CN116284413B - 一种Taq DNA聚合酶的单克隆抗体F12H12及其应用 - Google Patents

一种Taq DNA聚合酶的单克隆抗体F12H12及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种Taq DNA聚合酶的单克隆抗体F12H12，其重链可变区序列的CDR1序列为SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，CDR2序列为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，CDR3序列为SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；其轻链可变区序列的CDR1序列为SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，CDR2序列为SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，CDR3序列为SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。该抗体在广泛的非扩增温度范围内具有良好的封闭Taq DNA’聚合酶5’‑3聚合活性的效果。

Description

一种Taq DNA聚合酶的单克隆抗体F12H12及其应用
技术领域
本发明涉及一种Taq DNA聚合酶的单克隆抗体F12H12及其应用，属于Taq DNA聚合酶技术领域。
背景技术
Taq DNA聚合酶是最初由Saiki等从温泉中分离的一株水生噬热杆菌(thermusaquaticus)中提取获得，分子量约65kD。此酶能耐高温，在70℃反应2h后其残留活性大于原来的90％，在93℃下反应2h后其残留活性是原来的60％，在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40％；在分子克隆中Taq DNA聚合酶可用于DNA序列测定并可利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)对DNA的特定片段进行体外扩增。在PCR过程中，由于Taq DNA聚合酶在变性步骤中(约94℃)不失活，可直接进入第二轮循环，因此不必每轮循环时重新加入新酶，这使得Taq DNA聚合酶成为PCR反应中的独特用酶。
然而，在PCR预变性前，Taq DNA聚合酶5’-3’外切活性能够引起引物、探针或模板的降解；而其5’-3’聚合活性在PCR预变性前阶段即可引起模板或引物错配而产生非特异性的扩增；非特异性产物在后续的扩增循环中将进一步被放大，从而造成目的产物扩增产量降低，甚至扩增失败。
目前，有效解决上述问题的方法是热启动。热启动是即在PCR预变性阶段可逆地使Taq DNA聚合酶失去活性。目前常用的热启动方法有抗体法、化学修饰法、适体法等。化学修饰法较为常用，活性封闭较为完全、不会引入外源污染，但是其Taq DNA聚合酶活性较难完全激活，需要高温孵育较长时间。而适体法则无法彻底封闭Taq DNA聚合酶活性，当温度升高至45℃以上即可恢复酶活性，很难达到严格的热启动。抗体法是在热启动PCR中，Taq DNA聚合酶抗体与Taq DNA聚合酶可逆性结合，与Taq DNA聚合酶维持动态平衡；高温变性前，Taq DNA聚合酶抗体结合在Taq DNA聚合酶活性位点上，封闭其酶活性；变性阶段，Taq DNA聚合酶抗体失活，Taq DNA聚合酶快速释放。退火阶段，Taq DNA聚合酶抗体恢复活性，封闭Taq DNA聚合酶活性。延伸阶段，Taq DNA聚合酶抗体再次失活，Taq DNA聚合酶以目的基因为模板、引物为出发点合成完整双链DNA。抗体法中应用的Taq DNA聚合酶抗体可以封闭TaqDNA聚合酶活性位点，包括聚合活性位点和外切活性位点，抑制非特异性产物及引物二聚体的产生，提高检测灵敏度、引物与模板的结合效率和目的基因的扩增产率。
但是，现有的Taq DNA聚合酶抗体大多于预变性阶段前的广泛的温度范围(0070℃)内只有较窄的温度范围(如30037℃)内具有较好的聚合酶活性的封闭效果，在其他温度范围内的封闭效果不佳，这也将影响到聚合酶的热启动效果。因此，本领域亟需一种能够在广泛的非扩增温度范围内可以完全抑制Taq DNA聚合酶的聚合活性的Taq DNA聚合酶抗体。
发明内容
本发明提供了Taq DNA聚合酶的单克隆抗体F12H12及其应用，可以有效解决上述问题。
本发明是这样实现的：
一种Taq DNA聚合酶的单克隆抗体F12H12，其重链可变区序列的CDR1序列为SEQID NO:1所示的氨基酸序列，CDR2序列为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，CDR3序列为SEQID NO:3所示的氨基酸序列；其轻链可变区序列的CDR1序列为SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，CDR2序列为SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，CDR3序列为SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。该单克隆抗体F12H12可以特异结合Taq DNA聚合酶，封闭其5’-3’聚合活性和/或5’-3’外切活性，尤其是5’-3’聚合活性，可用于制备热启动Taq DNA聚合酶。
优选地，所述单克隆抗体F12H12的重链可变区序列为SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
优选地，所述单克隆抗体F12H12的轻链可变区序列为SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
优选地，所述单克隆抗体F12H12的重链序列为SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
优选地，所述单克隆抗体F12H12的轻链序列为SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
一种所述的单克隆抗体F12H12在降低Taq DNA聚合酶的非特异性扩增中的应用。所述单克隆抗体F12H12能够在不影响Taq DNA聚合酶活性前提下，在广泛的非扩增温度条件下(0070℃)能够充分封闭Taq DNA聚合酶的活性区域，有效降低非特异性扩增和引物二聚体产生。
一种细胞，其能生产上述的单克隆抗体F12H12，包括不限于杂交瘤、CHO细胞和293细胞
本发明的有益效果是：
本发明单克隆抗体F12H12，在广泛的非扩增温度条件下(0070℃)能够充分封闭Taq DNA聚合酶的活性，其封闭效果均能到达97％以上，能有效降低非特异性扩增和引物二聚体产生。随着温度升高至75℃，单克隆抗体开始与Taq DNA聚合酶解离，恢复Taq DNA聚合酶聚合活性。与未封闭的Taq DNA聚合酶相比，特异性扩增效率显著提高。
本发明抗体酶能很好的扩增出低浓度15copies/反应的样本，相比野生Taq酶，其扩增灵敏度显著提升；扩增CT值与商品抗体酶有一定的升高，但荧光终值有较大提高，说明其扩增效率显著提高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1是本发明实施例2提供的Taq DNA聚合酶单克隆抗体聚合酶活性封闭检测。
图2是本发明实施例3提供的Taq DNA聚合酶抗体外切酶活性封闭检测结果。
图3是是本发明实施例4提供的Taq酶抗体的扩增效果图。
具体实施方式
为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
实施例1
特异结合Taq DNA聚合酶单克隆抗体F12H12的制备过程如下：
1、免疫动物
取8-12周龄的BALB/c小鼠，以100μg/只的含野生型Taq酶蛋白重组抗原与等量福氏完全佐剂充分混匀，注入小鼠腹腔内，每隔2周100μg/只的野生型Taq酶蛋白重组抗原与等量福氏不完全佐剂充分混匀，多次注入小鼠腹腔内加强免疫。经检测小鼠血清(间接ELISA法)滴度在1∶5000以上者可用于融合，融合前3天经小鼠腹腔内再次加强免疫，剂量为50μg/只。
2、饲养细胞的制备
以BALB/c鼠腹腔巨噬细胞作饲养细胞。在融合前1天，BALB/c鼠拉颈处死，75％酒精全身浸泡，超净台内，无菌操作下用剪刀剪开腹部皮肤，暴露腹膜，用注射器腹腔注入RPMI 1640基础培养液5mL，反复冲洗，回收冲洗液，1000rpm，离心5分钟，留沉淀，用含HAT的RPMI 1640完全培养液中重悬，调整细胞浓度1×105个/mL，加入96孔板，150μL/孔，37℃，5％CO2培养过夜。
3、免疫脾细胞的制备
小鼠最后一次免疫三天后，在无菌条件下取出脾脏，置于平皿中，RPMI1640基础培养液冲洗一次，放于小烧杯的尼龙网上磨碎过滤，制成细胞悬液。离心，弃上清，RPMI 1640基础培养液重悬，如此重复三次，计数。
4、细胞融合
(1)取40mL HAT培养液，15mL DMEM无血清培养液和1mL 50％PEG(M12000)分别置于37℃水浴中预温；
(2)分别取小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0(2-5×107个)、上述免疫脾细胞(108个)悬液加入50mL离心管中混匀，并加DMEM无血清培养液至40mL。离心10分钟，倒尽上清液，混匀；
(3)将离心管置于37℃预温的水中，取0.7mL预温的50％PEG溶液，静置90秒钟。立即滴加37℃15mL预温的无血清培养液；
(4)补加DMEM无血清培养液至40mL，离心10分钟，倒尽上清液。加40mL含15％～20％胎牛血清的HAT培养液。用吸管混匀，滴加到已含有饲养细胞的4块96孔细胞培养板的小孔中，每孔2滴，置37℃、7％CO2的培养箱中培养。
5、杂交瘤细胞的选择培养
在细胞融合后第1，3，5，7天用前述的HAT培养液换液培养，选择出真正的杂交细胞。
6、特异性抗体的检测及杂交瘤细胞克隆化
吸取每个培养孔的上清液，用间接ELISA法检测出培养液中含特异性识别Taq酶蛋白重组抗原的抗体的培养孔，筛选得到有较好反应性的抗体F12H12。
经测序，抗体的氨基酸序列如下：
重链CDR1序列：YTIH(SEQ ID NO:1)。
重链CDR2序列：YHPSYYTNYQKFKD(SEQ ID NO:2)。
重链CDR3序列：GRLTAAGNYFY(SEQ ID NO:3)。
轻链CDR1序列：ASQDGNFL(SEQ ID NO:4)。
轻链CDR2序列：YSTLH(SEQ ID NO:5)。
轻链CDR3序列：QQKTLPT(SEQ ID NO:6)。
重链可变区序列为：
EVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTYTIHWIKQRPGQGLE WIGYHPSYYTNYQKFKDKATLTADQSSGTAYMQLSSLTSEDSAVYYCA RGRLTAAGNYFYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:7)。
轻链可变区序列为：
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCASQDGNFLWYQQKPDGTVKLLIY YSTLHGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQKTLPTFGGGTKL ELK(SEQ ID NO:8)。
所述单克隆抗体F12H12的重链序列为：
EVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTYTIHWIKQRPGQGLEWIGYHPSYYTNYQKFKDKATLTADQSSGTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGRLTAAGNYFYWGQGTTLTVSSSTPPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK(SEQID NO:9)。
所述单克隆抗体F12H12的轻链序列为：
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCASQDGNFLWYQQKPDGTVKLLIYYSTLHGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQKTLPTFGGGTKLELKRTDAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(SEQ ID NO:10)。
人工合成上述抗体重链和轻链序列(SEQ ID NO:9和10)(上海生工生物工程股份有限公司)，并插入至pcDNA3.1载体中。按Thermo Fisher公司FreeStyle TM293 ExpressionSystem User Manual操作，转染含重链序列和轻链序列的载体至293-F细胞中，培养并收集细胞培养物上清。
细胞培养物上清经蛋白A亲和层析分离纯化，操作按Cytiva公司handbook:Affinity Chromatography,Vol 1:Antibodies进行。纯化制备得Taq DNA聚合酶单克隆抗体F12H12。
实施例2
特异结合Taq DNA聚合酶单克隆抗体聚合酶活性封闭检测
取Taq DNA聚合酶抗体F12H12和野生型Taq DNA聚合酶，按质量比2:1混匀，制备为抗体-Taq DNA聚合酶(抗体酶)。
取发夹型寡核苷酸探针如下：
5’-TAGCGAAGGATGTGAACCTAATCCCTGCTCCCGCGGCCGATCTGCCGGCC(SEQ ID NO:11)，稀释至100μmol/L。
配制10×PCR buffer：250mmol/L Tris-HCl，50mmol/L(NH4)·SO4，500mmol/LKCl，1％(体积比)Tritonx-100，pH8.8(25℃)，25mmol/L MgCl2，25mmol/L dNTP。
按照下表1配方配制，所有操作在冰上进行，每个实验均有三个重复：
表1
在荧光定量PCR仪上设置不同温度程序，检测不同温度下封闭效果：不同扩增温度为37℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃，扩增时间为16s。
PCR的循环数为120。
荧光采集通道：FAM
将加入反应液的PCR八联管置于荧光定量PCR仪前，按照以上温度分别预热荧光定量PCR仪半小时，开始聚合反应。
反应结束后，根据荧光定量PCR数据，计算第30cycles的荧光值与初始值的差异。检测酶的5’-3’聚合酶活性活性封闭效果＝100％-测试酶的前后荧光差异/野生型酶的前后荧光值差异。
结果如图1所示，由图谱可知经单抗F12H12封闭，在广泛的非扩增温度(0070℃)条件下，其封闭效果均能到达97％以上，能够充分封闭Taq DNA聚合酶的活性。在75℃时，抗体明显失活，聚合酶活性开始释放。
实施例3
特异结合Taq DNA聚合酶单克隆抗体外切酶活性封闭检测
取Taq DNA聚合酶抗体和Taq DNA聚合酶，按质量比2:1混匀，制备为抗体-Taq DNA聚合酶。
取发夹型寡核苷酸探针序列为
5-FAM-CTAGCTC(BHQ)CATGGTCCGTAGGCGTAACGGTCCCGGGTAGATCCCGGTCCGATGGGCCTTAGACTGTC-3’(SEQ ID NO:12)。
稀释至100μmol/L。
配制10×PCR buffer：250mmol/L Tris-HCl，50mmol/L(NH4)·SO4，500mmol/LKCl，1％(体积比)Tritonx-100，pH8.8(25℃)，25mmol/L MgCl2，25mmol/L dNTP。
按照以下表2配方配制，所有操作在冰上进行，每个实验均有三个重复：
表2
在荧光定量PCR仪上设置不同温度程序，37℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃——30s；检测不同温度下封闭效果。PCR 80个循环。
荧光采集通道：FAM
将加入反应液的PCR八联管置于荧光定量PCR仪前，按照以上温度分别预热荧光定量PCR仪半小时，开始反应。
反应结束后，根据荧光定量PCR仪的系统数据，计算第80cycles的荧光值与初始值的差异。检测酶的5’-3’外切酶活性封闭效果＝100％-测试酶的前后荧光差异/野生型酶的前后荧光值差异。
结果如图2所示。由图2可知，抗体F12H12在各温度下的外切酶封闭能力交差，可能是抗体的空间位阻抑制了Taq DNA聚合酶外切活性。
实施例4
q-pcr检测HBV样本扩增效果
合成引物HBV-L，序列为CAATCACTCACCAACCTCCTG
(SEQ ID NO:13)，引物HBV-R，序列为CGGGCAACATACCTTGATAA(SEQ ID NO:14)，探针HBV-P，序列为5’-FAM-CCAATTTGTCCTGGTTATCG(BHQ)-3’(SEQ ID NO:15)。
稀释至100μmol/L。
样本为HBV阳性血清，采用购置于天根生化科技的血清/血浆游离DNA提取试剂盒(货号DP339)提取样本DNA，根据HBV的q-pcr试剂盒测定样本DNA的拷贝数，制备15copies/5μL低浓度样本。
配制10×PCR buffer 2：250mmol/L Tris-HCl，50mmol/L(NH4)·SO4，500mmol/LKCl，1％(体积比)Tritonx-100，pH8.8(25℃)，25mmol/LMgCl2，25mmol/L dNTP，1mmol/LEDTA·2Na。
实验分成三组，分别为抗体酶组、野生Taq酶组及商抗酶组。
抗体酶：取抗体F12H12，浓度为5mg/mL，分别与浓度为0.5mg/mL的野生Taq DNA聚合酶按照2：1的质量比混合均匀，37度孵育30min，即为抗体酶。
野生Taq酶：另取浓度为0.5mg/mL的野生型Taq DNA聚合酶加相同体积的抗体储存缓冲液混合均匀，37度孵育30min。
商抗酶：取现有抗体(购自TAKARA)与浓度为0.5mg/mL的野生Taq DNA聚合酶混合均匀，混合比例为抗体与酶的质量比2：1。
按照以下表3配方配制
表3
在荧光定量PCR仪上设置温度程序如表4所示：
表4
结果如图3所示，抗体酶能很好的扩增出低浓度15copies/反应的样本，相比野生Taq酶，抗体酶扩增灵敏度有很大提升。相比商抗酶，抗体酶扩增CT值有一定提升，但荧光终值有较大提高，说明其扩增效率和灵敏度更高。
以上所述仅为本发明的优选实施方式而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种Taq DNA聚合酶的单克隆抗体F12H12，其特征在于，其重链可变区序列的CDR1序列为SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，CDR2序列为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，CDR3序列为SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；其轻链可变区序列的CDR1序列为SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，CDR2序列为SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，CDR3序列为SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的Taq DNA聚合酶的单克隆抗体F12H12，其特征在于，其重链可变区序列为SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的Taq DNA聚合酶的单克隆抗体F12H12，其特征在于，其轻链可变区序列为SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的Taq DNA聚合酶的单克隆抗体F12H12，其特征在于，其重链序列为SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的Taq DNA聚合酶的单克隆抗体F12H12，其特征在于，其轻链序列为SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
6.一种权利要求1至5任一项所述的单克隆抗体F12H12在降低Taq DNA聚合酶的非特异性扩增中的应用。
7.一种细胞，其特征在于，其能生产权利要求1至5任一项所述的单克隆抗体F12H12。
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Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111560073A (zh) * 2020-07-16 2020-08-21 翌圣生物科技（上海）有限公司 Taq酶5’-3’聚合酶活性封闭单克隆抗体及其应用
WO2021120095A1 (zh) * 2019-12-19 2021-06-24 深圳华大生命科学研究院 抗聚合酶的单克隆抗体及其应用
CN115536748A (zh) * 2021-06-30 2022-12-30 深圳华大生命科学研究院 中和Taq DNA聚合酶聚合活性的单克隆抗体及其应用
CN115806621A (zh) * 2022-11-25 2023-03-17 厦门康基生物科技有限公司 一种Taq DNA聚合酶的单克隆抗体F2B2及其应用
CN115806622A (zh) * 2022-11-25 2023-03-17 厦门康基生物科技有限公司 一种Taq DNA聚合酶的单克隆抗体R8F3及其应用
CN115838429A (zh) * 2022-11-25 2023-03-24 厦门康基生物科技有限公司 一种Taq DNA聚合酶抗体组合及其应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3402826A1 (en) * 2016-01-15 2018-11-21 Thermo Fisher Scientific Baltics UAB Antibodies that bind thermophilic dna polymerases
JP7209980B2 (ja) * 2020-12-11 2023-01-23 東洋紡株式会社 Ｄｎａポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性ドメインに特異的に結合する抗体

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021120095A1 (zh) * 2019-12-19 2021-06-24 深圳华大生命科学研究院 抗聚合酶的单克隆抗体及其应用
CN114787193A (zh) * 2019-12-19 2022-07-22 深圳华大生命科学研究院 抗聚合酶的单克隆抗体及其应用
CN111560073A (zh) * 2020-07-16 2020-08-21 翌圣生物科技（上海）有限公司 Taq酶5’-3’聚合酶活性封闭单克隆抗体及其应用
CN115536748A (zh) * 2021-06-30 2022-12-30 深圳华大生命科学研究院 中和Taq DNA聚合酶聚合活性的单克隆抗体及其应用
CN115806621A (zh) * 2022-11-25 2023-03-17 厦门康基生物科技有限公司 一种Taq DNA聚合酶的单克隆抗体F2B2及其应用
CN115806622A (zh) * 2022-11-25 2023-03-17 厦门康基生物科技有限公司 一种Taq DNA聚合酶的单克隆抗体R8F3及其应用
CN115838429A (zh) * 2022-11-25 2023-03-24 厦门康基生物科技有限公司 一种Taq DNA聚合酶抗体组合及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"hot start" PCR facilitated by a neutralizing monoclonal antibody directed against Taq DNA polymerase;Kellogg DE等;《Biotechniques》;第16卷(第6期);1134-7 *

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