CN103184198A - 一种改进逆转录酶性能的试剂和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种改进逆转录酶性能的试剂，所述试剂的主要成分为巯基封闭剂或二硫键还原剂或二者组合物。本发明还公开了一种改进逆转录酶性能的方法，包括将巯基封闭剂或二硫键还原剂或二者组合物入到所述的逆转录酶中。本发明公布的试剂及方法能够有效地改进逆转录酶的性能，使之具有更强的延伸能力，更高的反应灵敏度，可以使用较高的反转录温度，克服了因模板RNA的二级结构引起的反转录困难，适合用于构建高比例的全长cDNA文库和合成较长cDNA。

Description

一种改进逆转录酶性能的试剂和方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体的，本发明涉及一种可改进逆转录酶性能的试剂及其使用方法。
背景技术
逆转录酶(Reverse transcripatase)是以RNA为模板，指导三磷酸脱氧核苷酸合成互补DNA(cDNA)的酶，主要行使以下功能：依赖RNA或DNA为模板的DNA聚合作用；链转换作用；降解RNA-DNA杂合体中的RNA的RNase H功能。因此逆转录酶常用于cDNA文库的构建。目前从鸟类成髓细胞白血病病毒(Avian Myeloblastosis Virus，简称AMV)中纯化的AMV逆转录酶和从大肠杆菌(E.coli)中重组表达的莫洛尼氏鼠白血病病毒(MoloneyMurine Leukemia Virus，简称M-MLV)中纯化的M-MLV逆转录酶是两种最为常用的逆转录酶。
不管是AMV还是M-MLV逆转录酶，它们都有两种主要的活性：RNA依赖的DNA合成酶活性和RNase H活性。其中RNase H活性会导致逆转录酶催化效率低下，是合成全长cDNA所不希望具有的。一方面，RNase H同DNA合成酶相互竞争RNA模板与DNA引物或cDNA延伸链间形成的杂合链，并降解RNA：DNA复合物中的RNA链，从而降低cDNA合成的产量，增加RNA模板的最小用量。另一方面，被RNase H活性所降解的RNA模板不能再作为合成cDNA的有效底物，降低了cDNA合成的产量和长度。通常野生型M-MLV合成大于5kb的全长cDNA是不合适的。减弱或消除逆转录酶的RNase H活性能够解决上述问题。
目前，在构建cDNA文库和合成全长cDNA时使用最多的是通过基因重组技术得到的去除或削弱了RNase H活性的M-MLV逆转录酶突变体。也有文献报道通过PEG修饰技术可得到RNase H活性去除了的M-MLV逆转录酶。关于既能减弱或去除逆转录酶的RNase H活性同时又不影响其RNA依赖的DNA合成酶活性的非基因重组、非化学修饰技术，如添加剂技术还缺乏广泛的研究成果和专利技术，相关的研究工作仍需要进一步展开。
另外，mRNA分子自身的二级结构可能导致部分mRNA难以合成第一链cDNA，进而影响逆转录效率。比如，当RNA分子的某些区域具有足够的互补性而发生杂交并形成双链RNA时，就能形成这些二级结构。通常，可以通过提高RNA分子所处溶液的温度来降低RNA二级结构的形成。因此，在许多情况中，希望在超过37℃的反应条件下来逆转录RNA。然而，本领域已知的逆转录酶在大大超过37℃(如50℃)的温度孵育时通常丧失活性。
PCT专利《热稳定逆转录酶及其用途》(专利申请号CN01810163.1)公开了一种通过突变或修饰技术增加了热稳定性、降低了末端脱氧核苷酸转移酶活性、和/或增加了保真度的逆转录酶。该酶在加热至50℃达5min后保留了至少95％的逆转录酶活性。PCT专利《Productionof Nucleic Acid》(专利申请号WO2009125006)公开了一种筛选蛋白的技术。通过该方法得到的逆转录酶(Fermentas产品Maxima Reverse Transcriptase)在加热至50℃达60min后保留了90％以上的逆转录酶活性。以上两个专利均未涉及添加剂技术。
综上所述，有必要继续深入本领域研究，寻求除常用的基因重组技术之外的可用于改进逆转录酶性能的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可改进逆转录酶性能的试剂。
本发明的另一目的在于提供一种改进逆转录酶性能的方法。
本发明的第一方面，提供一种能改进逆转录酶性能的试剂，所述试剂为巯基封闭剂或二硫键还原剂或二者组合物。
当所述试剂仅含巯基封闭剂时，所述巯基封闭剂为碘乙酸、碘乙酰胺、溴乙酸、甲基甲硫醇磺酸钠、N-乙基马来酰亚胺中的至少一种。
其中，当所述巯基封闭剂为碘乙酸时，最终使用浓度为1-10mM，也可以是1-5mM。
其中，当所述巯基封闭剂为碘乙酰胺时，最终使用浓度为0.5-50mM，也可以是0.5-10mM。
在另一优选中，所述的巯基封闭剂为碘乙酸，最终使用浓度为1-10mM，更优选1-5mM，最优选2-4mM。
在另一优选中，所述的巯基封闭剂为碘乙酰胺，最终使用浓度为0.5-50mM，更优选0.5-10mM，最优选1-5mM。
当所述试剂仅含二硫键还原剂时，所述二硫键还原剂为2-巯基乙醇、半胱氨酸·盐酸、二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦·盐酸盐、2-巯基乙胺·盐酸、二硫赤酰糖醇中的至少一种。
其中，当所述二硫键还原剂为二硫苏糖醇时，最终使用浓度为1-50mM，也可以是1-30mM。
其中，当所述二硫键还原剂为2-巯基乙醇时，最终使用浓度为5-300mM，也可以是5-100mM。
其中，当所述二硫键还原剂为三(2-羧乙基)膦·盐酸盐时，最终使用浓度为0.1mM-20mM，也可以是0.1mM-10mM。
在另一优选中，所述的二硫键还原剂为二硫苏糖醇，最终使用浓度为1-50mM，更优选1-30mM，最优选1-20mM。
在另一优选中，所述的二硫键还原剂为2-巯基乙醇，最终使用浓度为5-300mM，更优选5-200mM，最优选30-100mM。
在另一优选中，所述的二硫键还原剂为三(2-羧乙基)膦·盐酸盐，最终使用浓度为0.1-20mM，更优选0.1-10mM，最优选0.5-10mM。
当所述试剂为巯基封闭剂和二硫键还原剂的组合物时，所述巯基封闭剂选自碘乙酸、碘乙酰胺、溴乙酸、甲基甲硫醇磺酸钠、N-乙基马来酰亚胺中的至少一种，所述二硫键还原剂选自2-巯基乙醇、半胱氨酸·盐酸、二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦·盐酸盐、2-巯基乙胺·盐酸、二硫赤酰糖醇中的至少一种。
本发明的第二方面，提供一种改进逆转录酶性能的方法，包括以下步骤：将所述试剂配置成特定浓度的母液，然后将逆转录酶溶液加入到母液中，或将母液加入到逆转录酶溶液中，使所述试剂浓度达到最终使用浓度。
其中，所述试剂的母液浓度可以是最终使用浓度的2-100倍，也可以是最终使用浓度的2-20倍。
在另一优选中，所述的母液浓度为最终使用浓度的2-100倍，更优选2-20倍，最优选2-10倍。
本发明的第三方面，涉及一种试剂盒，所述试剂盒含有本发明所公开的试剂和逆转录酶，涉及一种试剂盒，所述试剂盒含有本发明所公开的用于改进逆转录酶性能的试剂，涉及一种试剂盒，所述试剂盒含有通过本发明所公开的试剂和方法得到的逆转录酶。
本发明公开的试剂还可以任选多元醇、多糖的一种或多种。多元醇包括但不仅限于甘油、甘露醇、山梨醇、肌醇、硫醇、聚乙二醇、木糖醇等。多糖包括但不仅限于葡萄糖、葡聚糖、甘露糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、果糖、蔗糖、海藻糖、麦芽糖、菊糖。
本发明公开的试剂还可以任选缓冲剂，任选非离子型去污剂，任选金属盐，任选还含有金属离子螯合剂。
本发明的其他方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1显示了50mM DTT处理后的M-MLV逆转录酶50℃热稳定性试验结果。其中，A：50mM DTT处理后的M-MLV。B：对照，M-MLV(RNase H-)(其他公司产品)。C：对照，M-MLV(思洛生物公司产品)。D：对照，M-MLV(其他公司产品)。
图2显示了用30mM DTT处理后的M-MLV逆转录酶进行第一链cDNA合成的结果。其中，A、B、C对应的cDNA长度分别为9kb、12kb、14kb。
图3显示了用30mM DTT处理后的M-MLV逆转录酶扩增HCV基因组RNA的试验结果。其中，图3(A)为扩增曲线，图3(B)为线性关系。
图4显示了用60mM DTT处理后的M-MLV逆转录酶分别在42℃、45℃、50℃、55℃、60℃下扩增MS2基因组RNA的试验结果。其中，A：对照，M-MLV(RNase H-)(其他公司产品)，B：60mM DTT处理后的M-MLV。
具体实施方式
本发明人经过长期的研究和试验，发现将一定浓度范围的巯基封闭剂或二硫键还原剂或二者组合物以适当的比例与逆转录酶溶液混合后，可以部分或全面改进逆转录酶以下各项性能：
(a)RNase H活性降低或显著降低；
(b)RNA或DNA依赖的DNA合成酶活性耐热性能提高或显著提高；
(c)合成的cDNA更长、产量更高；
(d)灵敏度提高。
如本领域所知，巯基封闭剂可以抑制RNase H酶的活性，未见将巯基封闭剂用于抑制逆转录酶RNase H活性以得到去除或削弱了RNase H活性的逆转录酶的报道。
低浓度的还原剂起保护蛋白-SH的作用，可阻止蛋白质中的半胱氨酸之间形成蛋白质分子内或分子间的二硫键。而高浓度的还原剂可以破坏已经形成的二硫键甚至可以还原大多数蛋白的半胱氨酸残基。
虽然不希望受理论约束，但认为，通过本发明公布的试剂和方法可使逆转录酶部分巯基被封闭(如碘乙酰胺可烷基化组氨酸和半胱氨酸)，或者部分二硫键重新形成和排布，可能导致逆转录酶的天然构象被改变，最终表现为逆转录酶部分性能被改变。
如本领域所知，通过基因重组、氨基酸修饰等技术可使逆转录酶的RNase H结构域和合成酶结构域的链接处的构象、功能亚基与结构亚基接触面的构象、RNase H活性中心引物捕获(primer grip)结构、α-螺旋和颈环(α-helix、loop)结构的构象发生改变，促使RNase H活性中心对底物不敏感或无法准确与底物契合，从而导致逆转录酶RNase H活性下降或丢失(参考文献作者及出处：Sharon J.Schultz，James J.Champoux，Virus Research：134(2008)86-103)。
任选多元醇或(和)多糖可提高逆转录酶的稳定性。多羟基化合物能够与蛋白质分子形成氢键，有助于蛋白质优先水化，形成溶剂层。糖是蛋白质的非特异性稳定剂。多糖，尤其是二糖的存在能够影响蛋白质的重折叠过程，从而提高蛋白质的稳定性。同时，多羟基化合物和多糖对蛋白质的保护作用与所选试剂本身及蛋白质的种类有关。
任选缓冲剂、非离子型去污剂、金属盐、金属离子螯合剂对于维持逆转录酶活性、提高其稳定性来说是必需的。
根据不同的需要，本发明涉及的试剂可以配置成母液形式，在使用时进行稀释，也可制备成能够直接与逆转录酶混合的各种形式。
本发明的主要优点：
(1)本发明公布的改进逆转录酶性能的方法是有别于基因重组技术和化学修饰技术之外的一种添加剂技术，主要通过添加特定的化学试剂来达到改进逆转录酶性能的目的。
(2)本发明公布的试剂和方法能有效的改进逆转录酶的性能，使之具有更强的延伸能力，更高的反应灵敏度，可以使用较高的反转录温度，克服了因模板RNA的二级结构引起的反转录困难，适合用于构建高比例的全长cDNA文库和合成较长cDNA。
(3)本发明所采用试剂的母液配置及存储简单方便，且用量小，成本低。
(4)本发明公布的改进逆转录酶性能的方法可用于改进M-MLV、AMV、HIV等逆转录酶的性能并批量生产，创造可观的经济效益。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件进行。
除非另行定义，文中所使用的所有专业用语和科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。
实施例1
按9∶1的体积比将野生型M-MLV逆转录酶(思洛生物，包含1mM DTT)加入到以下描述的A试剂中。吹打混匀数分钟后，按9∶1的体积比将所得酶液加入到以下描述的B试剂中。
按以下配方配制A试剂：
Figure BDA0000127102750000051
Figure BDA0000127102750000061
按以下配方配制B试剂：
Figure BDA0000127102750000062
以酶溶液为样本，利用荧光实时定量分析系统(安捷伦，Mx3000p)、实时定量PCR仪(ABI，StepOneTMReal-Time PCR System)、PCR仪、电泳仪等仪器，参照使用说明书，测定样本溶液的逆转录酶RT活性和RNase H活性，并计算剩余活力。结果见表1。
由表1结果可知，在本例试剂中，M-MLV经过母液浓度为50mM(10倍终浓度)的碘乙酸处理后，RT活性损失了20％，RNase H活性损失了91％。试验结果表明，本例试剂可以在基本不影响M-MLV逆转录酶RT活性的情况下，显著降低其RNase H活性。
表1 M-MLV RT、RNase H剩余活力
Figure BDA0000127102750000063
实施例2
按9∶1的体积比将野生型M-MLV逆转录酶(思洛生物，包含1mM DTT)加入到以下描述的A试剂中。吹打混匀数分钟后，按9∶1的体积比将所得酶液加入到以下描述的B试剂中。
按以下配方配制A试剂：
Figure BDA0000127102750000064
按以下配方配制B试剂：
Figure BDA0000127102750000071
以酶溶液为样本，利用荧光实时定量分析系统(安捷伦，Mx3000p)、实时定量PCR仪(ABI，StepOneTMReal-Time PCR System)、PCR仪、电泳仪等仪器，参照使用说明书，测定样本溶液的RT活性和RNase H活性，并计算剩余活力。结果见表2。
由表2结果可知，在本例试剂中，M-MLV经过母液浓度为40mM(10倍终浓度)的碘乙酰胺处理后，RT活性损失了17％，RNase H活性全部损失。试验结果表明，本例试剂可以在基本不影响M-MLV逆转录酶RT活性的情况下，去除其RNase H活性。
表2 M-MLV RT、RNase H剩余活力
Figure BDA0000127102750000072
实施例3
按4∶1的体积比将野生型M-MLV逆转录酶(思洛生物，包含1mM DTT)加入到以下描述的A试剂中。
按以下配方配制A试剂：
Figure BDA0000127102750000073
以酶溶液为样本，利用荧光实时定量分析系统(安捷伦，Mx3000p)、实时定量PCR仪(ABI，StepOneTMReal-Time PCR System)、PCR仪、电泳仪等仪器，参照使用说明书，测定样本溶液的RT活性和RNase H活性，并计算剩余活力。结果见表3。
由表3结果可知，在本例试剂中，M-MLV经过母液浓度为25mM(5倍终浓度)的碘乙酰胺处理后，RT活性损失了48％，RNase H活性全部损失。试验结果表明，本例试剂可以在损失M-MLV部分RT活性的情况下，去除其RNase H活性。
表3 M-MLV RT、RNase H剩余活力
Figure BDA0000127102750000081
实施例4
按9∶1的体积比将野生型M-MLV逆转录酶(思洛生物，包含1mM DTT)加入到以下描述的试剂中。
按以下配方配制试剂：
以酶溶液为样本，利用荧光实时定量分析系统(安捷伦，Mx3000p)、实时定量PCR仪(ABI，StepOneTMReal-Time PCR System)、PCR仪、电泳仪等仪器，参照使用说明书，测定样本溶液的RT活性和RNase H活性，并计算剩余活力。结果见表4。
将50mM DTT处理过的M-MLV样本溶液与野生型M-MLV(思洛生物和其他公司产品)、突变型M-MLV(RNase H-)(其他公司产品)酶溶液50℃共同孵育5min、30min、60min、120min、240min，检测逆转录酶RT活性，并计算剩余活力。其中，2个野生型M-MLV样本和一个突变型M-MLV(RNase H-)样本为对照。结果见图1。
由表4结果可知，在本例试剂中，M-MLV经过母液浓度为50mM(10倍终浓度)的DTT处理后，RT活性仅损失了6％，RNase H活性则损失了41％。
由图1可知，在本例试剂中，M-MLV经过母液浓度为50mM(10倍终浓度)的DTT处理后，其耐热性能大幅提高，50℃孵育240min后，RT活性仅损失了28％，优于野生型M-MLV和突变型M-MLV(RNase H-)。
以上试验结果表明，本例试剂可以在基本不影响野生型M-MLV逆转录酶RT活性的前提下，降低其RNase H活性，同时大幅提高其50℃耐热性。
表4 M-MLV RT、RNase H剩余活力
Figure BDA0000127102750000091
实施例5
按9∶1的体积比将野生型M-MLV逆转录酶(思洛生物，包含1mM DTT)加入到以下描述的试剂中。
按以下配方配制试剂：
Figure BDA0000127102750000092
以酶溶液为样本，利用荧光实时定量分析系统(安捷伦，Mx3000p)、实时定量PCR仪(ABI，StepOneTMReal-Time PCR System)、PCR仪、电泳仪等仪器，按照使用说明书，测定样本溶液的RT活性和RNase H活性，并计算剩余活力。试验结果见表5。
将所得M-MLV酶液用于两步法RT-PCR，按照产品说明书提供的实验方案进行第一链cDNA合成。试验结果见图2。
将所得M-MLV酶液用于两步法RT-qPCR，按照产品说明书提供的实验方案，扩增HCV基因组RNA。试验结果见图3。
由表5结果可知，M-MLV经过本例试剂处理后，RT活性仅损失了11％，RNase H活性则损失了63％。
由图2结果可知，M-MLV经过本例试剂处理后，可用于合成长达14kb的第一链cDNA，且逆转录完全。
由图3结果可知，将本例试剂处理过的M-MLV用于扩增HCV基因组RNA，扩增效率为95.123％，R2为1。结果表明，经过本例试剂处理后的M-MLV具有高的扩增灵敏度，可以用于RNA分子的精确定量。
以上试验结果表明，本例试剂可以在基本不影响M-MLV逆转录酶RT活性的前提下，降低其RNase H活性，提高其合成cDNA片段的长度和扩增灵敏度。
表5 M-MLV RT、RNase H剩余活力
实施例6
按14∶1的体积比将野生型M-MLV逆转录酶(思洛生物，包含1mM DTT)加入到以下描述的试剂中。
按以下配方配制试剂：
Figure BDA0000127102750000102
将本例试剂处理过的M-MLV样本溶液分别在42℃、45℃、50℃、55℃、60℃下，用两步法RT-PCR扩增MS2基因组RNA。其中，模板RNA量为1pg，使用特异性引物。对照为M-MLV(RNase H-)(其他公司产品)。试验结果见图4。
如图4所示，经过本例试剂处理后的M-MLV酶液，在42℃、45℃、50℃、55℃、60℃下，通过两步法RT-PCR扩增MS2基因组RNA，均能得到2kb大小的扩增产物，且cDNA产量远高于M-MLV(RNase H-)。
应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (23)

1.一种改进逆转录酶性能的试剂，其特征在于，所述试剂为巯基封闭剂或二硫键还原剂或二者组合物。
2.如权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述试剂为巯基封闭剂。
3.如权利要求2所述的试剂，其特征在于，所述的巯基封闭剂为碘乙酸、碘乙酰胺、溴乙酸、甲基甲硫醇磺酸钠(Methyl methanethiosulfonat，MMTS)、N-乙基马来酰亚胺(N-ethylmaleimide，NEM)中的至少一种。
4.如权利要求3所述的试剂，其特征在于，所述巯基封闭剂为碘乙酸，最终使用浓度为1-10mM。
5.如权利要求3所述的试剂，其特征在于，所述巯基封闭剂为碘乙酰胺，最终使用浓度为0.5-50mM。
6.如权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述试剂为二硫键还原剂。
7.如权利要求6所述的试剂，其特征在于，所述二硫键还原剂为2-巯基乙醇、半胱氨酸·盐酸、二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦·盐酸盐、2-巯基乙胺·盐酸、二硫赤酰糖醇中的至少一种。
8.如权利要求7所述的试剂，其特征在于，所述二硫键还原剂为二硫苏糖醇，最终使用浓度为1-50mM。
9.如权利要求7所述的试剂，其特征在于，所述二硫键还原剂为2-巯基乙醇，最终使用浓度为5-300mM。
10.如权利要求7所述的试剂，其特征在于，所述二硫键还原剂为三(2-羧乙基)膦·盐酸盐，最终使用浓度为0.1-20mM。
11.如权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述试剂为巯基封闭剂和二硫键还原剂的组合物。
12.如权利要求11所述的组合物，其特征在于，所述巯基封闭剂选自碘乙酸、碘乙酰胺、溴乙酸、甲基甲硫醇磺酸钠、N-乙基马来酰亚胺中的至少一种，所述二硫键还原剂选自2-巯基乙醇、半胱氨酸·盐酸、二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦·盐酸盐、2-巯基乙胺·盐酸、二硫赤酰糖醇中的至少一种。
13.如权利要求1-12中任一项的试剂，其特征在于，所述试剂任选还含有缓冲剂，任选还含有非离子型去污剂，任选还含有金属盐，任选还含有金属离子螯合剂，任选还含有选自多元醇、多糖的一种或多种试剂。
14.如权利要求12所述的试剂，其特征在于，所述多元醇选自甘油、甘露醇、山梨醇、肌醇、硫醇、聚乙二醇、木糖醇中的至少一种。
15.如权利要求12所述的试剂，其特征在于，所述多糖选自葡萄糖、葡聚糖、甘露糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、果糖、蔗糖、海藻糖、麦芽糖、菊糖中的至少一种。
16.一种改进逆转录酶性能的方法，其特征在于，包括步骤：将权利要求1-15中任一项的试剂配置成特定浓度的母液，然后将逆转录酶溶液加入到母液中，或将母液加入到逆转录酶溶液中，使所述试剂浓度达到最终使用浓度。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述试剂的母液浓度为最终使用浓度的2-100倍。
18.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述逆转录酶为M-MLV(莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶)、RSV(劳氏肉瘤病毒逆转录酶)，RAV(劳氏伴随病毒逆转录酶)、AMV(鸟类成髓细胞白血病病毒)、HIV(人免疫缺陷病毒逆转录酶)中的至少一种。
19.如权利要求18所述的逆转录酶，其特征在于，所述逆转录酶为M-MLV逆转录酶。
20.如权利要求16所述的方法，其特征在于，用所述方法得到的逆转录酶具有选自下组的一项或多项特性：
(a)RNase H活性降低或显著降低；
(b)RNA或DNA依赖的DNA合成酶活性耐热性能提高或显著提高；
(c)合成的cDNA更长、产量更高；
(d)灵敏度提高。
21.一种试剂盒，所述试剂盒含有权利要求1-20中任一项的试剂和逆转录酶。
22.一种试剂盒，所述试剂盒含有权利要求1-15中任一项的用于改进逆转录酶性能的试剂。
23.一种试剂盒，所述试剂盒含有通过权利要求1-20中任一项所述的试剂和方法得到的逆转录酶。
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