DE60223547T2

DE60223547T2 - Gangliosid-assoziierte rekombinante antikörper und deren verwendung bei der diagnose und behandlung von tumoren

Info

Publication number: DE60223547T2
Application number: DE60223547T
Authority: DE
Inventors: Cristina Maria Mateo De Acosta Del Rio; Josefa Agustina 70 entre San LOMBARDERO VALLADARES; Lourdes Tatiana Roque Navarro; Alejandro Av. de Acost 10 de Octubre LOPEZ REQUENA
Original assignee: Centro de Immunologia Molecular
Current assignee: Centro de Immunologia Molecular
Priority date: 2001-04-06
Filing date: 2002-04-08
Publication date: 2008-09-18
Anticipated expiration: 2022-04-09
Also published as: DK1384726T3; ES2312610T3; CA2441845A1; AU2002308348B2; IL158246A; HRP20030805B1; EA006936B1; UA86768C2; EP1411064B1; ES2296986T3; CN1535282A; EA200301098A1; HK1109160A1; IL158246A0; HUP0401695A2; WO2002081661A3; NO20034437D0; MY145703A; NO20034436L; EP1798243B1

Description

Gebiet der Technik
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Biotechnologie, insbesondere durch Gentechnologie erhaltene neue rekombinante Antikörper, genauer chimäre und humanisierte Antikörper, die von dem murinen monoklonalen Antikörper P3 (MAb P3) abgeleitet sind.
Genauer ausgedrückt betrifft die Erfindung Antikörper, die sich an Ganglioside binden, die N-glykolisierte Sialsäure enthalten, aber nicht an die acetylierten Formen der Ganglioside, noch an neutrale (orig.: "neuter") Glykolipide. Ganglioside, die N-glykolisierte Sialsäure enthalten, sind Antigene, die in Brustkrebs und Melanomen umfangreich exprimiert werden. Andererseits ist auch die Antitumorwirkung des MAbai 1E10 in experimentellen Modellen nachgewiesen worden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die pharmazeutischen Zusammensetzungen, die die oben beschriebenen rekombinanten Antikörper enthalten, die für die Diagnose und Therapie von Krebs, insbesondere Brustkrebs und Melanomen, verwendbar sind.
Stand der Technik
Ganglioside sind Glycosphingolipide, die Sialsäure enthalten und sie sind in der Plasmamembran von Zellen von Wirbeltieren vorhanden (Stults et al. (1989): Glycosphingolipids: structure, biological source und properties, Methods Enzymology, 179: 167-214). Einige dieser Moleküle sind in der Literatur als Antigene beschrieben worden, die mit Tumoren oder Tumormarkern assoziiert sind (Hakomori et al. (1991): Possible functions of tumor associated carbohydrate antigens, Curr. Opin. Immunol., 3: 646-653); aus diesem Grund ist die Verwendung von Anti-Gangliosid-Antikörpern als zweckdienlich bei der Diagnose und Therapie von Krebs beschrieben worden (Hougton et al. (1985): Mouse monoclonal antibody IgG3 antibody detecting GD3 ganglioside: to Phase I trial in patients with malignant melanoma, PNAS USA, 82: 1242-1246; Zhang et al. (1997): Selection of carbohydrate tumor antigens as targets for immune attack using immunohistochemistry. I. Focus an gangliosides, Int. J. Cancer, 73: 42-49).
Sialsäuren, die häufiger in Tieren exprimiert werden, sind N-acetyl (NeuAc) und N-glykolyl (NeuGc) (Corfield et al. (1982): Occurrence of sialic acids, Cell. Biol. Monogr., 10: 5-50). NeuGc wird im Allgemeinen nicht in normalem Human- und Geflügelgeweben exprimiert, ist aber umfangreich in anderen Wirbeltieren verbreitet (Leeden und Yu, (1976): Chemistry und analysis of sialic acid. In: Biological Role of Sialic Acid. Rosemberg A und Shengtrund CL (Herausgeber). Plenum Press, New York, 1-48; Kawai et al. (1991): Quantitative determination of N-glycolylneuraminic acid expression in human cancerous tissues und avian lymphoma cell lines as a tumor associated sialic acid by gas chromatographymass spectrometry, Cancer Research, 51: 1242-1246). Es gibt jedoch Berichte die zeigen, dass anti-NeuGc-Antikörper einige Humantumore und Tumorzelllinien erkennen (Higashi et al. (1988): Detection of gangliosides as N-glycotylneuraminic acid specific tumor-associated Hanganutziu-Deicher antigen in human retinoblastoma cells, Jpn. J. Cancer Res., 79: 952-956; Fukui et al. (1989): Detection of glycoproteins as tumor associated Hanganutziu-Deicher antigen in human gastric cancer cell line, NUGC4, Biochem. Biophys. Res. Commun., 160: 1149-1154). Es wurden erhöhte Niveaus an GM3(NeuGc) Gangliosiden in menschlichem Brustkrebs gefunden (Marquina et al. (1996): Gangliosides expressed in human breast cancer, Cancer Research, 1996; 56: 5165-5171); dieses Ergebnis macht die Verwendung von diesem Molekül als Ziel für Krebstherapie attraktiv.
Der monoklonale Antikörper (Mab) P3, der durch die mit der Hinterlegungsnummer ECACC 94113026 (Europäisches Patent EP 0 657 471 B1 ) hinterlegten Zelllinie hergestellt wird, ist ein muriner monoklonaler Antikörper mit IgM-Isotyp, der erhalten wurde, als murine Splenozyten von einer BALG/c-Maus, die mit Liposomen immunisiert war, die GM3(NeuGc) und tetanisches Toxoid enthalten, mit der Zelllinie P3-X63-Ag8.653 fusioniert wurden; die ein murines Myelom ist. Dieser Mab P3 reagiert stark mit Gangliosiden, die N-glykolisierte Sialsäure enthalten, aber nicht mit den acetylierten Formen der Ganglioside, noch mit den neutralen (orig.: "neuter") Glykolipiden. Es wurde durch immuncytochemische und immunhistochemische Studien, die mit Zelllinien und Geweben von gutartigen und neoplastischen Tumoren durchgeführt wurden, gezeigt, dass der Mab P3 Brustkrebs (Vázquez et al. (1995): Generation of a murine monoclonal antibody specific for N-glycolylneuraminic acid-containing gangliosides that also recognizes sulfated glycolipids, Hybridoma, 14: 551-556) und Melanom erkennt.
Der Mab P3 induzierte selbst ohne Adjuvans und Trägerprotein anti-idiotypische Immunantwort (Ab2) in BALG/c-Mäusen (syngenes Modell) (Vázquez et al. (1998): Syngeneic anti-idiotypic monoclonal antibodies to an anti-NeuGc-containing ganglioside monoclonal antibody, Hybridoma, 17: 527-534). Die Rolle der elektronegativen Gruppen, Sialsäure (für Ganglioside) und SO₃-(für Sulfatide) bei den Erkennungseigenschaften dieses Antikörpers wurde durch immunchemische Analyse nahegelegt (Moreno et al. (1998): Delineation of epitope recognized by an antibody specific for N-glycolylneuraminic acid-containing gangliosides, Glycobiology, 8: 695-705).
Der anti-idiotypische Mab 1E10 (Mabai 1E10) vom Subtyp IgG1 wurde von einer BALG/c-Maus erhalten, die mit dem an KLH gekoppelten Mab P3 immunisiert wurde ( US Patent 6,063,379 , unter Hinterlegungsnummer ECACC 971 12901 hinterlegte Zelllinie). Mabai 1E10 erkannte spezifisch den MAb P3 und er bindet nicht andere IgM Anti-Gangliosid-Antikörper. Darüber hinaus inhibierte Mabai 1E10 das spezifische Binden von Mab P3 an den GM3(NeuGc) und an eine Zelllinie MDA-MB-435, die von duktalem Brustkarzinom abgeleitet war (positiv für Mab P3-Bindung). Der MAbai 1E10 induzierte eine starke Immunantwort von Ab3-Antikörper, wenn Mäuse von syngenen oder alogenen Modellen immunisiert wurden, diese Ab3-Antikörper zeigten nicht die gleiche Spezifität wie der Mab P3, selbst wenn sie Idiotypen aufweisen, die jenen ähnlich sind, die der Ab1-Antikörper aufweist (Vázquez et al. (1998): Syngeneic anti-idiotypic monoclonal antibodies to an anti-NeuGc-containing ganglioside monoclonal antibody, Hybridoma, 17: 527-534). MAbai 1E10 induzierte eine starke Antitumorwirkung sowohl in syngenen als auch in alogenen Mäusen. Das Wachstum der Brustkarzinom-Zelllinie F3II wurde durch wiederholte Dosen des an KLH in Freunds Adjuvans gekoppeltem MAbai 1E10 signifikant reduziert, wenn BALG/c-Mäuse geimpft wurden. Auch die Anzahl an spontanen Lungenmetastasen war nach der Impfung verringert. Die intravenöse Verabreichung des Mabai 1E10 an geimpfte C57BL/6-Mäuse, 10 bis 14 Tage nach der intravenösen Impfung von Melanomzellen B16, verursachte eine dramatische Verringerung der Anzahl an Lungenmetastasen im Vergleich zu Mäusen, die mit einem irrelevanten IgG behandelt wurden. Diese Ergebnisse legen nahe, dass mehr als ein Mechanismus mit Antitumorwirkung ausgelöst wird (Vázquez et al. (2000): Antitumor properties of an anti-idiotypic monoclonal antibody in relation to N-glycolyl-containing gangliosides, Oncol. Rep., 7: 751-756, 2000).
Obwohl Hybridomtechnologie während 15 Jahren entwickelt wurde (Koehler und Milstein (1975): Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity, Nature, 256: 495-497) und obwohl monoklonale Antikörper immer noch sowohl bei Diagnose als auch bei Forschung sehr nützlich sind, haben sie ihre therapeutische Wirksamkeit beim Menschen nicht gezeigt. Dies liegt hauptsächlich an ihrer kurzen Halbwertszeit im Blut und daran, dass murine Effektorfunktionen bei dem menschlichen Immunsystem versagen, und auch an der humanen Anti-Maus-Antikörper Immunantwort (HAMA-Antwort).
Andererseits hat Gentechniktechnologie das Potential der MAb- Verwendbarkeit revolutioniert, da es durch Manipulieren von Immunoglobulin-Genen möglich ist, sowohl modifizierte Antikörper mit verringerter Antigenität zu erhalten, als auch ihre Effektorfunktionen für die Behandlung oder Diagnose von bestimmten Pathologien zu verbessern. Essentielle Zielsetzung von Verfahren zum Verringern von Immunoglobulin-Immunogenität ist es, die Unterschiede zwischen einem murinen Antikörper und einem humanen Immunglobulin zu verringern, ohne die Antigenerkennungs-Spezifität zu verändern (Morrison und Oi (1989): Genetically engineered antibody molecules, Adv Immunol., 44: 65-92).
In letzter Zeit sind verschiedene Verfahren entwickelt worden, um murine oder Ratten-Antikörper zu humanisieren, um auf diesem Weg die xenogene Immunantwort gegen fremde Proteine zu verringern, wenn sie in Menschen injiziert werden. Eine der ersten Versuche, die Antigenität zu verringern, waren die chimären Antikörper, in denen die variablen Domänen des murinen Proteins in die konstanten Domänen von humanen Molekülen eingefügt wurden, die im Vergleich mit ihren murinen Gegenstücken die gleiche Spezifität aber eine verringerte Immunogenität zeigen; menschliche Effektorfunktionen werden durch chimäre Antikörper beibehalten, (Morrison et al. (1984): Chimeric human antibody molecules: Mouse antigen-binding domains with human constant region domains, PNAS USA, 81: 6851-6855). Auch wenn chimäre Antikörper die gleiche Spezifität wie das murine Gegenstück aufweisen, wird häufig eine Immunantwort gegen die variablen Nagetierregionen beobachtet.
In einem Versuch, die Immunogenität von chimären Antikörpern weiter zu verringern, wurden nur die CDRs von dem monoklonalen Nagetierantikörper auf menschliche Gerüstregionen übertragen und diese variable Hybridregion mit konstanten menschlichen Regionen exprimiert (Jones et al. (1986): Replacing the complementary-determining regions in a human antibody with those from a mouse, Nature 321: 522-524; Verhoeyen et al. (1988): Reshaping human antibodies: grafting an antilysozyme activity, Science 239, 1534-1536). Diese Herangehensweise weist jedoch mehrere Nachteile auf: häufig weist der resultierende Antikörper eine verringerte Affinität auf und es muss eine Anzahl an Gerüstgruppen zu den entsprechenden murinen zurückmutiert werden, um Binden wieder herzustellen (Rietchmann et al. (1988): Reshaping human antibodies for therapy, Nature, 332: 323-327; Queen et al. (1989): A humanized antibody that binds to the interleukin 2 receptor, PNAS USA, 86: 10029-10033; Tempest et al. (1991): Reshaping a human monoclonal antibody to inhibit human respiratory syncytial virus infection in vivo, Biotechnology, 9: 266-272). Darüber hinaus wird bei den CDR-grafted Antikörpern häufig persistente Immunogenität beobachtet.
Mateo und Mitarbeiter ( US Patent mit Nummer US 5 712 120 ) haben ein Verfahren zum Reduzieren von Immunogenität von murinen Antikörpern beschrieben. Verfahrensgemäß sind die Modifikationen auf die variablen Domänen beschränkt, und insbesondere auf die murinen FRs von chimären Antikörpern. Darüber hinaus werden die Ersetzungen nur in jenen Bereichen der FRs durchgeführt, die amphipatische Sequenzen aufweisen und die daher potentielle Epitope sind, die von T-Zellen erkannt werden. Das Verfahren enthält vernünftiges Ersetzen von wenigen Aminosäureresten, die sich in den potentiellen immunogenen Epitopen befinden, durch entsprechende Reste aus der am stärksten homologen humanen Sequenz, wobei die Aminosäuren, die hauptsächlich für kanonische Strukturen verantwortlich sind, und auch die Reste in der unmittelbaren Nachbarschaft der CDRs oder in der Vernierzone beibehalten bleiben müssen.
Der resultierende Antikörper hält seine Antigen-Bindungsspezifität bei und ist weniger immunogen als entweder sein muriner oder chimärer Vorgänger (Mateo et al. (2000): Removal of T cell epitopes from genetically engineered antibodies: Production of modified immunoglobulins with reduced immunogenicity, Hybridoma 19: 463-71); diese Eigenschaften erhöhen ihre therapeutische Verwendbarkeit. Unter Verwenden dieses neuen Verfahrens müssen nur wenige Mutationen und selbstverständlich weniger genetische Manipulationen durchgeführt werden.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft einen chimären monoklonalen, von dem murinen monoklonalen Antikörper Mab P3 abgeleiteten Antikörper, der Ganglioside erkennt, die N-glykolisierte Sialsäure enthalten, und der durch die Hybridom-Zelllinie mit Hinterlegungsnummer ECACC 94113026 erzeugt wird, wobei die hypervariablen Domänen der schweren und leichten Ketten von Mab P3 die folgenden Sequenzen enthalten:
SCHWERE KETTE

CDR1: RYSVH
CDR2: MIWGGGSTDYNSALKS
CDR3: SGVREGRAQAWFAY

LEICHTE KETTE

CDR1: KASQDVSTAVA
CDR2: SASYRYT
CDR3: QQHYSTPWT;
die Gerüst-Bereiche (FRs) der schweren und leichten Ketten von Mab P3 die folgenden Sequenzen enthalten:

SCHWERE KETTE

FR1: QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLS
FR2: WVRQPPGKGLEWLG
FR3: RLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCAR
FR4: WGQGTLV

LEICHTE KETTE

FR1: DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITC
FR2: WYQQKPGQSPKLLIY
FR3: GVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYC
FR4: FGGGTKL;
wobei der chimäre monoklonale Antikörper für seine Humanisierung und Erhaltung der Bindungseigenschaften an das Antigen die folgenden Substitutionen in dem FR1-Bereich der leichten Kette aufweist:

LEICHTE KETTE:

Position 8: His gegen Pro
Position 9: Lys gegen Ser
Position 10: Phe gegen Ser
Position 11: Met gegen Leu
Position 13: Thr gegen Ala

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen, chimären, monoklonalen Antikörpers enthält er den konstanten Bereich der schweren Kette von humanem IgG1 und den konstanten Bereich der leichten Kette von humanem Ck. Somit ist es bevorzugt, dass der konstante Bereich der schweren Kette die Aminosäuresequenz der gamma-1-Kette enthält und der konstante Bereich der leichten Kette die Aminosäuresequenz einer Kappa-Kette enthält, die beide von humanen Immunglobulinen abgeleitet sind.
Die Erfindung betrifft weiter eine Zelllinie, die einen erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper erzeugt; eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von bösartigen Tumoren von Brustkrebs und Melanomen, ihren Metastasen und Rückfällen, die einen erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper enthält; eine pharmazeutische Zusammensetzung zur in vivo Lokalisierung und Identifizierung von bösartigen Brusttumoren und Melanomen, ihren Metastasen und Rückfällen, die einen erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper enthält; und die Verwendung eines erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpers zur Herstellung eines Medikaments, das für die Behandlung von bösartigen Brusttumoren und Melanomen, ihren Metastasen und Rückfällen verwendbar ist. Diese umfassen Tumore der Brust, Lunge, des Verdauungssytems, Urogenitalsystems, Melanome, Sarkome und neuroektodermale Tumore, und ihre Metastasen und Rückfälle.
cDNA-Synthese und Genamplifikation durch PCR (Polymerasekettenreaktion) des variablen Bereichs von MAb P3 und Mabai 1E10.
Es wurde zytoplasmatische RNA von etwa 10⁶ Hybridomzellen von P3 (murine IgM MAb, die das N-glykolisierte GM3-Gangliosid erkennt) oder von 1E10 (anti-idiotypischer anti-P3 Antikörper) extrahiert. Die RNA wurde unter Verwenden des Reagens TRIZOL (GIBCO BRL, Grand Island, NY) entsprechend den Anweisungen des Herstellers extrahiert.
Die cDNA-Synthesereaktion wurde durch Mischen von 5 μg der RNA, 25 pMol Vh (komplementär zu dem konstanten Bereich von murinem IgM für VHP3, und mit dem konstanten Bereich von murinem IgG1 für VH 1E10) oder Vk (komplementär zum konstanten murinen Kappa-Bereich für beide Antikörper), 2,5 mM von jedem dNTP, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 75 mM KCl, 10 mM DTT, 8 mM MgCl₂ und 15 Einheiten RNAse-Inhibitor in einer 50 μl Reaktionsmischung ausgeführt. Sie wurde für 10 Minuten auf 70°C erwärmt und langsam auf 37°C gekühlt. Dann wurden 100 Einheiten MLV Reverse-Transkriptase-Enzym zugegeben und die Inkubation für eine Stunde bei 42°C weitergeführt.
Die cDNAs der variablen Bereiche VK und VH wurden durch PCR amplifiziert. Kurz ausgedrückt wurden 5 μl cDNA von VH oder VK mit 25 pMol spezifischer Primer, 2,5 mM von jedem dNTP, 5 μl Bestandteilen von 10X Puffer Taq DNA-Polymerase und 1 Einheit von diesem Enzym gemischt. Die Proben wurden 25 thermischen Zyklen bei 94°C, 30 s; 50°C, 30 s; 72°C, 1 min unterzogen, und einer letzten Inkubation für 5 Minuten bei 72°C.
Klonieren und Sequenzieren von amplifizierter cDNA
Die PCR-Produkte von VH und VK (des P3 bzw. des 1E10) wurden in TA-Vektor kloniert (TA Klonierungskit, Promega, VStvA). Die resultierenden Klone wurden durch das Didesoxy-Verfahren unter Verwenden von T7 DNA-Polymerase (T7 Sequenzierungskit, Pharmacia, Schweden) sequenziert.
Konstruktion von chimären Genen
Die VH-VK-Gene wurden aus TA-Vektoren durch enzymatischen Verdau herausgeschnitten und sie wurden in die entsprechenden Expressionsvektoren kloniert (Coloma et al. (1992): Novel vectors for the expression of antibody molecules using variable regions generated by polymerase chain reaction, J. Immunol. Meth., 152: 89-104).
Die VH-Gene wurden aus dem TA-Vektor durch enzymatischen Verdau mit EcoRV und NheI herausgeschnitten und in einen Expressionsvektor (PAH 4604) kloniert, der eine variablen Bereich von humanem IgG1 und das Histidinol-Resistenzgen enthielt. Die resultierenden Konstruktionen waren P3VH-PAH4604 und 1E10VH-PAH4604. Die VK-Gene wurden aus TA-Vektor durch enzymatischen Verdau mit EcoRV und SalI herausgeschnitten und in einen Expressionsvektor kloniert (PAG4622). Dieser Vektor enthielt ein Mycophenolsäure-Resistenzgen und den konstanten Bereich von Human-Kappa. Die resultierenden Konstruktionen waren P3VK-PAG4622 und 1E10VK-PAG4622.
Expression von chimären Antikörpern, die von Mab P3 und Mabid 1E10 abgeleitet sind.
NS-O-Zellen wurden mit 10 μg P3VK-PAG4622 oder 1E10VK-PAG4622 elektroporiert, Klone, die leichte Ketten von Human-Kappa exprimieren, wurden mit 10 μg P3VH-PAH4604 oder 1E1OVH-PAH4604 transfiziert.
Die DNAs wurden durch Verdau mit PvuI-Enzym linearisiert, mit Ethanol ausgefällt und in 50 μl PBS gelöst. Ungefähr 10 Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet und in 0,5 ml PBS in einer Elektroporationsküvette zusammen mit der verdauten DNA resuspendiert.
Nach 10 Minuten auf Eis setzte man die Zellen einem Impuls von 200 Volt und 960 μF aus und beließ sie für weitere 10 Minuten in Eis. Die Zellen wurden in Platten mit 96 Wells mit D'MEM F12 plus 10% fötalem Kälberserum verteilt. Zwei oder vier Tage später wurde selektives Medium zugegeben (D'MEM F12 mit 0,45 μg/mL Mycophenolsäure oder 10 mM Histidinol). 14 Tage später waren transfizierte Klone mit dem bloßen Auge sichtbar.
Die Anwesenheit von humanem Antikörper in dem Medium der Wells, die transfizierte Klone enthalten, wurde durch [LISA gemessen. Es wurden Mikrotiter-Wellplatten mit der leichten Kette von Ziege-Anti-Human-Kappa (für Klone, die humane Kappa-Kette erzeugen) oder Anti-Human-IgG-Antikörper (gammakettenspezifisch) (für die Klone, die den vollständigen Antikörper erzeugen) beschichtet. Nach Waschen mit PEST (phosphatgepufferte Salzlösung, die 0,05% Tween 20 enthält) wurde verdünntes Kulturmedium der Wells, das Transfektanten enthält, für eine Stunde bei 37°C zu jedem Mikrotiterwell gegeben. Die Wells wurden mit PBS-T gewaschen und es wurde Peroxidase von leichter Kette von Meerrettich konjugierter Ziege-Anti-Human-Kappa oder alkalischer Phosphatase konjugierter Ziege-Anti-Human-IgG (gammakettenspezifisch) zugegeben und eine Stunde bei 37°C inkubiert. Die Wells wurden mit PBS-T gewaschen es wurde Substratpuffer zugegeben, der o-Phenylendiamin bzw. p-Nitrophenylphosphat enthielt. Nach einer halben Stunde wurde Extinktion bei 492 oder 405 nm gemessen.
Konstruktion der humanisierten Antikörper P3hu und 1E10 hu durch Humanisierung von T-Zell-Epitopen. Vorhersage von T-Zell-Epitopen
Die Sequenzen von variablen Domänen von P3 und 1E10 wurden mit dem Algorithmus AMPHI analysiert (Margalit et al. (1987): Prediction of immunodominant helper T cell antigenic sites from the primary sequence, J. Immunol., 138: 2213-2229). Er suchte helikale amphipatische Segmente mit 7 oder 11 Aminosäureresten, die mit T-Immunogenität assoziiert waren. Das Programm SOHHA sagte auch helikale hydrophobe Segmente voraus. (Elliot et al. (1987). An hypothesis an the binding of an amphipatic, alpha helical sequence in li to the desotope of class II antigen, J. Immunol., 138: 2949-2952). Beide Algorithmen sagten voraus, welche Segmente der Sequenzen der variablen Bereiche von Antikörper P3 und 1E10 T-Helferzellen in dem Kontext von MHC Klasse II Molekülen präsentiert werden könnten.
Homologieanalyse mit humanen Immunglobulinen.
Die Aminosäuresequenzen von murinen variablen Bereichen wurden mit den Immunglobulinsequenzen verglichen, die in der GeneBank und EMBL-Datenbank (im Internet verfügbar) vorhanden waren. Für jeden Antikörper wurde die am stärksten homologe Sequenz des humanen variablen Bereichs bestimmt. Zum Suchen von Sequenzhomologie wurde die Software PC-TWO HIBIO PROSIS 06-00 (Hitachi) verwendet.
Analyse der Verringerung von Immunogenität.
Das Ziel des Verfahrens ist es, mit einem Minimum an Änderungen durch Aufbrechen (orig.: "breaking") oder Humanisieren von potentiellen immunogenen T-Epitopen Immunogenität zu verringern. Das Verfahren enthält vernünftiges Ersetzen von wenigen Aminosäureresten, die in helikalen amphipatischen Segmenten angeordnet sind. Die Aminosäuren, die hauptsächlich für kanonische Strukturen verantwortlich sind, und auch die Reste in der unmittelbaren Nachbarschaft der CDRs oder in der in der Vernierzone müssen erhalten bleiben.
Verfahrensgemäß wurden Sequenzen des murinen variablen Bereichs mit der am stärksten homologen humanen Sequenz verglichen und es wurden unterschiedliche Aminosäurereste an jeder Position zwischen dem murinen MAb und der am stärksten homologen Sequenz identifiziert, wobei nur Reste in FRs berücksichtigt wurden (Kabat (1991), Sequences of Proteins of immunological interest, Fünfte Auflage, National Institute of Health); die oben definierten Reste wurden durch solche Reste ersetzt, die in der am stärksten homologen Sequenz vorhanden waren. Ersetzungen erfolgten durch gerichtete Mutagenesetechniken.
Reste, die in die dreidimensionale Struktur der Bindungsstelle einbezogen sind, wurden nicht mutiert; es könnte Antigenerkennung beeinflussen. Weitere Information über den Einfluss der Ersetzungen in der Tertiärstruktur kann durch Molecular Modelling der Antigen-Bindungsstelle erhalten werden.
Die Anwesenheit von Prolinresten in dem helikalen amphipatischen Segment und die Tatsache, dass bestimmte murine Reste nicht an der gleichen Position in der am stärksten homologen humanen Sequenz erscheinen, aber in anderen humanen Immunglobulinen häufig sind, muss berücksichtigt werden. Aus diesem Grund gibt es kein einmaliges Ensemble von murinen Aminosäuren, das in den Gerüsten ersetzt werden soll. Es ist möglich, durch verschiedene Anzahlen an Ersetzungen verschiedene Versionen des modifizierten Antikörpers zu erhalten. Die Mutationen wurden durch Überlappen von PCRs ausgeführt.
Klonieren und Expression von humanisierten P3hu- und 1E10hu-Antikörpern.
Die dem P3hu und 1E10hu entsprechenden genetischen Konstruktionen wurden in Expressionsvektoren kloniert, wobei dem Verfahren gefolgt wurde, das für die chimären Antikörper beschrieben ist. Die resultierenden Konstruktionen waren P3VKhu-PAG4622 oder 1E10Vkhu-PAG4622 und P3VHhu-PAH4604 und 1E10VHhu-PAH4604. Sie wurden in NS-O-Zellen transfiziert, wobei dem Protokoll gefolgt wurde, das oben für chimäre Antikörper beschrieben ist.
Reinigung der rekombinanten Antikörper.
Die rekombinanten Antikörper wurden durch Affinitätschromatographie unter Verwenden von Protein A gereinigt (Pharmacia, Uppsala, Schweden).
Biologische Aktivität.
Das durch ELISA gemessene spezifische Binden an Antigen testete die biologische Aktivität der rekombinanten Antikörper.
Bei rekombinantem MAb P3 wurden Mikrotiterplatten mit GM3(NeuGc)-Gangliosid in Methanol beschichtet. Nach einer Stunde Trocknen wurde unspezifisches Binden durch 1% Rinderserumalbumin (BSA) in Tris-HCl Puffer, inkubiert für eine Stunde bei 37°C, blockiert. Die Wells wurden mit PBS gewaschen und für 1 Stunde bei 37°C mit gereinigtem rekombinantem Mab P3 inkubiert. Die Wells wurden mit Tris-HCl gewaschen und es wurde ein mit alkalischer Phosphatase konjugierter Ziege-Anti-Human-Antikörper hinzugegeben und bei 37°C für eine Stunde inkubiert. Schließlich wurden die Wells gewaschen und es wurde der Substratpuffer hinzugegeben, der p-Nitrophenylphosphat enthielt. Nach einer halben Stunde wurde Extinktion bei 405 bzw. 492 nm gemessen.
Bei rekombinantem Mabai 1E10 war die ELISA-Analyse ähnlich, außer dass Wells mit Mab P3 beschichtet wurden und Waschen mit PBS-0,05% Tween 20 erfolgte.
Beispiele.
In den folgenden Beispielen wurden alle verwendeten Enzyme sowie alle Reagenzien und Materialien von kommerziellen Quellen bezogen, es sei denn, es ist anders angegeben.
Beispiel 1. Erhalten von chimärem MAb P3.
Die cDNA-Synthese wurde erhalten durch eine Reaktion mit Reverse-Transkriptase-Enzym, beginnend mit RNA von dem Hybridom erzeugenden Mab P3, wie oben beschrieben ist. Die Sequenz der bei dieser Reaktion verwendeten spezifischen Primer wird gezeigt:
Für VH:
Für VK:
cDNA VHP3 und cDNA VKP3 wurden durch PCR unter Verwenden von Taq-Polymerase und spezifischen Primern amplifiziert. Die in den Primern enthaltenen Restriktionsstellen waren ECORV/NHEI für VH und ECORV/SALI für VK. Es wurden die folgenden Primersequenzen verwendet:
Für VH:
Für VK:
PCR-Produkte wurden in einen TA-Vektor kloniert (TA Klonierungskit, Invitrogen). Es wurden zwölf unabhängige Klone durch das Didesoxy-Verfahren unter Verwenden von T7 DNA Pol (Pharmacia) sequenziert. Durch Homologiesuchanalyse wurde die am stärksten homologe Sequenzgruppe für VHP3 und VKP3 ermittelt. VHP3- und VKP3-Sequenzen (1 und 2) weisen gemäß der Klassifikation von Kabat eine hohe Homologie mit den Gruppen IB bzw. V auf.
Nach Verdau mit den Restriktionsenzymen ECORV und NHEI für VHP3 und mit ECORV und SALZ für VKP3 wurden sie in die vorher mit den gleichen Enzymen verdauten Expressionsvektoren PAH4604 bzw. PAG4622 für VH bzw. VK kloniert. Diese Expressionsvektoren wurden von Sherie Morrison (UCLA, Kalifornien, VStvA) zur Verfügung gestellt, sie sind geeignet für Expression von Immunglobulinen in Säugetierzellen. Der Vektor PAH 4604 enthält den humanen konstanten Bereich IgG1 und den humanen PAG 4622 (Coloma et al. (1992): Novel vectors for the expression of antibody molecules using variable regions generated by polymerase chain reaction, J. Immunol. Meth., 152: 89-104). Die resultierenden Konstrukte waren P3VH-PAH4604 und P3VK-PAG4622.
NS-O-Zellen wurden mit 10 μg P3VK-PAG4622 transfiziert, ein die leichte Kette exprimierender Klon wurde mit 10 μg P3VH-PAH4604 transfiziert, in beiden Fällen wird DNA mit PvuI linearisiert, mit Ethanol ausgefällt und in 50 μl PBS vor Transfektion gelöst.
Es wurden ungefähr 10 Zellen durch Zentrifugation geerntet und in 0,5 ml PBS zusammen mit der verdauten DNA in einer Elektroporationsküvette resuspendiert. Nach 10 Minuten auf Eis, setzte man die Zellen einem Impuls von 200 Volt und 960 μF aus und beließ sie für weitere 10 Minuten in Eis. Die Zellen wurden in Platten mit 96 Wells mit D'MEM F12 plus 10% fötalem Kälberserum verteilt. Zwei oder vier Tage später wurde selektives Medium zugegeben (D'MEM F12 mit 0,45 μg/mL Mycophenolsäure bzw. 10 mM Histidinol). 14 Tage später waren transfizierte Klone mit dem bloßen Auge sichtbar.
Die Anwesenheit von humanem Antikörper in dem Medium der Wells, die transfizierte Klone enthalten, wurde durch ELISA gemessen. Es wurden Mikrotiter-Wellplatten mit der leichten Kette von Ziege-Anti-Human-Kappa (für Klone, die humane Kappa-Kette erzeugen) oder Anti-Human-IgG-Antikörper (gammakettenspezifisch) (für die Klone, die den vollständigen Antikörper erzeugen) beschichtet. Nach Waschen mit PEST (phosphatgepufferte Salzlösung, die 0,05% Tween 20 enthält) wurde verdünntes Kulturmedium der Wells, das Transfektanten enthält, für eine Stunde bei 37°C zu jedem Mikrotiterwell gegeben. Die Wells wurden mit PBS-T gewaschen und es wurde Peroxidase von leichter Kette von Meerrettich konjugierter Ziege-Anti-Human-Kappa oder alkalischer Phosphatase konjugiertem Ziege-Anti-Human-IgG (gammakettenspezifisch) zugegeben und eine Stunde bei 37°C inkubiert. Die Wells wurden mit PBS-T gewaschen es wurde Substratpuffer zugegeben, der o-Phenylendiamin bzw. p-Nitrophenylphosphat enthielt. Nach einer halben Stunde wurde Extinktion bei 492 bzw. 405 nm gemessen.
Beispiel 2. Erhalten von verschiedenen Versionen des humanisierten Antikörpers P3.
Murine VHP3- und VKP3-Sequenzen (1 und 2) wurden mit humanen Sequenzen verglichen. 3 und 4 zeigen die am stärksten homologen Sequenzen. Es wurden helikale amphipatische Bereiche oder potentielle T-Zell-Epitope auf Sequenzen des variablen Bereichs von murinem P3 gesucht und es wurde verfahrensgemäß eine vernünftige Strategie für Aminosäureersetzungen festgelegt, um potentielle T-Zell-Epitope in den murinen Sequenzen aufzubrechen (orig.: "to break") oder zu humanisieren.
Die Analyse von VHP3 ergab (3) 2 amphipatische Segmente, das erste umfasste CDR1, FR2 und einige Reste des CDR2, das zweite umfasste das Ende von FR3 und CDR3. Die größten Unterschiede von muriner Sequenz im Vergleich mit der am stärksten homologen humanen Sequenz wurden in CDRs oder Resten gefunden, die in die dreidimensionale Struktur der Bindungsstelle einbezogen waren. Aus diesem Grund wurde entschieden, keine Aminosäure in muriner VHP3 zu ersetzten.
Die Analyse von VKP3 ergab auch 2 amphipatische Segmente (4), das erste umfasste FR1, das zweite umfasste CDR2 und einige Reste des FR3. Es wurde entschieden, Reste an Positionen 8, 9, 10, 11 und 13 durch Reste an der gleichen Position in der am stärksten homologen humanen Sequenz zu ersetzten. Die Aminosäuren His, Lys, Phe, Met und Thr wurden durch Pro, Ser, Ser, Leu bzw. Ala ersetzt. Die Ersetzungen erfolgten durch überlappende PCR (Kammann et al. (1989) Rapid insertional mutagenesis of DNA by polymerase chain reaction (PCR), Nucleic Acids Res., 17: 5404) unter Verwenden von Primern 1 und 2 und 3 und 4 mit den folgenden Sequenzen:
Die Punktmutationen wurden durch Sequenzieren verifiziert. Das resultierende Konstrukt war P3Vkhu und es wurde in PAG 4622-Expressionsvektor kloniert. Das resultierende Konstrukt war P3VKhu-PAG4622. Um den humanisierten Antikörper P3 zu exprimieren, wurden NS-O-Zellen mit P3VH-PAH4604 und P3VKhu-PAG4622 transfiziert.
P3hu-Antikörper wurde unter Anwenden des gleichen Verfahrens von Elektroporation und Nachweis transfiziert, das oben für die chimären Antikörper beschrieben ist.
Beispiel 3: Biologische Aktivität von chimärem MAb P3.
Das durch ELISA gemessene spezifische Binden testete die biologische Aktivität des chimären Mab P3.
Für rekombinanten MAb P3 wurden Mikrotiterplatten mit GM3(NeuGc)-Gangliosid in Methanol beschichtet. Nach einer Stunde Trocknen bei 37°C wurde unspezifisches Binden durch 1% Rinderserumalbumin (BSA) in Tris-HCl Puffer, inkubiert für eine Stunde bei 37°C, blockiert. Die Wells wurden mit PBS gewaschen und für 1 Stunde bei 37°C mit gereinigtem rekombinantem Mab P3 inkubiert. Die Wells wurden mit Tris-HCl gewaschen und es wurde ein mit alkalischer Phosphatase konjugierter Ziege-Anti-Human-Antikörper hinzugegeben und bei 37°C für eine Stunde inkubiert. Schließlich wurden die Wells mit Tris-HCl gewaschen und es wurde der Substratpuffer hinzugegeben, der p-Nitrophenylphosphat enthielt. Nach einer halben Stunde wurde Extinktion bei 405 nm gemessen.
Chimärer Mab T1 wurde als negative Kontrolle verwendet.
5 zeigt das spezifische Binden von chimärem Mab P3 an das Antigen.
Die folgenden BEISPIELE 4–6 betreffen nicht die Erfindung.
Beispiel 4. Erhalten von chimärem MAb 1E10.
Die cDNA-Synthese wurde durch eine Reaktion mit Reverse-Transkriptase-Enzym erhalten, beginnend mit RNA aus dem Hybridom erzeugenden Mab 1E10, wie oben beschrieben ist. Nachfolgend ist die Sequenz der bei dieser Reaktion verwendeten spezifischen Primer gezeigt:
Für VH:
Für VK:
cDNA VH1 E10 und cDNA VK1 E10 wurden durch PCR unter Verwenden von Taq Pol und spezifischen Primern amplifiziert.
Für VH:
Für VK:
PCR-Produkte wurden in TA-Vektor kloniert (TA Klonierungskit, Invitrogen). Es wurden zwölf unabhängige Klone durch das Didesoxy-Verfahren unter Verwenden von T7 DNA Pol sequenziert (Pharmacia) (7 und 8). Durch Homologiesuchanalyse wurde die am stärksten homologe Sequenzgruppe für VH1E10 und VK1E10 ermittelt. VH1E10- und VK1E10-Sequenzen weisen nach der Klassifikation von Kabat eine große Homologie mit verschiedenen Gruppen bzw. V auf. Nach Verdau mit den Restriktionsenzymen ECORV und NHEI für VH1E10 und mit HincII und SALZ für VK1E10, wurden sie in die Expressionsvektoren kloniert, die zuvor mit geeigneten Enzymen verdaut worden waren, PAH4604 bzw. PAG4622 für VH bzw. VK. Diese Expressionsvektoren wurden von Sherie Morrison (UCLA, Kalifornien, VStvA) zur Verfügung gestellt, sie sind für Expression von Immunglobulinen in Säugetierzellen geeignet. Der Vektor PAH 4604 umfasst den humanen konstanten Bereich IgG1 und den humanen PAG 4622 (Coloma et al. (1992): Novel vectors for the expression of antibody molecules using variable regions generated by polymerase chain reaction, J. Immunol. Meth., 152: 89-104). Die resultierenden Konstrukte waren 1E10VH-PAH4604 und 1E10VK-PAG4622.
NS-O-Zellen wurden mit 10 μg 1E10VK-PAG4622 transfiziert, ein die leichte Kette exprimierender Klon wurde mit 10 μg 1E10VH-PAH4604 transfiziert, in beiden Fällen wird DNA mit PvuI linearisiert, mit Ethanol ausgefällt und vor Transfektion in 50 μl PBS gelöst.
Es wurden ungefähr 10⁷ Zellen durch Zentrifugation geerntet und in 0,5 ml PBS zusammen mit der verdauten DNA in einer Elektroporationsküvette resuspendiert. Nach 10 Minuten auf Eis setzte man die Zellen einem Impuls von 200 Volt und 960 μF aus und beließ sie für weitere 10 Minuten in Eis. Die Zellen wurden in eine 96 Well-Platte mit D'MEM F12 plus 10% fötalem Kälberserum verteilt. Zwei oder vier Tage später wurde selektives Medium zugegeben (D'MEM F12 mit 0,45 μg/mL Mycophenolsäure bzw. 10 mM Histidinol). 14 Tage später waren transfizierte Klone mit dem bloßen Auge sichtbar.
Die Anwesenheit von humanem Antikörper in dem Medium der Wells, die transfizierte Klone enthalten, wurde durch ELISA gemessen. Es wurden Wells einer Mikrotiter-Platte mit der leichten Kette von Ziege-Anti-Human-Kappa (für Klone, die humane Kappa-Kette erzeugen) oder Anti-Human-IgG-Antikörper (gammakettenspezifisch) (für die Klone, die den vollständigen Antikörper erzeugen) beschichtet. Nach Waschen mit PEST (phosphatgepufferte Salzlösung, die 0,05% Tween 20 enthält) wurde verdünntes Kulturmedium der Wells, das Transfektanten enthält, für eine Stunde bei 37°C zu jedem Mikrotiterwell gegeben. Die Wells wurden mit PBS-T gewaschen und es wurde Peroxidase von leichter Kette von Meerrettich konjugierter Ziege-Anti-Human-Kappa oder alkalischer Phosphatase konjugiertem Ziege-Anti-Human-IgG (gammakettenspezifisch) zugegeben und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Wells wurden mit PBS-T gewaschen und es wurde Substratpuffer zugegeben, der o-Phenylendiamin bzw. p-Nitrophenylphosphat enthielt. Nach einer halben Stunde wurde Extinktion bei 492 bzw. 405 nm gemessen.
Beispiel 5. Erhalten von verschiedenen Versionen des humanisierten Antikörpers 1E10.
Murine VH1E10-VK1E10-Sequenzen (6 und 7) wurden mit humanen Sequenzen verglichen, 8 und 9 zeigen die am stärksten homologen humanen Sequenzen. Es wurden helikale amphipatische Bereiche oder potentielle T-Zell-Epitope auf Sequenzen des variablen Bereichs von murinem 1E10 gesucht und es wurde verfahrensgemäß eine vernünftige Strategie für Aminosäureersetzungen festgelegt, um potentielle T-Zell-Epitope in den murinen Sequenzen aufzubrechen (orig.: "to break") oder zu humanisieren.
Die Analyse auf VH1E10 ergab (8) 3 amphipatische Segmente, das erste umfasste FR1, das zweite umfasste FR2, das dritte umfasste FR3. Es wurde entschieden, Reste an Positionen 5, 40, 42 und 87 (83 nach der Zählung von Kabat) durch Reste an den gleichen Positionen in der am stärksten homologen humanen Sequenz auszutauschen. Die Aminosäuren Gln, Arg, Glu und wurden durch Val, Ala, Gly bzw. Arg ersetzt.
Die Ersetzungen erfolgten durch überlappende PCR (Kammann et al. (1989) Rapid insertional mutagenesis of DNA by polymerase chain reaction (PCR), Nucleic Acids Res., 17: 5404) unter Verwenden eines unterschiedlichen Primersatzes.
Primer für Mutation an Position der schweren Kette waren 1 und 2 und 3 und 4 mit den folgenden Sequenzen:
Nach Sequenzprüfung der Punktmutation an Position 5 wurden Mutationen an Positionen 40 und 42 eingefügt.
Primer für Mutationen an Positionen 40 und 42 der schweren Kette:
Nach Sequenzprüfung der Punktmutation an Positionen 40 und 42 wurde Mutation an Position 87 (83 nach der Zählung von Kabat) eingefügt.
Primer für Mutationen an Position 87 (83 nach der Zählung von Kabat) der schweren Kette:
Weitere Ersetzungen wurden nicht durchgeführt, da Reste in die dreidimensionale Struktur der Bindungsstelle einbezogen waren.
Die Punktmutationen wurden durch Sequenzieren verifiziert. Das resultierende Konstrukt war 1E10VHhu und es wurde in den Expressionsvektor PAH4604 kloniert. Das resultierende Konstrukt war 1E10VH-PAH4604.
Die Analyse auf VK1E10 ergab auch 3 amphipatische Segmente (9), das erste Segment umfasst FR1, das zweite umfasst CDR1 und das dritte umfasst FR3. Es wurde entschieden, Reste an Positionen 7, 8 und 15 durch Reste an der gleichen Position in der am stärksten homologen humanen Sequenz zu ersetzen. Die Aminosäuren Thr, Thr und Leu wurden durch Ser, Pro bzw. Val ersetzt. Die Ersetzungen erfolgten durch überlappende PCR (Kammann et al. (1989) Rapid insertional mutagenesis of DNA by polymerase chain reaction (PCR), Nucleic Acids Res., 17: 5404) unter Verwenden von Primern 1 und 2 und 3 und 4 mit den folgenden Sequenzen:
Primer für Mutation an Positionen 7, 8 und 15 der leichten Kette:
Die Punktmutationen wurden durch Sequenzieren verifiziert. Das resultierende Konstrukt war 1E10Vkhu und es wurde in den Expressionsvektor PAG 4622 kloniert. Das resultierende Konstrukt war 1E10VKhu-PAG4622.
Um den humanisierten Antikörper 1E10 zu exprimieren wurden NS-O-Zellen mit 1E10VHhu-PAH4604 und 1E10VKhu-PAG4622 transfiziert.
1E10hu-Antikörper wurde unter Anwenden des gleichen Verfahrens von Elektroporation und Nachweis transfiziert, das oben für die chimären Antikörper beschrieben ist.
Beispiel 6: Biologische Aktivität von chimärem MAb1E10.
Das durch ELISA gemessene spezifische Binden an Antigen testete die biologische Aktivität des chimären Mab 1E10.
Für rekombinanten MAb 1E10 wurden Mikrotiterplatten mit Mab P3 beschichtet. Nach Waschen mit PEST (phosphatgepufferte Salzlösung, die 0,05% Tween 20 enthält) wurde unspezifisches Binden durch 1% Rinderserumalbumin (BSA) in PEST, inkubiert für eine Stunde bei 37°C, blockiert. Die Wells wurden gewaschen und für 1 Stunde bei 37°C mit gereinigtem rekombinantem Mab 1E10 inkubiert. Die Wells wurden mit PEST gewaschen und es wurde ein mit alkalischer Phosphatase konjugierter Ziege-Anti-Human-Antikörper hinzugegeben und bei 37°C für eine Stunde inkubiert. Schließlich wurden die Wells mit PEST gewaschen und es wurde der Substratpuffer hinzugegeben, der p-Nitrophenylphosphat enthielt. Nach einer halben Stunde wurde Extinktion bei 405 nm gemessen.
Chimäres Mab C5 wurde als negative Kontrolle verwendet.
10 zeigt das spezifische Binden von chimärem Mab 1E10 an Mab P3.
Kurze Beschreibung der Figuren:
1: VHP3 DNA und abgeleitete Aminosäuresequenzen. Sequenzen sind entsprechend der Nummerierung von Kabat angeordnet (Kabat et al. (1991), Sequences of Proteins of immunological interest, Fünfte Auflage, National Institute of Health), CDRs erscheinen mit punktierter Linie markiert.
2: VKP3 DNA und abgeleitete Aminosäuresequenzen. Sequenzen sind entsprechend der Nummerierung von Kabat angeordnet (Kabat und Mitarbeiter (1991), Sequences of Proteins of immunological interest, Fünfte Auflage, National Institute of Health), CDRs erscheinen mit punktierter Linie markiert.
3: VHP3 wurde zu der am stärksten homologen humanen Sequenz angeordnet. Amphipatische Segmente sind unterstrichen und CDRs in Fettdruck.
4: VKP3 wurde zu der am stärksten homologen humanen Sequenz angeordnet. Amphipatische Segmente sind unterstrichen und CDRs in Fettdruck.
5: Spezifisches Binden an GM3(NeuGc) durch chimären Mab P3. Es wurden verschiedene Konzentrationen von Mab P3 und MAb T1 (negative Kontrolle) durch ELISA getestet. Es wurden Mikrotiterplatten mit GM3(NeuGc)- und GM3(NeuAc)-Gangliosid (negative Kontrolle) in Methanol beschichtet und es wurde spezifisches Binden gemessen.
6: VH1E10 DNA und abgeleitete Aminosäuresequenzen. Sequenzen sind entsprechend der Nummerierung von Kabat angeordnet (Kabat und Mitarbeiter (1991), Sequences of Proteins of immunological interest, Fünfte Auflage, National Institute of Health), CDRs erscheinen mit punktierter Linie markiert.
7: VK1E10 DNA und abgeleitete Aminosäuresequenzen. Sequenzen sind entsprechend der Nummerierung von Kabat angeordnet (Kabat et al. (1991), Sequences of Proteins of immunological interest, Fünfte Auflage, National Institute of Health), CDRs erscheinen mit punktierter Linie markiert.
8: VH1E10 wurde zu der am stärksten homologen humanen Sequenz angeordnet. Amphipatische Segmente sind unterstrichen und CDRs in Fettdruck.
9: VK1E10 wurde zu der am stärksten homologen humanen Sequenz angeordnet. Amphipatische Segmente sind unterstrichen und CDRs in Fettdruck.
10: Spezifisches Binden von murinem Mab P3 durch chimären Mab 1E10. Es wurden verschiedene Konzentrationen von Mab 1E10 und MAb C5 (negative Kontrolle) durch ELISA getestet. Es wurden Mikrotiterplatten mit Mab P3 und Mab A3 (negative Kontrolle) beschichtet und es wurde spezifisches Binden gemessen.
Sequenzprotokoll

Claims

Ein von dem murinen monoklonalen Antikörper Mab P3 abgeleiteter chimärer monoklonaler Antikörper, der Ganglioside erkennt, die N-glykolisierte Sialsäure enthalten, und der hergestellt ist durch die Hybridomzelllinie mit der Hinterlegungsnummer ECACC 94113026, wobei die hypervariablen Domänen der schweren und leichten Ketten von Mab P3 die folgenden Sequenzen enthalten: SCHWERE KETTE CDR1: RYSVH CDR2: MIWGGGSTDYNSALKS CDR3: SGVREGRAQAWFAY LEICHTE KETTE CDR1: KASQDVSTAVA CDR2: SASYRYT CDR3: QQHYSTPWT; die Framework-Bereiche (FRs) der schweren und leichten Ketten von Mab P3 die folgenden Sequenzen enthalten: SCHWERE KETTE FR1: QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLS FR2: WVRQPPGKGLEWLG FR3: RLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCAR FR4: WGQGTLV LEICHTE KETTE FR1: DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITC FR2: WYQQKPGQSPKLLIY FR3: GVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYC FR4: FGGGTKL; wobei der chimäre monoklonale Antikörper für seine Humanisierung und Erhaltung der Bindungseigenschaften an das Antigen die folgenden Substitutionen in dem FR1-Bereich der leichten Kette aufweist: LEICHTE KETTE: Position 8: His durch Pro Position 9: Lys durch Ser Position 10: Phe durch Ser Position 11: Met durch Leu Position 13: Thr durch Ala
Ein monoklonaler Antikörper nach Anspruch 1, wobei der konstante Bereich der schweren Kette die Aminosäuresequenz einer gamma-1-Kette enthält und der konstante Bereich der leichten Kette die Aminosäuresequenz einer kappa-Kette enthält, die beide von humanen Immunglobulinen abgeleitet sind.
Eine Zelllinie, die einen der monoklonalen Antikörper der Ansprüche 1 bis 2 erzeugt.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung für die Behandlung von bösartigen Tumoren der Brust und Melanomen, ihren Metastasen und Rückfällen, die einen der monoklonalen Antikörper der Ansprüche 1 bis 2 enthält.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung für in vivo Lokalisierung und Identifikation von bösartigen Tumoren der Brust und Melanomen, ihren Metastasen und Rückfällen, die einen der monoklonalen Antikörper der Ansprüche 1 bis 2 enthält.
Verwendung von monoklonalem Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 2 für die Herstellung eines Medikaments, das für die Behandlung von bösartigen Tumoren der Brust und Melanomen, ihren Metastasen und Rückfällen verwendbar ist.