CN116376869A - 经改变的耐热性dna聚合酶 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及经改变的耐热性DNA聚合酶。提供在核酸扩增法、特别是PCR、RT‑PCR中对于抑制物质的耐受性强、可以通过缩短逆转录反应时间而缩短整个核酸扩增反应时间的DNA聚合酶。一种DNA聚合酶，其特征在于，其为具有逆转录活性且改变了与序列号1或2的第509位或第744位相当的氨基酸中的至少1个的DNA聚合酶，特别是与序列号1或2中的第509位或第744位相当的氨基酸的改变是置换为组氨酸、赖氨酸或精氨酸。

Description

经改变的耐热性DNA聚合酶
本申请是申请日为2017年11月13日、申请号为201780071770.7、发明名称为“经改变的耐热性DNA聚合酶”的申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及聚合酶链反应(PCR)等中使用的耐热性DNA聚合酶的突变体。进而涉及使用该耐热性DNA聚合酶的核酸扩增方法。本发明不仅可以用于研究领域，还可以用于临床诊断、环境检查等。
背景技术
核酸扩增法是将数个拷贝的靶核酸扩增到可见的水平、即数亿拷贝以上的技术，不仅用于生命科学研究领域，也广泛用于基因诊断、临床检查之类的医疗领域、或者食品和环境中的微生物检查等中。
有代表性的核酸扩增法是PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应)。PCR是如下方法：以(1)利用热处理进行的DNA变性(由双链DNA解离为单链DNA)、(2)引物与模板单链DNA的退火、(3)使用DNA聚合酶使上述引物延伸这3个步骤为1个循环，通过重复进行该循环来扩增试样中的靶核酸。
在检测对象核酸为RNA时，例如，在病原性微生物的检测中对象为RNA病毒时、或通过定量mRNA来测定基因的表达量时等，广泛使用RT-PCR，所述RT-PCR在PCR之前进行利用逆转录酶将RNA转换为cDNA的反应(逆转录反应)。
已知这些核酸扩增法会由于生物试样中存在的糖、蛋白质等抑制物质而受到强烈抑制，扩增效率、检测灵敏度会下降，在上述核酸扩增之前，需要进行从生物试样中提取并纯化核酸的操作。
作为从生物试样提取核酸的核酸提取法，已知使用苯酚、氯仿等有机溶剂的方法(专利文献1)，但是即使使用这些方法进行试样中的核酸的纯化，也难以彻底除去杂质，试样中的核酸的回收量通常不稳定，特别是当试样中的核酸含量少时，有时难以进行核酸扩增。
另外，核酸扩增法的反应需要时间，这也是一个问题。通常，在PCR反应中需要根据靶核酸的大小来改变延伸时间，多数情况下每1kb设定为1分钟左右，靶核酸较长时，有时反应时间会超过2～3小时。另外，关于逆转录的反应时间，通常也需要20分钟左右。
综上，需要进一步改善反应体系，需要对抑制物质的耐受性强、可以以更短的时间实施反应的核酸扩增法。
实际上，为了提高反应效率，正在对DNA聚合酶的改良进行研究(专利文献2～4、非专利文献1～3)。在专利文献2中，通过向PCR中通常使用的Taq DNA聚合酶中导入突变，成功取得了耐受盐等的抑制的强的改变型DNA聚合酶。另外，同样地，专利文献3及非专利文献1～3中通过向Taq DNA聚合酶中引入突变而取得了耐受血液、抑制的强的改变型DNA聚合酶。
但是，这种突变体的制作止步于向最通用的Taq DNA聚合酶中引入突变，并未对其它的DNA聚合酶实施。另外，虽然也公开了耐受杂质强的抑制的例子，但是关于反应时间的缩短则没有言及。
Taq DNA聚合酶的逆转录活性弱，不能用于RT-PCR中。另外，这些Taq DNA聚合酶突变体中，也偶然出现不足以高效实施反应的例子，因此需要性能更高的DNA聚合酶。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开平9-19292号公报
专利文献2：日本专利第5809059号公报
专利文献3：日本专利第5852650号公报
专利文献4：日本专利第5189101号公报
非专利文献
非专利文献1：ORIGINAL RESEARCHARTICLE(2014年8月14日发行)
非专利文献2：Nucleic Acids Research,Vol.37,No.5e40(2009年发行)
非专利文献3：ORIGINAL RESEARCHARTICLE(2014年9月3日发行)
发明内容
发明要解决的问题
在核酸扩增法、特别是PCR、RT-PCR中，需要对抑制物质的耐受性强、另外可以缩短PCR反应时间的DNA聚合酶。
用于解决问题的方案
本发明人等鉴于上述课题进行了深入研究，结果发现，通过对具有逆转录活性的DNA聚合酶引入突变，从而与现有的Taq DNA聚合酶、在相同位置具有突变的Taq DNA聚合酶突变体相比，可以强地耐受抑制物质且大幅缩短反应时间。另外发现，由于使用具有逆转录活性的DNA聚合酶，因此在以往无法应对的RT-PCR中也可以应用该改变型DNA聚合酶，从而完成了本发明。
即，本发明的概要如下所示。
项1.一种DNA聚合酶，其特征在于，其为具有逆转录活性、并且与序列号1的氨基酸序列具有90％以上的同一性的DNA聚合酶，其中改变了选自由第509位及第744位组成的组中的至少1个位点的氨基酸。
项2.一种DNA聚合酶，其特征在于，其为具有逆转录活性、并且与序列号1的氨基酸序列具有96％以上的同一性的DNA聚合酶，其中改变了选自由第509位及第744位组成的组中的至少1个位点的氨基酸。
项3.一种DNA聚合酶，其特征在于，其为具有逆转录活性、并且具有序列号1的氨基酸序列的DNA聚合酶，其中改变了选自由第509位及第744位组成的组中的至少1个位点的氨基酸。
项4.一种DNA聚合酶，其特征在于，其为具有逆转录活性、并且与序列号2的氨基酸序列具有90％以上的同一性的DNA聚合酶，其中改变了选自由第509位及第744位组成的组中的至少1个位点的氨基酸。
项5.一种DNA聚合酶，其特征在于，其为具有逆转录活性、并且与序列号2的氨基酸序列具有96％以上的同一性的DNA聚合酶，其中改变了选自由第509位及第744位组成的组中的至少1个位点的氨基酸。
项6.一种DNA聚合酶，其特征在于，其为具有逆转录活性、并且具有序列号2的氨基酸序列的DNA聚合酶，其中改变了选自由第509位及第744位组成的组中的至少1个位点的氨基酸。
项7.根据项1～6中任一项所述的DNA聚合酶，其中，与序列号1或序列号2中的第509位或第744位相当的氨基酸的改变是置换为选自由组氨酸、赖氨酸及精氨酸组成的组中的任一氨基酸。
项8.根据项7所述的DNA聚合酶，其中，与序列号1或序列号2中的第509位相当的氨基酸的改变是置换为精氨酸。
项9.根据项1～8中任一项所述的DNA聚合酶，其中，逆转录反应在5分钟以下完成。
项10.根据项9所述的DNA聚合酶，其中，逆转录反应在1分钟以下完成。
项11.根据项1～10中任一项所述的DNA聚合酶，其中，每1kb的延伸时间为30秒以下。
项12.一种核酸扩增方法，其特征在于，使用项1～11中任一项所述的DNA聚合酶对未经过纯化工序的生物试样进行扩增。
项13.根据项12所述的核酸扩增方法，其中，所述生物试样为选自由源自血液的试样、唾液、脊髓液、尿及乳汁组成的组中的至少1种试样。
发明的效果
通过使用本发明的DNA聚合酶，可以不受杂质的影响且以短反应时间进行核酸扩增。可以省略除去杂质的纯化工序，因此可以大幅缩短处理时间。
附图说明
图1是示出实施例3中研究使用Tth DNA聚合酶及改变型Tth DNA聚合酶的DNA扩增的结果的图。
图2是示出实施例4中研究利用高速PCR进行的DNA扩增的结果的图。
图3是示出实施例5中研究血液试样中的DNA扩增的结果的图。
图4是示出实施例6中的RT-PCR的扩增曲线、熔解曲线的结果的图。
图5是示出实施例7中使用野生型Tth DNA聚合酶及改变型Tth DNA聚合酶的RT-PCR的扩增曲线以及熔解曲线的结果的图。
图6是示出实施例8中研究由用FTA卡保存的血液进行DNA扩增的结果的图。
图7是示出实施例10中评价DNA聚合酶对源自血浆的成分的耐受性的结果的图。
图8是示出实施例11中进行DNA聚合酶的高速RT-PCR的评价的结果的图。
图9是示出实施例12中评价DNA聚合酶对血液的耐受性的结果的图。
具体实施方式
本发明涉及具有逆转录活性的改变型DNA聚合酶。具有逆转录活性的耐热性DNA聚合酶是兼具将RNA转换为cDNA的能力和扩增DNA的能力的DNA聚合酶，并非对本发明进行特别限定但可列举：源自嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)HB8的DNA聚合酶(Tth)、源自栖热菌属Z05(Thermus sp Z05)的DNA聚合酶(Z05)、源自海栖热袍菌(Thermotoga maritima)的DNA聚合酶(Tma)等。特别优选列举Tth、Z05。
本发明的DNA聚合酶的特征在于，在由序列号1所示的氨基酸序列组成的蛋白质中，使特定部位的氨基酸突变，具体而言通过置换为其它氨基酸而改变。不限于改变前的氨基酸序列与序列号1完全相同的情况。优选的是，与序列号1的同一性为80％以上即可，优选为85％以上、更优选为90％以上、进一步优选为93％以上、特别优选为96％以上。
本发明的DNA聚合酶更优选具有与序列号1或序列号2中的氨基酸Q509或E744相当的氨基酸中的至少1个氨基酸的改变。在此，例如Q509是指第509位的氨基酸、即谷氨酰胺(Q)残基，一个字母表示通用的氨基酸的简称。在优选的例子中，Q509氨基酸为如下氨基酸置换：谷氨酰胺(Q)被置换为带正电的极性氨基酸，具体选自由Q509H、Q509K、及Q509R组成的组。在此，例如Q509K是指第509位的氨基酸即谷氨酰胺(Q)被置换为赖氨酸(K)，以下同样。在另一优选例子中，E744氨基酸为如下氨基酸置换：谷氨酸(E)被置换为带正电荷的极性氨基酸，具体为E744H、E744K或E744R。
本发明的DNA聚合酶只要改变了序列号1或序列号2中的第509位或第744位的氨基酸中的任一者即可，其它氨基酸也可以缺失/改变。具体而言，可以是为了除去5’-3’核酸外切酶活性而去除了N末端的类型、具有用于终止低温下的反应的E710L等突变的类型，没有特别限定。另外，本发明的DNA聚合酶在第509位、第744位以外也可以包含突变。优选为与第509位或第744位具有突变的序列号1或2具有90％以上的同一性的DNA聚合酶，进一步优选为与序列号1或2具有96％以上的同一性的DNA聚合酶。
作为制造这些经改变的DNA聚合酶的方法，可以使用以往公知的方法。例如优选下述方法：向编码野生型DNA聚合酶的基因中导入突变，从而利用蛋白质工程方法制造具有新功能的突变型(改变型)DNA聚合酶。
作为导入氨基酸的改变的方法的一个方式，可以使用基于Inverse PCR法的定点突变法。例如KOD-Plus-Mutagenesis Kit(Toyobo制)为下述试剂盒：(1)使插入有目标基因的质粒变性，使突变引物与该质粒退火，接着用KOD DNA聚合酶进行延伸反应；(2)将(1)的循环重复进行15次；(3)使用限制性内切酶DpnI仅对模板质粒进行选择性切割；(4)对重新合成的基因进行磷酸化，实施连接而使其环化；(5)将环化的基因转化至大肠杆菌中，由此可以取得携带导入了目标突变的质粒的转化体。
作为本发明的DNA聚合酶，可以为Sso7d、PCNA的融合蛋白的形态。另外，也可以为带有His标签、GST标签等蛋白质标签的融合蛋白。
作为本发明的DNA聚合酶的另一方式，优选与以往的DNA聚合酶相比逆转录活性优异、逆转录反应快。作为具体的方式例子，为在5分钟以下、优选为3分钟以下、更优选为1分钟以下完成逆转录反应。在此，本发明中，完成逆转录反应是如下定义的。即，作为RT-PCR反应成立的条件，设为PCR效率为90～110％以内且相关系数r2为0.98。PCR效率可以如下求出：以连续稀释的核酸量为X轴、以与核酸量对应的Ct值为Y轴而对结果作图，利用所得的标准曲线的斜率(slope)通过式(1)求出。相关系数r2表示标准曲线的直线性。在这种情形下，逆转录反应之后能够进行PCR则视为逆转录反应已完成。
[数学式1]
PCR效率(％)＝(10-1/斜率-1)×100 ···(1)
将上述DNA聚合酶基因根据需要而转移到表达载体中，用该表达载体转化宿主例如大肠杆菌，然后涂布于包含氨苄青霉素等药剂的琼脂培养基上，使其形成菌落。将菌落接种到营养培养基、例如LB培养基、2×YT培养基，在37℃下培养12～20小时后，将菌体破碎，提取粗酶液。作为载体，优选使用源自pBluescript的载体。作为破碎菌体的方法，可以使用任意公知方法，例如可以使用超声波处理、弗氏压碎器、玻璃珠破碎之类物理破碎法、溶菌酶之类的裂解酶。将该粗酶液在80℃、30分钟的条件下进行热处理而使源自宿主的DNA聚合酶失活，测定DNA聚合酶活性。
从利用上述方法筛选的菌株中取得纯化DNA聚合酶的方法可以使用任意方法，例如有如下方法。将在营养培养基上培养而得到的菌体回收之后，利用酶法或物理破碎法进行破碎提取，得到粗酶液。对得到的粗酶提取液进行热处理，例如在80℃、30分钟的条件下进行处理，然后通过硫酸铵沉淀回收DNA聚合酶级分。对于该粗酶液，可以通过使用Sephadex G-25(Amersham Pharmacia Biotech制)的凝胶过滤等方法进行脱盐。该操作之后，利用肝素琼脂糖柱色谱法进行分离、纯化，可以得到纯化酶标品。该纯化酶标品已纯化到用SDS-PAGE几乎显示单一条带的程度。
[DNA聚合酶活性测定法]
纯化后的DNA聚合酶可以通过以下所示的方法测定活性。在酶活性强的情况下，用保存缓冲液(50mM Tris-HCl(pH8.0)、50mM KCl、1mM二硫苏糖醇、0.1％ Tween20、0.1％Nonidet P40、50％甘油)将样品稀释后进行测定。(1)将下述的A液25μl、B液5μl、C液5μl、灭菌水10μl、及酶溶液5μl加入到微管中，在75℃下反应10分钟。(2)然后用冰冷却，加入E液50μl、D液100μl，搅拌后再用冰冷却10分钟。(3)将该液用玻璃过滤器(Whatman制GF/C过滤器)过滤，用0.1N盐酸及乙醇充分洗涤。(4)用液体闪烁计数器(liquid scintillationcounter)(PACKARD制Tri-Carb2810 TR)检测过滤器的放射活性，测定核苷酸向模板DNA中的掺入。酶活性的1单位设为：在该条件下，每30分钟将10nmol的核苷酸掺入到酸不溶性级分(即，添加D液时不溶的级分)的酶量。
A：40mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)、16mM氯化镁、15mM二硫苏糖醇、100μg/ml BSA(牛血清白蛋白)
B：1.5μg/μl活化小牛胸腺DNA
C：1.5mM dNTP(250cpm/pmol[3H]dTTP)
D：20％三氯乙酸(2mM焦磷酸钠)
E：1mg/ml小牛胸腺DNA
本发明的核酸扩增方法中，用于扩增核酸的温度/时间/反应循环等条件根据欲扩增的核酸的种类、碱基的序列、链长等而改变，本领域技术人员可以适当设定。其中，特别是将本发明的核酸扩增法用于PCR、RT-PCR时，可以使每1kb的延伸时间为30秒以下。在PCR、RT-PCR中，以(1)利用热处理进行的DNA变性(由双链DNA解离为单链DNA)、(2)引物向模板单链DNA的退火、(3)使用DNA聚合酶使上述引物延伸这3个步骤为1个循环，并重复进行该循环。本发明中的延伸时间表示(3)的使引物延伸的反应所需要的1个循环的时间。
[不经过纯化工序]
在本发明的核酸扩增方法中，可以在不对未经过纯化工序的生物试样内的核酸进行纯化来进行扩增。在此，纯化是指：使生物试样的组织、细胞壁等杂质与生物试样中的DNA分离的方法，具体可列举：使用苯酚或苯酚/氯仿等分离DNA的方法；利用离子交换树脂、玻璃过滤器或具有蛋白聚集作用的试剂对DNA进行分离的方法等。
本发明中的核酸扩增方法是不对生物试样采取这些纯化方法、而是直接添加到核酸扩增反应液中进行扩增的方法。在本发明中，“未经过纯化工序的生物试样”是指：生物试样本身；或者，将液体生物试样用水、核酸保存液等溶剂稀释了的产物；将生物试样添加到水等溶剂中并加热破碎的产物；贴合在FTA卡(GE Healthcare)之类的包含核酸保存液的物质的生物试样等。
在试样的组织例如脏器、细胞等内存在作为扩增对象的核酸时，为了提取上述核酸而破坏组织的行为(利用物理处理的破坏、使用表面活性剂等的破坏等)不相当于本发明中的纯化。另外，将通过上述方法得到的试样或生物试样用缓冲液等稀释的行为也不相当于本发明中的纯化。
[生物试样]
适用于本发明的核酸扩增方法的生物试样只要是从生物体收集的试样则没有特别限定。例如是指动植物组织、体液、排泄物、细胞、细菌、病毒等。体液包括血液、唾液，细胞包括由血液分离出的白细胞，但不限于这些。
本发明不仅用于PCR、RT-PCR，也可用于以DNA为模板并且使1种引物、dNTP(脱氧核糖核苷三磷酸)反应而使引物延伸、来合成DNA引物延伸物的方法。具体而言，也可以用于引物延伸法、测序法、以往的不进行温度循环的方法及循环测序法等。
本发明的经改变的DNA聚合酶可以以核酸扩增用试剂的方式提供。作为核酸扩增用试剂的一例，包含一引物与另一引物的DNA延伸产物彼此互补的2种引物、dNTP、及上述的本发明的耐热性DNA聚合酶、2价离子、1价离子及缓冲液，进而具体优选：包含一引物与另一引物的DNA延伸产物互补的2种引物、dNTP及上述耐热性DNA聚合酶、镁离子和/或锰离子、铵离子和/或钾离子、BSA、上述的非离子表面活性剂及缓冲液的方式。
作为核酸扩增用试剂的另一方式，有包含下述物质的核酸扩增用试剂，所述物质为：一引物与另一引物的DNA延伸产物彼此互补的2种引物、dNTP及上述的本发明的耐热性DNA聚合酶、2价离子、1价离子、缓冲液、及根据需要包含的具有抑制耐热性DNA聚合酶的聚合酶活性和/或5’-3’核酸外切酶活性的活性的抗体。作为该抗体，可列举单克隆抗体、多克隆抗体等。本核酸扩增用试剂对提升PCR的灵敏度、减少非特异性扩增特别有效。
以下基于实施例更详细地说明本发明。需要说明的是，本发明不受实施例的特别限定。
实施例
实施例1
DNA聚合酶质粒的制作
将通过人工合成而制作的源自嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)HB8的DNA聚合酶基因(序列号3)、源自栖热菌属Z05(Thermus sp Z05)的DNA聚合酶基因(序列号4)、及源自水生栖热菌(Thermus aquaticus)的耐热性DNA聚合酶基因(序列号5)克隆到pBluescript中，分别制作整合有野生型Tth、Z05、Taq DNA聚合酶的质粒(分别记作pTth、pZ05、pTaq)。在制作具有突变的质粒时，以pTth、pZ05、pTaq为模板，使用KOD-Plus-Mutagenesis Kit(Toyobo制)并基于操作说明书的方法来进行。对于部分双重突变，以所制作的突变质粒为模板，使用同样的试剂盒进一步导入突变而制作。将所制作的质粒及此时所使用的模板/引物示于表1。得到的质粒转化大肠埃希氏杆菌JM109，用于酶的制备。
[表1]
Figure BDA0004145689010000111
实施例2
DNA聚合酶的制作
实施例1中得到的菌体的培养如下所述地实施。首先，将灭菌处理后的含有100μg/ml的氨苄青霉素的TB培养基(Molecular cloning 2nd edition、p.A.2)80mL分注到500mL坂口烧瓶中。在该培养基上，接种预先用含有100μg/ml的氨苄青霉素的3ml的LB培养基(1％Bacto胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化钠；Gibco制)在37℃下培养了16小时的大肠埃希氏杆菌JM109(质粒转化株)(使用试管)，在37℃下通气培养16小时。通过离心分离由培养液回收菌体，悬浮于50ml的破碎缓冲液(30mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)、30mM NaCl、0.1mM EDTA)，然后利用超声处理将菌体破碎，得到细胞破碎液。然后将细胞破碎液在80℃下处理15分钟后，通过离心分离除去不溶性级分。再进行使用聚乙烯亚胺的除核酸处理、硫酸铵盐析、肝素琼脂糖色谱法，最后置换为保存缓冲液(50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)、50mM氯化钾、1mM二硫苏糖醇、0.1％ Tween20、0.1％ Nonidet P40、50％甘油),得到耐热性DNA聚合酶。
上述纯化工序的DNA聚合酶活性测定按照以下的操作来进行。另外，在酶活性高的情况下，将样品稀释后进行测定。
(试剂)
A液：40mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)、16mM氯化镁、15mM二硫苏糖醇、100μg/mlBSA
B液：1.5μg/μl活化小牛胸腺DNA
C液：1.5mM dNTP(250cpm/pmol[3H]dTTP)
D液：20％三氯乙酸(2mM焦磷酸钠)
E液：1mg/ml小牛胸腺DNA
(方法)
将A液25μl、B液5μl、C液5μl及灭菌水10μl加入到微管中，搅拌混合后加入上述纯化酶稀释液5μl，在75℃下反应10分钟。然后冷却，加入E液50μl、D液100μl，搅拌后再用冰冷却10分钟。将该液体用玻璃过滤器(Whatman制GF/C过滤器)过滤，用0.1N盐酸及乙醇充分洗涤，用液体闪烁计数器(PACKARD制Tri-Carb2810 TR)检测过滤器的放射活性，由此测定核苷酸向模板DNA的掺入。酶活性的1单位设为：在该条件下，每30分钟将10nmol的核苷酸掺入到酸不溶性级分的酶量。
实施例3
PCR
使用实施例2中制作的DNA聚合酶，实施扩增人β-珠蛋白3.6kb、8.5kb的PCR。
PCR中，使用KOD Dash(Toyobo制)附带的缓冲液，将包含1×PCR缓冲液及0.2mMdNTPs、用于扩增人β-珠蛋白3.6kb的15pmol的引物(序列号6及7)或用于扩增8.5kb的15pmol的引物(序列号8及9)、50ng的人基因组DNA(Roche制)、1、2、5、10U的酶的50μl的反应液，通过在94℃、2分钟的预反应之后，将98℃、10秒→60℃、10秒→68℃、4分钟(3.6kb的扩增)或8分钟(8.5kb的扩增)重复35个循环的程序，从而用PCRsystem GeneAmp9700(AppliedBiosystem制)来进行PCR。反应结束后，对于5μl的反应液进行1％琼脂糖电泳，进行溴乙锭染色，在紫外线照射下确认扩增DNA片段的扩增量。
图1示出用Tth DNA聚合酶及改变型Tth DNA聚合酶(E9K、P6S/E9K、P6S、K53N/K56Q/E57D、S30N/K53N/K56Q/E57D、S30N、D238N、Q509R、Q509K、E744K、E799G、E799G/E800A)扩增3.6kb的结果。在1、2、5、10U的情况下分别可以确认到扩增，在5U、10U的情况下可以确认到条带。而且Q509R、Q509K、E744K在2U的情况下即可进行扩增，可知可以以更少的酶量高效地进行扩增。
表2中对于3.6kb、表3中对于8.5kb的扩增结果，汇总示出用各种DNA聚合酶及突变体实施的结果。○表示进行了扩增，△表示扩增出的条带浅或非特异条带多，×表示未扩增。
Taq DNA聚合酶得到了如下结果：E507K、E507R、E742K、E742R的突变体提升了扩增成功率，能够扩增3.6kb。第507位、第742位在Tth、Z05中与第509位、第744位相当，表明Tth、Z05中的该位置的突变可提高性能。但是，关于8.5kb的扩增，结果是Taq DNA聚合酶、其突变体均未扩增。另一方面，可以确认具有逆转录能力的Tth、Z05的Q509K、Q509R、E744K、E744R突变体则也扩增了8.5kb。可知具有逆转录能力的DNA聚合酶的性能高，通过插入突变发挥了更高的性能。另外，此次的突变位置对于Taq DNA聚合酶而言已经报道过，但在Tth DNA聚合酶中存在的多种突变则看不到效果。
[表2]
Figure BDA0004145689010000141
[衷3]
Figure BDA0004145689010000151
实施例4
高速PCR
使用实施例2中制作的DNA聚合酶实施缩短了延伸时间的高速PCR。PCR中，使用KODDash(Toyobo制)附带的缓冲液，将包含1×PCR缓冲液及0.2mM dNTPs、用于扩增人β-珠蛋白3.6kb的15pmol的引物(序列号6及7)、50ng的人基因组DNA(Roche制)、5U的酶的50μl的反应液，通过在94℃、2分钟的预反应后，将98℃、10秒→60℃、10秒→68℃、15秒、1分钟或2分钟重复进行35个循环的程序，从而用PCR system GeneAmp9700(Applied Biosystem)来进行PCR。反应结束后，对于5μl的反应液进行1％琼脂糖电泳，进行溴乙锭染色，在紫外线照射下确认扩增DNA片段的扩增量。
图2示出在延伸时间(68℃下的反应时间)为15秒和2分钟的高速PCR中、使用5U的Tth DNA聚合酶和各种改变型Tth DNA聚合酶(E9K、P6S/E9K、P6S、K53N/K56Q/E57D、S30N/K53N/K56Q/E57D、S30N、D238N、Q509R、Q509K、E744K、E799G、E799G/E800A)并且通过1％琼脂糖电泳对于人β于珠蛋白3.6kb的扩增量进行比较的结果。在2分钟的扩增中，E9K、P6S/E9K、P6S、S30N/K53N/K56Q/E57D、S30N、D238N、Q509R、Q509K、E744K、E799G/E800A中可以确认扩增，其中Q509R、Q509K、E744K的条带强度大，可以确认到清晰的条带。在15秒的扩增中，仅Q509R、Q509K、E744K的突变体能够确认到扩增。
表4中，对于实施例4的扩增结果，汇总示出用各种DNA聚合酶及突变体实施的结果。○表示进行了扩增，△表示进行了扩增、但条带浅或非特异条带多，×表示未扩增。
Taq DNA聚合酶在任一扩增时间时均不能扩增，而E507K、E507R、E742K、E742R的突变体在所有的扩增时间时均确认到条带。Tth、Z05 DNA聚合酶的Q509K、Q509R、E744K、E744R突变体也在所有的扩增时间时均确认到条带，并且Taq DNA聚合酶的E507K、E507R、E742K、E742R突变体在扩增量减少的15秒的扩增时间时也能够确认到清晰的条带。可知：与通用的Taq DNA聚合酶及其突变体相比，具有逆转录活性的Tth、Z05 DNA聚合酶的突变体具有更适合于高速PCR的性能。
[衷4]
Figure BDA0004145689010000171
实施例5
由血液直接扩增
使用实施例2中制作的DNA聚合酶，向反应液中直接添加血液并实施PCR。PCR中，使用KOD Dash(Toyobo制)附带的缓冲液，将包含1×PCR缓冲液、及0.2mM dNTPs、用于扩增人β-珠蛋白3.6kb的15pmol的引物(序列号6及7)、血液1μl或3μl或5μl、5U的酶的50μl的反应液，通过在94℃、2分钟的预反应后，将98℃、10秒→60℃、10秒→68℃、4分钟重复进行35个循环的程序，从而用PCR system GeneAmp9700(Applied Biosystem公司)来进行PCR。反应结束后，对于5μl的反应液进行1％琼脂糖电泳，进行溴乙锭染色，在紫外线照射下确认扩增DNA片段的扩增量。
图3示出向反应液中添加血液1μl、5μl、并且使用5U的Tth DNA聚合酶及各种改变型Tth DNA聚合酶(E9K、P6S/E9K、P6S、K53N/K56Q/E57D、S30N/K53N/K56Q/E57D、S30N、D238N、Q509R、Q509K、E744K、E799G、E799G/E800A)、并且通过1％琼脂糖电泳对于人β-珠蛋白3.6kb的扩增量进行比较的结果。在由血液1μl进行扩增时，在Q509R、Q509K、E744K的情况下可以确认清晰的条带。在由血液5μl进行扩增时，虽然扩增量减少，但在Q509R、Q509K的突变体的情况下可以确认到扩增。
表5中汇总示出了用各种DNA聚合酶及突变体由1μl、3μl及5μl的血液中实施扩增的结果。○表示进行了扩增，△表示虽然进行了扩增、但条带薄或非特异条带，×表示未进行扩增。
在Taq DNA聚合酶的情况下，未能进行由血液的扩增，而E507K、E507R、E742K、E742R的突变体的情况下则能够由1μl血液进行扩增。在添加更多血液的情况下，Taq DNA聚合酶及其突变体均不能扩增。Tth、Z05 DNA聚合酶的情况下，野生型、大部分的突变体均未观察到扩增，但Q509K、Q509R、E744K、E744R突变体能够由1μl、3μl血液进行扩增。另外，在由5μl血液的情况下，Tth DNA聚合酶的Q509K、Q509R仍可以确认到扩增。可知：与通用的TaqDNA聚合酶及其突变体相比，具有逆转录活性的Tth、Z05 DNA聚合酶的突变体更不易受到血液的抑制。
[衷5]
Figure BDA0004145689010000191
实施例6
使用具有逆转录能力的DNA聚合酶的RT-PCR
使用实施例2中制作的DNA聚合酶，从RNA起实施一步RT-PCR。RT-PCR中，使用TKOD-Plus-Ver.2(Toyobo制)附带的缓冲液，向包含1×PCR缓冲液、及2.5mM Mn(OAc)2、0.4mMdNTPs、用于扩增人β-珠蛋白的0.4pmol的引物(序列号10及11)、1/30000倍稀释SYBR(注册商标)GreenI、1U的抗体混合酶的20μl反应液中添加HeLa总RNA并使其达到200ng、20ng、2ng、0.2ng，通过在90℃、30秒的预反应后，进行61℃、20分钟的逆转录反应、再次进行95℃、60秒的预反应后，将95℃、15秒→60℃、15秒→74℃、45分钟重复进行40个循环的程序，从而使用LC96(Roche制)来进行实时PCR。作为酶，使用了Tth DNA聚合酶、改变型Tth DNA聚合酶(Q509K、E744R)。
图4示出RT-PCR的扩增曲线、熔解曲线的结果，表6示出将各自的Cq值、PCR效率汇总而成的结果。野生型的Tth DNA聚合酶的上升慢，反应效率也不足60％，较低，而突变体的上升快，PCR效率也高达70～80％。由于改变的影响而性能提高，因此在用Taq DNA聚合酶不能实施的RT-PCR中，对于具有逆转录能力的Tth DNA聚合酶进行了改变的突变体优点明显。
[表6]
野生型 Q509K E744K
200ng 12.94 12.08 11.75
20ng 17.63 16.33 16.17
2ng 23.59 20.82 19.81
0.2ng 27.72 24.61 23
H2O - - -
斜率 -5.030 -4.208 -3.739
PCR效率 58.1％ 72.8％ 85.1％
R2 0.996 0.999 0.995
实施例7
使用具有逆转录能力的DNA聚合酶的RT-PCR
使用实施例2中制作的DNA聚合酶，实施从RNA起的一步RT-PCR。RT-PCR中，使用KOD-Plus-Ver.2(Toyobo制)附带的缓冲液，向包含1×PCR缓冲液及2.5mM Mn(OAc)2、0.4mMdNTPs、用于扩增β-肌动蛋白的4pmol的引物(序列号10及11)、1/30000倍稀释SYBR(注册商标)GreenI、1U的抗体混合酶的20μl反应液中添加HeLa总RNA并使其达到10ng、1ng、0.1ng、0.01ng，通过在90℃、30秒的预反应后进行60℃、1、5或10分钟的逆转录反应、再次进行95℃、60秒下的预反应、将95℃、15秒→60℃、60秒重复进行45个循环的程序，使用LC96(Roche)进行实时PCR。作为酶，使用Tth DNA聚合酶、改变型Tth DNA聚合酶(Q509R、E774K)。
图5示出将RT-PCR的扩增曲线、熔解曲线、Ct值、PCR效率汇总而成的结果。在野生型的Tth DNA聚合酶的情况下，逆转录时间越短则Ct值的间隔越密，逆转录时间为1分钟时r2为0.947，相当低，PCR效率也为586％，大幅偏离作为合适范围的90～110％。另一方面，在突变体的情况下，即使逆转录时间短，逆转录时间为1分钟时，r2也高达0.998及0.999，PCR效率也为93％及95％，进入了作为合适范围的90～110％内。这是由于改变的影响使得性能提高，在使用Taq DNA聚合酶无法进行的RT-PCR中，对具有逆转录能力的DNA聚合酶进行了改变的优点明显。
实施例8
改变型Tth DNA聚合酶(Q509K、Q509R)的保存稳定性
对使用实施例2中制作的Tth DNA聚合酶(Q509K、Q509R)的Master Mix的保存稳定性实施了评价。作为Master Mix，使用KOD-Plus-Ver.2(Toyobo制)附带的缓冲液并且按照使20μl体系中包含0.4mM dNTPs及1U的抗体混合酶的方式来制备2×Master Mix。将其在-20℃和37℃保存4周，对改变型Tth DNA聚合酶(Q509K、Q509R)的稳定性的差异进行评价。作为评价体系，实施从RNA起的一步RT-PCR。使用所制备的Master Mix，向包含1×Master Mix及2.5mM Mn(OAc)2、10pmol的引物(序列号12及13)、4pmol的探针(序列号14)、1U的抗体混合酶的20μl的反应液中添加625拷贝量的肠道病毒RNA，通过在90℃、30秒的预反应后，进行60℃、5分钟的逆转录反应、再次进行95℃、60秒的预反应后，将95℃、5秒→60℃、5秒重复进行45个循环的程序，使用LC96(Roche制)进行实时PCR。
如表7所示，在37℃、4周的情况下，仅改变型Tth DNA聚合酶(Q509R)确认到扩增，结果是Q509R突变体的稳定性高。我们认为，赖氨酸侧链的氨基的亲核性比精氨酸侧链的胍基高，因此反应性高，从而与缓冲液成分发生化学反应而稳定性降低。
[表7]
-20℃4周 37℃4周
Q509K 32.4 -
Q509R 31.9 34.83
实施例9
由用FTA卡保存的血液直接扩增
使用实施例2中制作的DNA聚合酶，向反应液中直接添加血液而实施PCR。PCR中，使用KOD FX(Toyobo制)附带的缓冲液，将包含1×PCR缓冲液、及0.4mM dNTPs、用于扩增人β-珠蛋白1.3kb的15pmol的引物(序列号15及16)、将附着有血液的FTA卡(GE Healthcare)用φ1.2mm的冲头冲出的1个片、2U的酶的50μl的反应液，通过在94℃、2分钟的预反应后，将94℃、30秒→60℃、10秒→68℃、2分钟重复进行30个循环的程序，使用PCR systemGeneAmp9700(Applied Biosystem制)进行PCR。作为酶，使用混合有抗体的Tth DNA聚合酶、改变型Tth DNA聚合酶(Q509K、Q509R)、Taq DNA聚合酶、及改变型Taq DNA聚合酶(E507K、E507R)。反应结束后，对于5ul的反应液进行1％琼脂糖电泳，进行溴乙锭染色，在紫外线照射下确认扩增DNA片段的扩增量。
图6示出向反应液中添加FTA卡保存的血液(φ1.2mm)并且使用2U的Tth DNA聚合酶、改变型Tth DNA聚合酶(Q509K、Q509R)、Taq DNA聚合酶、及改变型Taq DNA聚合酶(E507K、E507R)、并且通过1％琼脂糖电泳对人β-珠蛋白1.3kb的扩增量进行比较的结果。在野生型的Tth DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、及改变型Taq DNA聚合酶(E507K、E507R)的情况下未见扩增，而在改变型Tth DNA聚合酶(Q509K、Q509R)的情况下可以确认到清晰的条带。FTA卡中包含胍等变性剂以稳定核酸，已知这些会抑制PCR。可知：与Taq DNA聚合酶及其突变体相比，具有逆转录活性的Tth DNA聚合酶的突变体不易由于FTA卡、血液而受到抑制。
实施例10
改变型Tth DNA聚合酶对源自血浆的成分的耐受性
使用实施例2中制作的Tth DNA聚合酶，评价反应液中掺杂有40％的血浆时的影响。作为方法，供给大肠杆菌基因组DNA脉冲而实施实时PCR。PCR中，使用THUNDERBIRD(注册商标)Probe One-step qRT-PCR Kit(Toyobo制)附带的缓冲液，向包含1×PCR缓冲液及4pmol的大肠杆菌特异的引物(序列号17及18)、4pmol的探针(序列号19)、1U的抗体混合酶、血浆8μl的20μl反应液中添加大肠杆菌基因组DNA并且使其达到5ng、0.5ng、0.05ng、0.005ng，通过在95℃、1分钟的预反应后，将95℃、15秒→60℃、15秒重复进行40个循环的程序来进行实时PCR。作为酶，使用Tth DNA聚合酶、改变型Tth DNA聚合酶(Q509R)。
图7示出将RT-PCR的扩增曲线、Ct值、PCR效率汇总而成的结果。野生型的Tth DNA聚合酶受到源自血浆的抑制，r2为0.5801，相当低，PCR效率也为149％，大幅偏离作为合适范围的90～110％。另一方面，在Q509R突变体的情况下，即使逆转录时间短，逆转录时间为1分钟时，r2也高达0.998，PCR效率也为92％，进入了作为合适范围的90～110％。这是由于，由于改变的影响而提高了对源自血浆的成分的耐受性。
实施例11
高速RT-PCR检测
使用实施例2中制作的Tth DNA聚合酶(Q509R)实施从肠道病毒RNA起的一步RT-PCR。RT-PCR中，使用KOD-Plus-Ver.2(Toyobo制)附带的缓冲液，向包含1×PCR缓冲液及2.5mM Mn(OAc)2、0.4mM dNTPs、10pmol的引物(序列号12及13)、4pmol的探针(序列号14)、1U的抗体混合酶的20μl反应液中分别添加肠道病毒RNA并且使其达到2500、625、156、40、24.4拷贝的量，通过在90℃、30秒的预反应后，进行60℃、5分钟的逆转录反应、再次进行95℃、60秒下的预反应、然后将95℃、5秒→60℃、5秒重复进行50个循环的程序，从而使用LC96(Roche制)进行实时PCR。作为酶，使用Tth DNA聚合酶、改变型Tth DNA聚合酶(Q509R)。
如图8所示，改变型Tth DNA聚合酶(Q509R)与野生型Tth DNA聚合酶相比，可以通过高速RT-PCR稳定地检测24.4拷贝的肠道病毒。
实施例12
改变型Tth DNA聚合酶的血液耐受性
使用实施例2中制作的Tth DNA聚合酶实施实时PCR。PCR中，使用THUNDERBIRD(注册商标)Probe One-step qRT-PCR Kit(Toyobo制)附带的缓冲液制备包含1×PCR缓冲液及4pmol的引物(序列号20及21)、4pmol的探针(序列号22)、4U的抗体混合酶、血浆1μl的20μl反应液，通过在95℃、1分钟的预反应后，将95℃、15秒→60℃、60秒重复进行40个循环的程序来进行实时PCR。作为酶，使用Tth DNA聚合酶、改变型Tth DNA聚合酶(Q509R、E744R)。
如图9所示，在野生型Tth DNA聚合酶的情况下未确认到扩增，而改变型Tth DNA聚合酶(Q509R、E744K)的情况下确认由血液进行了扩增。
产业上的可利用性
通过本发明，提供在分子生物学领域中有用的经改变的DNA聚合酶及其组合物。通过本发明，在核酸扩增中反应不会被抑制、而且可以缩短反应时间。本发明在进行基因表达分析时特别有用，不仅可以用于研究用途，也可以用于临床诊断、环境检查等。

Claims (15)

1.一种DNA聚合酶，其特征在于，与序列号1或2的氨基酸序列具有90％以上的同一性的DNA聚合酶中，与第509位相当的氨基酸被置换为精氨酸。
2.一种DNA聚合酶，其特征在于，与序列号1或2的氨基酸序列具有96％以上的同一性的DNA聚合酶中，与第509位相当的氨基酸被置换为精氨酸。
3.一种DNA聚合酶，其特征在于，具有序列号1或2的氨基酸序列的DNA聚合酶中，与第509位相当的氨基酸被置换为精氨酸。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的DNA聚合酶，其在37℃下保存4周时是稳定的。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的DNA聚合酶，其在37℃下保存4周时具有核酸扩增活性。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的DNA聚合酶，其还具有逆转录活性。
7.根据权利要求6所述的DNA聚合酶，其中，逆转录反应在5分钟以下完成。
8.根据权利要求6或7所述的DNA聚合酶，其中，逆转录反应在1分钟以下完成。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的DNA聚合酶，其中，每1kb的延伸时间为30秒以下。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的DNA聚合酶，其中，其用于对未经过纯化工序的生物试样进行扩增。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的DNA聚合酶，其中，所述生物试样为选自由源自血液的试样、唾液、脊髓液、尿及乳汁组成的组中的至少1种试样。
12.一种核酸扩增用试剂，其特征在于，其含有权利要求1～11中任一项所述的DNA聚合酶。
13.根据权利要求12所述的核酸扩增用试剂，其在37℃下保存4周时是稳定的。
14.根据权利要求12或13所述的核酸扩增用试剂，其在37℃下保存4周时具有核酸扩增活性。
15.一种核酸扩增方法，其特征在于，使用权利要求1～11中任一项所述的DNA聚合酶，或使用权利要求12～14中任一项所述的核酸扩增用试剂。
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110023493A (zh) * 2016-11-22 2019-07-16 东洋纺株式会社 经改变的耐热性dna聚合酶
JP7342403B2 (ja) * 2019-03-29 2023-09-12 東洋紡株式会社 改変されたｄｎａポリメラーゼ
JP2020162510A (ja) * 2019-03-29 2020-10-08 東洋紡株式会社 改変されたｄｎａポリメラーゼ
JP7209980B2 (ja) 2020-12-11 2023-01-23 東洋紡株式会社 Ｄｎａポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性ドメインに特異的に結合する抗体
CN114574465B (zh) * 2022-05-09 2022-08-05 上海众启生物科技有限公司 一种聚合酶突变体及其应用
WO2024009873A1 (ja) * 2022-07-08 2024-01-11 東洋紡株式会社 逆転写活性を有する核酸ポリメラーゼ

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3811925A (en) 1971-10-28 1974-05-21 Engelhard Ind Method of applying a hot luster coating to glass by electrostatic means
JPS5852650B2 (ja) 1976-04-10 1983-11-24 信男 秋沢 洗穀装置
US5455170A (en) * 1986-08-22 1995-10-03 Hoffmann-La Roche Inc. Mutated thermostable nucleic acid polymerase enzyme from Thermus species Z05
US6759226B1 (en) * 2000-05-24 2004-07-06 Third Wave Technologies, Inc. Enzymes for the detection of specific nucleic acid sequences
JPH05317058A (ja) * 1992-05-18 1993-12-03 Toyobo Co Ltd 耐熱性ｄｎａポリメラーゼの遺伝情報を有するｄｎａ断片およびその用途
EP1294863B1 (en) * 2000-05-24 2009-07-08 Third Wave Technologies, Inc. Detection of rna
US6875573B2 (en) * 2001-07-06 2005-04-05 Amersham Biosciences Corp DNA polymerases having amino acid substitutions and homologs thereof
US8962293B2 (en) 2006-10-18 2015-02-24 Roche Molecular Systems, Inc. DNA polymerases and related methods
WO2010062777A2 (en) * 2008-11-03 2010-06-03 Kapabiosystems Modified type a dna polymerases
EP2524036B1 (en) * 2009-07-31 2019-06-12 Agilent Technologies, Inc. Thermostable type-a dna polymerase mutants with increased polymerization rate and resistance to inhibitors
US9315787B2 (en) * 2011-01-14 2016-04-19 Kapa Biosystems, Inc. Modified DNA polymerases for improved amplification
US9506045B2 (en) * 2012-12-13 2016-11-29 Roche Molecular Systems, Inc. DNA polymerases with improved activity
JP6969089B2 (ja) * 2015-12-11 2021-11-24 東洋紡株式会社 核酸増幅用組成物及び核酸増幅法
JP6980375B2 (ja) * 2015-12-11 2021-12-15 東洋紡株式会社 核酸増幅用試薬及び核酸増幅法
CN110023493A (zh) * 2016-11-22 2019-07-16 东洋纺株式会社 经改变的耐热性dna聚合酶

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