CN115894698A - 一种人chi3l1单克隆抗体1d7、重组载体、重组质粒及方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于抗体制备技术领域，属于一种人CHI3L1单克隆抗体1D7、重组载体、重组质粒及方法和应用。本发明提供了一种可特异性识别CHI3L1的单克隆抗体1D7，所述单克隆抗体1D7包括重链和轻链；所述重链的可变区包括3个重链互补决定区，所述3个重链互补决定区的氨基酸序列如SEQ IDNO.1～SEQ ID NO.3所示，或如SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.13所示；所述单克隆抗体1D7的轻链可变区包括3个轻链互补决定区，氨基酸序列如SEQ IDNO.4～SEQ ID NO.6所示。本发明所述单克隆抗体效价良好，并且用于制备所述单克隆抗体的表达载体和重组细胞，易于保存和改造。

Description

一种人CHI3L1单克隆抗体1D7、重组载体、重组质粒及方法和应用

技术领域

本发明属于抗体制备技术领域，具体涉及一种人CHI3L1单克隆抗体1D7、重组载体、重组质粒及方法和应用。

背景技术

几丁质酶-3样蛋白1(Chitinase-3-likeprotein 1，CHI3L1)是几丁质酶糖苷水解酶18家族成员之一。CHI3L1是一种分泌糖蛋白，大小约为40kDa，在巨噬细胞、软骨细胞、成纤维细胞样滑膜细胞、血管平滑肌细胞和肝星状细胞等多种细胞中表达和分泌。CHI3L1有2种亚型：一种为全长亚型包含所有10个外显子，另一种短变体的外显子8被选择性剪接删除。人体中存在8个几丁质酶的糖苷水解酶18家族成员，CHI3L1作为人体糖基水解酶18家族的糖蛋白成员之一，具有几丁质结合活性，但缺乏几丁质酶活性。该蛋白由1个(β/α)8桶状结构域和1个由6条反平行β链构成的第二结构域组成，链β7后插入1个α螺旋(α+β)结构域，同时(β/α)8桶状结构中β链的C端具有1个含43个残基的碳水化合物结合位点，侧边的堆叠可以控制蛋白质-碳水化合物的相互作用。该结构决定了CHI3L1可以作为传感器激活先天防御同时调节感染引起的炎症反应，也可能有助于肿瘤的发生。目前研究表明该蛋白的表达与炎症、细胞外组织重塑、纤维化、实体癌及哮喘相关疾病的发生发展过程密切相关。

研究发现CHI3L1在神经系统疾病发展进程中发挥重要作用。CHI3L1的表达受NFI-X3、STAT3和AP-1的控制，能够促进原代星形胶质细胞的迁移。它的缺失可以改变胶质细胞炎症反应，促进星形胶质细胞和小胶质细胞Aβ吞噬，减轻淀粉样斑块形成，并影响阿尔兹海默症(AD)的疾病进展；CHI3L1对创伤性脑损伤(TBI)相关的神经炎症反应有调节作用，它的缺失导致更严重的神经病理学现象和更显著的胶质细胞病变进程；此外，CHI3L1的高表达可促使主动脉粥样硬化斑块含量显著升高，颈动脉斑块新生血管高度增加，颈动脉斑块中的胶原蛋白含量显著降低。在早期人颈动脉斑块和小鼠模型斑块中，CHI3L1表达促进病变面积显著增加，同时明显抑制巨噬细胞凋亡。CHI3L1表现出医学应用中的巨大发展潜力，随着研究的进一步深入，CHI3L1可能成为中枢神经系统相关病的诊断标志和治疗的新靶标。CHI3L1检测用抗体可用于CHI3L1抗原检测等其它科学研究，但当前用于CHI3L1检测的抗体大部分来自于杂交瘤细胞，传统的杂交瘤细胞不易保存，使用时间过长会出现细胞状态变差，难以复苏等情况。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人CHI3L1单克隆抗体1D7、重组载体、重组质粒及方法和应用。本发明所述单克隆抗体效价良好，并且用于制备所述单克隆抗体的表达载体和重组细胞，易于保存和改造。

本发明提供了一种可特异性识别CHI3L1的单克隆抗体1D7，所述单克隆抗体1D7包括重链和轻链；所述重链的可变区包括3个重链互补决定区，所述3个重链互补决定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3所示，或如SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.13所示；所述单克隆抗体1D7的轻链可变区包括3个轻链互补决定区，氨基酸序列如SEQ ID NO.4～SEQID NO.6所示。

优选的是，所述单克隆抗体1D7的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示或如SEQ ID NO.14所示；所述单克隆抗体1D7的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。

优选的是，编码所述单克隆抗体1D7的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示或如SEQ ID NO.15所示；编码所述单克隆抗体1D7轻链可变区的核苷酸序列如SEQ IDNO.10所示。

本发明还提供了一种表达单克隆抗体1D7的重组载体，所述重组载体包括携带编码单克隆抗体1D7重链可变区的核苷酸序列的载体和携带编码单克隆抗体1D7轻链可变区核苷酸序列的载体；所述携带编码单克隆抗体1D7重链可变区的核苷酸序列的载体的基础载体包括pFUSE-CHIg-m2a，所述携带编码单克隆抗体1D7轻链可变区核苷酸序列的载体的基础载体包括pFUSE2ss-CLIg-mk；编码所述单克隆抗体1D7的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；编码所述单克隆抗体1D7的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

优选的是，所述单克隆抗体1D7的重链可变区的核苷酸序列连接到pFUSE-CHIg-m2a的EcoRI和NheI之间；所述单克隆抗体1D7的轻链可变区连接到pFUSE2ss-CLIg-mk的EcoRI和NheI之间。

本发明还提供了一种表达单克隆抗体1D7的重组细胞，所述重组细胞含上述技术方案所述重组载体，所述重组细胞的基础细胞包括哺乳动物细胞。

本发明还提供了上述技术方案所述重组细胞的构建方法，包括以下步骤：将上述技术方案所述重组载体混合后转染所述基础细胞，得重组细胞。

本发明还提供了一种制备上述技术方案所述单克隆抗体1D7的方法，包括以下步骤：对上述技术方案所述重组细胞培养48h，离心，收集上清液。

本发明还提供了上述技术方案所述单克隆抗体1D7或上述技术方案所述的重组载体或上述技术方案所述的重组细胞或上述技术方案所述构建方法构建得到的重组细胞或上述技术方案所述方法制备得到的单克隆抗体1D7在制备检测CHI3L1的试剂中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述单克隆抗体1D7或上述技术方案所述的重组载体或上述技术方案所述的重组细胞或上述技术方案所述构建方法构建得到的重组细胞或上述技术方案所述方法制备得到的单克隆抗体1D7在制备神经系统疾病诊断和/或预后判断的试剂中的应用。

本发明提供了一种人CHI3L1单克隆抗体1D7。本发明所述单克隆抗体1D7效价良好，基于本发明重链和轻链的可变区的互补决定区序列，构架表达载体，转染细胞，能够实现本发明所述单克隆抗体1D7的表达。本发明所述单克隆抗体1D7载体易于保存，易于抗体生产过程质量控制；也方便对抗体做一系列的改造，更深入的研究，更广泛的应用。经实施例验证，本发明所述的单克隆抗体1D7或利用重组细胞生产得到的单克隆抗体1D7，可以识别CHI3L1蛋白，具有生物学活性。所述单克隆抗体均可用于CHI3L1抗原检测等其它科学研究，具有非常好的应用价值和非常重要科研指导意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明提供的CBA法检测免疫小鼠血清抗体效价结果图；

图2为本发明提供的CBA法筛选阳性杂交瘤细胞结果图；

图3为本发明提供的单克隆抗体亚型鉴定结果图；其中，每组数据从左到右依次表示IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、kappa和lambda；

图4为本发明提供的单克隆抗体抗体效价测定结果图；

图5为本发明提供的免疫荧光验证单克隆抗体抗原表位分布情况图；其中，(a)抗体识别位点位于氨基酸序列的293-383区间示意图；(b)抗体识别位点位于329-346氨基酸片段上的示意图；

图6为本发明提供的WB验证重组单克隆抗体作用特征结果图。

具体实施方式

本发明提供了一种可特异性识别CHI3L1的单克隆抗体1D7，所述单克隆抗体1D7包括重链和轻链；所述重链的可变区包括3个重链互补决定区，所述3个重链互补决定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3所示，或如SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.13所示；所述单克隆抗体1D7的轻链可变区包括3个轻链互补决定区，氨基酸序列如SEQ ID NO.4～SEQID NO.6所示。

在本发明中，所述3个重链互补决定区的氨基酸序列如下所示：

CDR1(SEQ ID NO.1)：GFWMS；

CDR2(SEQ ID NO.2)：

DINSDGSTINYAPSIKD；

CDR3(SEQ ID NO.3)：YKGAH；

或，

CDR1(SEQ ID NO.11)：VFWMS；

CDR2(SEQ ID NO.12)：

DIISDGSVINYAPSIKD；

CDR3(SEQ ID NO.13)：YKGAY；

在本发明中，CDR1(SEQ ID NO.11)、CDR2(SEQ ID NO.12)和CDR3(SEQ ID NO.13)为可替换的重链互补决定区，当单克隆抗体1D7重链可变区序列被替换时，依然可以达到相同的实验结果。

在本发明中，所述3个轻链互补决定区的氨基酸序列如下所示：

CDR1(SEQ ID NO.4)：

KSSQSLLDSDGKTYLN；

CDR2(SEQ ID NO.5)：LVSKLDS；

CDR3(SEQ ID NO.6)：WQGTHFPYT。

在本发明中，所述单克隆抗体1D7的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示(MEWELSLIFIFALVKDVQCEVQLLETGGGLVQPGGSRGLSCEGSGFTFSGF WMSWVRQTPGKTLEWIGDINSDGSTINYAPSIKDRFTIFRDNDKSTLYLQMSN VRSEDTATYFCMRYKGAHWGQGTLVTVSA)或如SEQ ID NO.14所示(MEWELSLIFIFALLKDVQCEVKLLETGGGLVQPGGSRGLSCEGSGFTFSVF WMSWVRQTPGKTLEWIGDIISDGSVINYAPSIKDRFTIFRDNDKSTLYLQMSNVRSEDTATYFCLRYKGAYWGQGTTLTVSS)；所述单克隆抗体1D7的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示(MMSPAQFLFLLVLWIRETNGDVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGTHFPYTFGGGTKLEIK)。

在本发明中，编码所述单克隆抗体1D7的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示(atggagtgggaactgagcttaattttcatttttgctcttgtaaaagatgtccagtgtgaagtgcagctgttggagactggaggaggcttggtgcaacctggggggtcacggggactctcttgtgaaggctcagggtttacttttagtggcttctggatgagttgggttcgacagacacctgggaagaccctggagtggattggagacattaattctgatggcagtacaataaactacgcaccatccataaaggatcgattcactatcttcagagacaatgacaagagcaccctgtacctgcagatgagcaatgtgcgatctgaggacacagccacgtatttctgtatgagatataaaggggcccactggggccaagggactctggtcactgtctctgca)或如SEQ ID NO.15所示(atggagtggg aactgagcttaattttcatt tttgctcttt taaaagatgt ccagtgtgaagtgaagctg ttggagact ggaggaggcttggtgcaacctggggggtc acggggactc tcttgtgaag gctcaggttt tacttttagt gtcttctggatgagctgggt tcgacagaca cctgggaaga ccctggagtg gattggagacattatttc tgatggcagtgtaataaact acgcaccatc cataaaggatcgattcac tatcttcaga gacaatgaca agagcaccctgtacctgcag atgagcaatg tgcgatctga ggacacagcc acgtatttct gtttgagata taagggggcctactggggcc aaggcaccac tctcacagtc tcctca)；编码所述单克隆抗体1D7轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示(atgatgagtcctgcccagttcctgtttctgttagtgctctggattcgggaaaccaacggtgatgttgtgatgacccagactccactcactttgtcggttaccattggacaaccagcctccatctcttgcaagtcaagtcagagcctcttagatagtgatggaaagacatatttgaattggttgttacagaggccaggccagtctccaaagcgcctaatctatctggtgtctaaactggactctggagtccctgacaggttcactggcagtggatcagggacagatttcacactgaaaatcagcagagtggaggctgaggatttgggagtttattattgctggcaaggtacacattttccgtacacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaa)。

在本发明中，CHI3L1单克隆抗体1D7，其重链属于IgG2b，轻链为kappa。

本发明所述单克隆抗体1D7筛选自杂交瘤细胞。在本发明中，所述杂交瘤细胞的构建方法优选包括构建包含人CHI3L1基因序列(NM_001276.4，SEQ ID NO.16)的原核表达载体，并将所述原核表达载体转化至TOP10感受态细胞中，挑取单克隆，提取质粒后转入大肠杆菌BL21(DE3)表达感受态细胞中，挑取单克隆培养并离心收集上清，经纯化得到纯化抗原；将所述纯化抗原免疫小鼠后，取免疫效果较好的小鼠的脾脏制备脾细胞；将所述脾细胞与杂交瘤细胞融合，筛选ELISA检测阳性杂交瘤细胞。在本发明中，利用腹水制备单克隆抗体，纯化后得所述单克隆抗体1D7。

在本发明中，能够被单克隆抗体1D7识别的抗体表位氨基酸片段位置信息为位于CHI3L1的第329-346氨基酸片段，具体核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示：gacgaccaggaaagcgtcaaaagcaaggtgcagtacctgaaggacaggcagctg。

本发明还提供了一种表达单克隆抗体1D7的重组载体，所述重组载体包括携带编码单克隆抗体1D7重链可变区的核苷酸序列的载体和携带编码单克隆抗体1D7轻链可变区核苷酸序列的载体；所述携带编码单克隆抗体1D7重链可变区的核苷酸序列的载体的基础载体包括pFUSE-CHIg-m2a，所述携带编码单克隆抗体1D7轻链可变区核苷酸序列的载体的基础载体包括pFUSE2ss-CLIg-mk；编码所述单克隆抗体1D7的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；编码所述单克隆抗体1D7的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。在本发明中，所述pFUSE-CHIg-m2a优选购自invivogen公司。在本发明中，所述pFUSE2ss-CLIg-mk优选购自invivogen公司。

在本发明中，所述单克隆抗体1D7的重链可变区的核苷酸序列优选连接到pFUSE-CHIg-m2a的EcoRI和NheI之间，形成重组载体1D7m2a；所述单克隆抗体1D7的轻链可变区优选连接到pFUSE2ss-CLIg-mk的EcoRI和NheI之间，形成重组载体1D7mk。本发明对所述核苷酸序列插入载体的方法并没有特殊限定，优选包括双酶切。

本发明还提供了一种表达单克隆抗体1D7的重组细胞，所述重组细胞含上述技术方案所述重组载体，所述重组细胞的基础细胞包括哺乳动物细胞。

本发明还提供了上述技术方案所述重组细胞的构建方法，包括以下步骤：将上述技术方案所述重组载体混合后转染所述基础细胞，得重组细胞。在本发明中，所述携带编码单克隆抗体1D7重链可变区的核苷酸序列的载体和携带编码单克隆抗体1D7轻链可变区核苷酸序列的载体混合的质量比优选为1：1。本发明所述哺乳动物细胞的类型并没有特殊限定，优选包括293T细胞、CHO细胞或者其它哺乳动物细胞等，在本发明实施例中，以购自ATCC细胞库的293T细胞为例进行说明。本发明对质粒(重组载体)的提取方法并没有特殊限定，优选利用试剂盒法，实施例中选用TIANGEN BIOTECH质粒提取试剂盒。本发明利用混合质粒转染基础细胞，本发明对所述转染的方法并没有特殊限定。

本发明还提供了一种制备上述技术方案所述单克隆抗体1D7的方法，包括以下步骤：对上述技术方案所述重组细胞培养48h，离心，收集上清液。上清液中含有所述单克隆抗体1D7。本发明使用载体转染细胞表达单克隆抗体，该方式有利于细胞保存，抗体质量控制及后期抗体改造研究。在本发明中，所述培养的条件优选为在37℃和5％CO₂环境中培养。

本发明还提供了上述技术方案所述单克隆抗体1D7或上述技术方案所述的重组载体或上述技术方案所述的重组细胞或上述技术方案所述构建方法构建得到的重组细胞或上述技术方案所述方法制备得到的单克隆抗体1D7在制备检测CHI3L1的试剂中的应用。在本发明中，所述检测的方法优选包括ELISA法和/或CBA法。本发明所述单克隆抗体或利用重组细胞生产的单克隆抗体，可识别CHI3L1蛋白，具有生物学活性。

本发明还提供了上述技术方案所述单克隆抗体1D7或上述技术方案所述的重组载体或上述技术方案所述的重组细胞或上述技术方案所述构建方法构建得到的重组细胞或上述技术方案所述方法制备得到的单克隆抗体1D7在制备神经系统疾病诊断和/或预后判断的试剂中的应用。在本发明中，所述试剂优选采用ELISA法和/或CBA法进行诊断和/或预后判断。在本发明中，CHI3L1与神经系统疾病，尤其是阿尔兹海默症和胶质细胞病变相关疾病的发生、发展和预后判断等相关，因此本发明所述单克隆抗体1D7可用于制备相关的试剂。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种人CHI3L1单克隆抗体1D7、重组载体、重组质粒及方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

CHI3L1蛋白制备

步骤一、CHI3L1原核表达载体构建

1.从GenBank序列数据库中查得人CHI3L1基因序列(SEQ ID NO.16)，序列号为NM_001276.4，合成该基因序列到pET-32a载体的NdeI和NotI之间，同时将目的基因CHI3L1连接到pGEX 4t-1载体的EcoRI和NotI之间；

2.设计好引物，PCR扩增出目的条带。

上游引物CHI3L1-F(SEQ ID NO.17)：

ggatctggttccgcgtggatccccggaattcatgggtgtgaaggcgtctc；

下游引物CHI3L1-R(SEQ ID NO.18)：

atgcactcgctgcaacgtaggcggccgcatcgtgactgactgacgatctg。

PCR扩增体系(50μl)：模板50ng、CHI3L1-F(10μM)1μl、CHI3L1-R(10μM)1μl、FastPfu DNAPolymerase(2.5units)1μl、5×FastPfubuffer 10μl、2.5mM dNTP4μl和余量的Nuclease-freeWater；

PCR扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性20s，58℃退火20s，72℃延伸40s，变性到延伸35个循环；72℃再延伸5min；4℃保存。

3.将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，分别将目的片段和载体用相应的限制性内切酶酶切，回收；

4.将目的片段和载体用同源重组酶连接，50℃连接15min；

5.将连接产物转化至TOP10感受态细胞，37℃培养箱过夜培养；

6.挑取单克隆至相应Amp抗性的LB培养基，37℃摇床过夜培养；

7.提取质粒，测序，比对结果。

步骤二、CHI3L1蛋白表达及纯化

1.将构建好且测序正确的质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)表达感受态细胞中；

2.挑取单克隆接于LB培养基中，37℃摇菌至OD值0.5～1，加IPTG诱导，16℃过夜表达；

3.收集菌体，超声破碎，离心后收集上清，pET-32a表达的CHI3L1蛋白利用Ni柱亲和层析纯化，纯化的蛋白记为CHI3L1-6his；pGEX4t-1表达的CHI3L1蛋白进行纯化，纯化的蛋白记为CHI3L1-strep；

纯化后的蛋白经过透析、浓缩，得到高浓度的CHI3L1-6his蛋白作为抗原备用，CHI3L1-strep蛋白用于包被ELISA板检测CHI3L1抗体。

实施例2

杂交瘤细胞的获得

步骤一、CHI3L1抗原免疫小鼠

将纯化好的CHI3L1-6his抗原与完全氟氏佐剂按体积比1:1混合，使最终浓度为40μg抗原/100μL；取5只6～8周龄的雌性Balb/c小鼠，左侧后小腿肌肉注射100μL(含40μg抗原)混合好的抗原；三周后进行第二次免疫，40μg抗原与不完全氟氏佐剂1:1混合，右侧后小腿肌肉注射100μL(含40μg抗原)混合好的抗原；

步骤二、检测免疫小鼠抗体产生情况

对小鼠进行二次免疫，三周后，采集鼠尾血，离心收集血清，检测小鼠抗体产生的情况，具体实施如下：

1.ELISA法检测小鼠抗体效价：用纯化好的CHI3L1-strep蛋白包被ELISA板，100ng/孔，4℃过夜包被(包被液为25mL碳酸盐缓冲液，pH9.6，其中Na₂CO₃0.03975g，NaHCO₃0.07325g，KH₂PO₄0.00625g)；次日，用PBST溶液洗3次，每次3min，每次拍干；加入2％BSA满孔封闭，于37℃条件下孵育1h；孵育完成后用PBST洗3次，每次3min，每次均需拍板除去多余水分；将血清用稀释液进行倍比稀释，每孔加入稀释好的血清100μL，37℃孵育1h，用PBST洗涤3次，每次3min，每次拍干；将羊抗鼠IgG-HRP二抗按1：5000比例稀释，加入板中，37℃孵育30min；孵育完成后，用PBST洗涤3次，拍干，加入TMB显色10min，2M H₂SO₄终止，450nm测得吸光值。筛选效价好的3号小鼠进行后续实验，其抗体ELISA效价为656.1万。

2.CBA法检测小鼠抗体效价：将CHI3L1(CHI3L1-6his)构建在真核表达载体pcDNA3.1上，大提质粒备用；将玻片铺在10cm细胞培养皿里，多聚赖氨酸处理后，将293T细胞均匀的种在皿里，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱过夜培养；转染构建成功的质粒至上述准备好的293T细胞，48h后，弃掉培养液后用丙酮固定30min，培养箱干燥后备用；将血清用稀释液按1：100、1：1000、1：10000、1：100000比例稀释，分别用按照上述比例稀释好的血清孵育上述片子，室温孵育1h；PBST洗涤3次，二抗孵育30min；PBST洗涤3次，显微镜观察结果，3号小鼠免疫荧光信号结果如图1所示，其抗体CBA效价约为1000。

步骤三、细胞融合

1.骨髓瘤细胞的准备：复苏SP2/0细胞，用DMEM培养基，15％FBS传代培养一周。选对数生长期的骨髓瘤细胞准备进行细胞融合。

2.脾细胞的制备：筛选出免疫效果好的小鼠，摘除眼球法采血，离心分离血清；脱颈椎法处死小鼠，75％(v/v)酒精中浸泡5min消毒；转移至超净台内进行后续处理，固定好小鼠，取出脾脏，除去粘连细胞的脂肪组织和结缔组织；获取的脾脏用无血清培养液冲洗干净后，置于细胞滤网上，用注射器内芯轻轻研磨，并用无血清培养液轻柔冲洗滤网，收集冲洗后的液体；将收集到的脾细胞悬液500g离心5min，收集细胞沉淀，洗涤细胞3次，弃掉上清液，细胞沉淀用无血清DMEM培养液悬浮，计数备用。

3.细胞融合：超净台内提前紫外灭菌水浴锅，将水浴锅调节至37℃备用，将上述准备好的SP2/0细胞和脾细胞按1:10比例加入50mL离心管中，混匀。500g离心10min，轻柔吸出弃去上清液，轻弹离心管底部，使细胞沉淀略松动；在90s内缓慢滴入预温至37℃的45％PEG1450溶液1mL；并不断地轻轻摇晃离心管；整个过程保持离心管在37℃水浴中进行；然后向上述PEG1450细胞混合溶液按下述速率逐渐加入DMEM培养基，即：第1min逐滴滴入lmL，第2min加2mL，第3min加3mL，第4min加4mL，第5min加5mL，在37℃水浴中边加边摇。随后37℃孵育15min，500g离心5min，弃上清；向收集到的细胞沉淀中加入5mL含有HAT的DMEM培养基，轻轻悬浮沉淀细胞，最后补充含有HAT的DMED培养基至总体积100mL左右。按100μL/孔分置于已铺巨噬细胞的96孔细胞培养板中，然后将培养板置于37℃，5％CO₂培养箱培养。

步骤四、阳性杂交瘤细胞的筛选

1.ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞

用pGEX4t-1载体表达的CHI3L1(CHI3L1-strep)蛋白包被ELISA板，100ng/孔，4℃过夜包被。

观察杂交瘤细胞的生长情况，七天后待细胞培养上清变黄时，取适量培养上清进行ELISA检测相应抗体，进行第一次亚克隆筛选，结果如表1所示；七到十天后再进行第二次亚克隆筛选，ELISA检测抗体，选取第一次筛选中OD值高的克隆，铺96孔板，使每孔约1个细胞，培养七到十天后再进行ELISA检测抗体，实验结果如表2所示；选取第二次筛选中OD值高的克隆进行第三次亚克隆筛选，铺96孔板，使每孔约1个细胞。选取OD值高的克隆，最终筛选出1个阳性克隆细胞1D7-C5-D5，命名为1D7。实验结果如表3所示。

表1第一次ELISA法筛选阳性单克隆实验结果

表2第二次ELISA法筛选阳性单克隆实验结果

1D7	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
													A	0.055	0.059	0.062	0.064	0.059	0.054	0.05	0.085	0.054	0.057	0.035	0.051
B	0.042	0.054	0.053	0.045	0.059	0.062	0.065	0.046	0.053	0.047	0.062	0.069
													C	0.034	0.06	0.051	0.053	0.954	0.052	0.072	0.598	0.045	0.051	0.078	0.062
D	0.035	0.062	0.078	0.054	0.049	0.053	0.056	0.042	0.059	0.052	0.054	0.059
													E	0.029	0.062	0.075	0.041	0.045	0.057	0.059	0.05	0.062	0.065	0.049	0.06
F	0.057	0.047	0.051	0.052	0.502	0.058	0.056	0.056	0.065	0.058	0.053	0.052
													G	0.058	0.047	0.046	0.039	0.062	0.064	0.049	0.059	0.046	0.056	0.056	0.046
H	0.07	0.055	0.049	0.049	0.045	0.057	0.052	0.054	0.048	0.056	0.042	0.052

表3第三次ELISA法筛选阳性单克隆实验结果

1D7C5	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
													A	0.075	0.154	0.229	0.075	0.062	0.067	0.05	0.085	0.054	0.057	0.035	0.051
B	0.138	0.279	1.103	0.905	0.573	1.502	0.065	0.046	0.053	0.047	0.062	0.069
													C	0.089	0.067	0.139	0.088	1.225	1.055	0.072	0.598	0.045	0.552	0.078	0.211
D	0.601	1.405	1.286	0.786	1.624	0.088	0.056	0.042	0.123	0.052	0.112	0.075
													E	0.06	1.243	0.26	0.943	1.296	1.504	0.059	0.05	0.120	0.065	0.049	0.061
F	1.349	0.378	1.141	1.272	0.088	0.528	0.056	0.056	0.079	1.037	0.053	0.052
													G	0.408	0.18	0.742	1.159	0.132	1.23	0.049	0.059	0.046	0.056	0.056	0.048
H	0.058	0.069	0.376	0.272	0.873	0.072	0.052	0.023	0.120	0.056	0.042	0.059

2.CBA法验证阳性杂交瘤细胞筛选结果

将CHI3L1(CHI3L1-6his)构建在真核表达载体pcDNA3.1上，大提质粒备用；将玻片铺在10cm细胞培养皿里，多聚赖氨酸处理后，将293T细胞均匀的种在皿里，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱过夜培养；转染构建成功的质粒至上述准备好的293T细胞，48h后，弃掉培养液后用丙酮固定30min，培养箱干燥后备用；分别用筛选出的杂交瘤细胞培养上清液孵育上述片子，SP2/0细胞培养上清作为对照组，室温孵育1h；PBST洗涤3次，二抗孵育30min；PBST洗涤3次，显微镜观察结果，其中对照组上清不能与过表达CHI3L1蛋白的细胞结合产生阳性信号，而1D7杂交瘤细胞上清能够检出明显的的阳性信号，实验结果如图2所示，说明筛选出的阳性杂交瘤细胞能够分泌与CHI3L1结合的抗体。

实施例3

单克隆抗体分型鉴定

用CHI3L1-strep包被ELISA板，100ng/孔，过夜；用PBST洗涤包被好的ELISA板3次，用2％BSA满孔封闭1小时；加入实施例2筛选出的阳性单克隆细胞培养上清100μL，SP2/0细胞培养上清作为阴性对照组(NC组)，免疫小鼠的眼球血作为阳性对照组，37℃孵育1h；用PBST洗涤3次；孵育HRP标记的二抗(IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgG kappa chain、lambda)，37℃孵育30min。PBST洗涤3次，TMB显色，450nm测得吸光值。实验结果如图3所示，1D7单克隆抗体重链为IgG2b，轻链为kappa。

实施例4

单克隆抗体序列测定

用实施例2中筛选出的阳性单克隆细胞1D7提取RNA；用5’RACE方法扩增出抗体重链和轻链可变区片段；将扩增出的片段连接到pEASY-Blunt载体上，提取质粒，测序；轻链和重链核苷酸序列见SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.10，对应氨基酸序列见SEQ ID NO.7和SEQ IDNO.9；使用Kabat方法标记出抗体氨基酸序列的CDR区(SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6)。

实施例5

重组单克隆抗体及其作用效果

步骤一、重组单克隆抗体的制备

将测序确定的单克隆抗体1D7重链可变区(SEQ ID NO.8)连接到抗体表达载体pFUSE-CHIg-m2a上，记为1D7m2a；将1D7轻链可变区(SEQ ID NO.10)分别连接到pFUSE2ss-CLIg-mk上，记为1D7mk。测序正确后大量提取质粒，用于细胞转染制备抗体。

将玻片铺在10cm细胞培养皿里，多聚赖氨酸处理后，将293T细胞均匀的种在皿里，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱过夜培养；将构建好的重组抗体表达质粒1D7m2a、1D7mk转入上述准备好的293T细胞，37℃、5％CO₂培养48h。收集上述培养好的细胞上清，离心取上清备用，同时收集筛选出的阳性单克隆细胞上清作为阳性对照。

步骤二、重组单克隆抗体效价检测

用纯化好的CHI3L1-strep蛋白包被ELISA板，100ng/孔，4℃过夜包被(包被液为25mL碳酸盐缓冲液，pH9.6，其中Na₂CO₃ 0.03975g，NaHCO₃ 0.07325g，KH₂PO₄ 0.00625g)；次日，用PBST溶液洗3次，每次3min，每次拍干；加入2％BSA满孔封闭，于37℃条件下孵育1h；孵育完成后用PBST洗3次，每次3min，每次均需拍板除去多余水分；将上述收集的上清液用稀释液进行倍比稀释，稀释比例分别按1:3、1:9、1:27、1:81、1:243、1:729、1:2187，每孔加入100μL，37℃孵育1h，用PBST洗涤3次，每次3min，每次拍干；将羊抗鼠IgG-HRP二抗按1：5000比例稀释，加入板中，37℃孵育30min；孵育完成后，用PBST洗涤3次，拍干，加入TMB显色10min，2M H₂SO₄终止，450nm测得吸光值如表4和图4所示：

表4重组单克隆抗体效价检测实验结果(OD₄₅₀)

稀释倍数	NC	1D7杂交瘤	1D7
				1:3	0.051	0.737	1.935
1:9	0.048	0.639	2.142
				1:27	0.05	0.505	2.229
1:81	0.045	0.169	1.658
				1:243	0.05	0.106	0.924
1:729	0.051	0.062	0.327
				1:2187	0.044	0.055	0.156

结果如图4和表4所示，实验获得的重组单克隆抗体效价良好，具有进行进一步研究的意义。

步骤三、重组单克隆抗体特性检验

1.免疫荧光验证重组单克隆抗体的表位

将CHI3L1(CHI3L1-6his)、CHI3L1前段(CHI3L1-22-111-6his，SEQ ID NO.19)、CHI3L1中前段(CHI3L1-112-201-6his，SEQ ID NO.20)、CHI3L1中后段(CHI3L1-202-292-6his，SEQ ID NO.21)、CHI3L1后段(CHI3L1-293-383-6his，SEQ ID NO.22)；分别构建在真核表达载体pcDNA3.1上，大提质粒备用；将玻片铺在10cm细胞培养皿里，多聚赖氨酸处理后，将293T细胞均匀的种在皿里，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱过夜培养；分别转染含CHI3L1-6his、CHI3L1-22-111-6his、CHI3L1-112-201-6his、CHI3L1-202-292-6his、CHI3L1-293-383-6his片段的质粒至上述准备好的293T细胞，同时转染pcDNA3.1作为阴性对照组；转染细胞48h后，弃掉培养液后用丙酮固定30min，培养箱干燥后备用；设置孵育抗his抗体组验证质粒转染过表达是否成功；然后用步骤一中收集的重组单克隆细胞上清液作为一抗孵育上述片子，阳性杂交瘤细胞上清作为对照一抗，室温孵育1h；PBST洗涤3次，二抗孵育30min；PBST洗涤3次，显微镜观察结果。结果显示，除pcDNA3.1组外，与his抗体孵育的细胞均显示阳性结果，表明成功通过质粒转染过表达相应蛋白；此外，仅在过表达CHI3L1基因后段CHI3L1-293-383-6his及完整CHI3L1序列的细胞中有阳性信号检出，表明该抗体识别位点位于氨基酸序列的293-383区间，为进一步明确识别位点，将该片段进一步划分进行研究。

将CHI3L1后段每18个氨基酸分一段，划分为CHI3L1(CHI3L1-293-310，SEQ IDNO.23)、CHI3L1(CHI3L1-311-328，SEQ ID NO.24)、CHI3L1(CHI3L1-329-346，SEQ IDNO.25)、CHI3L1(CHI3L1-347-364，SEQ ID NO.26)、CHI3L1(CHI3L1-365-383，SEQ IDNO.27)五个片段，分别缺失各个片段后构建在真核表达载体pcDNA3.1上，大提质粒备用；将玻片铺在10cm细胞培养皿里，多聚赖氨酸处理后，将293T细胞均匀的种在皿里，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱过夜培养；分别转染空载质粒pcDNA3.1、Q CHI3L1-293-310-6his质粒、QCHI3L1-311-328-6his质粒、Q CHI3L1-329-346-6his质粒、Q CHI3L1-347-364-6his质粒、QCHI3L1-365-383-6his质粒、含CHI3L1-293-383-6his片段的质粒及包含完整的CHI3L1-6his序列的质粒至上述准备好的293T细胞；重复上述操作步骤，显微镜观察结果。

实验结果如图5中的(a)所示，重组1D7单克隆抗体在293T细胞中成功表达，并且成功分泌于细胞上清。该重组单克隆抗体可以识别CHI3L1，具有生物学活性，该抗体识别位点位于CHI3L1氨基酸序列的293-383区间；进一步的实验结果如图5中的(b)所示，转染空载pcDNA3.1的对照组无荧光信号，孵育抗his抗体的组均有信号，说明质粒转染过表达操作成功；而在分段缺失的各组中，除去缺失氨基酸区间329-346组外，其余各组均可被CHI3L1抗体识别并产生荧光信号，说明329-346片段的缺失直接影响了抗体的识别过程，更进一步的证明该抗体识别位点位于329-346氨基酸片段上。

2.WB验证重组单克隆抗体作用特征

取纯化CHI3L1蛋白、过表达CHI3L1细胞蛋白及转染空载pcDNA3.1质粒的细胞对照蛋白作为Western Blot上样样品进行SDS-PAGE电泳，验证重组单克隆抗体作用特性；电泳完成后，使用湿法转膜，转膜条件为200mA，60min；5％的脱脂奶粉室温封闭1h；重组单克隆细胞上清做一抗，市售CHI3L1抗体(A ffinity Biosciences Cat#DF7223，RRID：AB_2839164)做对照组一抗，室温孵育2h；TBST洗3次，每次5min；加入HRP标记的二抗，室温孵育1h；TBS T洗3次，每次5min；加入化学发光液显色拍照，观察结果。

实验结果如图6所示，CHI3L1抗体能够检出纯化后的CHI3L1蛋白；重组单克隆抗体1D7能够达到相同的实验结果；过表达CHI3L1的细胞蛋白可能由于浓度低而未被检出。总之，重组单克隆抗体1D7可识别CHI3L1蛋白的线性结构，且具有良好性能可用作WesternBlot实验。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种可特异性识别CHI3L1的单克隆抗体1D7，其特征在于，所述单克隆抗体1D7包括重链和轻链；所述重链的可变区包括3个重链互补决定区，所述3个重链互补决定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3所示，或如SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.13所示；所述单克隆抗体1D7的轻链可变区包括3个轻链互补决定区，氨基酸序列如SEQ ID NO.4～SEQID NO.6所示。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体1D7，其特征在于，所述单克隆抗体1D7的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示或如SEQ ID NO.14所示；所述单克隆抗体1D7的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。

3.根据权利要求1所述的单克隆抗体1D7，其特征在于，编码所述单克隆抗体1D7的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示或如SEQ ID NO.15所示；编码所述单克隆抗体1D7轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

4.一种表达单克隆抗体1D7的重组载体，其特征在于，所述重组载体包括携带编码单克隆抗体1D7重链可变区的核苷酸序列的载体和携带编码单克隆抗体1D7轻链可变区核苷酸序列的载体；所述携带编码单克隆抗体1D7重链可变区的核苷酸序列的载体的基础载体包括pFUSE-CHIg-m2a，所述携带编码单克隆抗体1D7轻链可变区核苷酸序列的载体的基础载体包括pFUSE2ss-CLIg-mk；编码所述单克隆抗体1D7的重链可变区的核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示；编码所述单克隆抗体1D7的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述单克隆抗体1D7的重链可变区的核苷酸序列连接到pFUSE-CHIg-m2a的EcoRI和NheI之间；所述单克隆抗体1D7的轻链可变区连接到pFUSE2ss-CLIg-mk的EcoRI和NheI之间。

6.一种表达单克隆抗体1D7的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞含权利要求4或5所述重组载体，所述重组细胞的基础细胞包括哺乳动物细胞。

7.权利要求6所述重组细胞的构建方法，包括以下步骤：将权利要求4或5所述重组载体混合后转染所述基础细胞，得重组细胞。

8.一种制备权利要求1～3任一项所述单克隆抗体1D7的方法，包括以下步骤：对权利要求6所述重组细胞培养48h，离心，收集上清液。

9.权利要求1～3任一项所述单克隆抗体1D7或权利要求4或5所述的重组载体或权利要求6所述的重组细胞或权利要求7所述构建方法构建得到的重组细胞或权利要求8所述方法制备得到的单克隆抗体1D7在制备检测CHI3L1的试剂中的应用。

10.权利要求1～3任一项所述单克隆抗体1D7或权利要求4或5所述的重组载体或权利要求6所述的重组细胞或权利要求7所述构建方法构建得到的重组细胞或权利要求8所述方法制备得到的单克隆抗体1D7在制备神经系统疾病诊断和/或预后判断的试剂中的应用。

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