CN114478784A

CN114478784A - 一种eno2单克隆抗体1c5及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN114478784A
Application number: CN202210011859.7A
Authority: CN
Inventors: 闫亚平; 郝文斌; 张亚剑; 穆瑜; 王璐; 刘龙月; 李科
Original assignee: Shaanxi Mybiotech Co ltd
Current assignee: Shaanxi Mybiotech Co ltd
Priority date: 2022-01-07
Filing date: 2022-01-07
Publication date: 2022-05-13
Anticipated expiration: 2042-01-07
Also published as: CN114478784B

Abstract

本发明提供了一种ENO2单克隆抗体1C5及其制备方法和应用，涉及单克隆抗体技术领域。本发明公开了所述单克隆抗体1C5的重链和轻链的可变区的互补决定区序列，基于所述序列，可将可变区序列构建到抗体表达载体上，转染细胞表达获得重组单克隆抗体。本发明得到的单克隆抗体1C5载体易于保存，易于抗体生产过程质量控制；本发明所述单克隆抗体1C5，可以识别ENO2蛋白，具有生物学活性，可用于ENO2抗原检测等其它科学研究，具有非常好的应用价值和非常重要科研指导意义。

Description

一种ENO2单克隆抗体1C5及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于单克隆抗体技术领域，具体涉及一种ENO2单克隆抗体1C5及其制备方法和应用。

背景技术

烯醇化酶是生物体内糖酵解过程中的关键酶，在脊椎动物中，烯醇化酶(enolase)存在3种同功酶:α、β和γ。α-enolase(ENO1)又称为非神经元烯醇化酶(non-neuralenolase,NNE)，在许多组织均存在；β-enolase(ENO3)又称为肌肉特异性烯醇化酶(muscle-specificenolase,MSE)、骨胳肌enolase(skeletalmuscleenolase)，几乎仅见于肌肉组织；γ-enolase(ENO2)又称为神经元烯醇化酶(neuraleno-lase)、神经元特异性烯醇化酶(neuron-specificeno-lase,NSE)，主要存在于神经元和神经内分泌组织。Enolase的活性形式均为二聚体，即由两个亚基组成，目前已知有5种形式的组合：αα、ββ、γγ、αβ和αγ。

烯醇化酶2(ENO2)又称NSE，NSE主要存在于神经元和神经内分泌细胞的胞质。神经元特异性烯醇化酶是一种普遍存在于生物体细胞质中能敏感反映神经元损伤的神经系统特异糖酵解酶。

NSE最早是作为小细胞肺癌的肿瘤标记物，但近年来越来越多的研究结果表明NSE可作为各类神经元损伤的特异性标志。在脑血管病，尤其在脑出血方面，越来越受到人们的重视。测定NSE在脑出血的诊断、判断疾病严重程度、估计预后和指导治疗等方面具有重要意义。

在脑损伤性疾病中，神经细胞中的NSE透过血脑屏障释放入脑脊液及血液中，引起血清及脑脊液中NSE水平升高，不同程度及不同性质的脑损伤NSE释放的量及速度亦不相同，且在广泛的脑损伤和越来越严重的继发性脑损伤患者中NSE持续升高，因此，其水平不仅能反映原发性脑损伤的程度，而且能反映继发性脑损伤的进展。检测血清NSE水平可为颅脑损伤和脑出血等脑血管性疾病诊断及预后判断提供一种新的手段。NSE作为神经重症监护的长期预后生物标志物和治疗指标具有极好的潜力。

但是目前关于NSE的检测，传统的产单克隆抗体的杂交瘤细胞不易保存，时间过长会出现细胞状态变差，甚至难以复苏，产生抗体量降低，并且抗体的序列未知，无法对抗体做更深入的研究

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种ENO2单克隆抗体1C5及其制备方法和应用

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种ENO2单克隆抗体1C5，所述单克隆抗体1C5包括重链和轻链；

所述轻链的可变区的互补决定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3所示；

所述重链的可变区的互补决定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4～SEQ ID NO.6所示。

优选的，所述单克隆抗体1C5的轻链可变区的骨架区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7～10所示；

所述单克隆抗体1C5的重链的可变区的骨架区的氨基酸序列如SEQ ID NO.11～14所示。

优选的，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示；

所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。

本发明还提供了编码上述ENO2单克隆抗体1C5的核酸，编码所述单克隆抗体1C5的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；

编码所述单克隆抗体1C5的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。

本发明还提供了一种表达上述单克隆抗体1C5的重组载体，所述重组载体的基础载体包括携带编码重链可变区核苷酸序列的pFUSE-CHIg-mG1，和携带编码轻链可变区核苷酸序列的pFUSE2ss-CLIg-mk。

优选的，所述编码重链可变区的核苷酸序列连接到pFUSE-CHIg-mG1的EcoRI和NheI之间；

所述编码轻链可变区的核苷酸序列连接到pFUSE2ss-CLIg-mk的EcoRI和NheI之间。

本发明还提供了一株表达上述单克隆抗体1C5的重组细胞，所述重组细胞的基础细胞包括哺乳动物细胞。

本发明还提供了上述重组细胞的构建方法，包括以下步骤：将所述单克隆抗体1C5的重链可变区连接到pFUSE-CHIg-mG1上，得1C5mG1；

将所述单克隆抗体1C5的轻链可变区连接到pFUSE2ss-CLIg-mk上，得1C5mk；

分别提取1C5mG1和1C5mk的质粒，混合后转染所述基础细胞，得重组细胞。

本发明还提供了一种制备上述单克隆抗体1C5的方法，对上述重组细胞培养48h，收集上清液，所述上清液中包含所述单克隆抗体1C5。

本发明还提供了上述单克隆抗体1C5或利用上述方法制备得到的单克隆抗体1C5在制备特异性检测ENO2的试剂中的应用。

本发明还提供了上述单克隆抗体1C5或利用上述方法制备得到的单克隆抗体1C5在制备脑血管性疾病诊断和/或预后判断的试剂中的应用。

有益效果：本发明提供一种ENO2单克隆抗体1C5，并具体公开了重链和轻链的可变区的互补决定区序列，基于所述序列，可将可变区序列构建到抗体表达载体上，转染细胞表达获得重组单克隆抗体。本发明得到的单克隆抗体1C5载体易于保存，易于抗体生产过程质量控制；也方便对抗体做一系列的改造，更深入的研究，更广泛的应用。经实施例验证，本发明所述单克隆抗体1C5或利用重组细胞生产得到的单克隆抗体1C5，可以识别ENO2蛋白，具有生物学活性，可用于ENO2抗原检测等其它科学研究，具有非常好的应用价值和非常重要科研指导意义。

附图说明

图1为免疫小鼠抗体效价测定结果；

图2为单克隆抗体电泳结果；

图3为单克隆抗体分型鉴定结果；

图4为单克隆抗体可变区序列示意图；

图5为Western Blot验证单克隆抗体特异性结果；

图6为ELISA验证单克隆抗体作用效果；

图7免疫荧光验证重组单克隆抗体在细胞内的表达情况。

具体实施方式

本发明所述单克隆抗体的轻链可变区，包括3个互补决定区，氨基酸序列分别为：

CDR1(SEQ ID NO.1)：Arg-Ser-Asn-Thr-Gly-Ala-Val-Thr-Thr-Ser-Asn-Tyr-Ala-Asn；

CDR2(SEQ ID NO.2)：Gly-Thr-Tyr-Asn-Arg-Ala-Pro；

CDR3(SEQ ID NO.3)：Ser-Leu-Trp-Tyr-Ser-Asn-His-Trp-Val。

本发明所述单克隆抗体的重链可变区，包括3个互补决定区，氨基酸序列分别为：

CDR1(SEQ ID NO.4)：Asp-Tyr-Tyr-Met-Ile；

CDR2(SEQ ID NO.5)：Phe-Ile-Arg-Asn-Lys-Ala-Asn-Gly-Tyr-Thr-Thr-Gln-Tyr-Asn-Ala-Ser-Val-Lys-Gly；

CDR3(SEQ ID NO.6)：Asp-Arg-Arg-Gly-Thr-Thr-Phe-Ala-Tyr。

本发明所述单克隆抗体的轻链可变区，包括4个骨架区，氨基酸序列分别为：

FR1(SEQ ID NO.7)：Gln-Ala-Val-Val-Thr-Gln-Glu-Ser-Ala-Leu-Thr-Thr-Ser-Pro-Gly-Glu-Thr-Val-Thr-Leu-Thr-Cys；

FR2(SEQ ID NO.8)：Trp-Val-Gln-Glu-Lys-Pro-Asp-His-Leu-Phe-Thr-Gly-Leu-Ile-Gly；

FR3(SEQ ID NO.9)：Gly-Val-Pro-Ala-Arg-Phe-Ser-Gly-Ser-Leu-Ile-Gly-Asp-Lys-Ala-Ala-Leu-Thr-Ile-Thr-Gly-Ala-Gln-Thr-Glu-Asp-Glu-Ala-Ile-Tyr-Phe-Cys；

FR4(SEQ ID NO.10)：Phe-Gly-Gly-Gly-Thr-Lys-Leu-Thr-Val-Leu。

本发明所述重链的可变区包括4个骨架区，氨基酸序列分别为：

FR1(SEQ ID NO.11)：Glu-Val-Lys-Leu-Val-Glu-Ser-Gly-Gly-Asp-Leu-Val-Gln-Pro-Gly-Gly-Ser-Leu-Arg-Leu-Ser-Cys-Ala-Thr-Ser-Gly-Phe-Thr-Phe-Thr；

FR2(SEQ ID NO.12)：Trp-Val-Arg-Gln-Pro-Pro-Gly-Lys-Ala-Leu-Glu-Trp-Leu-Gly；

FR3(SEQ ID NO.13)：Arg-Phe-Thr-Ile-Ser-Arg-Asp-Asn-Ser-Gln-Ser-Ile-Leu-Tyr-Leu-Gln-Met-Asn-Thr-Leu-Arg-Pro-Glu-Asp-Ser-Ala-Thr-Tyr-Tyr-Cys-Val-Arg；

FR4(SEQ ID NO.14)：Trp-Gly-Gln-Gly-Thr-Leu-Val-Thr-Val-Ser-Ala。

在本发明中，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示：MAWISLILSLLALSSGAISQAVVTQESALTTSPGETVTLTCRSNTGAVTTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTYNRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCSLWYSNHWVFGGGTKLTVL；所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO.16所示：MKLWLNWIFLVTLLNGIQCEVKLVESGGDLVQPGGSLRLSCATSGFTFTDYYMIWVRQPPGKALEWLGFIRNKANGYTTQYNASVKGRFTISRDNSQSILYLQMNTLRPEDSATYYCVRDRRGTTFAYWGQGTLVTVSA。

本发明还提供了编码上述ENO2单克隆抗体1C5的核酸，编码所述单克隆抗体1C5的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示：ATGGCCTGGATTTCACTTATACTCTCTCTCCTGGCTCTCAGCTCAGGGGCCATTTCCCAGGCTGTTGTGACTCAGGAATCTGCACTCACCACATCACCTGGTGAAACAGTCACACTCACTTGTCGCTCAAATACTGGGGCTGTTACAACTAGTAACTATGCCAACTGGGTCCAAGAAAAACCAGATCATTTATTCACTGGTCTAATAGGTGGTACCTACAACCGAGCTCCAGGTGTTCCTGCCAGATTCTCAGGCTCCCTGATTGGAGACAAGGCTGCCCTCACCATCACGGGGGCACAGACTGAGGATGAGGCAATATATTTCTGTTCTCTATGGTACAGCAACCATTGGGTGTTCGGTGGAGGAACCAAACTGACTGTCCTA；编码所述单克隆抗体1C5的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示：ATGAAGTTGTGGCTGAACTGGATTTTCCTTGTAACACTTTTAAATGGTATCCAGTGTGAGGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAGACTTGGTACAGCCTGGGGGTTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAACTTCTGGGTTCACCTTCACTGATTACTACATGATCTGGGTCCGCCAGCCTCCAGGAAAGGCACTTGAGTGGTTGGGTTTTATTAGAAACAAAGCTAATGGTTACACAACACAGTACAATGCATCTGTGAAGGGTCGGTTCACCATCTCCAGAGATAATTCCCAAAGCATCCTCTATCTTCAAATGAACACCCTGAGACCTGAGGACAGTGCCACTTATTACTGTGTAAGAGATAGGAGGGGGACGACATTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA。

本发明还提供了一种表达上述单克隆抗体1C5的杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞的构建方法优选包括构建包含人ENO2基因序列(NM_001975.3，SEQ ID NO.19)的原核表达载体，并将所述原核表达载体转化至TOP10感受态细胞中，挑取单克隆，提取质粒后转入大肠杆菌BL21(DE3)表达感受态细胞中，挑取单克隆培养并离心收集上清，经纯化得到纯化抗原；将所述纯化抗原免疫小鼠后，取免疫效果较好的小鼠的脾脏制备脾细胞；将所述脾细胞与杂交瘤细胞融合，筛选ELISA检测阳性杂交瘤细胞。

本发明还提供了一种利用所述杂交瘤细胞制备所述单克隆抗体1C5的方法，优选包括利用腹水制备单克隆抗体，纯化后得所述单克隆抗体1C5。本发明获得的ENO2单克隆抗体，重链属于IgG2a，轻链为lambda。

本发明所述携带编码重链可变区核苷酸序列的pFUSE-CHIg-mG1优选购自invivogen公司，且优选将所述SEQ ID NO.18所示的核苷酸序列优选插入所述pFUSE-CHIg-mG1的EcoRI和NheI位点，形成重组载体1C5mG1。

本发明所述携带编码轻链可变区核苷酸序列的pFUSE2ss-CLIg-mk优选购自invivogen公司，且优选将所述SEQ ID NO.17所示的核苷酸序列优选插入所述pFUSE2ss-CLIg-mk的EcoRI和NheI位点，形成重组载体1C5mk。

本发明对所述核苷酸序列插入载体的方法并没有特殊限定，优选包括双酶切。

本发明所述哺乳动物细胞的类型并没有特殊限定，优选包括293T细胞、CHO细胞或者其它哺乳动物细胞等，在本发明实施例中，以购自ATCC细胞库的293T细胞为例进行说明，但是不能仅将其认定为本发明的全部保护范围。

本发明所述1C5mG1和1C5mk的构建方法优选与上述相同，在此不再赘述。

本发明对所述质粒的提取方法并没有特殊限定，优选利用试剂盒法，实施例中选用TIANGEN BIOTECH质粒提取试剂盒。本发明所述1C5mG1和1C5mk的质粒的混合比例优选为2:3。本发明利用混合质粒转染基础细胞，本发明对所述转染的方法并没有特殊限定。

本发明所述培养优选包括在37℃和5％CO₂环境中培养48h，离心，收集细胞培养的上清液，上清液中包含所述单克隆抗体1C5。

本发明所述单克隆抗体1C5或利用重组细胞生产的单克隆抗体1C5，可特异性识别ENO2蛋白，具有生物学活性，可用于特异性检测ENO2。

在本发明中，ENO2与脑血管性疾病，尤其是颅脑损伤和脑出血的发生、发展和预后判断等相关，因此本发明所述单克隆抗体1C5可用于制备相关的试剂.

下面结合实施例对本发明提供的一种ENO2单克隆抗体1C5及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1 ENO2蛋白制备

步骤一、ENO2原核表达载体构建

1.从GenBank序列数据库中查得人ENO2基因序列(SEQ ID NO.19)，序列号为NM_001975.3，合成该基因序列到pET-32a载体的NdeI和NotI之间，同时将目的基因ENO2连接到pGEX 4t-1载体的EcoRI和NotI之间；

2.设计好引物，PCR扩增出目的条带。

上游引物ENO2(4t-1)-EcoRI-F(SEQ ID NO.20)：

ATCTGGTTCCGCGTGGATCCCCGGAATTCatgtccatagagaagatctgggc；

下游引物ENO2(4t-1)-NotI-R(SEQ ID NO.21)：

CAGTCAGTCACGATGCGGCCGCTCGAGtcacagcacactgggattacgga。

PCR扩增体系(50μl)：模板50ng、ENO2(4t-1)-EcoRI-F(10μM)1μl、ENO2(4t-1)-EcoRI-R(10μM)1μl、FastPfu DNA Polymerase(2.5units)1μl、5×FastPfu buffer 10μl、2.5mM dNTP 4μl和余量的Nuclease-free Water；

PCR扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性20s，58℃退火20s，72℃延伸40s，变性到延伸35个循环；72℃再延伸5min；4℃保存。

3.将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，分别将目的片段和载体用相应的限制性内切酶酶切，回收；

4.将目的片段和载体用同源重组酶连接，50℃连接15min；

5.将连接产物转化至TOP10感受态细胞，37℃培养箱过夜培养；

6.挑取单克隆至相应Amp抗性的LB培养基，37℃摇床过夜培养；

7.提取质粒，测序，比对结果。

步骤二、ENO2蛋白表达及纯化

1.将构建好且测序正确的质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)表达感受态细胞中；

2.挑取单克隆接于LB培养基中，37℃摇菌至OD值0.5～1，加IPTG诱导，16℃过夜表达；

3.收集菌体，超声破碎，离心后收集上清，pET-30a表达的ENO2蛋白利用Ni柱亲和层析纯化，纯化的蛋白记为ENO2-his；pGEX 4t-1表达的ENO2蛋白利用GST柱纯化，纯化的蛋白记为ENO2-GST；

纯化后的蛋白经过透析、浓缩，得到高浓度的ENO2-his蛋白作为抗原备用，ENO2-GST蛋白用于包被ELISA板检测ENO2抗体。

实施例2杂交瘤细胞的获得

步骤一、ENO2抗原免疫小鼠

1.将40μg纯化好的ENO2-his抗原与完全氟氏佐剂1:1混合；

2.取5只6～8周龄的雌性Balb/c小鼠，左侧后小腿肌肉注射100μL(40μg抗原)混合好的抗原；三周后进行第二次免疫，40μg抗原与不完全氟氏佐剂1:1混合，右侧后小腿肌肉注射100μL(40μg抗原)混合好的抗原；

步骤二、ELISA检测小鼠产生抗体的情况

第二次免疫后再过三周采集鼠尾血，离心收集血清，ELISA检测小鼠产生抗体的情况，具体步骤如下：

①用纯化好的ENO2-GST蛋白包被ELISA板，100ng/孔，4℃过夜包被，包被液：25mL碳酸盐缓冲液，pH 9.6(Na₂CO₃0.03975g，NaHCO₃0.07325g，KH₂PO₄0.00625g)；

②PBST洗3次，每次3min，每次拍干；

③2％BSA满孔封闭，37℃孵育1h；

④PBST洗3次，每次3min，每次拍干；

⑤将血清用稀释液进行倍比稀释，按1：4万、1：8万、1：16万、1：32万、1：64万、1:128万、1:256万、1:512万稀释，每孔加入100μL，37℃孵育1h，用PBST洗涤3次，每次3min，每次拍干；

⑥羊抗鼠IgG-HRP 1：5000稀释，37℃孵育30min；

⑦PBST洗涤3次，拍干后，TMB显色10min，2M H₂SO₄终止，450nm测得吸光值。结果见图1，33号小鼠抗体效价1024万以上，44号小鼠抗体效价500万以上。

步骤三、细胞融合

1.骨髓瘤细胞的准备

复苏SP2/0细胞，用15％胎牛血清DMEM培养液传代培养一周。融合时，选对数生长期的骨髓瘤细胞。

2.脾细胞的制备

取免疫效果好的44号小鼠，摘除眼球采血分离血清，并颈脱位将小鼠致死，75％酒精中浸泡5min消毒；在超净台内，固定好小鼠，取出脾脏，用剪刀去掉粘连细胞的脂肪组织和结缔组织；将脾脏用无血清培养液冲洗后，置于细胞滤网上，用注射器内芯轻轻研磨，并用无血清培养液轻柔冲洗滤网，收集脾细胞悬液；500g离心5min，洗涤细胞3次，弃掉上清液，细胞沉淀用无血清DMEM培养液悬浮，计数备用。

3.细胞融合

在超净台内准备好37℃水浴锅，将SP2/0细胞和脾细胞按1:10比例加入50ml离心管中，混匀。500g离心10min，吸出上清液，轻弹离心管底部，使细胞沉淀略加松动；在90s内慢慢滴入预温至37℃的45％PEG1450溶液1mL；并不断地轻轻摇晃离心管；整个过程离心管都在37℃水浴中。

然后向细胞混合物中逐渐加入DMEM培养基，第一分钟逐滴滴入lmL，第二分钟加2mL，第3min加3mL，第4min加4mL，第5min加5mL，37℃水浴中边加边摇晃。然后37℃孵育15min，500g离心5min，去掉上清。

加入5ml含有HAT的DMEM培养基，轻轻悬浮沉淀细胞，最后补加含有HAT的DMED培养基至100mL左右。分装于已铺巨噬细胞的96孔细胞培养板中，100uL/孔，然后将培养板置37℃，5％CO₂培养箱培养。

步骤三、ELISA检测阳性杂交瘤细胞

1.用pGEX 4t-1载体表达的ENO2(ENO2-GST)蛋白包被ELISA板，100ng/孔，4℃过夜包被。

2.观察杂交瘤细胞的生长情况，七天后待其细胞培养上清变黄时，吸取适量细胞上清进行ELISA检测抗体。

3.根据ELISA结果，选取OD值高的克隆，高于阴性对照两倍以上，铺96孔板，进行第一次亚克隆筛选。

4.七到十天后再进行ELISA检测抗体，选取OD值高的克隆，铺96孔板，进行第二次亚克隆筛选，使每孔约1个细胞；

5.培养七到十天后再进行ELISA检测抗体，选取OD值高的克隆，铺96孔板，进行第三次亚克隆筛选，使每孔约1个细胞。选取OD值高的几个克隆，进行进一步的验证。最终筛选出1个阳性克隆细胞，命名为：1C5。

实施例3腹水制备单克隆抗体及单克隆抗体纯化

步骤一、腹水制备单克隆抗体

1.注射300μl腹水佐剂至12周龄Balb/c小鼠腹腔。

2.两周后将杂交瘤细胞培养至细胞活性状态最佳，将细胞数量调至约1×10⁶个/100ul，接种100ul杂交瘤细胞到已注射腹水佐剂的小鼠腹腔。

3.7～10天后收集腹水。

步骤二、单克隆抗体纯化

1.腹水用PBS pH7.4稀释，离心取上清，用protein G亲和层析进行纯化。

2.平衡：用0.4M PB缓冲液(pH 7.0)平衡纯化柱子；

3.上柱：将稀释后的腹水上清缓慢过柱，保证抗体更好的结合在protein G柱子上；

4.洗涤：再用平衡缓冲液洗涤柱子；

5.洗脱：用0.1M甘氨酸缓冲液(pH 2.7)洗脱结合在柱子上的抗体，并加入1MTris-HCl(pH 8.0)中和甘氨酸，使pH保持为适合抗体保存的中性。

分别取纯化后的单克隆抗体和对照血清进行SDS-PAGE电泳，结果如图2所示，可清晰的看到抗体的重链和轻链。

实施例4单克隆抗体分型鉴定

1.用pGEX 4t-1载体表达的ENO2包被ELISA板，100ng/孔，过夜包被。

2.用PBST洗涤包被好的ELISA板3次，用2％BSA满孔封闭1小时；

3.加杂交瘤细胞上清100μl，37℃孵育1h；用PBST洗涤3次；

4.孵育HRP标记的二抗(IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c、IgG3、IgM、IgG kappa chain)，37℃孵育30min。

5.PBST洗涤3次，TMB显色，450nm测得吸光值。

实验结果如图3，1C5单克隆抗体重链为IgG2a。轻链抗kappa抗体未能检出信号，推测1C5单克隆抗体轻链为lambda，需要经过测序确定。

实施例5单克隆抗体序列测定

1.提取实施例2中培养好的杂交瘤细胞提取RNA；

2.用5’RACE方法扩增出抗体重链和轻链可变区片段；

3.将扩增出的片段连接到pEASY-Blunt载体上，提取质粒，测序，结果显示轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示；

4.使用Kabat方法标记出抗体氨基酸序列的CDR区(SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6)，如图4所示。

经过测序确定1C5单克隆抗体轻链为lambda。

实施例6单克隆抗体应用效果

1、Western验证单克隆抗体的特异性

1)将ENO2 C末端加上flag标签，连接到真核表达载体pcDNA3.1的NheI和NotI之间；

2)将构建好的ENO2flag-pcDNA3.1和空载体对照pcDNA3.1转染至10cm细胞培养皿；

3)48h后，收集细胞，超声破碎，15000rpm离心20min收集上清蛋白。

4)取50μl蛋白上清，加10μl 6×protein Loading，100℃金属浴煮10min；

5)准备好SDS-PAGE胶，煮好的蛋白上样20μ，120V电压至蓝色loading跑至胶底部；

6)转PVDF膜后用5％脱脂奶粉封闭2h；

7)孵育杂交瘤细胞上清2h，TBST洗涤3次，HRP标记的二抗孵育1h；

8)TBST洗涤3次，ECL显色曝光。结果如图5所示：ENO2mab是购买的商业化的抗体，作为阳性对照，正常鼠血作阴性对照。单克隆抗体1C5能够特异的识别ENO2抗原，在293T细胞和人血清中均具有较高的特异性。

2、ELISA验证单克隆抗体的作用效果

1)构建载体

将ENO1(NM_001428.5，SEQ.ID.NO.22)、ENO3(NM_001374524.1，SEQ.ID.NO.23)分别构建在pGEX 4t-1载体的EcoRI和NotI之间；

2)构建好的质粒转化至BL21(DE3)表达感受态，摇菌，ITPG诱导表达；

3)收集菌体，超声破碎后离心，收集上清，过GST柱纯化；

4)得到的ENO1、ENO3蛋白记为ENO1-GST、ENO3-GST，将蛋白透析、浓缩，测得蛋白浓度；

5)将ENO1-GST、ENO2-GST、ENO3-GST包被ELISA板，100ng/孔，4℃过夜包被；

6)用PBST洗涤包被好的ELISA板3次，再用2％BSA满板封闭1小时；

7)用PBST洗涤3次，每次拍干；

8)加杂交瘤细胞上清100μl，37℃孵育1h；用PBST洗涤3次，每次拍干；

9)孵育HRP标记的二抗，37℃孵育30min。

10)用PBST洗涤3次，每次拍干；

11)TMB显色10min，2M H₂SO₄终止，450nm测得吸光值。实验结果见表1和图6，1C5单克隆抗体可以识别ENO2抗原。

表1 ELISA验证单克隆抗体的作用效果(OD₄₅₀)

实施例7重组1C5单克隆抗体及其作用效果

步骤一、抗体表达载体构建

1)将测序确定的抗体重链(SEQ ID NO.16)和轻链(SEQ ID NO.15)可变区分别连接到抗体表达载体pFUSE-CHIg-mG1/G2a、pFUSE2ss-CLIg-mk的EcoRI和NheI之间，记为1C5mG1、1C5mk。

2)测序正确后大量提取质粒，用于细胞转染制备抗体。

步骤二、ELISA验证重组单克隆抗体的作用效果

1)将玻片铺在10cm细胞培养皿里，多聚赖氨酸处理后，将293T细胞均匀的种在皿里，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱过夜培养；

2)细胞转染：将构建好的重组抗体表达质粒1C5mG1、1C5mk、1C5mG1+1C5mk、mG1+mk转入上述准备好的293T细胞，mG1+mk为空载体对照，37℃、5％CO₂培养48h。

3)将纯化的ENO2蛋白包被ELISA板，100ng/孔，4℃过夜包被；

4)用2％BSA37℃满板封闭1小时，PBST洗涤3次；

5)收集上述培养好的细胞上清，离心取上清，加100μl到包被好的ELISA板孔里，杂交瘤细胞上清作为阳性对照，37℃孵育1h；用PBST洗涤3次，每次拍干；

6)孵育HRP标记的抗重链二抗IgG、抗轻链二抗IgG Kappa chain，37℃孵育30min。

7)用PBST洗涤3次，每次拍干；

8)TMB显色10min，2M H₂SO₄终止，450nm测得吸光值。

实验结果见表2，单独转染重组1C5抗体重链1C5mG1和轻链1C5mk，细胞上清未能检测出信号；共同转染重链1C5mG1和轻链1C5mk，细胞上清检测出抗ENO2抗体。1C5单克隆抗体在293T细胞中成功表达，并且分泌于细胞上清。该重组单克隆抗体可以识别ENO2蛋白，具有生物学活性。

表2 ELISA验证重组1C5单克隆抗体作用效果

步骤三、免疫荧光验证重组单克隆抗体在细胞内的表达情况

1)将步骤二中的细胞用丙酮固定30min，培养箱干燥后备用；

2)分别用Alexa Fluor 594标记的抗重链二抗IgG、抗轻链二抗IgG Kappa chain孵育上述制备好的片子，室温30min；

3)PBST洗涤3次，Alexa Fluor 594标记的二抗孵育30min；

4)PBST洗涤3次，显微镜观察结果。

实验结果如图7所示，重链1C5mG1和轻链1C5mk共同转染293T细胞后，可以检测到信号；结合上述ELISA结果，重组1C5单克隆抗体在293T细胞中成功表达，并且成功分泌于细胞上清。该重组单克隆抗体可以识别ENO2蛋白，具有生物学活性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 陕西脉元生物科技有限公司

<120> 一种ENO2单克隆抗体1C5及其制备方法和应用

<160> 23

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Arg Ser Asn Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn

1 5 10

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Gly Thr Tyr Asn Arg Ala Pro

1 5

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ser Leu Trp Tyr Ser Asn His Trp Val

1 5

<210> 4

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Asp Tyr Tyr Met Ile

1 5

<210> 5

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Gln Tyr Asn Ala Ser

1 5 10 15

Val Lys Gly

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Asp Arg Arg Gly Thr Thr Phe Ala Tyr

1 5

<210> 7

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys

20

<210> 8

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly Leu Ile Gly

1 5 10 15

<210> 9

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala

1 5 10 15

Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys

20 25 30

<210> 10

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

1 5 10

<210> 11

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr

20 25 30

<210> 12

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Gly

1 5 10

<210> 13

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Ser Ile Leu Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asn Thr Leu Arg Pro Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Val Arg

20 25 30

<210> 14

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

1 5 10

<210> 15

<211> 128

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Met Ala Trp Ile Ser Leu Ile Leu Ser Leu Leu Ala Leu Ser Ser Gly

1 5 10 15

Ala Ile Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser

20 25 30

Pro Gly Glu Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Asn Thr Gly Ala Val

35 40 45

Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu

50 55 60

Phe Thr Gly Leu Ile Gly Gly Thr Tyr Asn Arg Ala Pro Gly Val Pro

65 70 75 80

Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile

85 90 95

Thr Gly Ala Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ser Leu Trp

100 105 110

Tyr Ser Asn His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

115 120 125

<210> 16

<211> 139

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Met Lys Leu Trp Leu Asn Trp Ile Phe Leu Val Thr Leu Leu Asn Gly

1 5 10 15

Ile Gln Cys Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln

20 25 30

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe

35 40 45

Thr Asp Tyr Tyr Met Ile Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu

50 55 60

Glu Trp Leu Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser

85 90 95

Gln Ser Ile Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Pro Glu Asp Ser

100 105 110

Ala Thr Tyr Tyr Cys Val Arg Asp Arg Arg Gly Thr Thr Phe Ala Tyr

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

130 135

<210> 17

<211> 384

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

atggcctgga tttcacttat actctctctc ctggctctca gctcaggggc catttcccag 60

gctgttgtga ctcaggaatc tgcactcacc acatcacctg gtgaaacagt cacactcact 120

tgtcgctcaa atactggggc tgttacaact agtaactatg ccaactgggt ccaagaaaaa 180

ccagatcatt tattcactgg tctaataggt ggtacctaca accgagctcc aggtgttcct 240

gccagattct caggctccct gattggagac aaggctgccc tcaccatcac gggggcacag 300

actgaggatg aggcaatata tttctgttct ctatggtaca gcaaccattg ggtgttcggt 360

ggaggaacca aactgactgt ccta 384

<210> 18

<211> 417

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

atgaagttgt ggctgaactg gattttcctt gtaacacttt taaatggtat ccagtgtgag 60

gtgaagctgg tggagtctgg aggagacttg gtacagcctg ggggttctct gagactctcc 120

tgtgcaactt ctgggttcac cttcactgat tactacatga tctgggtccg ccagcctcca 180

ggaaaggcac ttgagtggtt gggttttatt agaaacaaag ctaatggtta cacaacacag 240

tacaatgcat ctgtgaaggg tcggttcacc atctccagag ataattccca aagcatcctc 300

tatcttcaaa tgaacaccct gagacctgag gacagtgcca cttattactg tgtaagagat 360

aggaggggga cgacatttgc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgca 417

<210> 19

<211> 1305

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

atgtccatag agaagatctg ggcccgggag atcctggact cccgcgggaa ccccacagtg 60

gaggtggatc tctatactgc caaaggtctt ttccgggctg cagtgcccag tggagcctct 120

acgggcatct atgaggccct ggagctgagg gatggagaca aacagcgtta cttaggcaaa 180

ggtgtcctga aggcagtgga ccacatcaac tccaccatcg cgccagccct catcagctca 240

ggtctctctg tggtggagca agagaaactg gacaacctga tgctggagtt ggatgggact 300

gagaacaaat ccaagtttgg ggccaatgcc atcctgggtg tgtctctggc cgtgtgtaag 360

gcaggggcag ctgagcggga actgcccctg tatcgccaca ttgctcagct ggccgggaac 420

tcagacctca tcctgcctgt gccggccttc aacgtgatca atggtggctc tcatgctggc 480

aacaagctgg ccatgcagga gttcatgatc ctcccagtgg gagctgagag ctttcgggat 540

gccatgcgac taggtgcaga ggtctaccat acactcaagg gagtcatcaa ggacaaatac 600

ggcaaggatg ccaccaatgt gggggatgaa ggtggctttg cccccaatat cctggagaac 660

agtgaagcct tggagctggt gaaggaagcc atcgacaagg ctggctacac ggaaaagatc 720

gttattggca tggatgttgc tgcctcagag ttttatcgtg atggcaaata tgacttggac 780

ttcaagtctc ccactgatcc ttcccgatac atcactgggg accagctggg ggcactctac 840

caggactttg tcagggacta tcctgtggtc tccattgagg acccatttga ccaggatgat 900

tgggctgcct ggtccaagtt cacagccaat gtagggatcc agattgtggg tgatgacctg 960

acagtgacca acccaaaacg tattgagcgg gcagtggaag aaaaggcctg caactgtctg 1020

ctgctcaagg tcaaccagat cggctcggtc actgaagcca tccaagcgtg caagctggcc 1080

caggagaatg gctggggggt catggtgagt catcgctcag gagagactga ggacacattc 1140

attgctgacc tggtggtggg gctgtgcaca ggccagatca agactggtgc cccgtgccgt 1200

tctgaacgtc tggctaaata caaccagctc atgagaattg aggaagagct gggggatgaa 1260

gctcgctttg ccggacataa cttccgtaat cccagtgtgc tgtga 1305

<210> 20

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

atctggttcc gcgtggatcc ccggaattca tgtccataga gaagatctgg gc 52

<210> 21

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

cagtcagtca cgatgcggcc gctcgagtca cagcacactg ggattacgga 50

<210> 22

<211> 1305

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

atgtctattc tcaagatcca tgccagggag atctttgact ctcgcgggaa tcccactgtt 60

gaggttgatc tcttcacctc aaaaggtctc ttcagagctg ctgtgcccag tggtgcttca 120

actggtatct atgaggccct agagctccgg gacaatgata agactcgcta tatggggaag 180

ggtgtctcaa aggctgttga gcacatcaat aaaactattg cgcctgccct ggttagcaag 240

aaactgaacg tcacagaaca agagaagatt gacaaactga tgatcgagat ggatggaaca 300

gaaaataaat ctaagtttgg tgcgaacgcc attctggggg tgtcccttgc cgtctgcaaa 360

gctggtgccg ttgagaaggg ggtccccctg taccgccaca tcgctgactt ggctggcaac 420

tctgaagtca tcctgccagt cccggcgttc aatgtcatca atggcggttc tcatgctggc 480

aacaagctgg ccatgcagga gttcatgatc ctcccagtcg gtgcagcaaa cttcagggaa 540

gccatgcgca ttggagcaga ggtttaccac aacctgaaga atgtcatcaa ggagaaatat 600

gggaaagatg ccaccaatgt gggggatgaa ggcgggtttg ctcccaacat cctggagaat 660

aaagaaggcc tggagctgct gaagactgct attgggaaag ctggctacac tgataaggtg 720

gtcatcggca tggacgtagc ggcctccgag ttcttcaggt ctgggaagta tgacctggac 780

ttcaagtctc ccgatgaccc cagcaggtac atctcgcctg accagctggc tgacctgtac 840

aagtccttca tcaaggacta cccagtggtg tctatcgaag atccctttga ccaggatgac 900

tggggagctt ggcagaagtt cacagccagt gcaggaatcc aggtagtggg ggatgatctc 960

acagtgacca acccaaagag gatcgccaag gccgtgaacg agaagtcctg caactgcctc 1020

ctgctcaaag tcaaccagat tggctccgtg accgagtctc ttcaggcgtg caagctggcc 1080

caggccaatg gttggggcgt catggtgtct catcgttcgg gggagactga agataccttc 1140

atcgctgacc tggttgtggg gctgtgcact gggcagatca agactggtgc cccttgccga 1200

tctgagcgct tggccaagta caaccagctc ctcagaattg aagaggagct gggcagcaag 1260

gctaagtttg ccggcaggaa cttcagaaac cccttggcca agtaa 1305

<210> 23

<211> 1332

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

atggccgtta tgaggaccct aagagccatg gccatgcaga aaatctttgc ccgggaaatc 60

ttggactcca ggggcaaccc cacggtggag gtggacctgc acacggccaa gggccgattc 120

cgagcagctg tgcccagtgg ggcttccacg ggtatctatg aggctctgga actaagagac 180

ggagacaaag gccgctacct ggggaaagga gtcctgaagg ctgtggagaa catcaacaat 240

actctgggcc ctgctctgct gcaaaagaaa ctaagcgttg tggatcaaga aaaagttgac 300

aaatttatga ttgagctaga tgggaccgag aataagtcca agtttggggc caatgccatc 360

ctgggcgtgt ccttggccgt gtgtaaggcg ggagcagctg agaagggggt ccccctgtac 420

cgccacatcg cagatctcgc tgggaaccct gacctcatac tcccagtgcc agccttcaat 480

gtgatcaacg ggggctccca tgctggaaac aagctggcca tgcaggagtt catgattctg 540

cctgtgggag ccagctcctt caaggaagcc atgcgcattg gcgccgaggt ctaccaccac 600

ctcaaggggg tcatcaaggc caagtatggg aaggatgcca ccaatgtggg tgatgaaggt 660

ggcttcgcac ccaacatcct ggagaacaat gaggccctgg agctgctgaa gacggccatc 720

caggcggctg gttacccaga caaggtggtg atcggcatgg atgtggcagc atctgagttc 780

tatcgcaatg ggaagtacga tcttgacttc aagtcgcctg atgatcccgc acggcacatc 840

actggggaga agctcggaga gctgtataag agctttatca agaactatcc tgtggtctcc 900

atcgaagacc cctttgacca ggatgactgg gccacttgga cctccttcct ctcgggggtg 960

aacatccaga ttgtggggga tgacttgaca gtcaccaacc ccaagaggat tgcccaggcc 1020

gttgagaaga aggcctgcaa ctgtctgctg ctgaaggtca accagatcgg ctcggtgacc 1080

gaatcgatcc aggcgtgcaa actggctcag tctaatggct ggggggtgat ggtgagccac 1140

cgctctgggg agactgagga cacattcatt gctgaccttg tggtggggct ctgcacagga 1200

cagatcaaga ctggcgcccc ctgccgctcg gagcgtctgg ccaaatacaa ccaactcatg 1260

aggatcgagg aggctcttgg ggacaaggca atctttgctg gacgcaagtt ccgtaacccg 1320

aaggccaagt ga 1332

Claims

1.一种ENO2单克隆抗体1C5，其特征在于，所述单克隆抗体1C5包括重链和轻链；

2.根据权利要求1所述单克隆抗体1C5，其特征在于，所述单克隆抗体1C5的轻链可变区的骨架区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7～10所示；

3.根据权利要求2所述单克隆抗体1C5，其特征在于，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示；

所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。

4.编码权利要求1～3任一项所述ENO2单克隆抗体1C5的核酸，其特征在于，编码所述单克隆抗体1C5的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；

5.一种表达权利要求1～3任一项所述单克隆抗体1C5的重组载体，其特征在于，所述重组载体的基础载体包括携带编码重链可变区核苷酸序列的pFUSE-CHIg-mG1，和携带编码轻链可变区核苷酸序列的pFUSE2ss-CLIg-mk。

6.一株表达权利要求1～3任一项所述单克隆抗体1C5的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞的基础细胞包括哺乳动物细胞。

7.权利要求6所述重组细胞的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：将所述单克隆抗体1C5的重链可变区连接到pFUSE-CHIg-mG1上，得1C5mG1；

8.一种制备权利要求1～3任一项所述单克隆抗体1C5的方法，其特征在于，对权利要求6所述重组细胞培养48h，收集上清液，所述上清液中包含所述单克隆抗体1C5。

9.权利要求1～3任一项所述单克隆抗体1C5或利用权利要求8所述方法制备得到的单克隆抗体1C5在制备特异性检测ENO2的试剂中的应用。

10.权利要求1～3任一项所述单克隆抗体1C5或利用权利要求8所述方法制备得到的单克隆抗体1C5在制备脑血管性疾病诊断和/或预后判断的试剂中的应用。