JP7209980B2 - Dnaポリメラーゼの5’→3’エキソヌクレアーゼ活性ドメインに特異的に結合する抗体 - Google Patents
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Description
[項1]
DNAポリメラーゼの5’→3’エキソヌクレアーゼ活性ドメインに特異的に結合する抗体又はその断片。
[項2]
前記DNAポリメラーゼが、Taqポリメラーゼ、Tthポリメラーゼ、及びZ05ポリメラーゼからなる群から選択される、請求項1に記載の抗体又はその断片。
[項3]
下記式(A-1):
GFXA3XA4XA5XA6XA7XA8 (A-1)
[式中、
XA3はT又はSであり、
XA4はF、L、又はIであり、
XA5はD、N、S、又はTであり、
XA6はD、N、S、T、K、R、又はHであり、
XA7はY、F、又はWであり、
XA8はG、S、T、W、Y又はFである]
で表されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR1と、
下記式(B-1):
IXB2XB3XB4XB5XB6XB7XB8 (B-1)
[式中、
XB2はG、S、T、K、R、H、D、又はNであり、
XB3はF、Y、L、I、G、S、T、D、又はNであり、
XB4はG、S、T、D、N、K、R、又はHであり、
XB5はG、S、T、又はAであり、
XB6はG、S、T、D、又はNであり、
XB7はS、T、F、Y、D、N、K、R、又はHであり、
XB8はS、T、V、L、I、又はMである]
で表されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR2と、
下記式(C-1)~(C-6):
VRXC1XC2XC3GXC4XC5XC6TGFDXC7 (C-1)
VRXC1XC2XC3GXC4XC5XC6FDXC7 (C-2)
XC8RDGALGLAVNWFDXC7 (C-3)
ATSDDYYALNI (C-4)
TTAYYSRYSYYMFDXC7 (C-5)
TTALRDXC7 (C-6)
[式中、
XC1はA、S、D、K、H、又はRであり、
XC2はG、A、D、P、K、H、又はRであり、
XC3はS、T、L、Y、又はIであり、
XC4はA、V、I、R、又はLであり、
XC5はA、V、Y、又はPであり、
XC6はA、V、S、T、又はYであり、
XC7はV、I、L、S、T、又はNであり、
XC8はA又はVである]
のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR3と、
下記式(D-1):
XD1XD2XD3XD4XD5XD6 (D-1)
[式中、
XD1はE、Q、D、又はNであり、
XD2はG、A、S、又はTであり、
XD3はA、V、L、I、又はFであり、
XD4はS、T、K、R、又はHであり、
XD5はS、T、D、N、K、R、又はHであり、
XD6はF、Y、又はWである]
で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1と、
下記式(E-1):
XE1XE2XE3 (E-1)
[式中、
XE1はG、S、T、D、N、F、Y、K、R、又はHであり、
XE2はG、A、S、T、V、L又はIであり、
XE3はK、R、H、D、N、S、又はTである]
で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2と、
下記式(F-1)又は(F-2):
XF1XF2XF3XF4XF5XF6XF7XF8 (F-1)
XF1XF2XF3XF4XF5XF6XF7XF8XF9 (F-2)
[式中、
XF1はL、I、E、Q、F、Y又はWであり、
XF2はD、N、E又はQであり、
XF3はS、T、F、又はYであり、
XF4はG、S、T、F、Y、N又はQであり、
XF5はS、T、N、Q、L又はIであり、
XF6はG、S、T、F、Y、又はWであり、
XF7はS、T、P、Y又はWであり、
XF8はL、I、P、K、R、H、Y、T、又はWであり、
XF9はG、S、T、D又はEである]
で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3と
を含む、抗体又はその断片。
[項3a]
さらに、下記式(E-2):
XE4XE5XE6XE7 (E-2)
[式中、
XE4はG、S、R、H、K、D、N、F、Y、又はTであり、
XE5はL、I、K、H、又はRであり、
XE6はG、A、S、T、P、F、又はYであり、
XE7はG、A、D、N、S、又はTである]
で表されるアミノ酸配列からなる、軽鎖CDR2のC末端に隣接する配列領域を含む、項3に記載の抗体又はその断片。
[項4]
下記式(A-1-1):
GFTFXA51XA61XA71XA81 (A-1-1)
XA51はD、N、又はSであり、
XA61はD、N、S、K、又はHであり、
XA71はY又はWであり、
XA81はG、W、又はYである]
で表されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR1と、
下記式(B-1-1):
IXB21XB31XB41XB51XB61XB71XB81 (B-1-1)
[式中、
XB21はG、S、T、K、又はNであり、
XB31はY、L、G、T、又はNであり、
XB41はG、S、T、D、又はHであり、
XB51はG又はSであり、
XB61はG、S、T、又はDであり、
XB71はS、T、Y、D、又はHであり、
XB81はS、T、V、I、又はMである]
で表されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR2と、
下記式(C-1-1)~(C-6-1):
VRXC11XC21XC31GXC41XC51XC61TGFDXC71 (C-1-1)
VRXC11XC21XC31GXC41XC51XC61FDXC71 (C-2-1)
XC81RDGALGLAVNWFDXC71 (C-3-1)
ATSDDYYALNI (C-4)
TTAYYSRYSYYMFDXC71 (C-5-1)
TTALRDXC71 (C-6-1)
[式中、
XC11はA又はRであり、
XC21はP又はRであり、
XC31はT又はIであり、
XC41はV又はLであり、
XC51はP又はAであり、
XC61はT又はYであり、
XC71はV、T、又はNであり、
XC81はA又はVである]
のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR3と、
下記式(D-1-1):
QXD21XD31XD41XD51XD61 (D-1-1)
[式中、
XD21はG又はSであり、
XD31はV又はIであり、
XD41はS又はKであり、
XD51はS、N、又はKであり、
XD61はF又はYである]
で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1と、
下記式(E-1-1):
XE11XE21XE31 (E-1-1)
[式中、
XE11はG、T、D、Y、又はRであり、
XE21はA、T、又はVであり、
XE31はK、D、N、又はSである]
で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2と、
下記式(F-1-1)又は(F-2-1):
XF11QXF31XF41XF51XF61XF71XF81 (F-1-1)
XF11QXF31XF41XF51XF61XF71XF81T (F-2-1)
[式中、
XF11はL、Q、F、又はYであり、
XF31はS又はYであり、
XF41はG、N、Q、又はYであり、
XF51はS、N、又はIであり、
XF61はG、S、Y、又はWであり、
XF71はS、P、又はWであり、
XF81はL、P、H、Y、又はTである]
で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3と
を含む、抗体又はその断片。
[項4a]
さらに、下記式(E-2-1)又は(E-2-2):
SLXE61S (E-2-1)
XE42XE52XE62XE72 (E-2-2)
[式中、
XE61はA又はPであり、
XE42はR、N、Y、又はTであり、
XE52はL又はRであり、
XE62はA又はYであり、
XE72はS又はTである]
で表されるアミノ酸配列からなる、軽鎖CDR2のC末端に隣接する配列領域を含む、項4に記載の抗体又はその断片。
[項5]
Taqポリメラーゼの5’→3’エキソヌクレアーゼ活性ドメインに特異的に結合する、項3又は4、或いは、3a又は4aに記載の抗体又はその断片。
[項6]
Tthポリメラーゼの5’→3’エキソヌクレアーゼ活性ドメインに特異的に結合する、項3又は4、或いは、3a又は4aに記載の抗体又はその断片。
[項7]
Z05ポリメラーゼの5’→3’エキソヌクレアーゼ活性ドメインに特異的に結合する、項3又は4、或いは、3a又は4aに記載の抗体又はその断片。
[項8]
モノクローナル抗体又はその断片である、項1~7、3a、及び4aのいずれかに記載の抗体又はその断片。
[項8a]
配列番号4~11のいずれかに示されるアミノ酸配列又はこれらのアミノ酸配列において1~3個のアミノ酸が変異しているアミノ酸配列からなる重鎖CDR1と、
配列番号12~20のいずれかに示されるアミノ酸配列又はこれらのアミノ酸配列において1~3個のアミノ酸が変異しているアミノ酸配列からなる重鎖CDR2と、
配列番号21~28のいずれかに示されるアミノ酸配列又はこれらのアミノ酸配列におい
て1~3個のアミノ酸が変異しているアミノ酸配列からなる重鎖CDR3と、
配列番号29~35のいずれかに示されるアミノ酸配列又はこれらのアミノ酸配列において1~3個のアミノ酸が変異しているアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1と、
YTN、YTD、YAD、YAN、DAS、GVK、RAK、GAK、又はTASのいずれかで示されるアミノ酸配列
からなる軽鎖CDR2と、
配列番号42~48のいずれかに示されるアミノ酸配列又はこれらのアミノ酸配列において1~3個のアミノ酸が変異しているアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3と
を含む、項1~8、3a、及び4aのいずれかに記載の抗体又はその断片。
[項8b]
さらに、配列番号36~41のいずれかに示されるアミノ酸配列又はこれらのアミノ酸配列において1~3個のアミノ酸が変異しているアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2のC末端に隣接する配列領域を含む、項8aに記載の抗体又はその断片。
[項8c]
前記変異が保存的置換である、項8a又は8bに記載の抗体又はその断片。
[項9]
項1~8、3a、4a、及び8a~8cのいずれかに記載の抗体の断片であって、Fab、F(ab’)2、又はscFvである断片。
[項10]
項1~8、3a、4a、及び8a~8cのいずれかに記載の抗体又はその断片、或いは、項9に記載の断片を含む試薬。
[項11]
5’→3’エキソヌクレアーゼ活性ドメインを有するDNAポリメラーゼ、プライマー、プローブ、及びデオキシリボヌクレオシド-5’-リン酸からなる群より選択される少なくとも一種を更に含む、項10に記載の試薬。
[項12]
前記DNAポリメラーゼが、Taqポリメラーゼ、Tthポリメラーゼ、及びZ05ポリメラーゼからなる群から選択される、項11に記載の試薬。
[項13]
核酸増幅用試薬である、項11又は12に記載の試薬。
[項14]
DNAポリメラーゼの5’→3’エキソヌクレアーゼ活性ドメインに特異的に結合する抗体又はその断片の製造方法であって、DNAポリメラーゼの一部(ここで、当該一部は5’→3’エキソヌクレアーゼ活性ドメインを含む)からなる免疫原で免疫した動物が産生する抗体から、DNAポリメラーゼの全体に対する結合能を有する抗体を選択する工程Aを含む、製造方法。
[項15]
前記免疫原が、DNAポリメラーゼの5’→3’エキソヌクレアーゼ活性ドメインからなる、項14に記載の製造方法。
[項16]
前記DNAポリメラーゼが、Taqポリメラーゼ、Tthポリメラーゼ、及びZ05ポリメラーゼからなる群から選択される、項14又は15に記載の製造方法。
[項17]
前記免疫原が、Tthポリメラーゼの5’→3’エキソヌクレアーゼ活性ドメインからなる、項14~16のいずれかに記載の製造方法。
[項18]
工程Aが、Tthポリメラーゼの一部(ここで、当該一部は5’→3’エキソヌクレアーゼ活性ドメインを含む)からなる免疫原で免疫した動物が産生する抗体から、Taqポリメラーゼの全体に対する結合能を有する抗体を選択する工程である、項14に記載の製造方法。
[項19]
工程Aが、Tthポリメラーゼの5’→3’エキソヌクレアーゼ活性ドメインからなる免疫原で免疫した動物が産生する抗体から、Taqポリメラーゼの全体に対する結合能を有する抗体を選択する工程である、項14に記載の製造方法。
[項20]
項14~19のいずれかに記載の製造方法によって得られた抗体のアミノ酸配列に基づき、その一部のアミノ酸配列を遺伝子工学的手法により発現させる工程を含む、抗体断片の製造方法。
[項21]
37℃で24時間にわたりDNAポリメラーゼと共存させた場合、該DNAポリメラーゼの5’→3’エキソヌクレアーゼに対する阻害能が60%以上である、項1~8、3a、4a、及び8a~8cのいずれかに記載の抗体又はその断片。
[項22]
25℃で24時間にわたり基質DNA(ここで、基質DNAは一本鎖であっても二本鎖であってもよく、基質DNAはプローブとしての機能を有していてもよい)と5’→3’エキソヌクレアーゼ活性ドメインを有するDNAポリメラーゼとを共存させた場合、該基質DNA分解率が40%以下である、項1~8、3a、4a、8a~8c、及び21のいずれかに記載の抗体又はその断片。
[項23]
5’→3’エキソヌクレアーゼ活性ドメインを有するDNAポリメラーゼと、プライマー、プローブ、及び核酸テンプレートからなる群より選択される少なくとも一種の核酸とを含む組成物を安定化するための試薬であって、項1~8、3a、4a、8a~8c、21、及び22のいずれかに記載の抗体又はその断片、或いは、項9に記載の断片を含む試薬。
[項24]
5’→3’エキソヌクレアーゼ活性ドメインを有するDNAポリメラーゼと、プライマー、プローブ、及び核酸テンプレートからなる群より選択される少なくとも一種の核酸とを含む組成物を安定化する方法であって、項1~8、3a、4a、8a~8c、21、及び22のいずれかに記載の抗体又はその断片、或いは、項9に記載の断片を前記組成物に添加する工程を含む、方法。
本明細書において、アミノ酸は、天然アミノ酸であっても非天然アミノ酸であってもよい。非天然アミノ酸としては、例えばシトルリン、オルニチン、ε-アセチル-リジン、β-アラニン、アミノ安息香酸、6-アミノカプロン酸、アミノ酪酸、ヒドロキシプロリン、メルカプトプロピオン酸、3-ニトロチロシン、ノルロイシン、ピログルタミン酸等が挙げられるが、これらに限定されない。また、アミノ酸は、例えばL-アミノ酸、D-アミノ酸、又はDL-アミノ酸であってもよい。
適にアライメントさせたときのアミノ酸の一致の程度をいう。アミノ酸配列の同一性は、市販の又は電気通信回線(インターネット)を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができ、例えば、市販のソフトウェアGENETYX(株式会社ゼネティックス社)を用いて、又は全米バイオテクノロジー情報センター(NCBI)の相同性アルゴリズムBLAST(Basic local alignment search tool)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)においてデフォルト(初期設定)のパラメータを用いて算出することができる。
本発明の抗体又はその断片は、DNAポリメラーゼのドメインEに特異的に結合することにより、5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を阻害することができ、5’→3’エキソヌクレアーゼ活性阻害剤として有用である。本発明の5’→3’エキソヌクレアーゼ活性阻害剤は抗体であるので、特異性が高く、また加熱等で阻害活性を失活させることもできるのでホットスタート法にも適用させ易いという利点がある。DNAポリメラーゼは、ドメインEを有する限り、特に限定されない。DNAポリメラーゼは、野生型のDNAポリメラーゼであってもよく、該DNAポリメラーゼをコードする遺伝子を任意の宿主細胞へ導入して得られた組換えDNAポリメラーゼであってもよく、該遺伝子を改変したDNAポリメラーゼであってもよい。例えば、DNAポリメラーゼは、野生型ではドメインEを有さないDNAポリメラーゼにドメインEを融合したDNAポリメラーゼであってもよい。
由来のDNAポリメラーゼ(Z05ポリメラーゼ)、Bacillus caldotenax由来のDNAポリメラーゼ(Bcaポリメラーゼ)、Bacillus stearothermophilus由来のDNAポリメラーゼ(Bstポリメラーゼ)、Thermococcus kodakarensis由来のDNAポリメラーゼ(KODポリメラーゼ)、Pyrococcus furiosus由来のDNAポリメラーゼ(Pfuポリメラーゼ)、Pyrococcus woesei由来のDNAポリメラーゼ(Pwoポリメラーゼ)、Thermus brockianus由来のDNAポリメラーゼ(Tbrポリメラーゼ)、Thermus filiformis由来のDNAポリメラーゼ(Tfiポリメラーゼ)、Thermus flavus由来のDNAポリメラーゼ(Tflポリメラーゼ)、Thermotoga maritima由来のDNAポリメラーゼ(Tmaポリメラーゼ)、Thermotoga neapolitana由来のDNAポリメラーゼ(Tneポリメラーゼ)、Thermococcus litoralis由来のDNAポリメラーゼ(Ventポリメラーゼ)、Pyrococcus GB-D由来のDNAポリメラーゼ(DEEPVENTポリメラーゼ)等が挙げられるが、これらに限定されない。なお、Taqポリメラーゼ等の用語には変異体も含まれる。ここで、変異体とは、元のDNAポリメラーゼのアミノ酸配列に対して80%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ポリメラーゼ活性、5’→3’エキソヌクレアーゼ活性、及び耐熱性等の酵素学的性質が維持されているものをいう。変異体のポリメラーゼ活性ドメインは、元のDNAポリメラーゼのポリメラーゼ活性ドメインのアミノ酸配列に対して85%以上(好ましくは90%以上又は95%以上)の同一性を有するアミノ酸配列からなることが好ましい。変異体のドメインEは、元のDNAポリメラーゼのドメインEのアミノ酸配列に対して85%以上(好ましくは90%以上又は95%以上)の同一性を有するアミノ酸配列からなることが好ましい。変異体におけるアミノ酸の変異は保存的置換であることが好ましい。
コールソルビタンモノラウラート(Tween(商標) 20),0.1%(v/v) オ
クチルフェニル-ポリエチレングリコール(Nonidet(商標) P40),50%(v/v) グリセリン)でDNAポリメラーゼ溶液を希釈してから以下のようにして測定を行う。
(1)下記のA液25μl、B液5μl、C液5μl、滅菌水10μl、及びDNAポリメラーゼ溶液5μlをマイクロチューブに加えて75℃にて10分間反応する。
(2)その後氷冷し、E液50μl及びD液100μlを加えて、攪拌後更に10分間氷冷する。
(3)この液をガラスフィルター(ワットマン製GF/Cフィルター)で濾過し、0.1
N 塩酸及びエタノールで十分洗浄する。
(4)フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター(パッカード製)で計測し、鋳型DNAのヌクレオチドの取り込みを測定する。ポリメラーゼ活性の1単位(ユニット)はこの条件で30分当りの10nmolのヌクレオチドを酸不溶性画分(即ち、D液を添加したときに不溶化する画分)に取り込むDNAポリメラーゼ量とする。
A液:40mM Tris-HCl緩衝液(pH7.5)16mM 塩化マグネシウム15mM ジチオスレイトール100μg/mL BSA(牛血清アルブミン)
B液:1.5μg/μl 活性化仔牛胸腺DNA
C液:1.5mM dNTP(250cpm/pmol [3H]dTTP)
D液:20%(w/v) トリクロロ酢酸(2mMピロリン酸ナトリウム)
E液:1mg/mL 仔牛胸腺DNA
配列番号1:
MRGMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFHALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLKALKEDGDAVIVVFDAKAPSFRHEAYGGYKAGRAPTPEDFPRQLALIKELVDLLGLARLEVPGYEADDVLASLAKKAEKEGYEVRILTADKDLYQLLSDRIHVLHPEGYLITPAWLWEKYGLRPDQWADYRALTGDESDNLPGVKGIGEKTARKLLEEWGSLEALLKNLDRLKPAIREKILAHMDDLKLSWDLAKVRTDLPLEVDFAKRREPDRERLRAFLERLEFGSLLHEFGLLESに示されるアミノ酸配列(Taqポリメラーゼ(野生型)のEドメインのアミノ酸配列)、
配列番号2:
MEAMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFFALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLKALKEDGYKAVFVVFDAKAPSFRHEAYEAYKAGRAPTPEDFPRQLALIKELVDLLGFTRLEVPGYEADDVLATLAKKAEKEGYEVRILTADRDLYQLVSDRVAVLHPEGHLITPEWLWEKYGLRPEQWVDFRALVGDPSDNLPGVKGIGEKTALKLLKEWGSLENLLKNLDRVKPENVREKIKAHLEDLRLSLELSRVRTDLPLEVDLAQGREPDREGLRAFLERLEFGSLLHEFGLLEAに示されるアミノ酸配列(Tthポリメラーゼ(野生型)のEドメインのアミノ酸配列)、
配列番号3:
MKAMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFFALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLKALKEDGYKAVFVVFDAKAPSFRHEAYEAYKAGRAPTPEDFPRQLALIKELVDLLGFTRLEVPGFEADDVLATLAKKAEREGYEVRILTADRDLYQLVSDRVAVLHPEGHLITPEWLWEKYGLKPEQWVDFRALVGDPSDNLPGVKGIGEKTALKLLKEWGSLENILKNLDRVKPESVRERIKAHLEDLKLSLELSRVRSDLPLEVDFARRREPDREGLRAFLERLEFGSLLHEFGLLEAに示されるアミノ酸配列(Z05ポリメラーゼ(野生型)のEドメインのアミノ酸配列)、及び
これらのアミノ酸配列に対して80%以上(好ましくは85%以上、90%以上、又は95%以上)の同一性を有するアミノ酸配列
からなる群より選択される少なくとも一種のEドメインに結合することが好ましい。
・表2に示す式(A-1)で表されるアミノ酸配列、
・当該アミノ酸配列に対して90%以上(好ましくは95%以上)の同一性を有するアミノ酸配列、又は
・当該アミノ酸配列の1~3個(好ましくは1又は2個、さらに好ましくは1個)のアミノ酸が変異(好ましくは保存的置換)しているアミノ酸配列。
・表3に示す式(B-1)で表されるアミノ酸配列、
・当該アミノ酸配列に対して90%以上(好ましくは95%以上)の同一性を有するアミノ酸配列、又は
・当該アミノ酸配列の1~3個(好ましくは1又は2個、さらに好ましくは1個)のアミノ酸が変異(好ましくは保存的置換)しているアミノ酸配列。
・表4に示す式(C-1)~(C-6)のいずれかで表されるアミノ酸配列、
・当該アミノ酸配列に対して90%以上(好ましくは95%以上)の同一性を有するアミノ酸配列、又は
・当該アミノ酸配列の1~3個(好ましくは1又は2個、さらに好ましくは1個)のアミノ酸が変異(好ましくは保存的置換)しているアミノ酸配列。
・表5に示す式(D-1)で表されるアミノ酸配列、
・当該アミノ酸配列に対して90%以上(好ましくは95%以上)の同一性を有するアミノ酸配列、又は
・当該アミノ酸配列の1~3個(好ましくは1又は2個、さらに好ましくは1個)のアミノ酸が変異(好ましくは保存的置換)しているアミノ酸配列。
・表6Aに示す式(E-1)で表されるアミノ酸配列、
・当該アミノ酸配列に対して90%以上(好ましくは95%以上)の同一性を有するアミノ酸配列、又は
・当該アミノ酸配列の1~3個(好ましくは1又は2個、さらに好ましくは1個)のアミノ酸が変異(好ましくは保存的置換)しているアミノ酸配列。
・表6Bに示す式(E-2)で表されるアミノ酸配列、
・当該アミノ酸配列に対して90%以上(好ましくは95%以上)の同一性を有するアミノ酸配列、又は
・当該アミノ酸配列の1~3個(好ましくは1又は2個、さらに好ましくは1個)のアミノ酸が変異(好ましくは保存的置換)しているアミノ酸配列。
・表7に示す式(F-1)又は(F-2)で表されるアミノ酸配列、
・当該アミノ酸配列に対して90%以上(好ましくは95%以上)の同一性を有するアミノ酸配列、又は
・当該アミノ酸配列の1~3個(好ましくは1又は2個、さらに好ましくは1個)のアミノ酸が変異(好ましくは保存的置換)しているアミノ酸配列。
I、さらに好ましくはS又はI、或いは、S又はNであり、XF6は好ましくはG、S、Y、又はW、さらに好ましくはG、Y、又はW;S、Y、又はW;或いは、G又はSであり、XF7は好ましくはS、P、又はW、さらに好ましくはP又はW;S又はP;或いはPであり、XF8は好ましくはL、P、H、又はY、さらに好ましくはL、H、Y、又はT、或いは、Pである。
放射性同位元素で標識した基質核酸λDNA;
DNAポリメラーゼ単独(1ユニット(U))、又は、DNAポリメラーゼ(1U)及
び本発明の抗体又はその断片(0.005μg/μL);
10mM Tris-HCl(pH8.6);
50mM KCl;及び
1.5mM MgCl2
を含む溶液を37℃で24時間インキュベートした際に遊離する標識塩基の放射能を測定し、下記式により算出することができる。
5’→3’エキソヌクレアーゼ活性に対する阻害能(%)=(N2-N3)÷(N2-N1)×100
N1:本発明の抗体又はその断片を含まない溶液を37℃で24時間インキュベートする前(又は-20℃で24時間インキュベートした後)の遊離ヌクレオチドの量、或いは、本発明の抗体又はその断片もDNAポリメラーゼも含まない溶液を37℃で24時間インキュベートした後の遊離ヌクレオチドの量
N2:本発明の抗体又はその断片を含まない溶液を37℃で24時間インキュベートした後の遊離ヌクレオチドの量
N3:本発明の抗体又はその断片を含む溶液を37℃で24時間インキュベートした後の遊離ヌクレオチドの量
Aはプローブとしての機能を有していてもよい)とDNAポリメラーゼとを共存させた場合、該DNAポリメラーゼの5’→3’エキソヌクレアーゼ活性に対する阻害能(基質DNA分解阻害能)は、例えば、下記(1)又は(2)の方法で定量的に確認することもできる。
(1)本発明の抗体又はその断片を蛍光標識基質DNA(例えば蛍光標識プローブ)と共存させて、25℃で24時間曝露した反応液と、コントロールの反応液(本発明の抗体又はその断片の非存在下、-20℃で24時間曝露後又は25℃で24時間曝露前の反応液)についてリアルタイムPCRでのCt値を比較する。Ct値の差が小さいほど、DNAポリメラーゼの5’→3’エキソヌクレアーゼ活性に対する阻害能が高いことを意味する。
(2)本発明の抗体又はその断片を蛍光標識基質DNA(例えば蛍光標識プローブ)と共存させて、25℃で24時間曝露した反応液と、コントロールの反応液(本発明の抗体又はその断片の非存在下、-20℃で24時間曝露後又は25℃で24時間曝露前の反応液)についてリアルタイムPCRでのサイクル初期の蛍光強度を比較する。蛍光強度の差が小さいほど、DNAポリメラーゼの5’→3’エキソヌクレアーゼ活性に対する阻害能が高いことを意味する。
下記の成分:
本発明の抗体又はその断片(0.06μg/μL);
配列番号49に記載のTaqポリメラーゼ(0.05U/μL);
ホットスタートPCR用抗ポリメラーゼ抗体(0.01μg/μL);
10mM Tris-HCl(pH8.3);
50mM KCl;
1.5mM MgCl2;
0.3mM dNTPs;
HeLa細胞RNA由来のcDNA(5ng/μL);及び
プライマー及びプローブ溶液(全体の液量の1/20量)
を含む反応液、又は
下記の成分:
本発明の抗体又はその断片(0.06μg/μL);
配列番号50に記載のTthポリメラーゼ又は配列番号55に記載のZ05ポリメラーゼ(0.05U/μL);
ホットスタートPCR用抗ポリメラーゼ抗体(0.01μg/μL);
10mM Tris-HCl(pH8.3);
80mM KCl;
1.5mM MgCl2;
0.5mg/mL BSA;
0.1%(v/v) TritonX-100;
0.1%(w/v) コール酸ナトリウム;
0.3mM dNTPs;
HeLa細胞RNA由来のcDNA(5ng/μL);及び
プライマー及びプローブ溶液(全体の液量の1/20量)
を含む反応液を使用することができる。
Thermo Fisher Scientific株式会社のTaqMan(登録商標) Gene Expression Assays
[遺伝子:
Interleukin 6、Assay ID: Hs00985639_m1(以下
「IL6」と略す)、
cyclin―dependent kinase 10、Assay ID: Hs00177586_m1(以下「CDK10」と略す)、
APC、WNT signaling pathway regulator、Assay ID: Hs01568269_m1(以下「APC」と略す)、
mitogen―activated protein kinase 8、Assay
ID: Hs00177083_m1(以下「MAPK8」と略す)、
SIVA1 apoptosis inducing factor、Assay ID: Hs00276002_m1(以下「SIVA1」と略す)、
ribosomal protein S19、Assay ID: Hs03044115_g1(以下「RPS19」と略す)、又は
serpin family B member 5、Assay ID: Hs00985285_m1(以下「SERPINB5」と略す)]
(a)25℃で24時間曝露前(又は-20℃で24時間曝露後)のCt値/25℃で24時間曝露後のCt値≧0.8
(b)25℃で24時間曝露前(又は-20℃で24時間曝露後)のサイクル初期の蛍光強度/25℃で24時間曝露後のサイクル初期の蛍光強度≧0.3
(式中、サイクル初期の蛍光強度とは、増幅曲線が立ち上がるまでのリアルタイムPCRにおける蛍光強度を指し、サイクル初期とは、通常は1~30サイクル目までをいう)
(c)蛍光標識基質DNA分解率≦40%
(式中、蛍光標識基質DNA分解率は、下記式で算出できる:
蛍光標識基質DNA分解率(%)=(F13-F11)÷(F12-F11)×100
F11:本発明の抗体又はその断片を含まない場合の25℃で24時間曝露前(又は-20℃で24時間曝露後)のサイクル初期の蛍光強度
F12:本発明の抗体又はその断片を含まない場合の25℃で24時間曝露後のサイクル初期の蛍光強度
F13:本発明の抗体又はその断片を含む場合の25℃で24時間曝露後のサイクル初期の蛍光強度)
(3)本発明の抗体又はその断片を基質DNA(例えば二本鎖基質DNA)と共存させて、25℃で24時間曝露した溶液と、コントロールの溶液(本発明の抗体又はその断片の非存在下で-20℃で24時間曝露後又は25℃で24時間曝露前の溶液)についてゲル電気泳動により基質DNAのバンド強度を比較する。バンド強度の差が小さいほど、DNAポリメラーゼの5’→3’エキソヌクレアーゼ活性に対する阻害能が高いことを意味する。
(4)本発明の抗体又はその断片を蛍光標識基質DNA(例えば、少なくとも一方の鎖が
蛍光標識された二本鎖基質DNA)と共存させて、37℃で24時間曝露した反応液と、コントロールの反応液(本発明の抗体又はその断片の非存在下で-20℃で24時間曝露後又は37℃で24時間曝露前の反応液)についてリアルタイムPCRでのサイクル初期の蛍光強度又は分光光度計における蛍光強度を比較する。蛍光強度の差が小さいほど、DNAポリメラーゼの5’→3’エキソヌクレアーゼ活性に対する阻害能が高いことを意味する。
下記の成分:
本発明の抗体又はその断片(0.06μg/μL);
配列番号49に記載のTaqポリメラーゼ(0.05U/μL);
ホットスタートPCR用抗ポリメラーゼ抗体(0.01μg/μL);
10mM Tris-HCl(pH8.3);
50mM KCl;
1.5mM MgCl2;
0.3μM 基質DNA;
を含むもの、又は
下記の成分:
本発明の抗体又はその断片(0.06μg/μL);
配列番号50に記載のTthポリメラーゼ又は配列番号55に記載のZ05ポリメラーゼ(0.05U/μL);
ホットスタートPCR用抗ポリメラーゼ抗体(0.01μg/μL);
10mM Tris-HCl(pH8.3);
50mM KCl;
1.5mM MgCl2;
0.3μM 基質DNA;
を含むものを使用することができる。
(d)基質DNA分解率≦40%
(式中、基質DNA分解率は、下記式で算出できる:
基質DNA分解率(%)=(S11-S13)÷(S11-S12)×100
S11:本発明の抗体又はその断片を含まない場合の25℃で24時間曝露前(又は-20℃で24時間曝露後)のバンド強度
S12:本発明の抗体又はその断片を含まない場合の25℃で24時間曝露後のバンド強度
S13:本発明の抗体又はその断片を含む場合の25℃で24時間曝露後のバンド強度)
(e)蛍光標識基質DNA分解率≦40%
(式中、蛍光標識基質DNA分解率は、下記式で算出できる:
蛍光標識基質DNA分解率(%)=(F23-F21)÷(F22-F21)×100)
F21:本発明の抗体又はその断片を含まない場合の37℃で24時間曝露前(又は-20℃で24時間曝露後)のサイクル初期の蛍光強度
F22:本発明の抗体又はその断片を含まない場合の37℃で24時間曝露後のサイクル初期の蛍光強度
F23:本発明の抗体又はその断片を含む場合の37℃で24時間曝露後のサイクル初期の蛍光強度
サイクル初期:通常は1~30サイクル目
蛍光強度:リアルタイムPCRにおける蛍光強度)
の重鎖CDR1~3のアミノ酸配列に対してそれぞれ80%以上の同一性を有するように設計した抗体遺伝子を組み込んだ発現ベクターを、当該分野で公知の任意の宿主細胞で発現させること等によっても取得することができる。
本発明のポリヌクレオチドは、上記2に記載した抗体又はその断片のコード配列を含むことが好ましい。
本発明の細胞は、上記3に記載したポリヌクレオチドを含むことが好ましい。細胞としては、例えばEscherichia coli K12等の大腸菌、Bacillus
subtilis MI114等のバチルス属細菌、Saccharomyces cerevisiae AH22等の酵母、Spodoptera frugiperda由来のSf細胞系もしくはTrichoplusia ni由来のHighFive細胞系、嗅神経細胞等の昆虫細胞、動物細胞等を挙げることができる。動物細胞としては、好ましくは哺乳動物由来の培養細胞、具体的には、COS7細胞、CHO細胞、HEK293細胞、Expi293細胞、293F細胞、293T細胞、293FT細胞、Hela細胞、PC12細胞、N1E-115細胞、SH-SY5Y細胞等が挙げられる。
本発明の試薬は、上記2に記載した抗体又はその断片、上記3に記載したポリヌクレオチド、又は上記4に記載した細胞を含むことが好ましい。本発明の試薬は、さらに賦形剤もしくは担体及び/又は添加剤を含むことが好ましい。
がなく、より一層のコンタミネーションのリスク低減が可能である。例えば、検出対象とする核酸配列のサブタイプに対応する、それぞれのハイブリダイゼーションプローブを異なる蛍光色素で標識することによって、標的核酸のサブタイプを識別することも可能である。ハイブリダイゼーションプローブとしては、例えば、TaqMan加水分解プローブ[米国特許第5,210,015号公報、米国特許第5,538,848号公報、米国特許第5,487,972号公報、米国特許第5,804,375号公報(参照することによりその全体が明細書に組み込まれる)]、モレキュラービーコン[米国特許第5,118,801号公報(参照することによりその全体が明細書に組み込まれる)]、FRETハイブリダイゼーションプローブ[国際公開第97/46707号、国際公開第97/46712号、国際公開第97/46714号(参照することによりその全体が明細書に組み込まれる)]等が挙げられる。
Sequence-Based Amplification(NASBA)法等が挙げられるが、これらに限定されない。核酸増幅方法は、好ましくはPCR法である。PCR法の中でも、例えば、DNAポリメラーゼに特異的なモノクローナル抗体で所定の温度までプライマーアニーリングを阻害するPCR法、いわゆるホットスタートPCR法が好ましい。本発明のホットスタートPCR用試薬は、DNAポリメラーゼのポリメラーゼ活性ドメインに特異的に結合する抗体及びDNAポリメラーゼのドメインEに特異的に結合する抗体を組み合わせて含むことで一層効果的に非特異反応を抑制できる。本発明のホットスタートPCR用試薬は、プライマー、デオキシリボヌクレオシド-5’-リン酸、DNAポリメラーゼ、DNAポリメラーゼのポリメラーゼ活性ドメインに特異的に結合する抗体、及びDNAポリメラーゼのドメインEに特異的に結合する抗体を含むことが好ましい。当該試薬を、標的核酸を含む試薬に混合し、得られた混合物を60℃以上に加熱(例えば、95℃で20秒以上加熱)して、どちらの抗体も不活性化することでプライマー伸長生成物を形成させることができる。
DNAポリメラーゼ全体を抗原とする場合には、配列番号49のアミノ酸配列を有するTaqポリメラーゼ(TAP-201、東洋紡株式会社、以下、「whole Taq」
と表記する)、及び、配列番号50のアミノ酸配列を有するTthポリメラーゼ(TTH-301、東洋紡株式会社、以下、「whole Tth」と表記する)を使用した。なお、whole Taqとwhole Tthの配列同一性は87%程度である。
exo」と表記する)を、それぞれ、E.coli JM109株を用いて発現させ、ヘパリンセファロースクロマトグラフィーを用いて精製して使用した。いずれの抗原もリン酸緩衝液に溶解した。
Slc:Hartleyモルモット(7週齢のオス)の背部皮下(腰部)に抗原400μgの抗原調製物0.8mLを注射した。抗原調製物は、試験例1で抗原をリン酸緩衝液に溶解させた抗原液とアジュバントTiterMAXGold(TiterMAX社)を1:1(液量比)で混合して、エマルジョン化したものを用いた。3週間後に、さらに抗原400μgの抗原調製物0.8mLを注射して、追加免疫を行った。さらに3週間後に、抗原400μgの抗原液0.4mLを注射して追加免疫を実施した。免疫後のモルモットのリンパ節の腫れは、whole Taq、Taq exo、whole Tth、Tth exoの順に大きくなった。
DNAポリメラーゼ全体、及び、ドメインEを欠損したDNAポリメラーゼをそれぞれ蛍光標識した。ドメインEを欠損したDNAポリメラーゼは、配列番号49においてN末端から289番目までのアミノ酸を欠失させたTaqポリメラーゼ(以下、「ΔTaq」と表記する)、及び、配列番号50においてN末端から291番目までのアミノ酸を欠失させたTthポリメラーゼ(以下、「ΔTth」と表記する)を、それぞれ、E.coli JM109株を用いて発現させ、ヘパリンセファロースクロマトグラフィーを用いて精製したものである。
Ester(Thermo Fisher Scientific社)を用いて蛍光標識を行った。ΔTaq及びΔTthはDyLight(商標)550 NHS Ester(Thermo Fisher Scientific社)を用いて蛍光標識を行った。
米国特許出願公開第2014/031528号、米国特許出願公開第2018/292407号、及び米国特許出願公開第2013/029325号に記載の方法により、試験例2で免疫したモルモットから腸骨リンパ節から細胞懸濁液を調製し、フローサイトメーターを用いてドメインE特異的形質細胞の選抜を行った。免疫に使用した抗原と試験例3で調製した蛍光標識タンパク質との組み合わせを変えて、以下の5種類の方法でドメインE特異的形質細胞の選抜を実施した。
whole Taqで免疫した細胞から、DyLight488標識whole TaqとDyLight550標識ΔTaqを用いて、サブトラクションによりドメインE特異的形質細胞を選抜した。すなわち、DyLight488に対応する蛍光が確認され、DyLight550に対応する蛍光が確認されない形質細胞を選抜した。
Taq exoで免疫した細胞から、DyLight488標識whole Taqを用いて、ドメインE特異的形質細胞を選抜した。
Tth exoで免疫した細胞から、DyLight488標識whole Taqを用いて、ドメインE特異的形質細胞を選抜した。
whole Tthで免疫した細胞から、DyLight488標識whole TthとDyLight550標識ΔTthを用いて、サブトラクションによりドメインE特異的形質細胞を選抜した。すなわち、DyLight488に対応する蛍光が確認され、DyLight550に対応する蛍光が確認されない形質細胞を選抜した。
Tth exoで免疫した細胞について、DyLight488標識whole Tthを用いて、ドメインE特異的形質細胞を選抜した。
米国特許出願公開第2018/292407号に記載の方法により、293FT細胞に抗体発現ベクターを導入し、抗体が分泌された培養上清を回収した。炭酸緩衝液を用いて、市販のホットスタート抗体(TCP-101、東洋紡株式会社製)をELISAプレート(住友ベークライト社、MS-8896F)に固相化した。各ウェルを洗浄後に1%(w/v)ウシ血清アルブミン(グロブリンフリー、ナカライテスク社)を含む1×TBS
(ナカライテスク社)を用いてブロッキングを実施した。各ウェルを洗浄後に1×TBS-T(ナカライテスク社)で希釈した抗原(whole Taq、whole Tth)を各ウェルに添加した。各ウェルを洗浄後に培養上清を各ウェルに添加した。各ウェルを洗浄後に、Goat Anti-Guinea pig IgG H&L (HRP)(Abcam社)を50000倍希釈して添加した。各ウェルを洗浄後に、TMB溶液(TMBW-1000-01、SURMODICS社)を添加して発色させ、1N硫酸(ナカライテスク社)を添加して反応を停止させたのちに、プレートリーダで450~620nmの波長を測定した。本結合能評価では、DNAポリメラーゼ活性ドメインは固相化抗体で占有されているため、ドメインEに対する抗体の結合能が評価される。
ドメインEを有するDNAポリメラーゼを含むPCR反応液を25℃で24時間曝露した場合、プローブが分解されることを確認した。
[PCR用ミックス]
下記に示す組成のPCR用ミックス1を調製した。
PCR用ミックス1:
Taqポリメラーゼ(0.05U/μL、TAP-201、東洋紡株式会社製);
ホットスタートPCR用抗ポリメラーゼ抗体(0.01μg/μL、TCP-101、東洋紡株式会社製);
10mM Tris-HCl(pH8.3);
50mM KCl;
1.5mM MgCl2;及び
0.3mM dNTPs。
20倍濃度のプライマー/プローブ混合液として、TaqMan(登録商標) Gene Expression Assays(Thermo Fisher Scientific社)を使用した。当該混合液中のプライマー/プローブで増幅/検出される遺伝
子は、IL6、CDK10、APC、MAPK8、SIVA1、RPS19、又はSERPINB5である。
HeLa細胞(ヒト子宮頸癌由来)RNAから作製したcDNAを用いた。RNAの抽出及びcDNAの合成には、Human HeLa Cell Total RNA(636543、タカラバイオ株式会社)及びSuperPrep(商標) II Cell
Lysis&RT Kit for qPCR(SCQ-401、東洋紡株式会社)を用い、手順は取扱説明書に従った。
PCR用ミックス1に、各プライマー/プローブを1/20、核酸テンプレートを1/20の割合で混合し、PCR反応液20μLを調製した。PCR反応液を、-20℃又は25℃で24時間保管した。その後、リアルタイムPCR装置(Applied Biosystems 7500 Fast リアルタイムPCRシステム)を使用して、以下の温度サイクルで反応を実施した。60℃、60秒の伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。
(温度サイクル)
工程1:95℃ 1分
工程2:95℃ 15秒-60℃ 60秒 50サイクル(PCR)
本反応系では、FAMチャネルで各遺伝子を検出する。リアルタイムPCRを用いて、HeLa cDNA中の各遺伝子(IL6、CDK10、APC、MAPK8、SIVA1、RPS19、SERPINB5)を検出した際のCt値と、Multicomponent Dataにおける10サイクル目の蛍光値を表9に示す。
ドメインEを有するDNAポリメラーゼ及び抗ドメインE抗体を含むPCR反応液を25℃で24時間曝露した場合、抗ドメインE抗体がプローブの分解を抑制するか否か確認した。
米国特許出願公開第2018/292407号に記載の方法により、293FT細胞に、上記試験例1~4に記載の方法で得られた抗体発現ベクターを導入し、抗体が分泌された培養上清を回収した。AKTA pure 25(Cytiva社)を用いて、培養上清をHiTrap ProteinA HPカラム(Cytiva社)に通して抗体を吸着させた。洗浄Buffer(20mM リン酸緩衝液、pH 7.4)を用いて当該カラムを洗浄した後、溶出Buffer(0.1M クエン酸-NaOH、pH3.5)で溶出させた。Amicon Ultra-15(Merck社)を用いて抗体を濃縮し、Nanodrop One(Thermo Fisher Scientific社)で定量した。クローン番号Anti-TAQ1~5は試験例4の方法3により取得した抗ドメインE抗体であり、クローン番号Anti-TTH1~5は試験例4の方法5により取得した抗ドメインE抗体である。
[PCR用ミックス]
試験例6で使用したPCR用ミックス1と同じものを使用した。さらに、下記の2種類のPCR用ミックス2及び3を調製して使用した。
PCR用ミックス2:
Tthポリメラーゼ(0.05U/μL、TTH-301、東洋紡株式会社製);
ホットスタートPCR用抗ポリメラーゼ抗体(0.01μg/μL、TCP-101、東洋紡株式会社製);
10mM Tris-HCl(pH8.3);
80mM KCl;
1.5mM MgCl2;
0.5mg/mL BSA;
0.1%(v/v) TritonX-100;
0.1%(w/v) コール酸ナトリウム;及び
0.3mM dNTPs。
PCR用ミックス3:
国際公開第2018/096961号に記載のTthポリメラーゼ(変異体)(0.05U/μL);
ホットスタートPCR用抗ポリメラーゼ抗体(0.01μg/μL、TCP-101、東洋紡株式会社製);
10mM Tris-HCl(pH8.3);
80mM KCl;
1.5mM MgCl2;
0.5mg/mL BSA;
0.1%(v/v) TritonX-100;
0.1%(w/v) コール酸ナトリウム;及び
0.3mM dNTPs。
20倍濃度のプライマー/プローブの混合液として、TaqMan(登録商標) Gene Expression Assays(Thermo Fisher Scientific社)を使用した。当該混合液中のプライマー/プローブで増幅/検出される遺伝子はRPS19である。
HeLa細胞(ヒト子宮頸癌由来)RNAから作製したcDNAを用いた。RNAの抽出及びcDNAの合成には、Human HeLa Cell Total RNA(636543、タカラバイオ株式会社)及びSuperPrep(商標) II Cell
Lysis&RT Kit for qPCR(SCQ-401、東洋紡株式会社)を用い、手順は取扱説明書に従った。
(反応液1)
PCR用ミックス1に、プライマー/プローブを1/20、核酸テンプレートを1/20の割合で混合し、混合液19μLを調製した。コントロールとして、20mM Tris-HCl(pH7.5)1μLを前記混合液に添加して、-20℃又は25℃で24時間曝露した。また、同じくコントロールとして、Platinum Taq Monoclonal Antibody(10965-028、Thermo Fisher Scientific社)1μLを前記混合液に添加し、25℃で24時間曝露した。抗ドメインE抗体については、各0.8mg/mL溶液1μLを前記混合液に添加し(持ち込み量:0.8μg)、25℃で24時間曝露した。
(反応液2)
PCR用ミックス2に、プライマー/プローブを1/20、核酸テンプレートを1/20の割合で混合し、混合液19μLを調製した。コントロールとして、20mM Tris-HCl(pH7.5)1μLを前記混合液に添加して、-20℃又は25℃で24時間曝露した。抗ドメインE抗体については、各1.2mg/mL溶液1μLを前記混合液に添加し(持ち込み量:1.2μg)、25℃で24時間曝露した。
(反応液3)
PCR用ミックス3に、プライマー/プローブを1/20、核酸テンプレートを1/20の割合で混合し、混合液19μLを調製した。コントロールとして、20mM Tris-HCl(pH7.5)1μLを前記混合液に添加して、-20℃又は25℃で24時間曝露した。抗ドメインE抗体については、各1.2mg/mL溶液1μLを前記混合液に添加し(持ち込み量:1.2μg)、25℃で24時間曝露した。
(反応)
反応液1~3について、リアルタイムPCR装置(Applied Biosystems 7500 Fast リアルタイムPCRシステム)を使用して、以下の温度サイクルで反応を実施した。60℃、60秒の伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。(温度サイクル)
工程1:95℃ 1分
工程2:95℃ 15秒-60℃ 60秒 50サイクル(PCR)
反応液1、2、及び3について、RPS19遺伝子を検出した際のCt値及びMulticomponent Dataにおける10サイクル目の蛍光値を、表10、11、及び12にそれぞれ示す。また、Anti-TAQ1~5及びAnti-TTH1~5の重鎖(H鎖)相補性決定領域(CDR)1~3、軽鎖(L鎖)相補性決定領域(CDR)1~3の配列、及びL鎖CDR2のC末端に隣接する配列を表13に示す。
(a)Ct値比[-20℃24時間の曝露後(25℃24時間の曝露前に相当)に測定したCt値/25℃24時間の曝露後に測定したCt値]≧0.8
(b)蛍光強度比[-20℃24時間の曝露後(25℃24時間の曝露前に相当)に測定したサイクル初期の蛍光強度/25℃24時間の曝露後に測定したサイクル初期の蛍光強度]≧0.3
(c)プローブ分解率[(F33-F31)÷(F32-F31)×100]≦40%
F31:抗ドメインE抗体の非存在下で-20℃24時間の曝露後(25℃24時間の曝露前に相当)に測定したサイクル初期の蛍光強度
F32:抗ドメインE抗体の非存在下で25℃24時間曝露した後に測定したサイクル初期の蛍光強度
F33:抗ドメインE抗体の存在下で25℃24時間曝露した後に測定したサイクル初期の蛍光強度
このことから、抗ドメインE抗体の全てのクローンがプローブ分解抑制効果を有することを見出した。
PCR反応液の25℃での曝露時間を変化させて、抗ドメインE抗体のプローブ分解抑制効果について確認した。
(1)PCR反応液の構成成分
[PCR用ミックス]
試験例6で使用したPCR用ミックス1と同じものを使用した。
20倍濃度のプライマー/プローブ混合液として、TaqMan(登録商標) Gene Expression Assays(Thermo Fisher Scientific社)を使用した。当該混合液中のプライマー/プローブで増幅/検出される遺伝子はIL6、CDK10、及びRPS19である。
HeLa細胞(ヒト子宮頸癌由来)RNAから作製したcDNAを用いた。RNAの抽
出及びcDNAの合成には、Human HeLa Cell Total RNA(636543、タカラバイオ株式会社)及びSuperPrep(商標) II Cell
Lysis&RT Kit for qPCR(SCQ-401、東洋紡株式会社)を用い、手順は取扱説明書に従った。
(反応液)
PCR用ミックス1に、各プライマー/プローブを1/20、核酸テンプレートを1/20の割合で混合し、混合液19μLを調製した。コントロールとして、20mM Tris-HCl(pH7.5)1μLを前記混合液に添加して、-20℃又は25℃で24時間曝露した。抗ドメインE抗体については、各0.1mg/mL溶液1μLを前記混合液に添加し(持ち込み量:0.1μg)、25℃で24時間曝露した。その後、リアルタイムPCR装置(Applied Biosystems 7500 Fast リアルタイムPCRシステム)を使用して、以下の温度サイクルで反応を実施した。60℃、60秒の伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。
(温度サイクル)
工程1:95℃ 1分
工程2:95℃ 15秒-60℃ 60秒 50サイクル(PCR)
各遺伝子(IL6、CDK10、RPS19)を検出した際のCt値を表14に示す。Tris-HClを添加した反応液を25℃で24時間曝露した場合では、3つの遺伝子で検出不能となった。一方、各抗ドメインE抗体を0.1μg添加した反応液では、Ct値の遅れは確認されず、いずれの遺伝子も検出可能となった。また、当該反応液を25℃で72時間曝露してもCt値の遅れは見られなかった。さらに、蛍光値の上昇も確認されないことから、抗ドメインE抗体の添加によってプローブの分解が抑制されていることが判明した。従って、当該抗体を用いることにより、25℃で72時間の条件下でもPCR反応液の保管が可能になることが確認された。
0.1μgの抗ドメインE抗体を含むPCR反応液を25℃で24時間曝露した場合、プローブの分解が抑制されるか否か確認した。
[PCR用ミックス]
試験例7で使用したPCR用ミックス2と同じものを使用した。
20倍濃度のプライマー/プローブ混合液として、TaqMan(登録商標) Gene Expression Assays(Thermo Fisher Scientific社)を使用した。当該混合液中のプライマー/プローブで増幅/検出される遺伝子はIL6、CDK10、SIVA1、及びRPS19である。
HeLa細胞(ヒト子宮頸癌由来)RNAから作製したcDNAを用いた。RNAの抽出及びcDNAの合成には、Human HeLa Cell Total RNA(636543、タカラバイオ株式会社)及びSuperPrep(商標) II Cell
Lysis&RT Kit for qPCR(SCQ-401、東洋紡株式会社)を用い、手順は取扱説明書に従った。
PCR用ミックス2に、各プライマー/プローブを1/20、核酸テンプレートを1/20の割合で混合し、混合液15μLを調製した。コントロールとして、20mM Tris-HCl(pH7.5)5μLを前記混合液に添加して、-20℃又は25℃で24時間曝露した。抗ドメインE抗体については、各0.1mg/mL溶液1μLを前記混合液に添加し(持ち込み量:0.1μg)、25℃で24時間曝露した。
各反応液について、リアルタイムPCR装置(Applied Biosystems
7500 Fast リアルタイムPCRシステム)を使用して、以下の温度サイクルで反応を実施した。60℃、60秒の伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。
(温度サイクル)
工程1:95℃ 1分
工程2:95℃ 15秒-60℃ 60秒 50サイクル(PCR)
表15に、各遺伝子(IL6、CDK10、SIVA1、RPS19)を検出した際のCt値を示す。
(1)抗体発現プラスミドの作製
Anti-TTH4のCDRを含む抗体配列を設計し、人工合成によりオリゴDNAを取得した。Mammalian PowerExpress System(商標)(MPH-102及びMPL-202、東洋紡株式会社)を用いて、付属の取扱説明書に従い、配列番号53及び54に記載のマウス由来重鎖及び軽鎖定常領域を有する抗体発現プラスミドを作製した。
ExpiCHO(商標) Expression System(Thermo Fisher Scientific社)を用いて、抗体の発現を行った。培養条件は、37
℃、5%(v/v) CO2、80rpmの振盪培養で実施した。付属の取扱説明書に従い、ExpiCHO-S(商標)細胞を蘇生し、生存細胞数2.0×105 cells/mLで振盪培養を行った。生存率が95%に到達するまで継代を継続し、生存細胞数6.0×106 cells/mLの培養液を調製した。培養液25mLに対し、抗体発現プラスミド1.0μg、ExpiFectamine(商標) CHO Reagent
80μLをOptiPro SFM(商標) 2mLで希釈して添加し、37℃、5%(v/v) CO2、80rpmで振盪培養を行った。24時間後にExpiCHO(商標) Enhancer 150μL及びExpiCHO(商標) Feed 6mLを添加して、生存率が50%になるまで37℃、5%(v/v) CO2、80rpmで振盪培養を継続した。
ExpiCHO-S(商標)細胞の培養上清を遠心分離により回収した。AKTA pure 25(Cytiva社)を用いて、培養上清をHiTrap ProteinA
HPカラム(Cytiva社)に通して抗体を吸着させた。洗浄Buffer(20mM リン酸緩衝液、pH 7.4)を用いて当該カラムを洗浄した後、溶出Buffer(0.1M クエン酸-NaOH、pH3.5)で溶出させた。Amicon Ultra-15(Merck社)を用いて抗体を濃縮し、Nanodrop One(Thermo Fisher Scientific社)で定量した。
キメラ抗ドメインE抗体を含むPCR反応液を25℃で24時間曝露した場合、キメラ抗ドメインE抗体がプローブの分解を抑制するか否か確認した。
[PCR用ミックス]
試験例6で使用したPCR用ミックス1及び試験例7で使用したPCR用ミックス2と同じものを使用した。
20倍濃度のプライマー/プローブ混合液として、TaqMan(登録商標) Gene Expression Assays(Thermo Fisher Scientific社)を使用した。当該混合液中のプライマー/プローブで増幅/検出される遺伝子はRPS19である。
HeLa細胞(ヒト子宮頸癌由来)RNAから作製したcDNAを用いた。RNAの抽出及びcDNAの合成には、Human HeLa Cell Total RNA(636543、タカラバイオ株式会社)及びSuperPrep(商標) II Cell
Lysis&RT Kit for qPCR(SCQ-401、東洋紡株式会社)を用い、手順は取扱説明書に従った。
(反応液4及び5)
PCR用ミックス1及び2のそれぞれに、プライマー/プローブを1/20の割合で混合し、混合液18μLを調製した(それぞれ、反応液4及び5に対応)。NanodropTM One(Thermo Fisher Scientific社)で定量した核
酸テンプレートを100、10、1、0.1 ng/μLに希釈し、1μLを前記混合液に添加した(持ち込み量:100、10、1、0.1ng)。コントロールとして、20mM Tris-HCl(pH7.5)1μLを前記混合液に添加して、-20℃又は25℃で24時間曝露した。キメラ抗ドメインE抗体については、0.1mg/mL溶液1μLを前記混合液に添加し(持ち込み量:0.1μg)、25℃で24時間曝露した。その後、リアルタイムPCR装置(Applied Biosystems 7500 Fast リアルタイムPCRシステム)を使用して、以下の温度サイクルで反応を実施した。60℃、60秒の伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。
(温度サイクル)
工程1:95℃ 1分
工程2:95℃ 15秒-60℃ 60秒 50サイクル(PCR)
反応液4については表16、反応液5については表17に、RPS19遺伝子を検出した際のCt値とMulticomponent Dataにおける10サイクル目の蛍光値を示す。
と共存させた場合のプローブの分解抑制
抗ドメインE抗体及びTaqポリメラーゼ(変異体)又はZ05ポリメラーゼを含むPCR反応液を25℃で24時間曝露した場合、抗ドメインE抗体がプローブの分解を抑制するか否か確認した。
[PCR用ミックス]
下記の3種類のPCR用ミックス4~6を調製して使用した。
PCR用ミックス4:
Taqポリメラーゼ(変異体)を含む、QuantiNova Probe RT-PCR Kit(QIAGEN社、208352)
PCR用ミックス5:
Taqポリメラーゼ(変異体)を含む、TaqMan Fast Advanced Master Mix(Thermo Fisher Scientific社、4444556)
PCR用ミックス6:
Z05ポリメラーゼ(0.05U/μL、Roche Diagnostics社、HawkZ05、配列番号55);
ホットスタートPCR用抗ポリメラーゼ抗体(0.01μg/μL、TCP-101、東洋紡株式会社製);
10mM Tris-HCl(pH8.3);
80mM KCl;
1.5mM MgCl2;
0.5mg/mL BSA;
0.1%(v/v) TritonX-100;
0.1%(w/v) コール酸ナトリウム;及び
0.3mM dNTPs。
20倍濃度のプライマー/プローブ混合液として、TaqMan(登録商標) Gene Expression Assays(Thermo Fisher Scientific社)を使用した。当該混合液中のプライマー/プローブで増幅/検出される遺伝子はRPS19である。
HeLa細胞(ヒト子宮頸癌由来)RNAから作製したcDNAを用いた。RNAの抽出及びcDNAの合成には、Human HeLa Cell Total RNA(636543、タカラバイオ株式会社)及びSuperPrep(商標) II Cell
Lysis&RT Kit for qPCR(SCQ-401、東洋紡株式会社)を用い、手順は取扱説明書に従った。
(反応液6~8)
PCR用ミックス4~6のそれぞれに、プライマー/プローブを1/20、核酸テンプレートを1/20の割合で混合し、混合液19μLを調製した(それぞれ、反応液6~8に対応)。コントロールとして、20mM Tris-HCl(pH 7.5)1μLを前記混合液に添加して、-20℃又は25℃で24時間曝露した。抗ドメインE抗体については、0.1mg/mL溶液1μLを前記混合液に添加し(持ち込み量:0.1μg)、25℃で24時間曝露した。その後、リアルタイムPCR装置(Applied Biosystems 7500 Fast リアルタイムPCRシステム)を使用して、以
下の温度サイクルで反応を実施した。60℃の伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。
(PCR用ミックス4を含む反応液6の温度サイクル)
工程1:95℃ 2分
工程2:95℃ 5秒-60℃ 24秒 50サイクル(PCR)
(PCR用ミックス5を含む反応液7の温度サイクル)
工程1:95℃ 20秒
工程2:95℃ 3秒-60℃ 30秒 50サイクル(PCR)
(PCR用ミックス6を含む反応液8の温度サイクル)
工程1:95℃ 60秒
工程2:95℃ 15秒-60℃ 45秒 50サイクル(PCR)
RPS19遺伝子を検出した際のCt値、及び、Multicomponent Dataにおける10サイクル目の蛍光値を、それぞれ、表18及び表19に示す。
取得した抗ドメインE抗体について、Taqポリメラーゼ又はTthポリメラーゼの5’→3’エキソヌクレアーゼ活性に対する阻害能を確認した。
(反応液9)
Taqポリメラーゼ(TAP-201、東洋紡株式会社)1ユニットと、市販のホットスタート抗体Anti-Taq high(TCP-101、東洋紡株式会社)0.2μgとを含むTaq酵素液を作製した。Taqポリメラーゼ酵素液及びAnti-TAQ2
0.1μgの混合液を、5’末端を32Pで放射性標識した基質DNA(9000cpm、計数率80%)を含む反応液(終濃度:10mM Tris-HCl(pH8.6)、50mM KCl、1.5mM MgCl2)に加えて、液量20μLに調製した(サ
ンプル3)。コントロールとして、Taqポリメラーゼ酵素液もAnti-TAQ2も含まないサンプル1、Taqポリメラーゼ酵素液のみを含むサンプル2を用意し、各サンプルを37℃で24時間インキュベートした。その後、各サンプルに10%(w/v)TCA 100μLを添加して、基質DNAを沈殿させ、上清に残留した遊離の32P標識塩基の放射能を測定した。
Tthポリメラーゼ(TTH-301、東洋紡株式会社)1ユニットと、市販のホットスタート抗体Anti-Taq high(TCP-101、東洋紡株式会社)0.6μgとを含むTth酵素液を作製した。Tthポリメラーゼ酵素液及びAnti-TTH4
0.1μgの混合液を、5’末端を32Pで放射性標識した基質DNA(9000cpm、計数率80%)を含む反応液(終濃度:10mM Tris-HCl(pH8.6)、50mM KCl、1.5mM MgCl2)に加えて、液量20μLに調製した(サンプル3)。コントロールとして、Tthポリメラーゼ酵素液もAnti-TTH4も含まないサンプル1、Tthポリメラーゼ酵素液のみを含むサンプル2を用意し、各サンプルを37℃で24時間インキュベートした。その後、各サンプルに10%(w/v)TCA 100μLを添加して、基質DNAを沈殿させ、上清に残留した遊離の32P標識塩基の放射能を測定した。
λDNA 10μg及びScaI(東洋紡株式会社製) 30ユニットを取扱説明書に従って混合した反応液を調製し、37℃で24時間インキュベートした。フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール(液量比25:24:1)処理及びエタノール沈殿によって生じたペレットをTE緩衝液100μLに溶解した。この溶液80μLに、P-32 Adenosine 5’-triphosphate,[γ-32P]-(パーキンエルマー社製、NEG002)5μL、T4 Polynucleotide Kinase(東洋紡株式会社製、PNK-111)5μL、10×Blunt End Kinase Buffer 10μL(東洋紡株式会社製、PNK-111添付品)を添加し、37℃で1時間インキュベートした。フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール(液量比25:24:1)処理及びエタノール沈殿によって生じたペレットをTE緩衝液100μLに溶解した。
反応液9について、Taqポリメラーゼ酵素液もAnti-TAQ2も含まないサンプル1では基質DNAが分解されないので100%とし、Taqポリメラーゼ酵素液のみを含むサンプル2では基質DNAが最も分解されるので0%として、サンプル3の基質DNAの残存率を、5’→3’エキソヌクレアーゼ活性阻害能として算出した結果を表20に示す。Anti-TAQ2の活性阻害能は91%と算出された。
取得した抗ドメインE抗体の添加量を変化させて、Taqポリメラーゼの5’→3’エキソヌクレアーゼ活性に対する阻害能を確認した。
(反応液)
Taqポリメラーゼ(TAP-201、東洋紡株式会社)1ユニットと、市販のホットスタート抗体Anti-Taq high(TCP-101、東洋紡株式会社)0.2μgとを含むTaqポリメラーゼ酵素液を作製した。Taqポリメラーゼ酵素液及びAnti-TAQ2 0.05、0.1、0.2、又は0.4μgの混合液を、5’末端を32Pで放射性標識した基質DNA(9000cpm、計数率80%)を含む反応液(終濃度:10mM Tris-HCl(pH8.6)、50mM KCl、1.5mM MgCl2)に加えて、液量20μLに調製した(サンプル3~6)。コントロールとして、Taqポリメラーゼ酵素液もAnti-TAQ2も含まないサンプル1、Taqポリメラーゼ酵素液のみを含むサンプル2を用意し、各サンプルを37℃で24時間インキュベートした。その後、各サンプルに10%(w/v)TCA 100μLを添加して、基質DNAを沈殿させ、上清に残留した遊離の32P標識塩基の放射能を測定した。
試験例13と同じ基質DNAを使用した。
Taqポリメラーゼ酵素液もAnti-TAQ2も含まないサンプル1では基質DNAが分解されないので100%とし、Taqポリメラーゼ酵素液のみを含むサンプル2では基質DNAが最も分解されるので0%として、サンプル3~6の基質DNAの残存率を、5’→3’エキソヌクレアーゼ活性阻害能として算出した結果を表22に示す。
TaqポリメラーゼのドメインEに特異的に結合する抗体及びTthポリメラーゼを含むPCR反応液を25℃で24時間曝露した場合、前記抗体がTthポリメラーゼのプローブ分解を抑制するか否か確認した。
[PCR用ミックス]
試験例6で使用したPCR用ミックス1及び試験例7で使用したPCR用ミックス2と同じものを使用した。
20倍濃度のプライマー/プローブ混合液として、TaqMan(登録商標) Gene
Expression Assays(Thermo Fisher Scienti
fic社)を使用した。当該混合液中のプライマー/プローブで増幅/検出される遺伝子はIL6、CDK10、SIVA1、RPS19、及びSERPINB5である。
HeLa細胞(ヒト子宮頸癌由来)RNAから作製したcDNAを用いた。RNAの抽出及びcDNAの合成には、Human HeLa Cell Total RNA(製品コード:636543、タカラバイオ株式会社)及びSuperPrep(商標) II Cell Lysis&RT Kit for qPCR(SCQ-401、東洋紡株式会社)を用い、手順は取扱説明書に従った。
PCR用ミックス1又は2に、各プライマー/プローブを1/20の割合で混合し、混合液18μLを調製した。NanodropTM One(Thermo Fisher
Scientific社)で定量した核酸テンプレートを100ng/μLに希釈し、1μLを添加した(持ち込み量:100ng)。コントロールとして、20mM Tris-HCl(pH7.5)1μL添加して、-20℃又は25℃に24時間曝露した。Anti-TAQ2については、0.1mg/mL溶液を4μL添加し(持ち込み量:0.4μg)、25℃に24時間曝露した。その後、リアルタイムPCR装置(Applied Biosystems 7500 Fast リアルタイムPCRシステム)を使用して、以下の温度サイクルで反応を実施した。60℃、45秒の伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。
(温度サイクル)
工程1:95℃ 1分
工程2:95℃ 15秒-60℃ 45秒 50サイクル(PCR)
各遺伝子を検出した際のCt値とMulticomponent Dataにおける10サイクル目の蛍光値を表23に示す。Tris-HClを添加した反応液を25℃で24時間曝露した場合では、各遺伝子を検出できない、もしくはCt値の大幅な遅れ、すなわち検出感度の低下が確認された。一方、Anti-TAQ2を添加した反応液を25℃で24時間曝露した場合、Tris-HClを添加した反応液を-20℃で24時間曝露した場合と同等のCt値で、HeLa cDNAの各遺伝子を検出可能であった。さらに、TaqポリメラーゼとTthポリメラーゼの両方に対して、Anti-TAQ2はプローブ分解の抑制能を示すことが確認された。従って、Tth exoを免疫原とし、whole Taqに対する抗体をスクリーニングする方法3により、TaqとTthの両方に中和活性を有する抗体を取得できることが確認された。
配列番号56及び57に記載のλDNA由来二本鎖基質DNAを設計し、Taqポリメラーゼ又はTthポリメラーゼの5’→3’エキソヌクレアーゼ活性に対する抗ドメインE抗体の阻害能を確認した。
下記の2種類の活性測定用ミックス1及び2を調製して使用した。
活性測定用ミックス1:
Taqポリメラーゼ(0.05U/μL、TAP-201、東洋紡株式会社製);
ホットスタートPCR用抗ポリメラーゼ抗体(0.01μg/μL、TCP-101、東洋紡株式会社製);
10mM Tris-HCl(pH8.6);
50mM KCl;
1.5mM MgCl2;
0.3μM 二本鎖基質DNA;
活性測定用ミックス2:
Tthポリメラーゼ(0.05U/μL、TTH-301、東洋紡株式会社製);
ホットスタートPCR用抗ポリメラーゼ抗体(0.01μg/μL、TCP-101、東洋紡株式会社製);
10mM Tris-HCl(pH8.6);
50mM KCl;
1.5mM MgCl2;
0.3μM 二本鎖基質DNA;
配列番号56及び57に記載のオリゴヌクレオチドを有するλDNA由来二本鎖基質D
NAを設計した。配列番号56及び57に記載のオリゴヌクレオチドはそれぞれ別個に合成し、等量に混合して使用した。
各サンプルを分析した際のバンドの定量値を表24に示す。活性測定ミックス1及び2のいずれにおいても、Tris-HClを添加して25℃で24時間曝露した場合では、-20℃で24時間曝露した場合に比べて、バンドの定量値が著しく低下し、二本鎖基質DNAの分解が確認された。一方で、Anti-TAQ2を添加して25℃で24時間曝露した場合は、Tris-HClを添加して-20℃で24時間曝露した場合と同等のバンドの定量値で、二本鎖基質DNAの分解は確認されなかった。
また、5’→3’エキソヌクレアーゼ活性阻害能を、下記の(d)二本鎖基質DNA分解率を算出することで判断した。
(d)二本鎖基質DNA分解率(%)[(S21-S23)÷(S21-S22)×100]
S21:抗ドメインE抗体を含まない場合の-20℃で24時間曝露後(25℃で24時間曝露前に相当)のバンド強度
S22:抗ドメインE抗体を含まない場合の25℃で24時間曝露後のバンド強度
S23:抗ドメインE抗体を含む場合の25℃で24時間曝露後のバンド強度
Anti-TAQ2を添加して25℃で24時間曝露したサンプルでは、Taqポリメラーゼ及びTthポリメラーゼによる(d)二本鎖基質DNA分解率(%)≦10%と算出された。従って、TaqポリメラーゼとTthポリメラーゼの両方に対して、Anti-TAQ2は二本鎖基質DNA分解の十分な抑制能を示すことが確認された。
TaqポリメラーゼのドメインEに特異的に結合する抗体とDNAポリメラーゼ(Taqポリメラーゼ又はTthポリメラーゼ)とを含むPCR反応液を37℃で24時間曝露した場合、前記抗体がポリメラーゼの蛍光標識二本鎖基質DNA分解を抑制するか否か確認した。
[PCR用ミックス]
下記の2種類のPCR用ミックス7及び8を調製して使用した。
PCR用ミックス7:
Taqポリメラーゼ(0.05U/μL、TAP-201、東洋紡株式会社製);
ホットスタートPCR用抗ポリメラーゼ抗体(0.01μg/μL、TCP-101、東洋紡株式会社製);
10mM Tris-HCl(pH8.6);
50mM KCl;
1.5mM MgCl2;及び
0.3μM 蛍光標識二本鎖基質DNA。
PCR用ミックス8:
Tthポリメラーゼ(0.05U/μL、TTH-301、東洋紡株式会社製);
ホットスタートPCR用抗ポリメラーゼ抗体(0.01μg/μL、TCP-101、東洋紡株式会社製);
10mM Tris-HCl(pH8.6);
50mM KCl;
1.5mM MgCl2;及び
0.3μM 蛍光標識二本鎖基質DNA。
配列番号58及び59に記載のオリゴヌクレオチドを有するλDNA由来蛍光標識二本鎖基質DNAを設計した(ここで、配列番号58の5’末端をFAMで標識し、5’末端をBHQ1で標識した)。配列番号58及び59に記載のオリゴヌクレオチドはそれぞれ別個に合成し、等量に混合して使用した。
コントロールとして、20mM Tris-HCl(pH 7.5)1μLを、PCR用ミックス19μLに添加した反応液を-20℃又は37℃で24時間曝露した。PCR用ミックス19μLに対して0.4mg/mLの抗ドメインE抗体溶液1μL(持ち込み量:0.4μg)を添加した反応液を37℃で24時間曝露した。その後、リアルタイムPCR装置(Applied Biosystems 7500 Fast リアルタイムPCRシステム)を使用して、以下の温度サイクルで反応を実施した。60℃、45秒の伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。
(温度サイクル)
工程1:95℃ 1分
工程2:95℃ 15秒-60℃ 45秒 50サイクル(PCR)
Multicomponent Dataにおける10サイクル目の蛍光値を表25に示す。Tris-HClを添加した反応液を37℃で24時間曝露した場合では、-20℃で24時間曝露した場合に比べて、蛍光値の上昇が確認された。一方、Anti-TAQ2を添加した反応液を37℃で24時間曝露した場合、Tris-HClを添加した反応液を-20℃で24時間曝露した場合と同等で、Taqポリメラーゼ及びTthポリメラーゼ共に蛍光値の上昇は確認されなかった。
具体的には、(e)蛍光標識二本鎖基質DNA分解率は、下記の式で算出できる。
(e)蛍光標識二本鎖基質DNA分解率[(F43-F41)÷(F42-F41)×100)]
F41:抗ドメインE抗体を含まない場合の-20℃で24時間曝露後(37℃24時間の曝露前に相当)の10サイクル目の蛍光強度
F42:抗ドメインE抗体を含まない場合の37℃で24時間曝露後の10サイクル目の蛍光強度
F43:抗ドメインE抗体を含む場合の37℃で24時間曝露後の10サイクル目の蛍光強度
Anti-TAQ2を添加して37℃で24時間曝露したサンプルでは、Taqポリメラーゼ及びTthポリメラーゼ共に(e)蛍光標識二本鎖基質DNA分解率(%)≦10%と算出された。従って、TaqポリメラーゼとTthポリメラーゼの両方に対して、Anti-TAQ2は蛍光標識二本鎖基質DNA分解の十分な抑制能を示すことが確認された。
表面プラズモン共鳴(SPR)を用いて、Tthポリメラーゼに対する抗体の親和性を決定した。測定装置は、Biacore X100装置(Cytiva社)を使用した。ランニング緩衝液は、0.01M HEPES、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.05%(v/v) Surfactant P 20(Cytiva社)を使用した。
(1)アミンカップリングによる固定化
EDC及びNHSを用いて、リガンド(Tthポリメラーゼ)をCM5センサーチップ(Cytiva社)に固定化し、1M ethanolamine hydrochloride溶液でブロッキングを行った。その結果、フローセル1-4上で200-500RUの密度でTthポリメラーゼが固定化された。
(2)相互作用測定
抗体を0.222~81nMの範囲で段階希釈して、フローセル上に添加した。得られたセンサグラムをBiacore X100評価ソフトウェアのBivalent an
alyteモデルにフィッティングさせて、結合速度定数(ka)、解離速度定数(kd)、および平衡解離定数(KD)を決定した。
(3)結果
抗ドメインE抗体としてAnti-TTH2、Anti-TTH4、Anti-TTH5の相互作用を解析した結果を表24に示す。抗ドメインE抗体は、いずれも10nM以下のKDを示した。
Claims (15)
- Taqポリメラーゼ、Tthポリメラーゼ、及びZ05ポリメラーゼからなる群から選択されるDNAポリメラーゼの5’→3’エキソヌクレアーゼ活性ドメインに特異的に結合し、且つ5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を阻害する抗体又はその抗原結合断片であって、下記(1)~(10)のいずれかである抗体又はその抗原結合断片。
(1)配列番号4に示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1と、配列番号12に示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2と、配列番号21に示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3と、配列番号29に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1と、YTNで示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2と、配列番号42で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3とを含む抗体又はその抗原結合断片、
(2)配列番号5に示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1と、配列番号13に示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2と、配列番号22に示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3と、配列番号30に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1と、YTDで示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2と、配列番号43で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3とを含む抗体又はその抗原結合断片、
(3)配列番号6に示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1と、配列番号14に示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2と、配列番号23に示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3と、配列番号31に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1と、YADで示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2と、配列番号43で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3とを含む抗体又はその抗原結合断片、
(4)配列番号7に示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1と、配列番号15に示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2と、配列番号22に示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3と、配列番号31に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1と、YANで示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2と、配列番号44で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3とを含む抗体又はその抗原結合断片、
(5)配列番号5に示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1と、配列番号13に示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2と、配列番号22に示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3と、配列番号31に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1と、YANで示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2と、配列番号43で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3とを含む抗体又はその抗原結合断片、
(6)配列番号8に示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1と、配列番号16に示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2と、配列番号26に示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3と、配列番号32に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1と、DASで示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2と、配列番号45で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3とを含む抗体又はその抗原結合断片、
(7)配列番号9に示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1と、配列番号17に示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2と、配列番号24に示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3と、配列番号33に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1と、GVKで示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2と、配列番号46で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3とを含む抗体又はその抗原結合断片、
(8)配列番号10に示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1と、配列番号18に示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2と、配列番号27に示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3と、配列番号33に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1と、RAKで示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2と、配列番号47で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3とを含む抗体又はその抗原結合断片、
(9)配列番号5に示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1と、配列番号19に示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2と、配列番号25に示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3と、配列番号34に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1と、GAKで示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2と、配列番号46で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3とを含む抗体又はその抗原結合断片、
(10)配列番号11に示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1と、配列番号20に示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2と、配列番号28に示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3と、配列番号35に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1と、TASで示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2と、配列番号48で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3とを含む抗体又はその抗原結合断片。 - Taqポリメラーゼの5’→3’エキソヌクレアーゼ活性ドメインに特異的に結合する、請求項1に記載の抗体又はその抗原結合断片。
- Tthポリメラーゼの5’→3’エキソヌクレアーゼ活性ドメインに特異的に結合する、請求項1に記載の抗体又はその抗原結合断片。
- Z05ポリメラーゼの5’→3’エキソヌクレアーゼ活性ドメインに特異的に結合する、請求項1に記載の抗体又はその抗原結合断片。
- モノクローナル抗体又はその抗原結合断片である、請求項1~4のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。
- 請求項1~5のいずれかに記載の抗体の抗原結合断片であって、Fab、F(ab’)2、又はscFvである抗原結合断片。
- 請求項1~5のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片、或いは、請求項6に記載の抗原結合断片を含む試薬。
- 5’→3’エキソヌクレアーゼ活性ドメインを有し且つTaqポリメラーゼ、Tthポリメラーゼ、及びZ05ポリメラーゼからなる群から選択されるDNAポリメラーゼ、プライマー、プローブ、並びにデオキシリボヌクレオシド-5’-リン酸からなる群より選択される少なくとも一種を更に含む、請求項7に記載の試薬。
- 核酸増幅用試薬である、請求項7又は8に記載の試薬。
- Taqポリメラーゼ、Tthポリメラーゼ、及びZ05ポリメラーゼからなる群から選択されるDNAポリメラーゼの5’→3’エキソヌクレアーゼ活性ドメインに特異的に結合し、且つ5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を阻害する抗体又はその抗原結合断片の製造方法であって、Taqポリメラーゼ、Tthポリメラーゼ、及びZ05ポリメラーゼからなる群から選択されるDNAポリメラーゼの一部(ここで、当該一部は5’→3’エキソヌクレアーゼ活性ドメインを含む)からなる免疫原で免疫した動物(但し、ヒトを除く)が産生する抗体から、Taqポリメラーゼ、Tthポリメラーゼ、及びZ05ポリメラーゼからなる群から選択されるDNAポリメラーゼの全体に対する結合能を有する抗体を選択する工程Aを含む、製造方法。
- 前記免疫原が、Taqポリメラーゼ、Tthポリメラーゼ、及びZ05ポリメラーゼからなる群から選択されるDNAポリメラーゼの5’→3’エキソヌクレアーゼ活性ドメインからなる、請求項10に記載の製造方法。
- 前記免疫原が、Tthポリメラーゼの5’→3’エキソヌクレアーゼ活性ドメインからなる、請求項10又は11に記載の製造方法。
- 工程Aが、Tthポリメラーゼの一部(ここで、当該一部は5’→3’エキソヌクレアーゼ活性ドメインを含む)からなる免疫原で免疫した動物(但し、ヒトを除く)が産生する抗体から、Taqポリメラーゼの全体に対する結合能を有する抗体を選択する工程である、請求項10に記載の製造方法。
- 工程Aが、Tthポリメラーゼの5’→3’エキソヌクレアーゼ活性ドメインからなる免疫原で免疫した動物(但し、ヒトを除く)が産生する抗体から、Taqポリメラーゼの全体に対する結合能を有する抗体を選択する工程である、請求項10に記載の製造方法。
- 請求項10~14のいずれかに記載の製造方法によって得られた抗体のアミノ酸配列に基づき、その一部のアミノ酸配列を遺伝子工学的手法により発現させる工程を含む、抗原結合断片の製造方法。
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