT-PCR检测试剂盒

技术领域

本发明属生物技术领域，为一种通过对新鲜抗凝外周血提取总RNA，并通过逆转录mRNA样品得到cDNA，再结合实时荧光定量PCR检测技术，可准确定量检测标本中细胞角蛋白19(Cytokeratin 19，CK19)mRNA的表达量的试剂盒。

背景技术

肿瘤的转移是临床治疗的一大难题，也是肿瘤致死的一个重要原因。及早发现并做出诊断，对肿瘤的临床治疗方案选择有着很重要的意义，可以极大地提高患者的生存率。目前肿瘤转移的发现和确定，主要靠临床及病理资料，即根据影像学(X光片、CT、磁共振、PET等)或病理形态来诊断。但要使影像学检查中能够发现病灶，需要一定大小转移灶的形成、能够被仪器成像且有效分辨；要使病理形态上判断出细胞恶变与否，则一定要取到合适的检测标本，且有相当数量的可观察到的肿瘤细胞存在。从这一点上讲，无论是影像学诊断还是病理学诊断，都是肿瘤形成及转移后相当晚期、有了大量恶变细胞积累的阶段，如果在肿瘤发生转移早期，在病理上可观察到或转移灶形成前就发现，并确定转移，则可以指导临床治疗方案的设计，并提供有力的预后依据。血行播散是肿瘤转移的主要途径之一，因此在患者外周血中进行肿瘤细胞基因表达检测、肿瘤特异性标记产物检测是了解肿瘤转移情况的一个有效的方式，因此肿瘤标志物的检测对肿瘤形成及转移的诊断具有极大的帮助。但是在肿瘤转移发生的早期，外周血中的肿瘤细胞常常很少，无法完全依赖病理形态检查，同时肿瘤特异性抗原的含量也很少，也很难通过常用的酶标免疫吸附分析(ELISA)或放射免疫分析(RIA)等方法检测到，因此，对循环血中的微量肿瘤细胞基因表达和一些特异性产物检测的研究，已经引起了人们的广泛关注。随着分子生物学技术的飞速发展及其在医学研究中的广泛应用，通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测外周血中微量肿瘤细胞已成为可能并被尝试。RT-PCR有着比病理学或ELISA/RIA等方法无法比拟的高灵敏度及高特异性，为外周血中微量肿瘤细胞的检测带来了希望。

荧光定量PCR技术的出现，为我们提供了一个定量检测mRNA的准确方法，对检测癌特异性基因mRNA量，以检测循环肿瘤细胞的存在产生了积极的推动作用。外周血中癌基因mRNA的定量测定，有利于肿瘤的早期诊断，治疗方案的确定以及预后的判断。1996年美国Applied Biosystems公司推出了实时荧光定量PCR技术，该技术融汇了PCR高灵敏性、DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确定量等优点，直接探测PCR过程中荧光信号的变化以获得定量的结果，不需要PCR后处理或电泳检测，完全闭管操作，一举克服了常规PCR技术的诸多难题。与常规PCR相比，有以下优点：1、可以进行准确的定量检测，可用于适用基因诊断的各种疾病。以目前常用的检测乙肝HBV-DNA为例，它不仅能检测出乙肝病毒在病人体内的复制、传染的情况，更重要的是能作为一个量化的指标，能定量地检测出病人体内的病毒数，可动态地观察病情病程，观察治疗效果，作为临床治疗的一个指标，可判断药物疗效，指导临床医师选择有效药物，确定药剂、药量和疗程以及分析治疗效果，确定进一步治疗方案等方面，有着重要而现实的意义。2、特异性极强，克服了假阳性的主要来源。3、定量范围极宽，样品无需做梯度稀释。4、操作迅速，无需PCR后处理，自动化程度高。

所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在荧光定量PCR技术中，通常以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的缺省设置是6-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，而将每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数设为Ct值。研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

实时荧光定量PCR扩增过程中在加入一对引物的同时加入一个特异的荧光探针，目前常用的为Taqman荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，故检测不到荧光；在PCR扩增过程中，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。每个循环过程结束检测一次荧光强度，反应结束后，便可得到一条工作曲线。

由于荧光定量PCR具有重复性好，灵敏度高，定量结果准确可靠的特点，所以在医学检测方面，一些常规检测方法所不能解决的问题得到了解决。例如，细胞形态学检查可直接观测到肿瘤细胞，但由于肿瘤脱落至血循环中的数目微小，这种检查的敏感性和特异性均较差，阳性率低。免疫组织化学方法提高了血循环中肿瘤细胞染色的特异性，特别是单克隆抗体的应用使染色的特异性和敏感性有了较大的改善，可查出10⁴-10⁵个有核细胞中的一个肿瘤细胞。但该技术则需要特异性的抗体，生产相对复杂。同时，假阳性限制了此项技术的广泛应用。与这些技术相比，荧光定量PCR有着明显的优点，由于大多数基因的调节发生于转移水平，有些肿瘤可转录特异性mRNA，但无相应蛋白合成，故荧光定量PCR应用范围较广；PCR简便易行，只要知道待测基因序列，即可设计合成引物进行逆转录及扩增；该方法具有较高的灵敏度及可重复性，也保证了医学检测结果的准确性。所以该技术的应用，将会对早期寻找肿瘤患者血循环中的肿瘤细胞，发现微小转移，对于指导临床治疗、改善患者预后产生极为重要的作用。

CK19在乳腺癌、小细胞肺癌细胞中存在较特异性的表达，CK19mRNA可以作为乳腺癌、小细胞肺癌患者骨髓及血中癌细胞的标志。检测乳腺癌、小细胞肺癌患者骨髓及血中CK19mRNA对于乳腺癌、小细胞肺癌的诊断、转移、复发、治疗效果评价及病情的动态观察具有重要意义。

发明内容

本发明试剂盒包含：细胞裂解液I、细胞裂解液II、RNA洗涤缓冲液I、RNA洗涤缓冲液II、无RNA酶的水、RNA分离柱、反转录缓冲液、逆转录酶储存液、dNTP混合物、PCR反应液、探针、标准品、对照品。以上各种溶液均为水溶液。

(1)、细胞裂解液I包含：0.1mol/L Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷-盐酸，pH7.6，25℃)、0.1mol/L氯化钠、0.05mol/L氯化镁、水。

(2)、细胞裂解液II包含：3mol/L异硫氰酸胍、2mol/L盐酸胍、0.3mol/L醋酸钠(pH5.2)、0.2％(W/V)SDS(十二烷基硫酸钠)、水。

(3)、RNA洗涤缓冲液I：0.2mol/L醋酸钠(pH5.2)、0.1mol/L氯酸钠、0.1mol/LTris-HCl(pH7.5，25℃)、水。

(4)、RNA洗涤缓冲液II：1.2mol/L柠檬酸钠、0.5mol/L Tris-HCl(pH7.5，25℃)、水。

(5)、无RNA酶的水制备方法为向去离子水加入DEPC(焦碳酸二乙酯)，至终浓度为0.05％(V/V)，室温(22-25℃)放置10-12小时后，121℃，20min高压，室温放置备用。

(6)、RNA分离柱是一种硅胶柱，购自美国Omega生物技术公司(Hibind-V柱)，本柱采用Hibind硅胶基质薄膜结合技术，可以特异性结合RNA，并可用水洗脱RNA，达到分离纯化RNA的目的。

(7)、反转录缓冲液包含：9.1μmol/L Oligo(dT)_12-18、3.6U/μl Rnase Inhibitor、72.7mmol/L DTT(二硫苏糖醇)、182mmol/L Tris-HCl(pH 8.3，25℃)、273mmol/L KCl、11mmol/L MgCl₂、水。

(8)、逆转录酶储存液包含：20mmol/L Tris-HCl(pH 7.5，25℃)、100mmol/L NaCl、0.1mmol/L EDTA、1.0mmol/L DTT、50％(V/V)甘油、0.01％(V/V)Nonidet p-40、200U/μl逆转录酶(M-MLV)、水。

(9)、dNTP混合物包含：dATP、dCTP、dGTP、dTTP，为其钠盐-水溶液pH7.0-7.5，四种dNTP浓度均为10mmol/L。

如dATP为脱氧腺苷三磷酸，其钠盐为磷酸上的三个氢中的一个或两个被钠取代，便形成了钠盐；其它几种也是如此。即dNTP是以钠盐形式存在的。

(10)、PCR反应液包含：18.5mmol/L Tris-HCl(pH8.3，25℃)、2.78mmol/L MgCl₂、92.6mmol/L KCl、上下游引物(0.37μmol/L)、0.1U/μl Taq酶、dNTP混合物(dATP，dCTP，dGTP，dTTP，其浓度均为400nmol/L)、水。

检测用上下游引物序列分别为：

P1：5’-ACT ACA GCC ACT ACT ACA CGA C-3’，

P2：5-CAG AGC CTG TTC CGT CTC AAA C-3’

(11)、探针为荧光标记探针，其序列为：

5’-FAM-TCT GGC TGC AGA TGA CTT CCG AAC CA-TAMRA-3’

探针的浓度为：2μmol/L，TE(10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，水)溶解。

(12)、标准品的序列为：

1 CAGAGCCTGT TCCGTCTCAA ACTTGGTTCG GAAGTCATCT GCAGCCAGAC

51 GGGCGTTGTC GATCTGCAGG ACAATCCTGG AGTTCTCAAT GGTGGCACCA

101 AGAATCTTGT CCCGCAGGTC CTGGATGGTC GTGTAGTAGT GGCTGTAGT

标准品的浓度为：10⁶copies/μl，TE(10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，水)溶解。

(13)、对照品分为阳性对照品与阴性对照品，阳性对照品为有CK19cDNA的样品(10⁴copies/μl，TE溶解)，阴性对照品为正常人外周血总RNA的反转录产物。

本发明试剂盒的规格为：10人份/盒；每盒中各组分的量为：细胞裂解液I1瓶(30ml/瓶)、细胞裂解液II1瓶(10ml/瓶)、RNA洗涤缓冲液I1瓶(10ml/瓶)、RNA洗涤缓冲液II1瓶(3ml/瓶)、无RNA酶水1瓶(2ml/瓶)、RNA分离柱(10个)、反转录缓冲液1管(27.5ul/管)、dNTP混合物1管(5ul/管)、逆转录酶1管(2.5ul/管)、PCR反应液1管(216ul/管)、探针1管(24ul/管)、标准品1管(10ul/管)、阳性对照品1管(10ul/管)、阴性对照品1管(10ul/管)。

本试剂总RNA提取试剂保存于室温(22-25℃)；RT PCR试剂保存于-20℃，尽量减少反复冻融。

本发明建立了利用TaqMan技术检测CK19mRNA表达的方法，并经检测患者标本，表明该法切实可行。由于本方法采用了PCR扩增技术，使得CK19mRNA表达的检测敏感性大大提高，而且由于荧光探针的应用，使得其特异性大大的提高，降低了常规PCR扩增的假阳性率，使得我们可以在极少量的标本中获得足够的信息，本发明中的总RNA提取试剂与目前常规的RNA提取试剂相比较有如下优点：(1).操作简便；(2).使用安全，操作过程无有机溶液污染；(3).提取完全，采用先进技术和优质试剂，保证样品RNA提取完全；(4).所得RNA纯度高。本方法所设计的引物、探针以及检测结果，可以为荧光定量PCR检测试剂盒的开发提供可靠的依据。

在本检测项目中，我们采用了目前最为先进的实时荧光定量PCR检测技术，在保持高敏感性的前提下尽量减少假阳性的干扰。在实时荧光定量PCR检测技术出现之前，人们对PCR模板的定量都要通过PCR产物电泳，再将电泳结果经计算机图像处理，根据电泳条带的亮度来确定最终PCR产物量的多少，或将带标记的PCR产物以ELISA的方式进行检测，再由此推测出起始模板的量，但这些方法实际上都属于半定量水平，因为即使PCR条件已最优化，电泳及后续步骤的操作的不稳定性仍会给结果的分析带来影响，从而影响定量这一目的。随着实时荧光定量PCR技术的出现，人们可以真正地做到对PCR模板的精确定量，这种定量不仅保持了常规PCR的高灵敏性，而且由于特异性荧光探针杂交技术的应用，使得被检测基因的特异性大大的提高。

本发明试剂盒的使用方法：

每次检测均应设立阳性对照和阴性对照。

【样品要求】

3毫升EDTA抗凝的新鲜外周血或骨髓样本。

采静脉血或骨髓3ml于5或10ml无菌离心管中，使用EDTA作抗凝剂(1.44mg/ml全血)。样本采集后应立即使用，若不能立即使用，可在4℃保存1-2小时，但时间不宜再过长，否则将影响测定结果。全血经处理后，得到的有核细胞可保存于-80℃或液氮中数月，不会影响测定结果。

【操作步骤】

一、实验准备

1.将细胞裂解液I按1∶10的比例用灭菌去离子水稀释成细胞裂解液I稀释液。

2.向细胞裂解液II中加入2-巯基乙醇，加入量为每1ml细胞裂解液II加入20μl的2-巯基乙醇(商品溶液的浓度通常为14.5mM)，分装2-巯基乙醇要在通风厨下进行。

3.RNA洗涤缓冲液II在使用之前，按标签上的指示加入无水乙醇。

二、总RNA提取

1.向一经高压灭菌处理过的50ml离心管中加入3ml新鲜抗凝血液及15ml的细胞裂解液I稀释液，漩涡振荡混匀。

2.冰浴15分钟，在漩涡振荡器上迅速混匀两次，溶液变澄清表明红细胞已裂解。如果个别样品的血细胞计容或ECR升高时，可延长冰浴时间至20分钟。

3.4℃，450g，离心10分钟沉淀有核细胞，完全弃去含有裂解红细胞的上清夜。

4.用6ml的细胞裂解液I稀释液洗涤沉淀有核细胞，漩涡振荡以完全悬浮细胞。

5.4℃，450g，离心10分钟，并再次去掉上清。

6.往成团的有核细胞中加入650μl细胞裂解液II(已加入2-巯基乙醇)，漩涡振荡充分混匀，将其转移至一无RNA酶的15ml离心管。

7.加入等体积的70％乙醇，漩涡振荡混匀。此时可能会由于乙醇的加入而产生沉淀物，但这不会影响RNA的提取。

8.把上述混合液(不包括沉淀)加到一支固定在2ml收集管上的RNA分离柱上(该柱最大结合能力是800μl，故每次加入的量不宜超过750μl)，10000g，离心1分钟，弃去流出液体并继续进行步骤8的操作。

9.吸取750μl RNA洗涤缓冲液I直接加到RNA分离柱上洗涤柱子。如上方法离心并弃去2ml收集管。

10.把柱子装到新的2ml收集管，加入500μl用乙醇稀释的RNA洗涤缓冲液II，10000g，离心1分钟，弃去流出液，重复使用该收集管。

11.再用500μl的RNA洗涤缓冲液II洗涤柱子，离心并弃去流出液。然后12000g离心柱子1分钟一甩干RNA分离柱基质。

12.洗脱RNA。把柱子转移到无RNA酶的1.5ml离心管(试剂盒未提供)并用50μl无RNA酶的水洗脱RNA。确保加入的无RNA酶的水直接加在柱基质上，10000g离心1分钟。将装有RNA的离心管置于冰盒上备用。

三、RT-PCR

1.将装有反转录缓冲液、dNTP混合物、逆转录酶储存液的离心管从-20℃中取出，置于冰盒上待其缓慢融化后，短暂离心，用移液器将dNTP混合物及逆转录酶储存液全部加入反转录缓冲液管中配制成反转录反应液，混匀，短暂离心，置于冰盒上备用，使用后剩余反转录反应液可放入-20℃冰箱中保存。

按下表配制反转录体系

反转录反应液 3.5ul

总RNA溶液 2.0ul

无RNA酶的水 4.5ul

反转录反应条件：50℃ 10分钟，取出置于冰盒上。

2.按下列组成配制PCR反应液：

反转录产物 10ul

PCR反应液 13.5ul

探针 1.5ul

PCR反应条件：95℃10分钟；(95℃15秒，61℃1分钟，50个循环)。

四、标准曲线的制作

将标准品贮存液(2×10⁶copies/ul)梯度稀释为2×10⁵，2×10⁴，2×10³，2×10²，2×10¹copies/ul，取5ul为模板(加水5ul，其他组分同上表)同待测样品一同进行PCR扩增，制作标准定量曲线。

【结果判定】

1.使用实时荧光定量PCR仪的随机软件进行文件的保存及阈值的设定。

2.选中不同浓度标准品对应的孔并标注标准值，应用相应进行分析，得出标准曲线及相关信息。

3.选中所有样品检测孔，应用相应进行分析，得出待测样品的起始模板数(M)。

4.每毫升全血样本中AFP mRNA的拷贝数N＝M×25/3。

附图说明

图1为样品标准检测图。

图2为样品标准曲线图。

具体实施方式

实施例1

实时荧光定量RT-PCR法检测人外周血CK19 mRNA的表达及应用

一、材料：

总RNA提取试剂、RT及PCR缓冲液、感受态细菌(DH5α)为合肥中科大生物技术有限公司生产，DEPC(焦碳酸二乙酯)购自Biobasic公司，M-MLV逆转录酶购自Invitrogen公司，、Taq酶、Oligo(dT)、T-载体、普通PCR扩增试剂盒购自Takara公司，DTT(二硫苏糖醇，0.1M)购自Invitrogen公司，DNA gelextraction kit、质粒大量回收试剂购自杭州维特洁生化技术有限公司，1-15K型微量高速低温离心机、2-5型低速常温离心机购自德国Sigma公司，超速低温离心机购自德国Hettich公司，3111型恒温水套式CO2培养箱购自美国Forma公司，超低温冰箱购自日本SANYO公司，超净工作台购自上海智诚生物设备公司，Biometra PCR仪购自Biometra公司，测序试剂、377测序仪、购自美国Applied Biosystems公司。

二、引物及探针设计与合成：

以CK19全长cDNA序列为模板，使用7000型实时荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems公司)随机软件分析TaqMan引物和探针位点，同时考虑CK19基因组DNA序列情况，从中选择最佳组合。

标准品引物序列与检测用PCR引物序列相同，上下游引物序列分别为：

P1：5’-ACT ACA GCC ACT ACT ACA CGA C-3’，P2：5’-CAG AGC CTG TTC CGT CTC AAA C-3’，荧光探针序列为：5’-FAM-TCT GGC TGC AGA TGA CTT CCG AAC CA-TAMRA-3’，均有上海生工公司合成。

三、检测用标准品制备：

1.细胞总RNA的提取

实验所用的细胞为MCF-7细胞，0.25％的胰蛋白酶消化，1000rpm离心收集细胞，转移到Eppendorf管中，每管约有1×10⁶个细胞。按上述总RNA提取方法步骤6-步骤12进行操作。

2.逆转录反应

将装有反转录缓冲液、dNTP混合物、逆转录酶的离心管从-20℃中取出，置于冰盒上待其缓慢融化后，短暂离心，用移液器将dNTP混合物及逆转录酶全部加入反转录缓冲液管中配制成反转录反应液，混匀，短暂离心，置于冰盒上备用，使用后剩余反转录反应液可放入-20℃冰箱中保存。

按下表配制反转录体系

反转录反应液 3.5ul

总RNA溶液 2.0ul

无RNA酶的水 4.5ul

反转录反应条件：50℃10分钟，取出置于冰盒上

3.PCR扩增

(注：此处PCR扩增所用试剂为购自Takara公司的普通PCR扩增试剂盒)

按下列组成配制PCR反应液：

反转录产物 10ul

10×buffer 5.0ul

dNTPmix 4.0ul

上下游引物 2.0ul

Taq酶 0.5ul

水 28.5ul

PCR反应条件：94℃5分钟；(94℃15秒，61℃1分钟，72℃50秒，35个循环)。

4.CK19扩增产物的获得：

制备1.2％琼脂糖凝胶，将所得PCR产物电泳，在紫外灯下切取含目的DNA的琼脂，用纸巾擦干后，切碎，称重，按照100mg＝100μl的比例确定胶的体积；按照DNA gel extraction kit说明书中的比例加入DE-A液，60℃加热完全熔化；加入0.5倍体积于DE-A液的DE-B液混匀，加异丙醇至终体积的20％；将上述液体转入制备管中，3600rpm离心1min，重复一次后弃滤液；加入0.5ml W1后，3600rpm离心30s，弃滤液；加入0.7ml W2，3600rpm离心30s，弃滤液后重复一次；12000rpm离心1min；将置备管置于新的1.5ml离心管中，在管正中加入25μl水或洗脱液，静置1min后，最高速(12000rpm)离心1min即可获得回收的DNA。

5.CK19扩增产物的克隆及鉴定：

重组CK19克隆载体的构建：10μl体系中，加入1μlT-载体，4μl DNA样品，加入5μl连接buffer，16℃过夜连接；取5μl连接产物，加入到200μl感受态细胞中，混匀后冰浴40min，置于42℃水中热休克90s，冰浴2min；加入无抗生素的LB培养基800μl，于37℃摇床上以100-150rpm的速度混合振摇45min；离心后吸去800μl上清，将剩余的200μl均匀地涂布于LA平板上，37℃平放20min后倒置培养10-14小时。

重组载体的鉴定：(质粒的提取方法/PCR鉴定)：观察LA平板上的菌落，随机挑取长得较好的菌落，分别转至装有5ml LA培养基的大试管中，编号后置37℃摇床中振摇14小时左右，至OD₆₀₀≈4时，将大约1.5ml培养物转入离心管中，4℃，11000rpm离心30s，将沉淀重悬于100μl预冷的碱裂解液I中，剧烈振荡混匀；加入200μl新配置的碱裂解液II，混匀后冰浴3min；加入150μl预冷的碱裂解液III，颠倒混匀后冰浴3-5min；4℃，11000rpm离心5min后上清转移至另一离心管中；加入等体积的酚/氯仿(1∶1)，振荡后4℃，11000rpm离心2min，上清转移至另一离心管；加入1/10体积的3M NaAc溶液和2.5倍无水乙醇，混匀后室温静置10min：4℃，11000rpm离心10min后弃上清，沉淀中加1ml 70％乙醇，振荡漂洗后4℃，11000rpm离心2min；弃去上层液体后加入少量无水乙醇，4℃，11000rpm离心2min，弃去乙醇后，室温静置，挥发乙醇后，加入30μl蒸馏水溶解DNA。取适量的DNA进行PCR扩增，通过电泳图像确定所取菌落是否是所要的目的菌落。

6.质粒的大量抽提：

鉴定所菌落为目的菌落后，取1ml长有目的菌落的菌液，加入到30ml LB培养基中，摇床培养至OD₆₀₀约为0.6，取25ml上述菌液接种至300ml LB培养基中，37℃培养过夜(300rpm)。4℃下4500rpm，20min收菌，菌体悬浮于200ml预冷的STE中，4℃下4500rpm，20min收菌，菌体加入9ml Solution I，混匀，加入1ml用10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)新鲜配制的溶菌酶(10mg/ml)。加入10ml新鲜配制的SolutionII，轻轻混匀5-7次，室温静置5分钟，加入7.5ml冰冷的SolutionIII，轻轻混匀，冰浴10分钟，4℃下11000rpm离心10分钟，取上清。加入2/3体积的异丙醇，混匀，室温静置10分钟，11000rpm离心10分钟，弃上清，用70％乙醇洗涤沉淀，8000rpm，15min离心回收，用2ml TE溶解沉淀，加入2ml 5mol/L的LiCl，混匀，10000g离心10分钟，弃去上清，用70％乙醇洗涤沉淀，蒸干。加入300μl TER，溶解沉淀，转移至Eppendorf管，37℃水浴1-2小时，加入300μl 1.6mol/L NaCl(含13％聚乙二醇)，混匀，4℃下12000rpm离心15分钟，弃上清。沉淀溶于250μl TE(pH8.0)中，分别用酚、酚/氯仿、氯仿各抽提一次。取上清，加入60μl 10mol/LNH₄Ac及2倍体积的无水乙醇(或95％乙醇)，混匀，4℃下12000g离心5分钟，弃上清。120μl 75％乙醇洗涤沉淀，4℃下12000g离心10分钟，弃上清。尽量控干液体，室温静置至干燥。加入100μl三蒸水溶解沉淀，紫外分光光度计下检测质粒的浓度和纯度。

7.质粒序列的测定

上述制备的质粒用美国Applied Biosystems公司的377测序仪进行序列测定。

四、标本检测

56例经病理确诊的乳腺癌患者为实验组，其中38例为病理诊断确诊已发生淋巴结或远端转移，18例为病理诊断未发生淋巴结或远端转移；18例健康献血员和16例乳腺良性患者为对照组。每例受试者取3ml新鲜抗凝外周血为标本。应用本发明的试剂盒进行细胞总RNA提取，取2μl RNA，在10μl总反应体系内进行逆转录后，用检测用上下游引物及探针在ABI公司7000型定量PCR仪上进行PCR扩增，条件为95℃10分钟变性；95℃15秒、60℃1分钟进行50个循环。同时加标准品制作标准曲线。结果经仪器处理根据标准曲线计算出检测标本CK19mRNA的表达量。

实验结果

一、标准品的制备

经测序，上述设计的标准品完全与预期相符，回收的标准品片段的序列如下(为插入T载体中的片段)：

1 CAGAGCCTGT TCCGTCTCAA ACTTGGTTCG GAAGTCATCT GCAGCCAGAC

51 GGGCGTTGTC GATCTGCAGG ACAATCCTGG AGTTCTCAAT GGTGGCACCA

101 AGAATCTTGT CCCGCAGGTC CTGGATGGTC GTGTAGTAGT GGCTGTAGT

二、样品检测：

1.标准检测结果见图1，标准曲线见图2。

2.实时荧光定量RT-PCR检测乳腺癌病人外周血中CK19 mRNA的表达，具体结果如下：

标本来源	例数	CK19阳性数	％
标本来源	例数	CK19阳性数	％	病理诊断淋巴结或远端有转移淋巴结或远端无转移对照乳腺良性患者健康献血员	38181618	371410	94.777.86.30

Claims

1.细胞角蛋白19mRNA荧光定量RT-PCR检测试剂盒，它包含细胞裂解液I、细胞裂解液II、RNA洗涤缓冲液I、RNA洗涤缓冲液II、无RNA酶的水、RNA分离柱、反转录缓冲液、dNTP混合物、逆转录酶储存液、PCR反应液、探针、标准品、对照品；以上各种溶液所用溶剂均为水；

(1)、细胞裂解液I包含0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸、0.1mol/L氯化钠、0.05mol/L氯化镁、水；其中0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液在25℃条件下，pH值为7.6；

(2)、细胞裂解液II包含3mol/L异硫氰酸胍、2mol/L盐酸胍、0.3mol/L醋酸钠、重量体积比为0.2％的十二烷基硫酸钠、水；其中0.3mol/L醋酸钠溶液pH值为5.2；

(3)、RNA洗涤缓冲液I包含0.2mol/L醋酸钠、0.1mol/L氯酸钠、0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸、水；其中0.2mol/L醋酸钠溶液pH值为5.2；0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液在25℃条件下，pH值为7.5；

(4)、RNA洗涤缓冲液II包含1.2mol/L柠檬酸钠、0.5mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸、水；其中0.5mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液在25℃条件下，pH值为7.5；

(5)、无RNA酶的水制备方法为：向去离子水加入焦碳酸二乙酯，至体积终浓度为0.05％，22-25℃放置10-12小时后，121℃，20min高压，22-25℃放置备用；

(6)、RNA分离柱是一种硅胶柱，可以特异性结合RNA，并可用水洗脱RNA，达到分离纯化RNA的目的；

(7)、反转录缓冲液包含9.1μmol/L Oligo(dT)_12-18、3.6U/μl RNA酶抑制剂、72.7mmol/L二硫苏糖醇、182mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸、273mmol/L氯化钾、11mmol/L氯化镁、水；其中182mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液在25℃条件下，pH值为8.3；

(8)、逆转录酶储存液包含20mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸、100mmol/L氯化钠、0.1mmol/L乙二胺四乙酸、1.0mmol/L二硫苏糖醇、体积比为50％的甘油、体积比为0.01％的Nonidet p-40、200U/μl逆转录酶、水；其中20mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液在25℃条件下，pH值为7.5；

(9)、dNTP混合物包含dATP、dCTP、dGTP、dTTP，为其钠盐-水溶液，pH7.0-7.5，四种dNTP浓度均为10mmol/L；

(10)、PCR反应液包含18.5mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸、2.78mmol/L氯化镁、92.6mmol/L氯化钾、0.37μmol/L上下游引物、0.1U/μl Taq酶、400nmol/L dATP、400nmol/L dCTP、400nmol/L dGTP、400nmol/L dTTP、水；其中18.5mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液在25℃条件下，pH值为8.3；

上下游引物序列分别为：

P1：5’-ACT ACA GCC ACT ACT ACA CGA C-3’，

P2：5’-CAG AGC CTG TTC CGT CTC AAA C-3’

(11)、探针为荧光标记探针，其序列为：

5’-FAM-TCT GGC TGC AGATGA CTT CCG AAC CA-T AMRA-3’

探针的浓度为：2μmol/L，TE溶液溶解，TE溶液的组成为10mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸，1mmol/L乙二胺四乙酸，水。

(12)、标准品的序列分别为：

1 CAGAGCCTGT TCCGTCTCAA ACTTGGTTCG GAAGTCATCT GCAGCCAGAC

51 GGGCGTTGTC GATCTGCAGG ACAATCCTGG AGTTCTCAAT GGTGGCACCA

101 AGAATCTTGT CCCGCAGGTC CTGGATGGTC GTGTAGTAGT GGCTGTAGT

标准品浓度为：10⁶拷贝/μl，TE溶液溶解，TE溶液的组成为10mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸，1mmol/L乙二胺四乙酸，水；

(13)、对照品分为阳性对照品与阴性对照品，阳性对照品为有CK19 cDNA的样品，浓度为10⁴拷贝/μl，TE溶解，阴性对照品为外周血总RNA的反转录产物。

2.根据权利要求1所述的细胞角蛋白19mRNA荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征是：本发明试剂盒的规格为，10人份/盒；每盒中各组分的量为：细胞裂解液I1瓶、30ml/瓶，细胞裂解液II1瓶、10ml/瓶，RNA洗涤缓冲液I1瓶、10ml/瓶，RNA洗涤缓冲液II1瓶、3ml/瓶，无RNA酶水1瓶、2ml/瓶，RNA分离柱10个，反转录缓冲液1管、27.5μl/管，dNTP混合物1管、5μl/管，逆转录酶1管、2.5μl/管，PCR反应液1管、216μl/管，探针1管、24μl/管，标准品1管、10μl/管，阳性对照品1管、10μl/管，阴性对照品1管、10μl/管。