CN117510639A - 抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体及其应用 - Google Patents

抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN117510639A
CN117510639A CN202311417977.9A CN202311417977A CN117510639A CN 117510639 A CN117510639 A CN 117510639A CN 202311417977 A CN202311417977 A CN 202311417977A CN 117510639 A CN117510639 A CN 117510639A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
cdr1
cdr2
cdr3
amino acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202311417977.9A
Other languages
English (en)
Inventor
林育佳
金虹
邓梦林
袁克湖
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhuhai Heavy Chain Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Zhuhai Heavy Chain Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhuhai Heavy Chain Biotechnology Co ltd filed Critical Zhuhai Heavy Chain Biotechnology Co ltd
Priority to CN202311417977.9A priority Critical patent/CN117510639A/zh
Publication of CN117510639A publication Critical patent/CN117510639A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0681—Cells of the genital tract; Non-germinal cells from gonads
    • C12N5/0682—Cells of the female genital tract, e.g. endometrium; Non-germinal cells from ovaries, e.g. ovarian follicle cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1252—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12Y207/07007—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及一种新的抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体或其抗原结合片段，其表现出特异性结合Taq DNA聚合酶的高灵敏度和高特异性，由此能够与Taq DNA聚合酶结合形成稳定且高效封闭的热启动Taq DNA聚合酶，从而避免在低温下进行聚合酶链式反应出现的非特异性扩增，提高PCR反应的特异性和灵敏度。

Description

抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明涉及DNA片段扩增技术领域，具体涉及一种Taq DNA聚合酶的抗体、用于扩增的抗体-酶复合物、以及使用所述复合物进行DNA片段扩增的方法。
背景技术
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的方法，被广泛应用于基因检测、生化试验等领域。Taq DNA聚合酶具有5’-3’端的聚合酶活性，具有良好的耐热性，能够承受PCR的热变性步骤，中途不需要额外进行添加，是一种常用的DNA聚合酶。但是，由于Taq DNA聚合酶在低温条件下也有部分活性，这会导致序列错配和形成引物二聚体，造成DNA片段的非特异扩增。特别是在PCR反应体系配制阶段和预热过程中，Taq DNA聚合酶会催化错配引物延伸或引物二聚体形成，是影响目的片段的合成的主要原因。
使用热启动Taq DNA聚合酶能有效降低DNA片段的非特异合成，热启动Taq DNA聚合酶在低温状态下处于非活性状态，不会引起错配，而在高温阶段才会恢复活性，进行特异性扩增，从而避免错配及形成引物二聚体。
热启动DNA聚合酶可以是用抗体修饰的DNA聚合酶。在低温状态下，Taq DNA聚合酶与其抗体结合，活性受到封闭；经过较高温度热启动一段时间后，Taq DNA聚合酶抗体在高温下变性，并从Taq DNA聚合酶活性中心脱落，Taq DNA聚合酶的活性得到释放，进行扩增反应。通过使用Taq DNA聚合酶抗体封闭Taq DNA聚合酶常温下的活性，从而避免引物错配引起的非特异性扩增，提高扩增特异性，而且抗体修饰的Taq DNA聚合酶需要的热启动时间短，能有效保护模板DNA。但是抗体与酶的结合力易受环境影响，容易出现无效封闭的情况，而且Taq DNA聚合酶突变体种类较多，很难找到适配且能高效封闭的抗体。
因此，需要一种适配且能稳定高效封闭的抗体来修饰热启动Taq DNA聚合酶，从而减少非特异性扩增，提高PCR反应特异性和灵敏度。
发明内容
本发明人用野生型Taq DNA聚合酶免疫小鼠，取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合，由ELISA方法筛选出Taq DNA聚合酶特异结合的杂交瘤细胞株，构建重组抗体，获得重组抗Taq DNA聚合酶的抗体。由此，实现了本发明。
因此，在第一方面，本发明提供了一种抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括轻链互补决定区VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3；其中：
VH CDR1的氨基酸序列由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:28所示；
VH CDR2的氨基酸序列由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:37所示；
VH CDR3的氨基酸序列由SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:38所示；
VL CDR1的氨基酸序列由SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:39所示；
VL CDR2的氨基酸序列由SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:35所示；以及
VL CDR3的氨基酸序列由SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:40所示。
在第二方面，本发明提供了一种核酸分子，其编码第一方面的抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体或其抗原结合片段。
在第三方面，本发明提供了一种载体，其包含第二方面的核酸分子。
在第四方面，本发明提供了一种表达细胞，其包含第二方面的核酸分子或第三方面的载体。
在第五方面，本发明提供了一种热启动Taq DNA聚合酶，其包含第一方面的抗TaqDNA聚合酶单克隆抗体或其抗原结合片段和Taq DNA聚合酶。
在第六方面，本发明提供了一种通过聚合酶链式反应扩增目标DNA序列的方法，所述方法包括使用第五方面的热启动Taq DNA聚合酶来扩增所述目标DNA序列的步骤。
在第七方面，本发明提供了一种用于聚合酶链式反应的试剂盒，其包括：第五方面的热启动Taq DNA聚合酶；以及使用说明。
综上，本发明提供了一种新的抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体或其抗原结合片段，其表现出特异性结合Taq DNA聚合酶的高灵敏度和高特异性，由此能够与Taq DNA聚合酶结合形成稳定且高效封闭的热启动Taq DNA聚合酶。该热启动Taq DNA聚合酶在低温下抑制TaqDNA聚合酶的活性，并且在高温下恢复Taq DNA聚合酶的活性，由此在用于聚合酶链式反应时，能够有效降低在低温条件下的序列错配和引物二聚体的形成，避免DNA片段的非特异性扩增，同时不会影响高温条件下DNA的特异性扩增，提供了PCR反应特异性和灵敏度。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示出了本发明的重组单克隆抗体T1、T3、T5和T8与三种Taq DNA聚合酶以及PfuDNA聚合酶(作为对照)的结合反应结果。
图2示出了本发明的重组单克隆抗体T11、T12、T15和T19与三种Taq DNA聚合酶以及Pfu DNA聚合酶(作为对照)的结合反应结果。
图3示出了根据本发明的一个实施方案制备的抗体-酶复合物的酶活性结果，其中，S1：未经热启动的抗体-Taq WT复合物，S2：未经热启动的抗体-酶Taq 22复合物，S3：未经热启动的抗体-酶KlenTaq10复合物，S4：经热启动的抗体-酶Taq WT复合物，S5：经热启动抗体-酶Taq 22复合物，S6：经热启动抗体-酶KlenTaq10复合物，S7：不加抗体的单酶TaqWT，S8：不加抗体的单酶Taq 22，S9：不加抗体的单酶KlenTaq10，S10：阴性对照，S11：阳性对照。
图4示出了本发明的重组单克隆抗体T8、T9和T11与Taq22酶结合的热启动Taq DNA聚合酶的特异性测试结果。
图5示出了本发明的重组单克隆抗体T8、T9和T11与TaqWT酶结合的热启动Taq DNA聚合酶的特异性测试结果。
图6示出了本发明的重组单克隆抗体T8、T9和T11与KlenTaq10酶结合的热启动TaqDNA聚合酶的特异性测试结果。
具体实施方式
在下文中，将结合附图对本发明进行详细的描述。需理解，以下描述仅以示例方式来对本发明进行说明，而无意于对本发明的范围进行限制，本发明的保护范围以随附权利要求为准。并且，本领域技术人员理解，在不背离本发明的精神和主旨的情况下，可以对本发明的技术方案进行修改。若并未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所述主题所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。在对本发明进行详细描述之前，提供以下定义以更好地理解本发明。
在提供数值范围的情况中，例如浓度范围、百分比范围或比率范围，应当理解，除非上下文另有明确规定，否则在该范围的上限与下限之间的、到下限单位的十分之一的各中间值以及在所述范围内的任何其他所述值或中间值包含在所述主题内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在较小范围中，并且此类实施方案也包括在所述主题内，受限于所述范围中的任何特定排除的极限值。在所述范围包括一个或两个极限值的情况中，排除那些所包括的极限值中的任一个或两个的范围也包括在所述主题中。
在本发明的上下文中，很多实施方案使用表述“包含”、“包括”或者“基本/主要由……组成”。表述“包含”、“包括”或“基本/主要由……组成”通常情况下可以理解为开放式表述，表示不仅包括该表述后面具体列出的各要素、组分、组件、方法步骤等外，还包括其他的要素、组分、组件、方法步骤。另外，在本文中，表述“包含”、“包括”或者“基本/主要由……组成”在某些情况下也可以理解为封闭式表述，表示仅包括该表述后面具体列出的各要素、组分、组件、方法步骤，而不包括任何其他的要素、组分、组件、方法步骤。此时，该表述等同于表述“由……组成”。
为了更好地理解本教导并且不限制本教导的范围，除非另外指出，否则在说明书和权利要求中使用的表示数量、百分比或比例的所有数字以及其他数值在所有情况下都应理解为由术语“约”进行修饰。因此，除非相反地指出，否则在以下说明书和所附权利要求书中阐述的数值参数为近似值，其可以根据寻求获得的所需性质而变化。至少，每个数值参数应该至少根据所报告的有效数字的数值并通过应用普通的舍入技术来进行解释。
如本文所用，术语“抗体”是指通常由两对多肽链(每对具有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链)组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且可以据此分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区(铰链区)连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q))的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为框架区(FR)的区域。对于每条重链或轻链，其可变区各自包含三个CDR，即CDR1、CDR2和CDR3。因此，各VH和VL由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗原结合部位。
将氨基酸分配至各区域或结构域的分配规则在多篇文献中给出了相关定义：Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes ofHealth,Bethesda M.d.(1987and 1991))；Chothia&Lesk J.Mol.Biol.1987；196:901-917；Chothia et al.,Nature 1989；342:878-883；Ehrenmann,Francois,Quentin Kaas,andMarie-PauleLefranc."IMGT/3Dstructure-DB and IMGT/DomainGapAlign:a databaseand a tool for immunoglobulins or antibodies,T cell receptors,MHC,IgSF andMhcSF."Nucleic acids research 2009；38(suppl_1):D301-D307。
CDR的确切边界已根据不同系统不同地限定，Kabat系统不仅提供了可应用于抗体的任何可变区的明确残基编号系统，还提供了限定3个CDR的精确残基边界，这些CDR被称为Kabat CDR；Chothia发现Kabat系统CDR内的某些亚部分尽管在氨基酸序列水平上具有很大多样性，但具有几乎相同的肽主链构象，这些亚部分被称为Chothia CDR，Chothia CDR具有与Kabat CDR重叠的边界。上述重叠的边界又由Padlan和MacCallum描述，CDR边界定义可能不严格遵守上述系统，例如AbM定义。在本文中，可以根据这些系统中任何一种限定CDR，尽管优选实施方案使用Chothia等人的抗体编号系统来定义CDR。
如本文中所使用，术语“单抗”或“单克隆抗体”是指来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片段，也即除可能自发出现的自然突变外的一群完全相同的抗体分子。所述抗体分子可以是免疫球蛋白，无论其是天然免疫球蛋白还是部分或全部通过合成方法获得的免疫球蛋白。所述抗体分子还可以包括具有抗体结合结构域的所有多肽或蛋白质，具有抗体结构域的抗体片段是诸如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd的分子以及双功能抗体。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。多克隆抗体是相对于单克隆抗体而言的，其通常包含至少2种或更多种的不同抗体，这些不同的抗体通常识别抗原上的不同表位。单克隆抗体通常可采用Kohler等首次报道的杂交瘤技术获得(G,Milstein C.Continuouscultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity[J].nature,1975；256(5517):495)，但也可采用重组DNA技术获得(如参见U.S.Patent 4,816,567)。如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”和“单抗”具有相同的含义且可互换使用；术语“多克隆抗体”和“多抗”具有相同的含义且可互换使用；术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用Ala或A表示，。甘氨酸可用Gly或G表示，缬氨酸可用Val或V表示，亮氨酸可用Leu或L表示，异亮氨酸可用Ile或I表示，脯氨酸可用Pro或P表示，苯丙氨酸可用Phe或F表示，酪氨酸可用Tyr或Y表示，色氨酸可用Trp或W表示，丝氨酸可用Ser或S表示，苏氨酸可用Thr或T表示，半胱氨酸可用Cys或C表示，蛋氨酸可用Met或M表示，天冬酰胺可用Asn或N，谷氨酰胺可用Gln或Q表示，天冬氨酸可用Asp或D表示，谷氨酸可用Glu或E表示，赖氨酸可用Lys或K表示，精氨酸可用Arg或R表示，组氨酸可用His或H表示。
如本文所使用的，术语“重组抗体”表示通过分子生物学技术将抗体基因克隆到表达载体中再将该表达载体转染到合适的宿主细胞系中进行表达得到的抗体。重组抗体编码基因可以与天然来源的抗体编码基因完全相同，也可以不完全相同。例如，可以将通过免疫动物获得的抗体的完整编码基因克隆到表达载体中进行表达，由此获得与免疫动物获得的抗体完全相同的抗体，也可以将通过免疫动物获得的抗体的编码可变区(包括重链可变区和轻链可变区)的基因与另一物种(例如人)来源的抗体的编码恒定区的基因一起克隆到表达载体中进行表达，由此获得与包括来自一个物种的重链和轻链可变区序列及来自另一物种的恒定区序列的抗体，例如具有与人恒定区连接的小鼠重链和轻链可变区的抗体。该抗体在本领域中通常被称为“嵌合抗体”。
如本文所使用的，术语“抗原结合片段”是指来自抗体的能够结合抗原的片段及抗体类似物，其通常包括至少部分母体抗体(parental antibody)的抗原结合区或可变区(例如一个或多个CDR)。抗原结合片段保留母体抗体的至少某些结合活性。通常，当基于摩尔来表示活性时，抗原结合片段保留至少10％的母体结合活性。具体地，抗原结合片段保留至少20％、50％、70％、80％、90％、95％或100％或更多的母体抗体对靶标的结合亲和力。抗原结合片段的示例包括但不限于：Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、线性抗体(linear antibody)、单链抗体、纳米抗体、结构域抗体和多特异性抗体。其中，“Fab片段”由一条轻链、一条重链的CH1及可变区组成。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。“Fab’片段”含有一条轻链和一条重链的部分(包含VH结构域、CH1结构域、以及CH1和CH2结构域之间的区域)；由此可在两个Fab’片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成F(ab’)2分子。“Fv区”包含来自重链和轻链二者的可变区，但缺少恒定区。
如本文中使用的，术语“特异性结合”是指两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。
在本发明中，还采用引物对编码抗体的核苷酸序列进行了PCR扩增。在引物序列中，一些位点仅仅涉及单独的一种碱基，如腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)中的任一种，而一些位点却涉及两种、三种或者四种碱基的组合，在这种情况下，这些碱基被称为彼此的简并碱基，其主要是基于密码子的简并性确定的。简并碱基可以用字母R、Y、M、K、S、W、H、B、V、D、N表示，其中，R代表A/G，Y代表C/T，M代表A/C，K代表G/T，S代表C/G，W代表A/T，H代表A/T/C，B代表G/T/C，V代表G/A/C，D代表G/A/T，以及N代表A/T/C/G。
本文中使用的术语序列“同一性”、“一致性”或者“同源性”具有本领域公认的含义，并且可以利用公开的技术计算两个核酸或多肽分子或区域之间序列同一性的百分比。可以沿着多核苷酸或多肽的全长或者沿着该分子的区域测量序列同一性(参见，例如Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，Oxford University Press，NewYork，1988；Biocomputing：Informatics and Genome Projects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis of Sequence Data，Part I，Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，New Jersey，1994；SequenceAnalysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；and SequenceAnalysis Primer，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，M Stockton Press，New York，1991)。虽然存在许多测量两个多核苷酸或多肽之间的同一性的方法，但是术语“同一性”是技术人员公知的在肽或蛋白中适合于保守型氨基酸置换的，并且一般可以进行而不改变所得分子的生物活性。通常，本领域技术人员认识到多肽的非必需区中的单个氨基酸置换基本上不改变生物活性(参见例如Watson et al.，Molecular Biology of the Gene，4thEdition，1987，The Benjamin/Cummings Pub.co.，p.224)。
在本文中，术语“热启动”、“热激活”和“热激”可以互换使用，并且具有本领域通常理解的含义，是指DNA聚合酶在样品温度至少超过一定温度例如至少90℃时才发挥其聚合活性的作用的现象。
如前所述，本发明旨在提供一种抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体。如前所述，本发明人用野生型Taq DNA聚合酶免疫小鼠，取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合，由ELISA方法筛选出能够特异结合Taq DNA聚合酶的杂交瘤细胞株。
因此，在第一方面，本发明提供了一种抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括轻链互补决定区VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3；其中：
VH CDR1的氨基酸序列由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:28所示；
VH CDR2的氨基酸序列由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:37所示；
VH CDR3的氨基酸序列由SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:38所示；
VL CDR1的氨基酸序列由SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:39所示；
VL CDR2的氨基酸序列由SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:35所示；以及
VL CDR3的氨基酸序列由SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:40所示。
在一个具体的实施方案中，所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:1-3所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:4-6所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在又一个具体的实施方案中，所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:7-9所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:10-12所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在又一个具体的实施方案中，所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:3所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在又一个具体的实施方案中，所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:16-18所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:19-21所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在又一个具体的实施方案中，所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:22-24所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:25-27所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在又一个具体的实施方案中，所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:3所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:31所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在又一个具体的实施方案中，所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:34-36所示的轻链互补决定区VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3。
在又一个具体的实施方案中，所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:40所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在又一个具体的实施方案中，所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:1-3所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在又一个具体的实施方案中，所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:18所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:21所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在又一个具体的实施方案中，所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:38所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:31所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在又一个具体的实施方案中，所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:3所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:40所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在又一个具体的实施方案中，所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:12所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在又一个具体的实施方案中，所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:33所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在又一个具体的实施方案中，所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:9所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在又一个具体的实施方案中，所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:38所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:27所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在又一个具体的实施方案中，所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:33所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:12所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在又一个具体的实施方案中，所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在又一个具体的实施方案中，所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:38所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:40所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在又一个具体的实施方案中，所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:24所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:36所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在一个具体的实施方案中，所述抗体为包含可变区和恒定区的完整抗体。对于本发明的抗体而言，可以使用任何框架区(FR)以及任何恒定区。本发明的抗体中使用的FR或恒定区的氨基酸序列可以是作为来源的原FR或恒定区的氨基酸序列，也可以是对原FR或恒定区的氨基酸序列进行1个或多个氨基酸取代、缺失、添加和/或插入等而得到的不同的氨基酸序列。用于支持本发明所述CDR或CDR组的结构通常属于抗体重链或轻链序列或其主要部分，其中所述CDR或CDR组位于与重排免疫球蛋白基因编码的天然存在的VH和VL抗体可变结构域的CDR或CDR组相应的位置上。
在一个具体的实施方案中，所述重链可变区还包含重链框架区HFR1、HFR2、HFR3和HFR4，与VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3从氨基末端到羧基末端按照HFR1、VH CDR1、HFR2、VHCDR2、HFR3、VH CDR3、HFR4的顺序排列。
在一个进一步具体的实施方案中，所述重链框架区HFR1、HFR2、HFR3和HFR4分别具有由SEQ ID NO:41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44所示的序列或与所述序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上、或甚至99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％以上的一致性的序列。
在又一个具体的实施方案中，所述轻链可变区还包含轻链框架区LFR1、LFR2、LFR3和LFR4，其与VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3从氨基末端到羧基末端按照LFR1、VL CDR1、LFR2、VLCDR2、LFR3、VL CDR3、LFR4的顺序排列。
在一个进一步具体的实施方案中，所述轻链框架区LFR1、LFR2、LFR3和LFR4分别具有由SEQ ID NO:45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：48所示的序列或与所述序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上、或甚至99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％以上的一致性的序列。
在一个具体的实施方案中，所述抗体还包括恒定区序列，例如但不限于选自IgG、lgA、IgM、IgE和IgD中任一种的恒定区序列，本领域技术人员能够基于需要进行选择，本文对此并无特别限定。
在又一个具体的实施方案中，所述恒定区序列种属来源可以为大鼠、小鼠、兔、山羊、绵羊、马、狗、牛、猪、鸡、鸭、鹅或人类，但不限于此。
在一个具体的实施方案中，本发明的抗体的恒定区来源于小鼠。
在一些实施方案中，所述恒定区序列种属来源为小鼠。
在第二方面，本发明提供了一种核酸分子，其编码第一方面的抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体或其抗原结合片段。
对于本领域技术人员而言，在知晓某种蛋白例如本发明的抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体的氨基酸序列的情况下，确定其核酸编码序列完全在其能力范围内。此外，为了通过重组方式获得单克隆抗体，可以将所述核酸分子克隆到载体中，并将该载体进一步导入表达细胞中，以利用该表达细胞来表达该抗体蛋白。
在第三方面，本发明提供了一种载体，其包含本发明第二方面的核酸分子。
在一个优选的实施方案中，所述载体可以为质粒载体，例如pEE12、pCAGGS、pTOPO、pcDNA、pTT、pTT3、pEFBOS、pBV、pJV和pBJ。
在一个具体的实施方案中，所述载体为pTOPO载体。
在又一个具体的实施方案中，所述载体为真核表达载体。
在一个优选的实施方案中，所述pcDNA载体可以为pCDNA3.1载体。
在第四方面，本发明提供了一种表达细胞，其包含第二方面的核酸分子或第三方面的载体。
所述表达细胞是通过将上述的核酸分子或上述的载体通过本领域技术人员熟知的分子生物学方法导入宿主细胞内来制备的。
如前所述，本发明人以野生型Taq DNA聚合酶免疫小鼠，取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合，由ELISA方法筛选出能够特异结合Taq DNA聚合酶的杂交瘤细胞株。在筛选出分泌目标抗体的单克隆细胞株后，可以通过逆转录-PCR从细胞株回收重链和轻链可变区cDNA，并选择合适的免疫球蛋白恒定区(例如人恒定区)，然后将所述重链和轻链可变区cDNA以及恒定区cDNA转入宿主细胞诸如COS或CHO细胞中，由此得到本发明的表达目标抗体的表达细胞。
利用上述单克隆抗体和重组DNA技术可以产生保留了原始抗体的特异性的其他抗体或嵌合分子，这些技术可包括将编码抗体免疫球蛋白可变区或互补决定区(CDR)的DNA导入包括不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区外加框架区的真核表达载体中，或者将这两者都导入合适的真核表达载体中，再将所述真核表达载体导入表达细胞例如CHO宿主细胞中，由此来得到各重组抗Taq DNA聚合酶的抗体。
在一个具体的实施方案中，所述表达细胞可以为哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢细胞、小仓鼠肾细胞、猴肾细胞、小鼠胸腺瘤细胞、人胚胎肾细胞。在一个更具体的实施方案中，所述表达细胞可以为例如经SV40转化的猴肾细胞(COS-7，ATCC CRL1651)、人胚胎肾细胞(HEK293或经亚克隆以供在悬浮培养中生长的HEK293细胞，Graham et al.,1977，J.Gen Virol.36：59)、幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL10)、中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR1(CHO，Urlaub et al.,1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77：4216；例如DG44)、小鼠胸腺瘤细胞(NSO)、小鼠睾丸支持细胞(TM4，Mather,1980,Biol.Reprod.23:243-251)、猴肾细胞(CV-1，ATCC CCL70)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)、人宫颈癌细胞(HELA，ATCCCCL2)、犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL34)、水牛鼠肝细胞(BRL3A，ATCC CRL1442)、人肺细胞(W138，ATCC CCL75)、人肝细胞(HepG2，HB8065)、小鼠乳房肿瘤(MMT060562，ATCC CCL51)、TR1细胞(Mather et al.,1982,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68)、MRC5细胞、FS4细胞等，但不限于此。
在第五方面，本发明提供了一种热启动Taq DNA聚合酶，其包含第一方面的抗TaqDNA聚合酶单克隆抗体或其抗原结合片段和Taq DNA聚合酶。
在一个具体的实施方案中，所述抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体或其抗原结合片段与Taq DNA聚合酶的重量比为5:1至1:5。
在一个优选的实施方案中，所述抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体或其抗原结合片段与Taq DNA聚合酶的重量比为2:1至1:2。
在一个更优选的实施方案中，所述抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体或其抗原结合片段与Taq DNA聚合酶的重量比为1:1。
在又一个具体的实施方案中，所述Taq DNA聚合酶包括但不限于野生型Taq DNA聚合酶或其突变体，例如KlenTaq10 DNA聚合酶、Taq22 DNA聚合酶、Klentaq1 DNA聚合酶、Stoffel片段、重组Taq-omni、KT-C3 DNA聚合酶、S-Taq、S-Taq(Δ289)。其中，“野生型TaqDNA聚合酶”(简称Taq WT)是全长Taq DNA聚合酶，包括832个氨基酸。“KlenTaq10 DNA聚合酶”是缺失N端287个氨基酸的突变体，其耐抑制剂的能力相比全长Taq DNA聚合酶提高了10-100倍。“Taq22酶”是对野生型Taq DNA聚合酶的三个位点(E626K、I170L和E708Q)进行突变得到，具有提高的耐抑制能力。
如前所述，本发明的抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体能够特异性结合Taq DNA聚合酶，形成抗体-酶复合物，由此得到热启动Taq DNA聚合酶。在低温状态下，Taq DNA聚合酶与抗Taq DNA聚合酶抗体保持结合，Taq DNA聚合酶的活性受到封闭。经过较高温度热启动一段时间(如95℃热激处理2分钟)后，抗Taq DNA聚合酶抗体在高温下变性，并从Taq DNA聚合酶的活性中心脱落，Taq DNA聚合酶的活性得到释放，进行扩增反应。本发明的热启动TaqDNA聚合酶在低温状态下处于非活性状态，不会引起错配以及引物二聚体的形成，到了高温阶段，Taq DNA聚合酶才恢复活性，从而进行特异性扩增。
在第六方面，本发明提供一种通过聚合酶链式反应扩增目标DNA序列的方法，所述方法包括使用第五方面的热启动Taq DNA聚合酶来扩增所述目标DNA序列的步骤。
在一个具体的实施方案中，所述聚合酶链式反应包括定量实时PCR(qPCR)、反转录-PCR(RT-PCR)、反转录-定量PCR(RT-qPCR)、数字PCR(dPCR)、数字滴定PCR(ddPCR)、微流控PCR等等，但不限于此。
在又一个具体的实施方案中，所述热启动Taq DNA聚合酶在用于聚合酶链式反应之前经热启动以激活。热启动的目的是使热启动Taq DNA聚合酶(即，抗体-酶复合物)中的抗体和酶解离，释放出有活性的单酶。
在一个进一步具体的实施方案中，所述热启动采用至少90℃的温度，例如95℃的温度。
在第七方面，本发明提供了一种用于聚合酶链式反应的试剂盒，其包括：第五方面的热启动Taq DNA聚合酶；以及使用说明。
实施例
在下述实施例中，示出了本发明的抗体的制备方法与相关性质的表征。如无特殊说明，其中采用的试验方法均为常规方法，并且如无特殊说明，下述实施例中所用的试验材料均为自常规化试剂商店购买所得。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。
应注意，本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，而并非旨在限制本发明。上文的发明内容部分以及下文的详细描述仅为具体阐释本发明之目的，无意于以任何方式对本发明进行限制。在不背离本发明的精神和主旨的情况下，本发明的范围由随附的权利要求书确定。
实施例1：抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体的制备
免疫接种：将高纯度Taq DNA聚合酶(WT序列，SEQ ID NO：49)作为免疫原以用于免疫接种小鼠。小鼠选取6-8周龄的雌性BALB/c小鼠。将小鼠免疫接种4次，每次免疫接种间隔2周，免疫剂量为100μg/只小鼠。首次免疫将Taq DNA聚合酶与弗氏完全佐剂(Sigma-Aldrich公司)等体积混合，经背部皮下多点注射，后三次免疫将Taq DNA聚合酶与弗氏不完全佐剂(Sigma-Aldrich公司)等体积混合，经腹腔注射。第四次免疫后7天，对小鼠断尾采血，分离血清，采用间接ELISA方法检测免疫接种小鼠抗血清的抗体效价水平，以观察免疫应答效果。选取血清抗体效价高于1：10000的小鼠进行细胞融合实验，在细胞融合实验前3天用不加佐剂的Taq DNA聚合酶经腹腔注射以进行加强免疫(100μg/只)。
SEQ ID NO:49的序列如下：MRGMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFHALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLKALKEDGDAVIVVFDAKAPSFRHEAYGGYKAGRAPTPEDFPRQLALIKELVDLLGLARLEVPGYEADDVLASLAKKAEKEGYEVRILTADKDLYQLLSDRIHVLHPEGYLITPAWLWEKYGLRPDQWADYRALTGDESDNLPGVKGIGEKTARKLLEEWGSLEALLKNLDRLKPAIREKILAHMDDLKLSWDLAKVRTDLPLEVDFAKRREPDRERLRAFLERLEFGSLLHEFGLLESPKALEEAPWPPPEGAFVGFVLSRKEPMWADLLALAAARGGRVHRAPEPYKALRDLKEARGLLAKDLSVLALREGLGLPPGDDPMLLAYLLDPSNTTPEGVARRYGGEWTEEAGERAALSERLFANLWGRLEGEERLLWLYREVERPLSAVLAHMEATGVRLDVAYLRALSLEVAEEIARLEAEVFRLAGHPFNLNSRDQLERVLFDELGLPAIGKTEKTGKRSTSAAVLEALREAHPIVEKILQYRELTKLKSTYIDPLPDLIHPRTGRLHTRFNQTATATGRLCCCDPNLQNIPVRTPLGQRIRRGFIAEEGWLLVALDYSQIELRVLAHLSGDENLIRVFQEGRDIHTETASWMFGVPREAVDPLMRRAAKTINFGVLYGMSAHRLSQELAIPYEEAQAFIERYFQSFPKVRAWIEKTLEEGRRRGYVETLFGRRRYVPDLEARVKSVREAAERMAFNMPVQGTAADLMKLAMVKLFPRLEEMGARMLLQVHDELVLEAPKERAEAVARLAKEVMEGVYPLAVPLEVEVGIGEDWLSAKE
杂交瘤细胞的建立：融合当天，在无菌条件下取出经免疫接种小鼠的脾脏并将该器官制成单细胞悬液。取小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)与上述经免疫的BALB/c小鼠脾细胞按1：5的比例融合，充分混匀，在与PEG融合前，洗涤细胞两次。加入预热的PEG1500，轻轻振荡，以预热的无血清RPMI-1640培养基洗涤细胞，再用HAT选择性培养基重悬细胞。将该细胞悬液以200μL/孔铺板至96孔培养板中，并且在37℃、5％CO2条件下培养细胞。培养4至7天后，改用HT培养基进行培养，当融合的细胞生长至96孔板的孔的底面积的1/10-1/5时，取上清进行抗体检测。
阳性杂交瘤细胞的筛选：将Taq DNA聚合酶用包被缓冲液(0.05mol/L，pH9.6，PBS)稀释，最终浓度为1μg/mL，以100μL/孔加入至96孔板中，于4℃包被过夜；弃包被液，用磷酸缓冲液(PBST)洗涤3次，拍干；用含2％ BSA的PBST封闭，150μL/孔，于37℃孵育2h，用PBST洗涤3次，拍干；将融合细胞上清、1:1000稀释的免疫小鼠阳性血清(作为阳性对照)和1:1000稀释的小鼠阴性血清(作为阴性对照)以100μL/孔分别加入至相应孔内，于37℃孵育1h，用PBST洗涤3次，拍干；加入1：5000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG(购自Sigma公司)，100μL/孔，于37℃孵育1h，用PBST洗涤3次，拍干；加入四甲基联苯胺(3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine，TMB)底物，100μL/孔，室温避光显色10min；每孔加入50μL的2mol/L硫酸终止反应。
利用酶标仪在450nm波长下检测所有孔的OD450nm值。当阴性血清的OD450nm≤0.1，以测定孔的吸光值OD450nm值是阴性孔OD450nm值的2.1倍以上为阳性作为判断标准。筛选出阳性杂交瘤细胞以进行下一步克隆化。
阳性细胞株克隆化：将分泌抗体的阳性细胞孔取样计数后，稀释成100个细胞/10mL培养基，将稀释的细胞悬液以100μL/孔铺板至96孔细胞培养板，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养。6-7天后，显微镜下可观察到克隆细胞的形成，标记出单个克隆生长孔，取出细胞上清，进行ELISA检测(与上述融合检测相同)，选出阳性的单克隆细胞。对阳性孔细胞进行有限稀释，每次有限稀释后5-6天测定ELISA值，挑取ELISA检测得到的OD450nm阳性值较高的单克隆孔进行有限稀释，直至ELISA测定96孔板全板结果为阳性。挑取阳性值高的单克隆稳定株。最后获得一系列稳定分泌抗Taq DNA聚合酶抗体的细胞株，分别命名为Taq1、Taq2、Taq3、Taq4、Taq5、Taq6、Taq7和Taq8。
实施例2：抗体可变区序列的克隆和测序
从上述杂交瘤细胞株分离总RNA，通过反转录制备cDNA，以从杂交瘤细胞株克隆免疫球蛋白序列，并对上述杂交瘤细胞株抗体可变区序列进行测定。
a.RNA的提取：参照细胞总RNA M5抽提试剂盒(购自北京聚合美生物科技有限公司)说明书，对上述杂交瘤细胞株进行总RNA提取。
b.RNA反转录成为cDNA：参照M5 First Strand cDNA Synthesis Kit聚合美(购自北京聚合美生物科技有限公司)对上一步骤中所提取的总RNA进行反转录，制得cDNA，冻存于-20℃备用。
c.可变区序列的PCR扩增及回收：以上一步骤中所得cDNA为模板，用通用重链引物Mu Ig VH 5′-A和Mu IgG VH 3′-2，通过PCR扩增免疫球蛋白重链(IgH)cDNA；相似地，使用轻链引物Mu IgκVL 5′-A和Mu IgκVL 3′-1，通过PCR扩增免疫球蛋白轻链(IgK)cDNA，将PCR产物进行回收；PCR反应全程使用热稳定性Pfu DNA聚合酶。
d.可变区序列的克隆和序列测定：按照克隆载体pTOPO-Blunt Cloning kit(购自北京聚合美生物科技有限公司)说明书，将重链和轻链可变区基因分别与pTOPO载体进行连接，转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆，交由北京睿博兴科生物技术有限公司进行测序。
对测序得到的杂交瘤细胞株的抗体重链可变区基因序列和轻链可变区基因序列进行分析，重链的互补决定区和轻链的互补决定区序列如下表1所示(依据Chothia编号系统)。
表1：重链和轻链的互补决定区序列
实施例3：重组抗体的制备与纯化
构建重组抗体，通过真核表达制备稳定表达抗体的细胞株，并大规模培养纯化。
具体地，对于抗体的VL和VH基因，将测序得到的CDR与如下表2所示的框架区(FR)序列依次连接，得到重轻链可变区，随后用分子克隆的方法构建出重组抗体真核表达质粒。将该真核表达质粒电转导入CHO宿主细胞，电转后加入压力筛选培养基(50μM MSX)中培养20天，然后取上清进行ELISA检测(用HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗进行筛选，方法同上)筛选出稳定表达的重组抗体细胞株。
表2：重组抗体的框架区序列
将筛选出的稳转细胞株采用细胞滚瓶培养技术进行细胞大规模培养，进行重组抗体制备。用培养基(Vega CHO)将细胞以(0.2-0.3)×106cells/mL接种于滚瓶中，1L滚瓶含300mL培养基(Vega CHO)，根据生产需求决定接种瓶数量，将接种细胞的滚瓶放入细胞转瓶机中在细胞培养箱中培养。培养条件为900转/小时，温度为37℃，二氧化碳为5％。培养7-9天后取样显微镜下观察，当细胞活率小于50％，离心收样。将样品用protein A亲和层析柱进行亲和纯化后得到抗体，即为重组单克隆抗体T1-T8。注意：重组单克隆抗体T1-T8的各重链和轻链CDR分别对应于前文通过杂交瘤产生的单克隆抗体Taq1-8的各重链和轻链CDR。
利用微量分光光度计测定各单克隆抗体的浓度，结果发现，单克隆抗体T1-T8的浓度均大于4mg/mL。对各单克隆抗体进行分装，于4℃-8℃保存。
用SDS-PAGE电泳鉴定上述单克隆抗体，抗体具有约51KD的抗体重链条带和约26KD的抗体轻链条带。
纯度检测：用体积排阻色谱(SEC-HPLC)分析单克隆抗体，在保证待测样品中所有组分均出峰的情况下，利用峰面积归一法计算出主峰的纯度百分比，纯度均达到大于98％。
实施例4：抗体与Taq DNA聚合酶的结合能力
用pH 9.6的0.05mol/L碳酸盐缓冲液稀释Taq DNA聚合酶，使其浓度为1μg/mL，以100μL/孔加入至96孔酶标板，于4℃包被过夜，在自动洗板机上用PBST洗涤3次，拍干。用含2％ BSA的PBST封闭，150μL/孔，于37℃孵育2h，用PBST洗涤3次，拍干。用pH7.4、0.02M的PBS缓冲液对抗Taq DNA聚合酶重组单克隆抗体进行梯度稀释，抗体起始浓度为5ug/mL，依次按三倍进行梯度稀释，得到一系列不同浓度的单克隆抗体样品。将稀释好的单克隆抗体样品以100μL/孔加入至上述酶标板，于37℃孵育1h，洗涤3次，拍干。加入1：15000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG(购自Sigma)，100μL/孔，于37℃孵育1h，用PBST洗涤3次，拍干。TMB底物以100μL/孔加入，于室温避光显色10min。以50μL/孔加入2mol/L硫酸终止反应。经酶标仪测定OD450nm值并相对于抗体浓度作图，如图1所示。由图1可知，重组单克隆抗体T1、T3、T5、T8与三种Taq DNA聚合酶均能结合，与Pfu DNA聚合酶(作为对照)不结合，这说明本发明抗体具有出色的特异性。通过软件分析上述ELISA结果，获得重组单克隆抗体的EC50值，结果如下表3所示。
表3：各重组单克隆抗体与各Taq DNA聚合酶结合的EC50值
Taq WT KlenTaq10 Taq22
T1 0.292 0.298 0.268
T2 0.318 0.308 0.423
T3 0.213 0.199 0.206
T4 0.526 0.552 0.486
T5 0.238 0.227 0.231
T6 0.219 0.198 0.201
T7 0.238 0.212 0.215
T8 0.204 0.210 0.208
另外，还通过基因重组技术，上述八个单克隆抗体的CDR进行重新组合，并采用表2给出的框架区序列，构建了另外一系列重组抗体，同样将抗体的重链与轻链基因表达质粒电转导入CHO宿主细胞，并对重组抗体进行筛选，筛选出一系列可以与Taq DNA聚合酶结合的重组抗体T9-T20，其中各重组抗体的各重链CDR和轻链CDR的序列如下表4所示。
表4：重组抗体序列CDR序列
VH CDR1 VH CDR2 VH CDR3 VL CDR1 VL CDR2 VL CDR3
T9 1 2 3 15 5 6
T10 13 14 18 39 5 21
T11 22 32 38 39 26 31
T12 13 37 3 25 5 40
T13 28 32 33 19 20 12
T14 22 23 33 30 5 6
T15 22 14 9 15 5 6
T16 16 32 38 10 11 27
T17 1 2 33 4 35 12
T18 1 37 38 19 5 6
T19 13 32 38 34 35 40
T20 22 37 24 15 5 36
根据前述方法，检测上述重组抗体与三种Taq DNA聚合酶的结合能力，部分重组抗体(T11、T12、T15和T19)与三种Taq DNA聚合酶的结合反应结果如图2所示。由图2可知，重组抗体与三种Taq DNA聚合酶结合能力也很强，与对照(Pfu DNA聚合酶)不结合。
经酶标仪测定OD450nm值，通过软件分析上述ELISA结果，获得各重组抗体的EC50值(单位nM)，如下表5所示。
表5：各重组单克隆抗体与Taq DNA聚合酶的EC50值
Taq WT KlenTaq10 Taq22
T9 0.307 0.320 0.214
T10 0.262 0.221 0.229
T11 0.206 0.241 0.209
T12 0.189 0.212 0.429
T13 0.280 0.308 0.215
T14 0.301 0.266 0.340
T15 0.241 0.340 0.275
T16 0.375 0.366 0.253
T17 0.174 0.332 0.292
T18 0.255 0.284 0.225
T19 0.249 0.239 0.237
T20 0.307 0.213 0.196
实施例5：本发明抗体对Taq DNA聚合酶的封闭有效性及Taq DNA聚合酶的酶活恢复效果的检测
将T1抗体与三种Taq DNA聚合酶按照2:1结合得到三种抗体-酶复合物，37℃孵育1小时后制成热启动Taq DNA聚合酶。对经热启动的抗体-酶复合物和未经热启动的抗体-酶复合物的活性进行测试，以不加酶的组作为阴性对照，阳性对照为不含抗体的单酶。
抗体-酶复合物的热启动：95℃热激处理2分钟，其中热启动的目的是使抗体-酶复合物中的抗体和酶解离，释放出有活性的单酶。
按照如下体系，进行反应：
反应液组分 用量(μL)
5x PCR Buffer 5
dNTP(0.25mM) 2.5
引物(10μM) 0.2
单链DNA底物(50ng/μL) 1
ddH2O 补足至24.5μL
上述反应体系经过94℃20秒和55℃30秒处理后，各实验组分别加入0.5μL DNA聚合酶，在37℃条件下反应1小时，对该温度下酶活性进行检测。
实验组包括S1：未经热启动的抗体-Taq WT复合物；S2：未经热启动的抗体-酶Taq22复合物；S3：未经热启动的抗体-酶KlenTaq10复合物；S4：经热启动的抗体-酶Taq WT复合物；S5：经热启动抗体-酶Taq 22复合物；S6：经热启动的抗体-酶KlenTaq10复合物；S7：不加抗体的单酶Taq WT；S8：不加抗体的单酶Taq 22；S9：不加抗体的单酶KlenTaq10；S10：阴性对照；S11：阳性对照。
待反应结束后，各实验组取5μL反应产物，加入6×上样缓冲液混合，进行1％的琼脂糖凝胶电泳检测，电泳180伏，30分钟，取出凝胶板置于观察仪处观察实验结果并拍照保存。
实验的结果如图3所示，由图3可知，未经热启动的抗体-酶复合物(S1-S3实验组)的扩增结果与阴性对照(S10实验组)基本一致，这表明本发明的这三种抗体-酶复合物在37℃几乎能够完全抑制Taq DNA聚合酶活性，即本发明的抗体能够成功地封闭这三种Taq DNA聚合酶。而采用本发明的经热启动的抗体-酶复合物(实验组S4-S6)扩增结果与阳性对照(S11实验组)以及单酶(S7-S10)基本一致，这表明本发明的这三种抗体-酶复合物经95℃热激后几乎能完全恢复酶活性。
实施例6：热启动Taq DNA聚合酶的特异性测试
制备Taq DNA聚合酶单克隆抗体T8/T9/T11与三种不同Taq DNA聚合酶(Taq WT、Taq 22和KlenTaq10)结合的热启动Taq DNA聚合酶。将T8、T9和T11抗体分别与三种酶按照质量比1:1比例结合，组成9种抗体-酶复合物，并对这九种抗体-酶复合物和三种单酶的活性和特异性进行测试和比较。
在PCR管中按照以下体系配制反应体系：
反应液组分 用量(μL)
5X PCR Buffer 5
2.5mM dNTP 2.5
引物-F(10μM) 0.5
引物-R(10μM) 0.5
100XSYBR GREEN 0.2
Taq DNA聚合酶 0.5
模板 5
ddH2O 补足至25μL
将PCR管置于荧光PCR仪中执行以下程序：
结果如图4-6所示，根据图4-6的结果可知，三种类型的Taq DNA聚合酶分别结合T8、T9和T11抗体制备成的抗体-酶复合物，与未经过抗体修饰的单酶比较，结合了抗体的Taq DNA聚合酶能明显减少引物二聚体的出现。

Claims (10)

1.一种抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3，所述轻链可变区包括轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；其中：
VH CDR1的氨基酸序列由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:16、SEQID NO:22或SEQ ID NO:28所示；
VH CDR2的氨基酸序列由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:17、SEQID NO:23、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:37所示；
VH CDR3的氨基酸序列由SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:24、SEQID NO:33或SEQ ID NO:38所示；
VL CDR1的氨基酸序列由SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:39所示；
VL CDR2的氨基酸序列由SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:35所示；以及
VL CDR3的氨基酸序列由SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:40所示。
2.根据权利要求1所述的抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，
1)所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:1-3所示的重链互补决定区VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:4-6所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；
2)所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:7-9所示的重链互补决定区VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:10-12所示的轻链互补决定区VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3；
3)所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:3所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的轻链互补决定区VL CDR1、VLCDR2和VLCDR3；
4)所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:16-18所示的重链互补决定区VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:19-21所示的轻链互补决定区VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3；
5)所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:22-24所示的重链互补决定区VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:25-27所示的轻链互补决定区VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3；
6)所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:3所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:31所示的轻链互补决定区VL CDR1、VLCDR2和VLCDR3；
7)所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:34-36所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；
8)所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:40所示的轻链互补决定区VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3；
9)所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:1-3所示的重链互补决定区VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:6所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；
10)所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ IDNO:18所示的重链互补决定区VH CDR1、VHCDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:21所示的轻链互补决定区VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3；
11)所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:32和SEQ IDNO:38所示的重链互补决定区VH CDR1、VHCDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:31所示的轻链互补决定区VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3；
12)所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:37和SEQ IDNO:3所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:40所示的轻链互补决定区VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3；
13)所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:32和SEQ IDNO:33所示的重链互补决定区VH CDR1、VHCDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:12所示的轻链互补决定区VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3；
14)所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ IDNO:33所示的重链互补决定区VH CDR1、VHCDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的轻链互补决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；
15)所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:14和SEQ IDNO:9所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的轻链互补决定区VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3；
16)所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:32和SEQ IDNO:38所示的重链互补决定区VH CDR1、VHCDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:27所示的轻链互补决定区VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3
17)所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:33所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:12所示的轻链互补决定区VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3；
18)所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38所示的重链互补决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的轻链互补决定区VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3；
19)所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:32和SEQ IDNO:38所示的重链互补决定区VH CDR1、VHCDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:40所示的轻链互补决定区VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3；或
20)所述重链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:37和SEQ IDNO:24所示的重链互补决定区VH CDR1、VHCDR2和VH CDR3，所述轻链可变区包括氨基酸序列分别由SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:36所示的轻链互补决定区VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3；
优选地，所述重链可变区还包含框架区HFR1、HFR2、HFR3和HFR4，其与VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3从氨基末端到羧基末端按照HFR1、VH CDR1、HFR2、VH CDR2、HFR3、VH CDR3、HFR4的顺序排列，其中所述HFR1、HFR2、HFR3和HFR4分别具有由SEQ ID NO:41、SEQ ID NO：42、SEQID NO：43和SEQ ID NO：44所示的序列或与所述序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列，所述轻链可变区还包含框架区LFR1、LFR2、LFR3和LFR4，其与VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3从氨基末端到羧基末端按照LFR1、VL CDR1、LFR2、VL CDR2、LFR3、VLCDR3、LFR4的顺序排列，其中所述LFR1、LFR2、LFR3和LFR4分别具有由SEQ ID NO:45、SEQ IDNO：46、SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：48所示的序列或与所述序列具有80％以上、85％以上、90％以上或95％以上一致性的序列。
3.一种核酸分子，其编码权利要求1或2所述的抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体或其抗原结合片段。
4.一种载体，其包含权利要求3所述的核酸分子；优选地，所述载体为质粒载体，例如pEE12、pCAGGS、pTOPO、pcDNA如pCDNA3.1、pTT、pTT3、pEFBOS、pBV、pJV和pBJ中的任一种。
5.一种表达细胞，其包含权利要求3所述的核酸分子或权利要求4所述的载体，优选地，所述表达细胞为哺乳动物细胞，例如选自中国仓鼠卵巢细胞、小仓鼠肾细胞、猴肾细胞、小鼠胸腺瘤细胞、人胚胎肾细胞。
6.一种热启动Taq DNA聚合酶，其包含根据权利要求1或2所述的抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体或其抗原结合片段和Taq DNA聚合酶。
7.根据权利要求6所述的热启动Taq DNA聚合酶，其中所述抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体或其抗原结合片段与Taq DNA聚合酶的重量比为5:1至1:5，优选2:1至1:2，优选1:1。
8.根据权利要求6或7所述的热启动Taq DNA聚合酶，其中，所述Taq DNA聚合酶包括野生型Taq DNA聚合酶或其突变体，例如KlenTaq10 DNA聚合酶、Taq22 DNA聚合酶、Klentaq1DNA聚合酶、Stoffel片段、重组Taq-omni、KT-C3 DNA聚合酶、S-Taq、S-Taq(Δ289)。
9.一种通过聚合酶链式反应扩增目标DNA序列的方法，所述方法包括使用权利要求6-8中任一项所述的热启动Taq DNA聚合酶来扩增所述目标DNA序列的步骤。
10.一种用于聚合酶链式反应的试剂盒，其包括：权利要求6-8中任一项所述的热启动Taq DNA聚合酶；以及使用说明。
CN202311417977.9A 2023-10-27 2023-10-27 抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体及其应用 Pending CN117510639A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311417977.9A CN117510639A (zh) 2023-10-27 2023-10-27 抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311417977.9A CN117510639A (zh) 2023-10-27 2023-10-27 抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117510639A true CN117510639A (zh) 2024-02-06

Family

ID=89744775

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202311417977.9A Pending CN117510639A (zh) 2023-10-27 2023-10-27 抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117510639A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106883297B (zh) 基于ch3结构域的异二聚体分子、其制备方法及用途
CN114787193B (zh) 抗聚合酶的单克隆抗体及其应用
CN114685671B (zh) 特异性结合Taq DNA聚合酶的单克隆抗体及其应用
CN113151186B (zh) 抗人cd271的单克隆抗体及用途
CN115838419A (zh) 抗呼吸道合胞病毒抗体及其相关应用
CN109384843B (zh) 抗体及其制造方法、以及提升抗体的热稳定性的方法
CN111647081B (zh) 一种重组小鼠抗人白介素19单克隆抗体、制备方法和应用
CN110878124B (zh) Dna聚合酶的抗体片段、抗体及其应用
CN117510639A (zh) 抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体及其应用
EP4019540A1 (en) Method for improving affinity of antibody for antigen and use thereof
CN115925909A (zh) 抗呼吸道合胞病毒抗体及其相关应用
CN111647086B (zh) 一种重组小鼠抗人肌酸激酶单克隆抗体、制备方法和应用
Sabrina et al. In vitro generation of anti-hepatitis B monoclonal antibodies from a single plasma cell using single-cell RT-PCR and cell-free protein synthesis
EP3230312B1 (en) A method for producing a recombinant allotypespecific rabbit monoclonal antibody
WO2019112027A1 (en) Antibodies, compositions for use in detecting or capturing a polypeptide in a sample, and methods for detecting or capturing a polypeptide in a sample
WO2024067151A1 (zh) 抗呼吸道合胞病毒抗体及其相关应用
CN117003880B (zh) 抗硫氰酸荧光素单克隆抗体及其应用
CN117402249A (zh) 抗胰脂肪酶单克隆抗体及其应用
CN116789807B (zh) 抗腺病毒单克隆抗体及其应用
CN111647083B (zh) 一种重组小鼠抗人血幼素单克隆抗体、制备方法和应用
WO2023046039A1 (zh) 抗SARS-CoV-2 E484Q刺突蛋白的单克隆抗体及其应用
CN117106073A (zh) 抗新型冠状病毒单克隆抗体及其应用
CN107987167B (zh) 一种RNA聚合酶II转录亚基37e介体的单克隆抗体及其应用
CN117551189A (zh) 抗寨卡病毒单克隆抗体及其应用
CN117304330A (zh) His标签抗体及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination