CN117304330A - His标签抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了His标签抗体及其应用。本发明的His标签抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:1所示的HCDR1，如SEQ ID NO:2所示的HCDR2，和如SEQ ID NO:3所示的HCDR3；以及所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:4所示的LCDR1，如SEQ ID NO:5所示的LCDR2，和如SEQ ID NO:6所示的LCDR3。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体而言，涉及His标签抗体及其应用。
背景技术
基于细胞的间接免疫荧光法是一种检测体液内自身抗体的检测方法，用于自身免疫疾病的诊断。该方法将待检测自身抗体特异性识别的抗原表达于活性细胞内并固定到载体板上制成该特异性自身抗体的检测试剂。人体液中的特异性自身抗体会与该抗原结合，利用间接免疫荧光法标记该自身抗体显色，通过荧光显微镜观察抗原报告荧光来判断人体液中是否含有该特异性自身抗体。
基于细胞的间接免疫荧光法的灵敏度、特异度明显高于其他检测方法。目前国际及国内的诊断共识或指南优先推荐应用基于细胞的间接免疫荧光法进行自身免疫抗体的检测。但是目前基于细胞的间接免疫荧光法试剂盒中国产和进口试剂盒中都没有阳性标品，这是一个短板。
CN115856324A公开了一种识别人lgG重组质粒转染细胞的应用，该细胞作为免疫荧光检测的质控品，能够和人体样本的抗体及后续的二抗连续反应，产生阳性信号，可以排除因为检测操作错误、体液样本失效等原因造成的假阴性，但是该申请没有解决阳性标品的问题。
CN102981002A公开了一种采用标签蛋白人源化嵌合抗体作为阳性对照物的间接免疫检测方法及试剂盒。该申请的技术主要是涉及固相载体上重组目标抗原的免疫检测，主要是用于基于重组蛋白的检测反应的间接免疫检测法，例如酶联免疫法和化学发光法，并且未给出抗体序列。
抗His多肽单克隆抗体制备是采用淋巴细胞杂交瘤技术，该技术的基础是细胞融合。骨髓瘤细胞与免疫的动物脾细胞融合后形成淋巴细胞杂交瘤，这种杂交瘤细胞既具有肿瘤细胞无限增殖特性，又具有淋巴细胞能分泌特异性抗体的能力，能分泌针对单一抗原表位的单克隆抗体。
发明内容
针对现行自身免疫抗体CBA法检测试剂盒的不足，为了解决缺少阳性标品的问题，本发明提出一种人鼠嵌合His单抗(HAB24 hFC)及在此基础上改造的双特异性抗体识别自身免疫抗原重组载体转染细胞的应用，制备自身抗体检测试剂时将该人鼠嵌合His单抗(HAB24 hFC)或者在此基础上改造的双特异性抗体设置为阳性标品，在利用自身抗体检测试剂进行体液样本中自身抗体检测时，若本发明的抗体和细胞反应后产生阳性结果，则提示检测所用的过表达自身免疫抗原的细胞基质质量可靠、二抗及其它试剂有效，从而防止因为检测细胞存在质量问题、二抗及其它试剂失效等原因造成的假阴性。
因此，一方面，本发明提供了一种His标签抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:1所示的HCDR1，如SEQ ID NO:2所示的HCDR2，和如SEQ ID NO:3所示的HCDR3；以及所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:4所示的LCDR1，如SEQ ID NO:5所示的LCDR2，和如SEQ ID NO:6所示的LCDR3。
在一些实施方式中，所述His标签抗体可以是鼠源抗体，嵌合抗体，或人源化抗体。
在一些实施方式中，所述His标签抗体或其抗原结合片段可以进一步包含源自人IgG1kappa的重链恒定区和轻链恒定区。
在一些实施方式中，所述His标签抗体或其抗原结合片段的重链可变区包含如SEQID NO:7所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:7具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列；以及所述His标签抗体或其抗原结合片段的轻链可变区包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:8具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述His标签抗体或其抗原结合片段可以包含重链和轻链，所述重链包含如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:9具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列；以及所述轻链包含如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:10具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述His标签抗体是单克隆抗体。
在一些实施方式中，所述抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、单链抗体(scFv)、二聚化的V区(双抗体)、二硫键稳定化的V区(dsFv)和包含CDR的肽的抗原结合片段。
另一方面，本发明提供了一种核酸分子，其包含编码上述His标签抗体或其抗原结合片段的多核苷酸。
再一方面，本发明提供了一种重组载体，特别是重组表达载体，其包含上述核酸分子。
又一方面，本发明提供了一种宿主细胞，其导入或含有上述重组载体。
在一些实施方式中，所述宿主细胞可以包括原核细胞和真核细胞，其实例包括但不限于，细菌、酵母菌或哺乳动物细胞，例如，大肠杆菌、毕赤酵母、CHO细胞或HEK293细胞。
还一方面，本发明提供了一种生产His标签抗体或其抗原结合片段的方法，包括以下步骤：
培养上述宿主细胞得到培养物；
从培养物中分离抗体；以及
任选地，对所述抗体进行纯化。
还一方面，本发明提供了上述His标签抗体或其抗原结合片段作为阳性标品在制备抗体检测试剂盒，特别是自身抗体检测试剂盒中的应用。
在一些实施方式中，所述自身抗体检测试剂盒可以用于检测以下自身免疫抗原的基因：Gliomedin(Q6ZMI3)、AQP4(P55087)、MOG(Q16653)、GFAP(P14136)、MBP(P02686)、NMDAR1(Q05586)、GluA1(P42261)、GluA2(P42262)、GABABR1(Q9UBS5)、GABABR2(O75899)、LGI1(O95970)、CASPR2(Q9UHC6)、IgLON5(A6NGN9)、GAD65(Q05329)、mGluR1(Q13255)、mGluR5(P41594)、Neurexin3α(Q9Y4C0)、GABAARα1(P14867)、GABAARβ3(P28472)、Titin(Q8WZ42)、MusK(O15146)、LRP4(O75096)、RyR1(P21817)、SOX1(O00570)、Hu(P26378)、Yo(Q01850)、Ri(P51513)、Amphiphysin(P49418)、CV2(Q9BPU6)、Ma1(Q8ND90)、Ma2(Q9UL42)、Zic4(Q8N9L1)、Tr(Q8NFT8)、NF155(O94856-9)、NF186(O94856-9)、CNTN1(Q12860)、CNTN2(Q02246)、CASPR1(P78357)、PLP1(P60201))。
另一方面，本发明提供了一种His标签双特异性抗体，其包含：
第一重链和第一轻链，所述第一重链包含第一重链重链可变区，所述第一重链重链可变区包含如SEQ ID NO:1所示的HCDR1，如SEQ ID NO:2所示的HCDR2，和如SEQ ID NO:3所示的HCDR3；所述第一轻链包含第一轻链可变区，所述第一轻链可变区包含如SEQ ID NO:4所示的LCDR1，如SEQ ID NO:5所示的LCDR2，和如SEQ ID NO:6所示的LCDR3；以及
第二重链和第二轻链，所述第二重链包含第二重链可变区，所述第二重链可变区包含如SEQ ID NO:11所示的HCDR1，如SEQ ID NO:12所示的HCDR2，和如SEQ ID NO:13所示的HCDR3；所述第一轻链包含第一轻链可变区，所述第一轻链可变区包含如SEQ ID NO:14所示的LCDR1，如SEQ ID NO:15所示的LCDR2，和如SEQ ID NO:16所示的LCDR3。
在一些实施方式中，所述His标签双特异性抗体可以是鼠源抗体，嵌合抗体，或人源化抗体。
在一些实施方式中，所述His标签双特异性抗体可以进一步包含源自人IgG1kappa的重链恒定区和轻链恒定区。
在一些实施方式中，His标签双特异性抗体包含：
第一重链和第一轻链，所述第一重链包含如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:19具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列；以及所述轻链包含如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:10具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列；以及
第二重链和第二轻链，所述第二重链包含如SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:20具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列；以及所述轻链包含如SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:21具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，可以在His标签双特异性抗体的Fc区的CH3结构域形成杵臼结构，以利于两种异源抗体重链正确组装成His标签双抗。具体地，所述双抗设计采用knobinto hole技术对抗体重链进行改造，以获得异源二聚体的抗体分子。具体地，在3D5 His标签单抗的重链CH3引入hole突变，形成一个凹陷的“臼”结构，在HAB24 His标签单抗的重链CH3引入Knob突变，形成一个凸起“杵”的结构，杵臼结构设计有利于HAB24和3D5两种异源抗体重链正确组装成His标签双抗。
另一方面，本发明提供了一种核酸分子，其包含编码上述His标签双特异性抗体的多核苷酸。
再一方面，本发明提供了一种重组载体，特别是重组表达载体，其包含上述核酸分子。
又一方面，本发明提供了一种宿主细胞，其导入或含有上述重组载体。
在一些实施方式中，所述宿主细胞可以包括原核细胞和真核细胞，其实例包括但不限于，细菌、酵母菌或哺乳动物细胞，例如，大肠杆菌、毕赤酵母、CHO细胞或HEK293T细胞。
还一方面，本发明提供了一种生产His标签双特异性抗体的方法，包括以下步骤：
培养上述宿主细胞得到培养物；
从培养物中分离抗体；以及
任选地，对所述抗体进行纯化。
另一方面，本发明提供了上述His标签双特异性抗体作为阳性标品在制备抗体检测试剂盒，特别是自身抗体检测试剂盒中的应用。
还一方面，本发明提供了一种自身免疫抗体CBA法检测试剂盒，所述试剂盒包含所述上述His标签抗体或其抗原结合片段或者上述His标签双特异性抗体作为阳性标品。
在一些实施方式中，所述自身抗体检测试剂盒可以用于检测以下自身免疫抗原的基因：Gliomedin(Q6ZMI3)、AQP4(P55087)、MOG(Q16653)、GFAP(P14136)、MBP(P02686)、NMDAR1(Q05586)、GluA1(P42261)、GluA2(P42262)、GABABR1(Q9UBS5)、GABABR2(O75899)、LGI1(O95970)、CASPR2(Q9UHC6)、IgLON5(A6NGN9)、GAD65(Q05329)、mGluR1(Q13255)、mGluR5(P41594)、Neurexin3α(Q9Y4C0)、GABAARα1(P14867)、GABAARβ3(P28472)、Titin(Q8WZ42)、MusK(O15146)、LRP4(O75096)、RyR1(P21817)、SOX1(O00570)、Hu(P26378)、Yo(Q01850)、Ri(P51513)、Amphiphysin(P49418)、CV2(Q9BPU6)、Ma1(Q8ND90)、Ma2(Q9UL42)、Zic4(Q8N9L1)、Tr(Q8NFT8)、NF155(O94856-9)、NF186(O94856-9)、CNTN1(Q12860)、CNTN2(Q02246)、CASPR1(P78357)、PLP1(P60201))。
本发明通过杂交瘤技术筛选得到了一株来自于小鼠的杂交瘤细胞HAB24，通过测序获得了其His标签抗体基因序列，将鼠来源抗体恒定区改成人源lgG1的恒定区序列，表达得到一种人鼠嵌合His标签抗体。另外本发明还将已知序列的鼠抗Anti-His Tag Antibody3D5(Sequence ID:1KTR_L)也变成人鼠嵌合抗体。通过knob into hole技术将两种标签抗体序列设计一种新的双特异性抗体(图1中A)。所述人鼠嵌合His标签双特异性抗体能够识别所有添加了His标签的自身免疫抗原蛋白，因此本发明将所述人鼠嵌合双特异性抗体作为一种辅助的检测试剂，包括：Gliomedin、AQP4、MOG、Flot1/2、GFAP、MBP、NMDAR、GluA1、GluA2、GABABR、LGI1、CASPR2、IgLON5、GAD65、mGluR1、mGluR5、Neurexin3α、GABAARα1、GABAARβ3、AchR、Titin、MusK、LRP4、SOX1、Hu、Yo、Ri、Amphiphysin、CV2、Ma1、Ma2、Zic4、Tr、NF155、NF186、CNTN1、CNTN2、CASPR1、PLP等，可以用于自身免疫抗体的检测。因此，本发明的人鼠嵌合His标签单克隆抗体和双特异性抗体可以作为一个阳性标品，填补了目前自身免疫抗体CBA法检测试剂盒的空白。
有益效果
1)本发明所述人鼠嵌合His标签单克隆抗体和双特异性抗体，可用于间接免疫荧光诊断试剂的阳性标品，防止因为转染细胞的问题、试剂失效等原因造成的假阴性；
2)利用在真核细胞表达和纯化的人鼠嵌合His标签单克隆抗体和双特异性抗体和人体体液中抗体平行检测，使用同一套试剂，简化了试剂盒的成分；
3)使用了人鼠嵌合His标签单克隆抗体和双特异性抗体间接免疫荧光诊断试剂，可以质控所有的靶标抗原是否正常、高效表达；
4)使用了人鼠嵌合His标签单克隆抗体和双特异性抗体间接免疫荧光诊断试剂，可以粗略定量阳性样本抗体的浓度值。
附图说明
图1：本发明人鼠嵌合His标签单抗和双抗。其中：A为本发明人鼠嵌合His标签单抗3D5和HAB24和双抗3D5_HAB24的结构示意图；B为实施例2中纯化的人鼠嵌合His标签单抗和双抗电泳考染图。其中：左图为重组表达人鼠嵌合his标签单抗(HAB24-hFC和3D5-hFC)在非还原loading buffer(DTT-)中为完整抗体分子，在还原loading buffer(DTT+)中解离成重链和轻链；右图为重组表达His标签双特异性抗体在非还原loading buffer(DTT-)中为完整抗体分子，在还原loading buffer(DTT+)中解离成2条重链和2条轻链。
图2：实施例4中人鼠嵌合His标签单抗、双抗检测转染GluR1抗原细胞的免疫荧光图。
图3：实施例5中人鼠嵌合His标签双特异性抗体检测转染脱髓鞘疾病抗原细胞的荧光图。
图4：实施例6中人鼠嵌合His标签双特异性抗体检测转染自身免疫性脑炎抗原细胞的荧光图。
图5：实施例7中不同浓度人鼠嵌合His标签双特异性抗体检测NMDAR抗原的荧光图。其中“未知阳性样本”指的是样本中含有NMDAR抗体，但是未知其抗体的浓度。
图6：人鼠嵌合His标签双抗可以作为免疫膜条的阳性标品。其中：+代表加入人鼠嵌合His抗体的反应膜条；-代表没有添加人鼠嵌合His标签抗体的反应膜条。
具体实施方式
在下文中，将通过实施例详细描述本发明。然而，在此提供的实施例仅用于说明目的，并不用于限制本发明。
下述实施例所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
材料和仪器
His标签多肽：由金斯瑞生物公司合成并偶联到牛血清白蛋白(Bovine SerumAlbumin)；
小鼠骨髓瘤Sp2/0-Ag14细胞株：购自武汉普诺赛生命科技有限公司；
BALB/c小鼠：购自百奥赛图公司；
HybriMore Hybridoma Cloning Factor杂交瘤生长添加剂：购自VisualProtein，货号：HB01-1L；
PCR酶：Max DNA Polymerase(Takara,货号：R045A)，KOD DNAPolymerase(品牌Toyobo，货号KOD-201)；
细胞系：HEK293T细胞，FreeStyleTM 293-F细胞购自Thermofisher，货号:R79007；
胶回收试剂盒：Omega Gel Extraction Kit；
质粒：pCDNA3.4(购自纽普生物，货号V001453#))；
质粒提取试剂盒：Omega plasmid mini kit；
同源重组试剂盒：HiFi DNA Assembly Master Mix，货号：E2621L
纯水仪：Millipore Direct-5 UV Water Purification System；
移液器：eppendorf；
PCR仪：Bio-Rad T100；
基因合成由通用生物公司合成；
Expi293TM Expression Medium购自Thermofisher，货号：A1435101；
Valproic Acid(VPA)购自Sigma货号P4543。
实施例1、His标签单克隆抗体的筛选
抗原合成与小鼠免疫：
1)为了免疫小鼠，我们将合成的10×His标签多肽和BSA(Bovine Serum Albumin，牛血清白蛋白)偶联后，免疫6只SPF级BALB/c健康小鼠，鼠龄在6～12周，雌雄不限；ELISA检测血清滴度，确定最终的抗体筛选策略；
2)对6只小鼠进行实验评估，检测小鼠血清抗体效价大于1:10000，达到制备单克隆抗体的要求。剩余小鼠建议再次免疫，如果融合不成功，可挑选备用老鼠。
杂交瘤细胞的获取：
1)小鼠骨髓瘤Sp2/0-Ag14细胞株用10％胎牛血清的RPMI1640培养基培养，每3～5天传代一次，以备细胞融合使用；
2)取冲击免疫三天后的小鼠，眼球放血，收集血清用于阳性对照，然后处死取小鼠脾脏细胞，制成小鼠脾细胞悬液，每只小鼠得到约5x107个脾细胞。将脾细胞与骨髓瘤细胞以5:1的比例，在50％PEG(W/V)作用下融合，之后可以将细胞以1x105个/孔加入到96孔培养板中，4-5板，在添加HybriMore Hybridoma Cloning Factor杂交瘤生长添加剂和含有HAT、HT的培养基中培养，观察生长情况，当细胞克隆覆盖率大于10％时，测定杂交瘤上清中包含目的抗体者为阳性孔，用于下一步经过有限稀释法进行亚克隆筛选；
3)融合细胞阳性克隆经有限稀释后(一般稀释至约0.8个细胞/孔)，应有36％以上的孔为1个细胞/孔。细胞培养至覆盖率大于10％孔底时，吸取培养上清用ELISA检测抗体含量。经过三次亚克隆筛选，选高分泌特异性细胞株扩大培养或冻存，经过反复冻存和复苏的杂交瘤细胞系，抗体检测保持阳性的细胞系进行建株并命名，得到一株高效价的杂交瘤细胞株HAB24。
杂交瘤细胞株HAB24抗体序列的获取：
杂交瘤细胞的培养：取单抗杂交瘤细胞株HAB24进行扩大培养，RPMI1640培养基37℃下培养10天到旺盛生长期，开始收集细胞；
杂交瘤细胞mRNA提取：使用trizol法提取RNA：trizol裂解细胞，加入氯仿，剧烈震荡后离心15min，取上清并加入异丙醇，混匀静置后离心10min，弃上清，沉淀用75％乙醇清洗后，在空气中晾干，并用适量DEPC水溶解；
RNA反转录获得cDNA：采用SMART RACE方法将RNA反转录合成cDNA：准备5’-RACE/3’-RACE的反应体系，并选择合适的扩增程序进行PCR扩增(延伸时间根据片段大小决定)，合成cDNA第一条链，然后根据已知的cDNA序列合成cDNA第二条链。cDNA PCR获得抗体重链/轻链可变区基因：加入用于PCR扩增的高保真DNA聚合酶与小鼠轻重链特有引物和随机引物等，对cDNA进行PCR扩增，获得重链/轻链可变区基因；
抗体基因连接至T载体，挑选阳性克隆并测序；
生物信息学分析测序结果，经过blast比对，得到一个全新的His标签抗体序列(anti-His mouse重链可变区：SEQ ID NO:7，anti-His轻链可变区：SEQ ID NO:8)。
经Antibody CDR annotation分析，该His标签抗体的重链可变区具有如DYNMD(SEQ ID NO:1)所示的HCDR1，如DINPNYDSTRYNQKFKG(SEQ ID NO:2)所示的HCDR2，以及如DGSNAMDY(SEQ ID NO:3)所示的HCDR3；以及该His标签抗体的轻链可变区具有如
KSSQSLLNSGHQKNYLA(SEQ ID NO:4)所示的LCDR1，如GASTRES(SEQ ID NO:5)所示的LCDR2，以及如QNDHRYPLT(SEQ ID NO:6)所示的LCDR3。
实施例2、人鼠嵌合His标签单抗及双特异性抗体的表达和纯化
人鼠嵌合His标签单抗、双特异性抗体序列的设计改造：
对杂交瘤细胞株HAB24进行测序获得了鼠源His抗体的全序列，序列为鼠lgG1kappa亚型，为了用于方便地检测PNS抗原，并能够和检测人体自身免疫抗体所用的试剂兼容，将鼠源His标签抗体的恒定区置换成人源lgG1 kappa的恒定区序列，得到重链和轻链(HAB24-hFC H：SEQ ID NO:9；HAB24-hFC L：SEQ ID NO:10)。该抗体基因由通用生物公司合成，并亚克隆到pcDNA3.4载体中，插入的位点为SacI和AgeI，得到表达质粒pCDNA3.4-HAB24-hFC-H和pCDNA3.4-HAB24-hFC-L。
同时，将已知序列的Anti-His Tag Antibody 3D5(Sequence ID:1KTR_L)抗体的恒定区置换成人源lgG1恒定区序列(3D5-hFC H：SEQ ID NO:17；3D5-hFC L：SEQ ID NO:18)，该抗体基因由通用生物公司合成，并亚克隆到pcDNA3.4载体中，插入的位点为SacI和AgeI，得到表达质粒pCDNA3.4-3D5-hFC-H和pCDNA3.4-3D5-hFC-L。
为了让两种His标签抗体融合成一种新的双抗，对两种His标签单抗的恒定区进行进一步地改造，HAB24抗体的VH加上FC knob元素(HAB24-H-hIgG1-Fc.knob；SEQ ID NO:19)，HAB24抗体的轻链表达载体没有改动，仍为原来的(HAB24-hFC L：SEQ ID NO:10)，Anti-His Tag Antibody 3D5抗体的重链可变区加上TCR beta-hlgG1-FC hole(3D5-H TCRbeta-hlgG1-FC hole；SEQ ID NO:20)，Anti-His Tag Antibody 3D5抗体的轻链可变区加上TCR alpha(3D5-L-TCRa；SEQ ID NO:21)，该抗体基因由通用生物公司合成，并亚克隆到pcDNA3.4载体中，插入的位点为SacI和AgeI，得到表达质粒pCDNA3.4-HAB24-H-hIgG1-Fc.knob、pCDNA3.4-HAB24-hFC-L、pCDNA3.4-3D5-H TCR beta-hlgG1-FC hole、和pCDNA3.4-3D5-L-TCRa。
人鼠嵌合His标签单抗、双特异性抗体基因合成及亚克隆：
改造后的HAB24-hFC、3D5-hFC和His标签双特异性抗体3D5_HAB24的基因由安徽通用生物公司合成，并带上信号肽：MGWSCIILFLVATATGVHS。合成上述抗体基因的通过分子克隆技术插入到抗体表达载体pcDNA3.4中，插入的位点为SacI和AgeI，测序验证得到正确分泌表达质粒。
改造后的HAB24-hFC重、轻链表达质粒为pCDNA3.4-HAB24-hFC-H和pCDNA3.4-HAB24-hFC-L。改造后的3D5-hFC重、轻链表达质粒为pCDNA3.4-3D5-hFC-H和pCDNA3.4-3D5-hFC-L。改造后的His标签双特异性抗体的基因表达质粒为pCDNA3.4-HAB24-H-hIgG1-Fc.knob、pCDNA3.4-HAB24-hFC-L、pCDNA3.4-3D5-H TCR beta-hlgG1-FC hole、和pCDNA3.4-3D5-L-TCRa。
重组his标签单抗和双特异性抗体的构建方法包括以下步骤：
分别合成人鼠嵌合HAB24-hFC、3D5-hFC抗体基因和改造后的双特异性抗体3D5_HAB24基因，保存到克隆质粒中；
设计PCR引物分别扩增重链、轻链，将目的片段连入表达载体pCDNA3.4中，获得人鼠嵌合His标签单抗和双特异性抗体表达载体；
表达载体pCDNA3.4的双酶切反应体系：
| 反应组分 | 体积 |
| pCDNA3.4质粒 | 2μL(浓度1μg/μL) |
| rCutSmart buffer | 5μL |
| NEB限制性内切酶SacI-HF | 1μL |
| NEB限制性内切酶AgeI-HF | 1μL |
| ddH2O | 补足至50μL |
反应体系混匀后，置于37℃培养箱孵育2h，电泳跑胶，切胶回收pCDNA3.4载体大片段。
抗体基因PCR体系：
引物序列如下：
3)混合好的PCR反应体系，短暂瞬时离心之后开始PCR扩增；
PCR反应程序如下所示：
预变性：94℃，2min
变性：98℃，10s
退火：60℃，10s
延伸：72℃，15s(1Kb/10s)
循环数：35个循环
延伸：72℃，2min
保存条件：10℃
4)PCR完成之后，电泳跑胶并切胶回收基因产物；
5)按胶回收检测方法说明书操作回收PCR产物；
无缝连接反应：
将回收的HAB24-hFC、3D5-hFC和3D5_HAB24抗体基因片段和pCDNA3.4载体大片段使用NEBuilder的进行无缝连接，反应体系如下：
| 反应组分 | 体积 |
| pCDNA3.4质粒大片段 | 3μL |
| HAB24-hFC/3D5-hFC/3D5_HAB24轻重链基因片段 | 2μL |
| NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | 10μL |
| ddH2O | 5μL |
| 总体积 | 20μL |
转化：取5μL连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，复苏之后涂到Amp抗性的LB固体培养平板上培养。
挑取单菌落，加入含有Amp抗生素的LB培养基中，37℃摇菌过夜培养，提取重组质粒筛选测序结果正确的重组子。
重组his标签单抗和双特异性抗体表达和纯化：
人鼠嵌合His标签单抗，其特征在于，该人鼠嵌合His标签单抗为重组蛋白，是将改造的人鼠嵌合HAB24-hFC和3D5-hFC单抗表达质粒转入表达细胞中经表达、纯化后获得。
人鼠嵌合His标签双特异性抗体3D5_HAB24，其特征在于，该人鼠嵌合His标签双特异性抗体为重组蛋白，是将构建的人鼠嵌合His标签双特异性抗体表达质粒转入表达细胞中经表达、纯化后获得。
人鼠嵌合His标签单抗3D5/HAB24的表达：
1、Expi293细胞培养到密度为2.5-3.0x 106cells/ml，准备转染；
2、将人鼠嵌合His标签单抗表达质粒pCDNA3.4-3D5-hFC-H和pCDNA3.4-3D5-hFC-L或pCDNA3.4-HAB24-hFC-H和pCDNA3.4-HAB24-hFC-L按1:2共30μg加入到3ml OptiMEM中，混匀；
3、取120ul的PEI MAX 40K(1mg/ml)加入到OptiMEM中混匀，室温静置10-15分钟；
4、将混匀好的DNA和PEI混合物加到27ml Expi293细胞中，37℃摇床振荡培养；
5、转染后24小时，加入300μL的VPA和270μL的葡萄糖溶液至VPA终浓度为1mM；
6、继续振荡培养4天，然后收取培养基。
人鼠嵌合His标签单抗3D5/HAB24的纯化：
1、将收取的Expi293细胞培养基15000rpm，4℃离心10分钟，去除死细胞和细胞碎片；
2、每200mL培养基上清液加入1mg Protein A beads，培养基上清液和protein Abeads旋转、结合孵育；
3、孵育1h后，用Wash缓冲液漂洗Protein A beads，漂洗3-5次，去除与beads或抗体结合弱的杂质；
4、然后利用强酸性缓冲液(pH3.0-3.5)洗脱Protein A上结合的抗体，再利用碱性的缓冲液(PH约12.0)中和。
5、第一步亲和层析完成后，将洗脱液浓缩至0.5ml左右，使用Superdex200Increase进行第二步分子筛层析，收集不同的蛋白峰流穿液，选择完整单抗位置的流穿液浓缩即得人鼠嵌合His标签单抗(3D5/HAB24)样品(图1中B)。
人鼠嵌合His标签双抗3D5_HAB24的表达：
1、Expi293细胞培养到密度为2.5-3.0x 106cells/ml，准备转染；
2、将人鼠嵌合His标签双抗表达质粒pCDNA3.4-HAB24-H-hIgG1-Fc.knob、pCDNA3.4-HAB24-hFC-L、pCDNA3.4-3D5-H TCR beta-hlgG1-FC hole、和pCDNA3.4-3D5-L-TCRa按1:1:1:1共30ug加入到3ml OptiMEM中，混匀；
3、取120ul的PEI MAX 40K(1mg/ml)加入到OptiMEM中混匀，室温静置10-15分钟；
4、将混匀好的DNA和PEI混合物加到27ml Expi293细胞中，37℃摇床振荡培养；
5、转染后24小时，加入300μL的VPA和270μL的葡萄糖溶液至VPA终浓度为1mM；
6、继续振荡培养4天，然后收取培养基。
人鼠嵌合His标签双抗3D5_HAB24的纯化：
1、将收取的Expi293细胞培养基15000rpm，4℃离心10分钟，去除死细胞和细胞碎片；
2、每200mL培养基上清液加入1mg Protein A beads，培养基上清液和protein Abeads旋转、结合孵育；
3、孵育1h后，用Wash缓冲液漂洗Protein A beads，漂洗3-5次，去除与beads或抗体结合弱的杂质；
4、然后利用强酸性缓冲液(pH3.0-3.5)洗脱Protein A上结合的抗体，再利用碱性的缓冲液(PH约12.0)中和。
5、第一步亲和层析完成后，将洗脱液浓缩至0.5ml左右，使用Superdex200Increase进行第二步分子筛层析，收集不同的蛋白峰流穿液，选择完整单抗位置的流穿液浓缩即得人鼠嵌合His标签双抗3D5_HAB24样品(图1中B)。
实施例3、带有His标签自身免疫抗原表达载体转染细胞的制备
步骤1重组载体质粒的构建：
通过人工合成或者购买获得自身免疫抗原的基因Gliomedin(Q6ZMI3)、AQP4(P55087)、MOG(Q16653)、GFAP(P14136)、MBP(P02686)、NMDAR1(Q05586)、GluA1(P42261)、GluA2(P42262)、GABABR1(Q9UBS5)、GABABR2(O75899)、LGI1(O95970)、CASPR2(Q9UHC6)、IgLON5(A6NGN9)、GAD65(Q05329)、mGluR1(Q13255)、mGluR5(P41594)、Neurexin3α(Q9Y4C0)、GABAARα1(P14867)、GABAARβ3(P28472)、Titin(Q8WZ42)、MusK(O15146)、LRP4(O75096)、RyR1(P21817)、SOX1(O00570)、Hu(P26378)、Yo(Q01850)、Ri(P51513)、Amphiphysin(P49418)、CV2(Q9BPU6)、Ma1(Q8ND90)、Ma2(Q9UL42)、Zic4(Q8N9L1)、Tr(Q8NFT8)、NF155(O94856-9)、NF186(O94856-9)、CNTN1(Q12860)、CNTN2(Q02246)、CASPR1(P78357)、PLP1(P60201))序列，并在目的基因序列的N端或者C端添加上His标签。对于多亚基组成的复合物，分别给不同的基因添加一种标签。两端添加NheI/NotI两个酶切位点附近的同源臂序列；将带有酶切位点的目的基因插入pEGFP-N1载体中，插入位点为NheI/NotI，得到表达各种抗自身免疫相关抗原的重组载体。
以MOG基因为例，设计PCR引物扩增MOG基因，将目的片段连入表达载体pEGFP-N1中，获得MOG基因表达载体；
表达载体pEGFP-N1的双酶切反应体系：
| 反应组分 | 体积 |
| pEGFP-N1质粒 | 2μL(浓度1μg/μL) |
| rCutSmart buffer | 5μL |
| NEB限制性内切酶NheI-HF | 1μL |
| NEB限制性内切酶NotI-HF | 1μL |
| ddH2O | 补足至50μL |
反应体系混匀后，置于37℃培养箱孵育2h，电泳跑胶，切胶回收pEGFP-N1载体大片段。
MOG基因PCR体系：
3)混合好的PCR反应体系，短暂瞬时离心之后开始PCR扩增；
PCR反应程序如下所示：
预变性：94℃，2min
变性：98℃，10s
退火：60℃，10s
延伸：72℃，10s(1Kb/10s)
循环数：35个循环
延伸：72℃，2min
保存条件：10℃
4)PCR完成之后，电泳跑胶并切胶回收基因产物；
5)按胶回收检测方法说明书操作回收PCR产物；
无缝连接反应：
将回收的MOG基因片段和pEGFP-N1载体大片段使用NEBuilder的进行无缝连接，反应体系如下：
| 反应组分 | 体积 |
| pEGFP-N1质粒大片段 | 3μL |
| MOG基因片段 | 2μL |
| NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | 10μL |
| ddH2O | 5μL |
| 总体积 | 20μL |
转化：取5μL连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，复苏之后涂到Amp抗性的LB固体培养平板上培养。
挑取单菌落，加入含有Amp抗生素的LB培养基中，37℃摇菌过夜培养，提取重组质粒筛选测序结果正确的MOG表达质粒。
步骤2获得瞬转表达细胞：
(1)细胞培养：293T/Hep2细胞使用10％FBS+DMEM高糖培养基，于37℃，5％CO2培养箱中培养；
(2)细胞转染：待细胞密度达到40％-50％，将步骤1所得重组质粒载体用PEI转染进入细胞，转染6小时后更换新鲜培养基；
步骤3细胞固定：
(1)转染48小时后，待细胞密度达到80％-90％；
(2)固定：使用4％多聚甲醛将细胞于室温固定15分钟，或者使用甲醇冰上固定10分钟；
(3)清洗：用PBS/TBS洗涤液200μL清洗3次。
各种自身抗原基因的瞬转细胞固定后，作为免疫荧光实验的材料备用。
实施例4、人鼠嵌合His标签单抗、双特异性抗体免疫荧光实验
间接免疫荧光技术是自身免疫抗体检测的一种重要手段，拿到重组表达的His标签抗体(人鼠嵌合His标签单抗3D5，HAB24，双特异性抗体3D5_HAB24)之后，测试重组His标签抗体用于细胞的免疫荧光实验的效果。
AMPAR属于细胞表面抗原，由GluR1、GluR2、GluR3和GluR4四种不同亚单位组成，介导突触兴奋性和可塑性。抗AMPAR抗体脑炎主要作用于细胞外GluR1和GluR2亚单位抗原决定簇，导致受体交联和内化，影响学习、记忆、认知等功能，多表现边缘性脑炎的特征，抗GluR1抗体的检测通常使用基于细胞的间接免疫荧光法。在所有的自身免疫性脑炎指标中，GluR1的表达最低，本发明人使用常规his标签鼠单抗(Thermo，R930-25)检测表达量时，发现GluR1在293T/hep2细胞中检测到的阳性信号很弱。本发明人对比了新的His标签抗体对his标签抗原的识别能力，使用改造后的人鼠嵌合抗体3D5和HAB24进行免疫荧光实验，得到的阳新信号要稍强于商业化his标签鼠单抗(Thermo，R930-25)，尤其是His标签双特异性抗体，能得到更强的荧光信号。具体实验过程如下。
转染自身免疫性脑炎GluR1抗原的hep2细胞包括载片、过表达GluR1抗原载体转染细胞的细胞爬片、Alexa Fluor 488标记IgG荧光二抗，爬片固定在载片上。用该检测试剂测定R930-25(Thermo)、改造后的人鼠嵌合His标签单抗3和双特异性抗体。其中过表达GluR1抗原载体转染细胞的细胞爬片为实施例3中制备的细胞爬片。
步骤1：将商业化R930-25 his标签鼠单抗、改造后的3D5抗体、改造后的HAB24抗体及人鼠嵌合His标签双特异性抗体稀释到合适的范围，加到检测孔；
步骤2：避光37℃孵育1小时；
步骤3：使用漂洗液清洗5次，所述的漂洗液为PBS或TBS(含有0.2％ Tween20)；
步骤4：加入偶联Alexa Fluor 488的Anti-mouse lgG或者Anti-human lgG的二抗(例如，山羊抗人二抗、兔抗人二抗、小鼠抗人二抗或绵羊抗人二抗)混匀孵育1小时；
步骤5：使用漂洗液清洗5次，所述的漂洗液为PBS或TBS(含有0.2％ Tween20)；
步骤6：荧光显微镜20X物镜下观察并拍摄荧光照片。
检测结果如图2所示，转染GluR1重组载体(带有His标签)的细胞爬片有绿色荧光染色，不同的人鼠嵌合His标签抗体(商业化3D5抗体(Thermo，R930-25)、改造后的HAB24、改造后的3D5抗体及人鼠嵌合His标签双特异性抗体3D5_HAB24)都能检测到阳性信号，但是4种抗体和转染GluR1的细胞反应得到的阳性信号强度不一致，Thermo，R930-25得到的阳性信号较弱，改造后的人鼠嵌合抗体3D5和HAB24得到的阳新信号要稍强于商业化His鼠单抗(Thermo，R930-25)，尤其是His标签双特异性抗体，能得到更强的荧光信号。因此，本发明的3D5和HAB24分别能和GluA1-his抗原反应，His标签双抗能够更加高效地识别GluA1-his抗原。因此人鼠嵌合His标签双抗具有更好的检测灵敏度，可能是由于它能识别不同的His标签的表位或者不同状态的his标签。
实施例5、人鼠嵌合His标签双抗(3D5_HAB24)测定脱髓鞘抗原(ICC/IF)
自身免疫抗体检测试剂包括载片、过表达自身免疫抗原载体转染细胞的细胞爬片、Alexa Fluor 488标记IgG荧光二抗，爬片固定在载片上。用该检测试剂测定血清样本，PBS作对照。其中过表达自身免疫抗原载体转染细胞的细胞爬片为实施例3制备的细胞附着于爬片上。
所述的靶抗原包括AQP4、MOG、GFAP、MBP。
关于所述的人鼠嵌合His标签双抗(3D5_HAB24)在制备检测抗体的试剂盒中的应用，所述人鼠嵌合His标签双抗(3D5_HAB24)的使用终浓度范围为200ng/mL～1000ng/mL。
所述的人鼠嵌合His标签双抗(3D5_HAB24)作为阳性标品快速检测抗原的方法包括以下步骤：
步骤1：将人鼠嵌合His标签双抗(3D5_HAB24)稀释到合适的范围(200ng/mL～1000ng/m)，加到检测孔；
步骤2：避光37℃孵育1小时；
步骤3：使用漂洗液清洗5次，所述的漂洗液为PBS或TBS(含有0.2％ Tween20)；
步骤4：加入偶联Alexa Fluor 488Anti-human lgG的二抗(例如，山羊抗人二抗、兔抗人二抗、小鼠抗人二抗或绵羊抗人二抗)混匀孵育1小时；
步骤5：使用漂洗液清洗5次，所述的漂洗液为PBS或TBS(含有0.2％ Tween20)；
步骤6：荧光显微镜20X物镜下观察并拍摄荧光照片。
检测结果如图3所示，未转染的细胞中不含有带有His标签的抗原蛋白，故Human-IgG没有绿色荧光染色，结果为阴性，但是转染AQP4、MOG、GFAP、MBP重组载体(带有His标签)的细胞爬片有绿色荧光染色，不同的蛋白免疫荧光之后显示不同的荧光模式，例如GFAP呈现出典型的丝状，AQP4和MOG呈现膜蛋白模式，而MBP呈现胞质蛋白的模式，提示人鼠嵌合His标签双抗(3D5_HAB24)能够特异性识别带有His标签的脱髓鞘重组抗原，结果可靠。
实施例6、人鼠嵌合His标签双抗(3D5_HAB24)测定自身免疫性脑炎抗原(ICC/IF)
自身免疫抗体检测试剂包括载片、过表达自身免疫抗原载体转染细胞的细胞爬片、Alexa Fluor 488标记IgG荧光二抗，爬片固定在载片上。用该检测试剂测定血清样本，PBS作对照。其中过表达自身免疫抗原载体转染细胞的细胞爬片为实施例3制备的细胞附着于爬片上。
所述的靶抗原包括NMDAR、AMPAR1/2、GABABR、LGI1、CASPR2、IgLON5、GAD65。
关于所述的人鼠嵌合His标签抗体(3D5_HAB24)在制备检测抗体的试剂盒中的应用，所述人鼠嵌合His标签抗体的使用终浓度范围为200ng/mL～1000ng/mL。
所述的人鼠嵌合His标签抗体(3D5_HAB24)作为阳性标品快速检测抗原的方法包括以下步骤：
步骤1：将人鼠嵌合His标签双抗(3D5_HAB24)稀释到合适的范围(200ng/mL～1000ng/mL)，加到检测孔；
步骤2：避光37℃孵育1小时；
步骤3：使用漂洗液清洗5次，所述的漂洗液为PBS或TBS(含有0.2％ Tween20)；
步骤4：加入偶联Alexa Fluor 488Anti-human lgG的二抗(例如，山羊抗人二抗、兔抗人二抗、小鼠抗人二抗或绵羊抗人二抗)混匀孵育1小时；
步骤5：使用漂洗液清洗5次，所述的漂洗液为PBS或TBS(含有0.2％ Tween 20)；
步骤6：荧光显微镜20X物镜下观察并拍摄荧光照片。
检测结果如图4所示，未转染的细胞中不含有带有His标签的抗原蛋白，故Human-IgG没有绿色荧光染色，结果为阴性，但是转染NMDAR、AMPAR1/2、GABABR、LGI1、CASPR2、IgLON5、GAD65重组载体(带有His标签)的细胞爬片有绿色荧光染色，提示人鼠嵌合His双抗(3D5_HAB24)能够识别带有His标签的自身免疫性脑炎重组抗原，结果可靠。
实施例7、不同浓度人鼠嵌合His标签双抗(3D5_HAB24)测定NMDAR抗原
自身免疫抗体检测试剂包括载片、过表达NMDAR抗原载体转染细胞的细胞爬片、Alexa Fluor 488标记IgG荧光二抗，爬片固定在载片上。用该检测试剂测定血清样本，PBS作对照。其中过表达自身免疫抗原载体转染细胞的细胞爬片为实施例3制备的细胞附着于爬片上。
所述的靶抗原包括NMDAR、AMPAR1/2、GABABR、LGI1、CASPR2、IgLON5、GAD65、DPPX。
关于所述的人鼠嵌合His标签抗体(3D5_HAB24)在制备检测抗体的试剂盒中的应用，所述人鼠嵌合His标签抗体的使用终浓度范围为200ng/mL～1000ng/mL。
所述的人鼠嵌合His标签抗体(3D5_HAB24)作为阳性标品快速检测抗原的方法包括以下步骤：
步骤1：将人鼠嵌合His标签抗体稀释到不同的浓度(0.2μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL)；
步骤2：加到NMDAR转染细胞检测孔，避光37℃孵育1小时；
步骤3：使用漂洗液清洗5次，所述的漂洗液为PBS或TBS(含有0.2％ Tween20)；
步骤4：加入偶联Alexa Fluor 488Anti-human lgG的二抗(例如，山羊抗人二抗、兔抗人二抗、小鼠抗人二抗或绵羊抗人二抗)混匀孵育1小时；
步骤5：使用漂洗液清洗5次，所述的漂洗液为PBS或TBS(含有0.2％ Tween20)；
步骤6：荧光显微镜20X物镜下观察并拍摄荧光照片。
检测结果如图5所示，过表达NMDAR抗原载体转染细胞添加稀释到不同的浓度的人鼠嵌合His标签抗体，添加Human-IgG后都有绿色荧光染色，产生阳性信号，并且随着人鼠嵌合His标签双抗(3D5_HAB24)浓度的升高，荧光信号明显增强，未知阳性样本的荧光信号大致和0.2ug/mL的人鼠嵌合His标签抗体产生的阳性信号相当，证明人鼠嵌合His标签抗体不但能够识别带有His标签的NMDAR重组抗原，还能大致反应阳性样本中抗体的浓度值。
实施例8、人鼠嵌合His双抗(3D5_HAB24)用于免疫印迹实验
另外相关的副肿瘤抗体检测试剂盒及阳性样品一直被国外垄断，国内的试剂盒中完全忽略了阳性样品。本发明人通过不断的摸索，设计一种高效表达的原核表达质粒拿到了12种融合His标签的PNS抗原蛋白(专利申请号：2023104289503)。本发明人将12种副肿瘤抗原蛋白喷到膜条上，然后利用人鼠嵌合His双抗(3D5_HAB24)和商业化的山羊抗人AP二抗及BCIP底物，通过膜条法检测实验，一次性标记12种抗原蛋白。
所述的人鼠嵌合His标签抗体(3D5_HAB24)作为阳性标品快速检测抗原的方法包括以下步骤：
步骤1：将免疫膜条加到反应槽内，
步骤2：将人鼠嵌合His标签双抗(3D5_HAB24)稀释到合适的范围(200ng/mL～1000ng/mL)，加到检测槽内；
步骤3：避光37℃孵育30分钟；
步骤3：使用漂洗液清洗5次，所述的漂洗液为PBS或TBS(含有0.2％ Tween20)；
步骤4：加入偶联AP Anti-human lgG的二抗混匀孵育30分钟；
步骤5：使用漂洗液清洗5次，所述的漂洗液为PBS或TBS(含有0.2％ Tween20)；
步骤6：加入AP底物混匀孵育20分钟；
步骤7：将膜晾干后观察膜条上蛋白条带的显色结果。
检测结果如图6所示，+代表加入人鼠嵌合His标签抗体的反应膜条和二抗及底物，所有的12条抗原蛋白都能够被抗体所识别，并和底物反应产生紫色的条带；-代表没有添加人鼠嵌合His标签双抗(3D5_HAB24)的反应膜条，除了Control条带，12条蛋白未见任何条带显色。
序列表
HAB24 VH CDR1(SEQ ID NO:1)：DYNMD
HAB24 VH CDR2(SEQ ID NO:2)：DINPNYDSTRYNQKFKG
HAB24 VH CDR3(SEQ ID NO:3)：DGSNAMDY
HAB24 VL CDR1(SEQ ID NO:4)：KSSQSLLNSGHQKNYLA
HAB24 VL CDR2(SEQ ID NO:5)：GASTRES
HAB24 VL CDR3(SEQ ID NO:6)：QNDHRYPLT
HAB24 VH(SEQ ID NO:7)：
EAQMQQTGAELVKPGAAVKISCKASGYTFTDYNMDWVKQSHGKSLEWIGDINPNYDSTRYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDTAVYYCARDGSNAMDYWGQGTSVTVSSHAB24 VL(SEQ ID NO:8)：
DIVMTQSPSSLSVSAGEKVTMNCKSSQSLLNSGHQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDHRYPLTFGAGTKLELK
HAB24-hFC H(SEQ ID NO:9)：
EAQMQQTGAELVKPGAAVKISCKASGYTFTDYNMDWVKQSHGKSLEWIGDINPNYDSTR
YNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDTAVYYCARDGSNAMDYWGQGTSVTVSSA
STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY
SLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL
FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR
VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKN
QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN
VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
HAB24-hFC L(SEQ ID NO:10)：
DIVMTQSPSSLSVSAGEKVTMNCKSSQSLLNSGHQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTR
ESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDHRYPLTFGAGTKLELKRTVAAPSV
FIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL
SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
3D5 VH CDR1(SEQ ID NO:11)：DYYMN
3D5 VH CDR2(SEQ ID NO:12)：DINPNNGGTSYNQKFKG
3D5 VH CDR3(SEQ ID NO:13)：QSGAY
3D5 VL CDR1(SEQ ID NO:14)：RSSQSIVHSNGNTYLE
3D5 VL CDR2(SEQ ID NO:15)：KVSNRFS
3D5 VL CDR3(SEQ ID NO:16)：FQGSHVPFT
3D5-hFC H：(SEQ ID NO:17)
QVQLQQSGPEDVKPGASVKISCKASGYTFTDYYMNWVKQSPGKGLEWIGDINPNNGGTS
YNQKFKGRATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSSVYYCESQSGAYWGQGTTVTVSAASTKG
PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS
VVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPP
KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS
VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSL
TCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCS
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
3D5-hFC L(SEQ ID NO:18)：
DILMTQTPSSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSG
VPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPFTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPP
SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT
LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
HAB24-H-hIgG1-Fc.knob(SEQ ID NO:19)：
EAQMQQTGAELVKPGAAVKISCKASGYTFTDYNMDWVKQSHGKSLEWIGDINPNYDSTR
YNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDTAVYYCARDGSNAMDYWGQGTSVTVSSA
STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY
SLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL
FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR
VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKN
QVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN
VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
3D5-H TCR beta-hlgG1-FC hole(SEQ ID NO:20)：
QVQLQQSGPEDVKPGASVKISCKASGYTFTDYYMNWVKQSPGKGLEWIGDINPNNGGTS
YNQKFKGRATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSSVYYCESQSGAYWGQGTTVTVSALEDLK
NVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKE
QPALQDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEA
WGRASDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN
WYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT
ISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
3D5-L-TCRa(SEQ ID NO:21)：
DILMTQTPSSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSG
VPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPFTFGSGTKLEIKPDIQNPDPAVYQ
LRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTQVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSQKSDF
ACANAFQNSIIPEDTFFPSPESS
pCDNA3.4-HAB24-hFC-F(SEQ ID NO:22)：
GAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGCCACCATGGGCTGGAGCTGCATCATCC
pCDNA3.4-HAB24-hFC-R(SEQ ID NO:23)：
CAAACTCATTACTAACCGGTTCACTTGCCAGGGCTCAGGGAC
pCDNA3.4-HAB24-L-F(SEQ ID NO:22)：
GAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGCCACCATGGGCTGGAGCTGCATCATCC
pCDNA3.4-HAB24-L-R(SEQ ID NO:24)：
CAAACTCATTACTAACCGGTCTAGCACTCGCCCCTGTTGAAGCTC
pCDNA3.4-3D5-hFC-F(SEQ ID NO:25)：
GAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGCCACC ATGGGCTGGAGCTGCATCATCC
pCDNA3.4-3D5-hFC-R(SEQ ID NO:26)：
CAAACTCATTACTAACCGGTTCACTTGCCGGGGGACAGGG
pCDNA3.4-3D5-L-F(SEQ ID NO:25)：
GAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGCCACC ATGGGCTGGAGCTGCATCATCC
pCDNA3.4-3D5-L-R(SEQ ID NO:27)：
CAAACTCATTACTAACCGGTTCAGGAGCTCTCGGGGGAGGG
pCDNA3.4-3D5-L-TCRa-R(SEQ ID NO:28)
CAAACTCATTACTAACCGGTTCAGGAGCTCTCGGGGGAGGG
pEGFP-MOG-F(SEQ ID NO:29)：
GTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCCACCATGGCAAGCTTATCAAGACCCTCTCTGCpEGFP-MOG-R(SEQ ID NO:30)：
ATGATCTAGAGTCGCGGCCGCTCACTCGAGGAAGGGATTTCGTAGCTC。
Claims (11)
1.一种His标签抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:1所示的HCDR1，如SEQ ID NO:2所示的HCDR2，和如SEQ ID NO:3所示的HCDR3；以及所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:4所示的LCDR1，如SEQ ID NO:5所示的LCDR2，和如SEQ ID NO:6所示的LCDR3。
2.根据权利要求1所述的His标签抗体或其抗原结合片段，其中，
所述His标签抗体是鼠源抗体，嵌合抗体，或人源化抗体，
优选地，所述His标签抗体或其抗原结合片段进一步包含源自人IgG1 kappa的重链恒定区和轻链恒定区。
3.根据权利要求1所述的His标签抗体或其抗原结合片段，其中，所述His标签抗体或其抗原结合片段的重链可变区包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:7具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列；以及所述His标签抗体或其抗原结合片段的轻链可变区包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或者与SEQ IDNO:8具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列，
优选地，所述His标签抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链包含如SEQ IDNO:9所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:9具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列；以及所述轻链包含如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:10具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列。
4.一种His标签双特异性抗体，其包含：
第一重链和第一轻链，所述第一重链包含第一重链重链可变区，所述第一重链重链可变区包含如SEQ ID NO:1所示的HCDR1，如SEQ ID NO:2所示的HCDR2，和如SEQ ID NO:3所示的HCDR3；所述第一轻链包含第一轻链可变区，所述第一轻链可变区包含如SEQ ID NO:4所示的LCDR1，如SEQ ID NO:5所示的LCDR2，和如SEQ ID NO:6所示的LCDR3；以及
第二重链和第二轻链，所述第二重链包含第二重链重链可变区，所述第二重链重链可变区包含如SEQ ID NO:11所示的HCDR1，如SEQ ID NO:12所示的HCDR2，和如SEQ ID NO:13所示的HCDR3；所述第一轻链包含第一轻链可变区，所述第一轻链可变区包含如SEQ ID NO:14所示的LCDR1，如SEQ ID NO:15所示的LCDR2，和如SEQ ID NO:16所示的LCDR3，
优选地，所述His标签双特异性抗体包含：
第一重链和第一轻链，所述第一重链包含如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:19具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列；以及所述轻链包含如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:10具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列；以及
第二重链和第二轻链，所述第二重链包含如SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:20具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列；以及所述轻链包含如SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:21具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列。
5.根据权利要求4所述的His标签双特异性抗体，其中，
所述His标签双特异性抗体是鼠源抗体，嵌合抗体，或人源化抗体，
优选地，所述His标签双特异性抗体可以进一步包含源自人IgG1 kappa的重链恒定区和轻链恒定区，
优选地，在所述His标签双特异性抗体的Fc区的CH3结构域形成杵臼结构。
6.一种核酸分子，其包含编码如权利要求1-3中任一项所述的His标签抗体或其抗原结合片段的多核苷酸，或者包含编码如权利要求4或5所述的His标签双特异性抗体的多核苷酸。
7.一种重组载体，特别是重组表达载体，其包含如权利要求6所述的核酸分子。
8.一种宿主细胞，其导入或含有如权利要求7所述的重组载体。
9.一种生产His标签抗体或其抗原结合片段的方法，包括以下步骤：
培养上述宿主细胞得到培养物；
从培养物中分离抗体；以及
任选地，对所述抗体进行纯化。
10.如权利要求1-3中任一项所述的His标签抗体或其抗原结合片段或者如权利要求4或5所述的His标签双特异性抗体作为阳性标品在制备抗体检测试剂盒，特别是自身抗体检测试剂盒中的应用。
11.一种自身免疫抗体CBA法检测试剂盒，所述试剂盒包含如权利要求1-3中任一项所述的His标签抗体或其抗原结合片段或者如权利要求4或5所述的His标签双特异性抗体作为阳性标品。
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