KR100946168B1 - 강글리오사이드-관련 재조합 항체 및 종양의 진단 및치료에 있어서 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본원발명은 부다페스트조약에 따라서 기탁번호 ECACC 97112901인 히브리도마 세포주에 의해서 생산된 항유전자형 마우스 단일클론 항체 1E10 (MAbai 1E10)로부터 DNA 재조합 기술에 의해서 변형된 항체를 수득하는 방법에 관한 것이며, 원래의 항체의 항원에 대한 선택적 결합의 생물학적 작용은 유지하면서 동시에 면역원성이 적은 단일클론성 항체를 수득하는 것을 목적으로 한다.
본원발명의 키메릭 항체는 인간의 면역글로불린의 불변부를 포함하는 이외에 마우스 면역글로불린의 가변부 및 인간 면역극로불린의 불변부를 포함하며, (이는 인간화되어 있음), 이들은 마우스 프레임워크 (murine frameworks, FRs)에서, 특히 T 세포에 대한 항원성 부위가 될 수 있는 부위에 대해서 변형이 가해졌다 (FRs의 몇몇 위치들도 인간화되었음). 이러한 항체는 상이한 타입의 종양을 진단하고 치료하는데 사용될 수 있다.
본원발명은 또한 항체의 치료 및 진단 목적으로 사용하는 것에 대한 것이다.
마우스 단일클론 항체 P3 (MAb P3), 항유전자형 마우스 단일클론 항체 1E10 (MAbai 1E10)

Description

강글리오사이드-관련 재조합 항체 및 종양의 진단 및 치료에 있어서 이의 용도{Ganglioside-associated recombinant antibodies and the use thereof in the diagnosis and treatment of tumors}
본원발명은 생명공학분야에 관한 것이며, 특히 유전자 공학에 의해서 수득한 신규한 재조합 항체에 대한 것이며, 구체적으로 마우스 단일클론 항체 P3 (MAb P3)의 항-유전자형 마우스 단일클론 항체 1E10 (MAbai 1E10)로부터 수득한 키메릭 및 인간화된(humanized) 항체에 대한 것이다.
더욱 구체적으로, 본 발명은 N-글리콜릴화 시알산(N-glycolylated sialic acid)을 포함하는 강글리오사이드에 결합하는 항체에 관한 것이며, 아세틸화된 형태의 강글리오사이드에 관한 것은 아니며, 중성 글리코리피드(glycolipid)에 대한 것도 아니다. N-글리콜릴화 시알산을 포함하는 강글리오사이드는 유방암 및 흑색종에서 널리 발현되는 항원이다. 반면, MAbai 1E10의 항종양 효과는 실험 모델에서 제시되어 왔다.
본원발명은 또한 앞서 언급한 암, 특히 유방암 및 흑색종의 진단 및 치료에 유용한 재조합 항체를 포함하는 약학조성물에 관한 것이다.
강글리오사이드는 시알산을 포함하는 당스핑고지질이며 척추동물군 (vertebrates) 세포의 세포막 (plasmatic membrane)에 존재한다 (Stults et al. (1989): Glycosphingolipids: structure, biological source and properties, Methods Enzymology, 179:167-214). 몇몇의 분자들은 종양 및 종양표지물질(tumor maker)과 관련된 항원으로서 보고되어 왔으며 (Hakomori et al. (1991): Possible functions of tumor associated carbohydrate antigens, Curr. Opin. Immunol., 3: 646-653), 그러한 이유로 항-강글리오사이드 항체의 사용은 암의 진단 및 치료에 유용한 것으로 설명되어 왔다 (Hougton et al. (1985): Mouse monoclonal antibody IgG3 antibody detecting GD3 ganglioside: to phase I trial in patients with malignant melanoma, PNAS USA, 82:1242-1246; Zhang et al. (1997): Selection of carbohydrate tumor antigens as targets for immune attack using immunohistochemistry. I. Focus on gangliosides, Int. J. Cancer, 73: 42-49).
동물에 높은 빈도로 발현되는 시알산은 N-아세틸 (NeuAc) 및 N-글리콜릴이다 (NeuGc) (Corfield et al. (1982): Occurrence of sialic acids, Cell. Biol. Monogr., 10: 5-50). NeuGc은 일반적으로 통상의 인간 및 병아리 조직에서는 발현되지 않으나, 다른 척추동물군에 있어서는 광범위하게 퍼져 있다 (Leeden and Yu, (1976): Chemistry and analysis of sialic acid. In: Biological Role of Sialic Acid. Rosemberg A and Shengtrund CL (Eds). Plenum Press, New York, 1-48; Kawai et al. (1991): Quantitative determination of N-glycolylneuraminic acid expression in human cancerous tissues and avian lymphoma cell lines as a tumor associated sialic acid by gas chromatography-mass spectrometry, Cancer Research, 51: 1242-1246). 그러나, 항체 항-NeuGc가 몇몇 인간의 종양 및 종양 세포주를 인식하는 것을 보여주는 보고들이 있다 (Higashi et al. (1988): Detection of gangliosides as N-glycolylneuraminic acid specific tumor-associated Hanganutziu-Deicher antigen in human retinoblastoma cells, Jpn. J. Cancer Res., 79: 952-956; Fukui et al. (1989): Detection of glycoproteins as tumor associated Hanganutziu-Deicher antigen in human gastric cancer cell line, NUGC4, Biochem. Biophys. Res. Commun., 160: 1149-1154). 증가된 수준의 GM3 (NeuGc) 강글리오사이드가 인간 유방암에서 발견되었으며 (Marquina et al. (1996): Gangliosides expressed in human breast cancer, Cancer Research, 1996; 56: 5165-5171), 이 결과가 이 분자를 암 치료의 타겟으로서 더욱 관심가지게 한다.
기탁번호 ECACC 94113026 (유럽특허 EP 0 657 471 B1)로 기탁된 세포주에 의해 생성되는 단일클론 항체 (Mab) P3, 그것은 IgM 유전자형을 가지는 마우스 단일클론 항체이며, GM3(NeuGc) 및 파상풍 톡소이드(tetanic toxoid)를 포함하는 리포좀으로 면역화된 BALB/c 마우스 유래 마우스 비장세포(splenocytes)를 마우스 골수종(myeloma)인 세포주 P3-X63-Ag8.653로 융합시킴으로수 수득된다. 이 Mab P3는 N-글리콜릴화 시알산을 포함하는 강글리오사이드와 강하게 반응하며, 강글리오 사이드의 아세틸화된 형태 및 중성 당지질과는 반응하지 않는다. Mab P3가 유방암 및 흑색종을 인식한다는 것은 양성 (benign) 및 신생물성 (neoplasic) 종양 유래 세포주 및 조직을 이용한 면역세포화학적 (immunocytochemical) 및 면역조직화학적 (immunohistochemical) 연구에 의해서 밝혀졌다 (Vazquez et al. (1995): Generation of a murine monoclonal antibody specific for N-glycolylneuraminic acid-containing gangliosides that also recognizes sulfated glycolipids, Hybridoma, 14: 551-556).
Mab P3은 강화제 및 전달단백질이 없이도 마우스 BALB/c (syngeneic model)에 있어 항-유전자형 면역반응 (Ab2)를 유발한다 (Vazquez et al. (1998): Syngeneic anti-idiotypic monoclonal antibodies to an anti-NeuGc-containing ganglioside monoclonal antibody, Hybridoma, 17: 527-534). 이러한 항체의 인식특성에 있어서 전기음성 그룹, 시알산 (강글리오사이드) 및 SO3- (설파티드, sulfatides)의 역할은 면역화학적 분석에 의해서 설명되었다 (Moreno et al. (1998): Delineation of epitope recognized by an antibody specific for N-glycolylneuraminic acid-containing gangliosides, Glycobiology, 8: 695-705).
서브타입 IgG1의 항-유전자형 Mab 1E10 (Mabai 1E10)은 KLH에 커플링된 Mab P3로 면역화된 마우스 BALB/c로부터 수득하였다 (미국특허 6,063,379, 기탁번호 ECACC 97112901의 세포주). Mabai 1E10는 특성적으로 MAb P3를 인식하며 다른 IgM 항-강글리오사이드 항체와 결합하지는 않는다. 특히, Mabai 1E10는 Mab P3 가 특성적으로 GM3(NeuGc) 및 유관 유방암 (ductal breast carcinoma) 유래 세포주 MDA-MB-435에 결합하는 것을 방해한다 (Mab P3 결합에 양성). 동계 (syngeneic) 또는 동종이계(alogenic) 모델 유래 마우스가 면역화되었을 때, MAbai 1E10는 Ab3 항체의 강한 면역 반응을 유발하며, 이러한 Ab3 항체는 Ab1 항체에 의해서 전달되는 것과 유사한 유전자형을 전달하고 있을 때에도 Mab P3 만큼의 선택성 (specificity)를 나타내지 않았다 (Vazquez et al. (1998): Syngeneic anti-idiotypic monoclonal antibodies to an anti-NeuGc-containing ganglioside monoclonal antibody, Hybridoma, 17: 527-534). MAbai 1E10는 동계 및 동종이계 마우스에 대해서도 강한 항종양 효과를 유발하였다. BALB/c 마우스가 백신접종을 받았을 경우에는 Freund 강화제에서 KLH에 커플링된 MAbai 1E10을 반복하여 투여하였을 때 유방 암종 세포주 F3II가 현저히 감소하였다. 또한 백신 우에 자발적인 폐전이의 수도 감소하였다. 흑색종 세포 B16의 정맥내 접종 10~14일 후에 C57BL/6 마우스에 Mabai 1E10를 정맥내 투여하였을 때, 관련없는 IgG로 처리한 마우스와 비교하여, 현저한 폐전이 수의 감소를 유발하였다. 이러한 결과는 하나 이상의 항종양 효과의 메커니즘이 관여되었다는 점을 암시한다 (Vazquez et al. (2000): Antitumor properties of an anti-idiotypic monoclonal antibody in relation to N-glycolyl-containing gangliosides, Oncol. Rep., 7: 751-756, 2000).
히브리도마 기술이 15년 동안 발달하였고 (Koehler y Milstein (1975): Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity, Nature, 256: 495-497) 단일클론 항체가 여전히 진단 및 연구에서 유용하지만, 인간에 있어서 그들의 치료효과는 밝혀지지 않고 있다. 이는 주로 혈액내 그들의 짧은 반감기에 기인하며, 또한 마우스 작용세포(effector)가 인간면역시스템 및 인간의 항마우스 항체 면역반응(HAMA response)에 작용하지 못한다는 점에 기인한다.
유전공학기술은 MAb 유용성(utility)의 가능성을 획기적으로 증대시켜왔으며, 면역글로불린 유전자를 조작함으로써 감소한 항원성을 갖는 변형된 항체를 수득하는 것이 가능하게 되었으며 특정 질병에 대한 치료 또는 진단에 유용한 그 작용세포의 작용을 향상시킬 수도 있게 되었다. 면역글로불린 면역원성을 감소시키는 방법은 필수적인 목적으로서 마우스 항체 및 인간의 면역글로불린의 차이점을 줄이면서 항원인식 선택성은 바꾸지 않는 것을 목적으로 하고 있다 (Morrison y Oi (1989): Genetically engineered antibody molecules, Adv Immunol., 44: 65-92).
최근에 마우스(murine) 또는 랫(rat) 항체를 인간화하고 인간에게 주입되었을때 외부 단백질에 대한 이종발생성(xenogenic) 면역반응을 줄이기 위해 몇몇의 방법이 개발되어 왔다. 항원성을 줄이는 첫번째 접근이 키메릭항체였으며, 이는, 마우스의 것에 비해서 동일한 선택성을 보이면서 면역원성은 감소시키고 키메릭 항체에 의해서 인간 작용세포의 작용이 유지될 수 있도록, 마우스 단백질의 가변부를 인간 분자의 불변부에 삽입하게 된다 (Morrison et al. (1984): Chimeric human antibody molecules: Mouse antigen-binding domains with human constant region domains, PNAS USA, 81: 6851-6855). 키메릭 항체가 마우스의 것과 동 일한 선택성을 가지고 있을 경우에도, 설치동물(rodent) 가분부에 대한 면역반응이 자주 관찰되었다.
키메릭 항체의 면역원성을 줄이기 위한 추가적인 시도로서, 설치류 단일클론 항체 유래 CDRs만을 인간의 프레임원크 부위에 그래프팅시키며, 이 하이브리드 가분부는 인간의 불변부에 대해서 발현한다 (Jones et al. (1986): Replacing the complementary-determining regions in a human antibody with those from a mouse, Nature 321: 522-524; Verhoeyen et al. (1988): Reshaping human antibodies: grafting an antilysozyme activity, Science 239, 1534-1536). 그러나, 이러한 접근은 몇몇의 단점을 가지고 있는데, 그 항체가 친화도(affinity)를 자주 감소시키고 다수의 프레임워크 잔기(residue)가 결합력을 회복하기 위해서 해당 마우스의 것에 백뮤테이트(backmutate)되어야 한다 (Rietchmann et al. (1988): Reshaping human antibodies for therapy, Nature, 332: 323-327; Queen et al. (1989): A humanized antibody that binds to the interleukin 2 receptor, PNAS USA, 86: 10029-10033; Tempest et al. (1991): Reshaping a human monoclonal antibody to inhibit human respiratory syncytial virus infection in vivo, Biotechnology, 9: 266-272). 또한, CDR-그래프트 항체 있어 면역원성이 유지되는 것이 자주 관찰되었다.
마테오 등은 마우스 항체의 면역원성을 줄이는 과정을 개시하고 있다 (미국특허 5,712,120). 이러한 방법을 따라서, 변형은 가분부에 한정되었으며 특히 키메릭 항체의 마우스 FRs에 한정되었다. 또한 치환은 양극성 서열을 가지는 FRs의 이러한 부위에서만 수행되며, 따라서 T 세포에 의해서 인식되는 잠재적 에피토프(potential epitope)이다. 이 방법은 잠재적인 면역원성 에피토프에 위치한 몇 아미노산 잔기를 가장 동질적인 인간 서열 유래 해당 잔기로 치환하는 것을 포함하며, 카노니컬(canonical) 구조에 주로 관련되어 있는 아미노산 및 CDRs 또는 베르니에 부위(Vernier zone)에 바로 인근한 잔기는 반드시 유지되어야 한다.
결과적인 항체는 그 항원 결합 선택성은 유지하고, 그 마우스 또는 키메릭 전구자(predecessor)에 비해서 면역원성이 적으며 (Mateo et al. (2000): Removal of T cell epitopes from genetically engineered antibodies: Production of modified immunoglobulins with reduced immunogenicity, Hybridoma 19: 463-71), 이러한 특성은 그 치료 유용성을 증가시킨다. 이러한 새로운 과정을 사용함으로써, 적은 변형, 물론 적은 유전자 조작이 행해져야 한다.
본원발명은 유전자 공학기술에 의해서 수득된 재조합 항체에 관한 것이다. 구체적으로 본원발명은 기탁번호가 ECACC 94113026인 히브리도마(hybridoma) 세포주로부터 제조되는 마우스 단일클론 항체 P3 유래 키메릭 항체에 관한 것이다. MAB P3는 유방암세포 및 흑색종에서 발현되는 항원을 인식한다. MAb P3는 H 사슬 및 L 사슬(heavy and light chains)의 초변이성 부분(hypervariable region, CDRs)이 다음의 서열로서 특성되어진다:
H 사슬
CDR1: RYSVH
CDR2: MIWGGGSTDYNSALKS
CDR3: SGVREGRAQAWFAY
L 사슬
CDR1: KASQDVSTAVA
CDR2: SASYRYT
CDR3: QQHYSTPWT
또한, 다음의 H 및 L 사슬의 FRs 서열은 다음인 것이 바람직하다:
H 사슬
FR1: QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLS
FR2: WVRQPPGKGLEWLG
FR3: RLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCAR
FR4: WGQGTLV
L 사슬
FR1: DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITC
FR2: WYQQKPGQSPKLLIY
FR3: GVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYC
FR4: FGGGTKL
바람직한 구현예에서, 본원발명의 키메릭 항체는 H 사슬 인간 IgG1의 불변부 및 L 사슬 인간 Ck의 불변부를 포함한다.
다른 측면에서, 본원발명은 기탁번호가 ECACC 94113026인 히브리도마 세포주에 의해서 제조된 Mab P3 유래 인간화된 항체에 관한 것이며, 인간 H 사슬 IgG1의 불변부 및 인간 L 사슬 인간 Ck의 불변부를 포함하고 있으며 L 사슬의 FRs 부위는 다음의 점변이(point mutations)를 갖는다는 점에 특징이 있다:
L 사슬:
Position 8: His by Pro
Position 9: Lys by Ser
Position 10: Phe by Ser
Position 11: Met by Leu
Position 13: Thr by Ala
다른 측면에서, 본원발명은 기탁번호 ECACC 97112901의 히브리도마 세포주에 의해서 제조되는 마우스 단일클론 항체 1E10 유래 키메릭 항체에 관한 것이며, 이는 MAb P3를 인식하는 항유전자형 항체이다. MAbai 1E10는 H 및 L 사슬의 초변이 영역 (CDRs)가 다음의 서열인 것에 특징이 있다:
H 사슬
CDR1: SYDIN
CDR2: WIFPGDGSTKYNEKFKG
CDR3: EDYYDNSYYFDY
L 사슬
CDR1: RASQDISNYLN
CDR2: YTSRLHSG
CDR3: QQGNTLPWT
또한, H 및 L 사슬의 FRs 서열은 다음인 것이 바람직하다:
H 사슬
FR1: QVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFT
FR2: WVRQRPEQGLEWIG
FR3: KATLTTDKSSSTAYMQLSRLTSEDSAVYFCAR
FR4: WGQGTTLTV
L 사슬
FR1: DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISC
FR2: WYQQKPDGTVKLLIY
FR3: VPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFC
FR4: FGGGTKLESK
바람직한 구현예에서, 본원발명의 키메릭 항체는 H 사슬 인간 IgG1의 불변부 및 L 사슬 인간 Ck의 불변부를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본원발명은 기탁번호 ECACC 97112901인 히브리도마 세포주에 의해서 제조되는 Mab 1E10 유래 인간화된 항체에 대한 것이며, 인간 H 사슬 IgG1의 불변부 및 인간 L 사슬 Ck의 불변부를 포함하고 H 및 L 사슬의 FRs 영역은 다음의 점변이를 포함하고 있다는데 특징이 있다:
L 사슬:
Position 7: Thr by Ser
Position 8: Thr by Pro
Position 15: Leu by Val
H 사슬:
Position 5: Gln by Val
Position 40: Arg by Ala
Position 42: Glu by Gly
Position 87 (카밧 넘버링에 따르면 83): Thr by Arg
또 다른 측면에서 본원발명은 개시한 키메릭 및 인간화된 항체를 발현하는 세포주에 관한 것이고, 추가적으로 본원발명은 이러한 항체를 포함하는 약학조성물에 대한 것이다.
바람직하게 본원발명은 상기한 항체 및 적절한 부형제를 포함하는 유방, 폐, 소화계, 비뇨생식계, 흑생종, 육종, 신경외배엽 종양, 그 전이 및 재발의 치료용 약학조성물에 대한 것이다.
또 다른 측면에서, 본원발명의 약학조성물은 이러한 항체를 포함하며 유방, 폐, 소화계, 비뇨생식계, 흑생종, 육종 및 신경외배엽 종양, 그 전이 및 재발의 국소화 및 진단에 사용될 수도 있다.
MAb P3 및 Mabai 1E10의 가변부 영역의 PCR (Polymerase chain reaction)에 의한 cDNA 합성 및 유전자 증폭
세포질(cytoplasmic) RNA를 약 106의 P3 (GM3 N-글리콜릴화 강글리오사이드에 반응하는 마우스 IgM MAb) 또는 1E10 (항유전자형 항-P3 항체)의 히브리도마 세포로부터 추출하였다. RNA는 제품설명서에 따라서 시약 TRIZOL (GIBCO BRL, Grand Island, NY)을 이용하여 추출하였다.
cDNA 합성 반응은 5 ㎍의 RNA, 25 pmoles의 Vh (VHP3에 대한 마우스 IgM의 불변부 및 VH 1E10에 대한 마우스 IgG1의 불변부에 대한 보체) 또는 Vk (두 항체에 대한 불변 마우스 카파 영역에 대한 보체), 각 2.5 mM의 dNTPs, 50 mM의 pH 7.5인 Tris-HCl, 75 mM의 KCl, 10 mM의 DTT, 8 mM MgCl2 및 15단위의 RNAse 억제제(inhibitor)를 50 ㎕의 반응혼합물에 혼합함으로써 수행되었다. 70℃로 가열하고 10분동안 천천해 37℃까지 냉각시켰다. 그리고 나서 100 단위의 MLV 역전사(reverse transcriptase) 효소를 첨가하고 1시간 동안 42℃에서 배양하였다.
VK 및 VH cDNAs의 가변부는 PCR에 의해 증폭되었다. 그리고 나서, VH 또는 VK의 cADN 5 ㎕을 25 pmoles의 특정 프라이머(specific primers), 각 2.5 mM의 dNTP, 5 ㎕의 10X 버퍼 Taq DNA 폴리머라제의 구성분 및 and 1 단위의 이 효소에 혼합하였다. 표본은 94℃, 30초; 50℃, 30초; 72℃, 1분, 및 마지막으로 5 분, 72℃에서 배양의 25 열사이클을 수행하였다..
증폭된 cDNA의 클로닝 및 시퀀싱
(각각 P3 및 1E10의) VH 및 VK의 PCRs 생성물을 TA 벡터 (TA Cloning kit. Promega, USA) 내로 클로닝하였다. 그 클론들은 T7 DNA 폴리머라이즈 (T7 sequencing kit, Pharmacia, Sweden)를 이용하여 디데옥시법 (dideoxy method)에 의해 시퀀싱하였다.
키메릭 유전자의 구성(construction)
VH VK 유전자는 효소분해(enzymatic digestion)에 의해서 TA 벡터로부터 절단되었으며, 각각의 발현벡터내로 클로닝되었다 (Coloma et al. (1992): Novel vectors for the expression of antibody molecules using variable regions generated by polymerase chain reaction, J. Immunol. Meth., 152: 89-104).
VH 유전자는 EcoRV 및 NheI로 효소분해에 의해서 TA 벡터로부터 절단되었으며 가변영역 인간 IgG1 및 히스티디놀 저항 유전자를 포함하는 발현벡터 (PAH 4604)로 클로닝되었다. 결과물(resultant constructions)은 P3VH-PAH4604 및 1E10VH-PAH4604이었다. VK 유전자는 EcoRV 및 SalI로 효소분해에 의해서 절단되었으며 발현벡터 (PAG4622)내로 클로닝되었다. 이 벡터는 미코페놀산 저항 유전자 및 인간 카파 불변부를 포함하고 있다. 결과물은 P3VK-PAG4622 및 1E10VK-PAG4622이었다.
Mab P3 및 Mabid 1E10으로부터 수득한 키메릭 항체의 발현.
NS-0 세포는 10 ㎍의 P3VK-PAG4622 또는 1E10VK-PAG4622로 전기천공 (electroporated)되었으며, 인간 L 사슬을 발현하는 유전자는 10 ㎍의 P3VH-PAH4604 or 1E10VH-PAH4604에 의해서 감염시켰다.
DNAs는 PvuI 효소로 직선화시켰으며 (linearized), 에탄올로 침전시키고 나서 50 ㎕의 PBS에 용해시켰다. 약 107 세포들을 원심분리에 의해서 수득하였고, 전기천공 큐벳 내의 PBS 및 분리된 DNA 0.5 ml에 재현탁시켰다. 얼음위에서 10분이 경과되고 나서, 세포에 200 볼트 및 960 oF의 펄스를 가하였으며, 얼음위에 추가적으로 10분동안 두었다. 세포들을 D'MEM F12 및 10% 태아소혈청(fetal calf serum)이 있는 96 웰 플레이트에 나누었다. 2일 또는 4일 후에, 선택적인 배양액 (각각 미코페놀산 0.45 ㎍/mL 또는 히스티디놀 10 mM이 있는 D'MEM F12)을 첨가하였다. 감염된 클론은 14일 후에 나안(naked eyes)로도 볼 수 있었다.
감염된 클론을 포함하는 웰의 배양에 인간항체가 존재하는지 여부는 ELISA에 의해서 분석되었다. 마이크로타이터 플레이트 웰(microtiter plate wells)은 고트 항인간 카파 L 사슬 (인간 카파 사슬생성 클론) 또는 항인간 IgG (감마 사슬 선택성, 완전항체생성 클론) 항체로 코팅하였다. PBST (0.05% Tween 20을 포함하는 살린 포스페이트 버퍼 용액)으로 세척하고 나서, 감염제(transfectants)를 포함하는 웰의 희석 배양액 (culture medium)을 37℃에서 한시간동안 각 마이크로타이터 웰에 첨가하였다. 웰은 PBS-T로 세척하였으며 스파이시 라디시-콘주게이트 고트 항인간 카파 L 사슬 (spicy radish-conjugated goat anti-human kappa light chain)의 퍼록시다제 또는 알칼라인 포스하타제-콘주게이트 고트항인간 IgG(감마 사슬 선택성)을 첨가하고 나서 37℃에서 한시간동안 배양되었다. 웰은 PBS-T로 세척하고 각각 o-페닐렌디아민 또는 p-니트로페닐포스페이트를 포함하는 기질 버퍼(substrate buffer)를 첨가하였다. 30분 후에 각각 492 또는 405 nm의 흡광도가 측정되었다.
T 세포 에피토프의 인간화에 의한 인간화된 항체 P3hu 및 1E10 hu의 구성 및 T 세포 에피토프의 예측
P3 및 1E10 가변부의 서열은 알고리듬 AMPHI에 의해서 분석되었다 (Margalit et al. (1987): Prediction of immunodominant helper T cell antigenic sites from the primary sequence, J. Immunol., 138: 2213-2229). 이는 T 면역원성과 관련되어 있는 7개 또는 11개 아미노산 잔기를 갖는 헬리칼 양극성 세그먼트를 탐색하였다. 프로그램 SOHHA 또한 헬리칼 소수성 세그먼트를 예측하였다 (Elliot et al. (1987). An hypothesis on the binding of an amphipatic, alpha helical sequence in Ii to the desotope of class II antigen, J. Immunol., 138: 2949-2952). 두개의 알고리듬은 항체 P3 및 1E10의 가변부 서열에서 유래하는 어느 세그먼트가 MHC 클래스 II 분자의 콘텍스트 내에서 T-헬퍼 세포에 제공될 수 있는지 예측하였다.
인간 면역글로분린에 의한 동질분석
마우스 가변부의 아미노산 서열을 GeneBank 및 EMBL 데이타베이스 (인터넷으로 확인가능)에 포함된 면역글로불린 서열과 비교하였다. 각 항체에 대해서 가장 동질적인 인간 가변부 서열을 결정하였다. 소프트웨어 PC-TWO HIBIO PROSIS 06-00 (Hitachi)를 서열동질성 검색에 사용되었다.
면역원성 감소에 대한 분석
이 방법의 목적은 최소의 변화를 가지고 면역원성 브레이킹(immunogenicity breaking)을 감소시키고 잠재적 면역원성 T 에피토프를 인간화하는 것이다. 이 방법은 헬리칼 양극성 세그먼트에 위치한 몇 아미노산 잔기를 적절히 치환하는 것을 포함한다. 카노니컬 구조에 주로 책임이 있는 아미노산 및 CDRs의 바로 인근 또는 베르니에 존에 있는 잔기는 유지되어야 한다.
이 방법에 따라서, 마우스 가변부 서열을 가장 동질적인 인간 서열과 비교하였고, 마우스 MAb 및 가장 동질적인 인간 서열 사이의 각 위치의 상이한 아미노산 잔기를 확인하였으며, FRs 내의 잔기만이 고려되었고 (Kabat (1991), Sequences of proteins of immunological interest, Fifth Edition, National Institute of Health), 전에 정의되었던 잔기는 가장 동질적인 인간 서열에 존재하는 그 잔기로 치환되었다. 치환은 돌연변이 기술(mutagenesis techniques)에 의해서 수행되었다.
결합부위의 3차원 구조에 관련된 잔기는 돌연변이시키지 않았고, 이는 항원인식에 영향을 끼쳤을 수도 있다. 3차 구조 내 치환의 영향에 대한 추가적인 정보는 항원 결합부위의 분자모델링에 의해서 얻을 수 있었다.
헬리칼 양극성 세그먼트 내에 프롤린 잔기의 존재 및 특정의 마우스 잔기가 가장 동질적인 인간 서열의 동일한 부위에 나타나지는 않지만 다른 면역글로불린에서는 자주 나타난다는 사실을 염두에 두어야 한다. 그러한 이유로 프레임워크로 치환될 유일한 마우스 아미노산 집합(ensemble)은 없다. 상이한 숫자의 치환으로 상이한 버전의 변형된 항체를 얻는 것은 가능하다. 돌연변이는 PCRs의 중첩(over-lapping)에 의해서 수행하였다
인간화된 항체 P3hu 및 1E10hu의 클로닝 및 발현
P3hu 및 1E10hu에 대응되는 유전자 구성은 키메릭 항체에 대해서 설명된 방법에 따라서 발현 벡터내에 클로닝하였다. 결과적인 구성은 P3VKhu-PAG4622 또는 1E10Vkhu-PAG4622 및 P3VHhu-PAH4604 및 1E10VHhu-PAH4604이었다. 이는 키메릭 항체에 대해서 설명된 프로토콜에 따라서 NS-0 세포내로 감염시켰다.
재조합 항체의 정제
재조합 항체는 단백질 A (Pharmacia, Upssala, Sweden)을 이용하여 친화크로 마토그래피(affinity chromatography)법에 의해서 정제하였다.
생물학적 활성
ELISA에 의해 측정된 항체에 대한 선택적인 결합에 의해서 재조합 항체의 생물학적 활성을 테스트하였다.
재조합 MAb P3에 대해서, 마이크로타이터 플레이트는 메탄올 내에서 GM3(NeuGc) 강글리오사이드로 코팅하였다. 한시간 동안 건조시키고 나서, Tris-HCl 버퍼 내 우혈청알부민 (BSA) 1%를 이용하여 비선택적인 결합을 차단하였으며, 37℃에서 한시간동안 배양하였다. 웰을 PBS로 세척하였으며 정제된 재조합 Mab P3를 이용하여 37℃에서 한시간동안 배양하였다. 웰을 tris-HCl로 세척하였으며, 알칼라인 포스페이트와 콘주게이트된 고트 항인간 항체 (a goat anti- human antibody)를 첨가하고, 37℃에서 한시간동안 배양하였다. 마지막으로 웰을 세척하고 p-니트로페닐포스페이트를 포함하는 기질 버퍼 (substrate buffer)를 첨가하였다. 30분 후에, 각각 405 or 492 nm에서 흡광도를 측정하였다.
재조합 Mabai 1E10에 대해서, ELISA 분석은 웰을 Mab P3로 코팅하고 PBS-0.05% Tween 20로 세척한다는 점을 제외하고는 비슷하다.
도 1: VHP3 DNA 및 얻어진 아미노산 서열. 서열은 카밧 넘버링에 의해서 배열하였으며 (Kabat et al. (1991), Sequences of proteins of immunological interest, Fifth Edition, National Institute of Health), CDRs은 점선으로 나타냈다.
도 2: VKP3 DNA 및 얻어진 아미노산 서열. 서열은 카밧 넘버링에 의해서 배열되었으며 (Kabat and collaborators (1991), Sequences of proteins of immunological interest, Fifth Edition, National Institute of Health), CDRs은 점선으로 나타내었다.
도 3: VHP3를 가장 동질인 인간 서열에 대해서 배열하였다(aligned with the most homologous human sequence). 양극성 세그먼트는 밑줄로 표시하였고 CDRs는 볼드로 표시하였다.
도 4: VKP3를 가장 동질인 인간서열에 대해서 배열하였다. 양극성 세그먼트는 밑줄로, CDRs는 볼드로 표시하였다.
도 5: 키메릭 Mab P3에 의한 GM3(NeuGc)에의 선택적 결합. 상이한 농도의 Mab P3 및 MAb T1 (네거티브 콘트롤)를 ELISA로 테스트하였다. 마이크로타이터 플레이트를 메탄올 내에서 GM3(NeuGc) 및 GM3(NeuAc) (네거티브 콘트롤) 강글리오사이드로 코팅하였고, 선택적인 결합을 측정하였다.
도 6: VH1E10 DNA 및 얻어진 아미노산 서열. 서열은 카밧 넘버링에 따라서 배열하였으며 (Kabat and collaborators (1991), Sequences of proteins of immunological interest, Fifth Edition, National Institute of Health), CDRs는 점선으로 표시하였다.
도 7: VK1E10 DNA 및 얻어진 아미노산 서열. 서열은 카밧 넘버링으로 배열 하였으며 (Kabat et al. (1991), Sequences of proteins of immunological interest, Fifth Edition, National Institute of Health), CDRs은 점선으로 표시하였다.
도 8: VH1E10를 가장 동질의 인간 서열에 대해서 배열하였다. 양극성 세그먼트는 밑줄로, CDRs은 볼드로 표시하였다.
도 9: VK1E10를 가장 동질의 인간서열에 대해서 배열하였다. 양극성 세그먼트는 밑줄로 CDRs은 볼드로 표시하였다.
도 10: 키메릭 Mab 1E10에 의한 마우스 Mab P3에의 선택적 결합. 상이한 농도의 Mab 1E10 및 MAb C5 (네거티브 콘트롤)를 ELISA로 테스트하였다. 마이크로타이터 플레이트를 Mab P3 및 Mab A3 (네거티브 콘트롤)로 코팅하였으며 선택적 결합을 측정하였다.
이하의 실시예는 단지 설명의 목적으로만 기재되었으며, 본원발명의 범위를 해석함에 있어 축소하기 위해서 사용되어서는 안되다. 또한 하기의 실시예에서, 다른 기재가 없는 한, 모든 효소, 시약 및 물질은 모두 상용으로 구입하여 사용하였다.
실시예 1. 키메릭 MAb P3의 수득
cDNA 합성은 앞서 설명한 바와 같이 Mab P3를 제조하는 히브리도마 유래 RNA 를 가지고 시작하면서 역전사 효소를 가지고 수득하였다. 이 반응에 사용된 특정 프라이머의 서열은 다음과 같다:
VH:
5' AGGTCTAGAA(CT)CTCCACACACAGG(AG)(AG)CCAGTGGATAGAC 3'
VK:
5' GCGTCTAGAACTGGATGGTGGGAAGATGG 3'
cDNA VHP3 및 cDNA VKP3는 Taq 폴리머라제 및 특정 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭되었다. 프라이머에 포함된 제한부위는 VH에 대해서는ECORV /NHEI이며 VK에 대해서는 ECORV/SALI이다. 사용된 프라이머 서열은 다음과 같다:
VH:
프라이머 1 (시그널 펩티드):
5' GGGGATATCCACCATGG(AG)ATG(CG)AGCTG(TG)GT(CA)AT(CG)CTCTT 3'
프라이머 2 (CH1):
5' GGGGCTAGCTGCAGAGACAGTGACCAGAGT 3'
VK:
프라이머 1 (시그널 펩티드):
5' GGGGATATCCACCATGGAG(TA)CACA(GT)(TA)CTCAGGTCTTT(GA)T 3'
프라이머 2 (Ck):
5' AGCGTCGACTTACGTTT(TG)ATTTCCA(GA)CTT(GT)GTCCC 3'
PCR 프로덕트는 TA 벡터 (TA cloning kit, Invitrogen) 내로 클로닝되었다. 12개의 독립적인 클론들을 T7 DNA Pol (Pharmacia)을 사용하여 디데옥시법에 의해 시퀀싱하였다. 동질검색분석법(homology search analysis)에 의해서, VKP3에 대한 가장 동질적인 서열그룹을 결정하였다. VHP3 및 VKP3 서열 (도 1 및 도 2)은 카밧 분류(Kabat's classification)에 따르면 각각 IB 및 V 그룹에 대해서 높은 동질성을 가진다.
VHP3에 대해서는 ECORV 및 NHEI를 제한효소로 사용하고 VKP3에 대해서는 ECORV 및 SALI를 제한효소로 사용하여 분해함으로써, 전에 동일한 효소인 VH 및 VK에 대해서 각각 PAH4604 및 PAG4622에 의해서 분해된 발현벡터 내로 클로닝되었다. 이러한 발현벡터는 셰리 모리슨(Sherie Morrison, UCLA, California, USA)에게서 제공받았으며, 이는 포유동물 세포의 면역글로불린 발현에 적합하다. 벡터 PAH 4604는 인간 불변부 IgG1 및 인간 PAG 4622을 포함한다 (Coloma et al. (1992): Novel vectors for the expression of antibody molecules using variable regions generated by polymerase chain reaction, J. Immunol. Meth., 152: 89-104). 결과적인 구성물은 P3VH-PAH4604 및 P3VK-PAG4622이었다.
NS-0 세포는 10 ㎍의 P3VK-PAG4622로 감염시켰고, L 사슬을 발현하는 클론은 10 ㎍의 P3VH-PAH4604로 감염시켰으며, 이 두 경우에 있어 DNA는 PvuI로 선형화시켰고, 에탄올로 침전시키고 나서 감염전에 50 ㎕의 PBS에 용해시켰다.
약 107 세포들을 원심분리에 의해서 수득하였고 전기천공 큐벳 내에 0.5 ml의 PBS 및 분해된 (digested) DNA 내에 재현탁시켰다. 얼음 위에서 10 후에, 세포에 200 volts 및 960 oF의 펄스를 가하였고, 10분 더 얼음 위에 두었다. 세포는 D'MEM F12 및 10% 우태혈청이 있는 96 웰 플레이트에 분포시켰다. 2일 또는 4일 후에, 선택 배양액(selective medium) (각각 미코페놀산이 있는 D'MEM F12 0,45 ug/mL 또는 히스티딘 10mM)을 첨가하였다. 감염된 클론은 14일후에 나안으로도 볼수 있었다.
감염된 클론을 포함하는 웰의 배양액 내에 인간 항체가 존재하는지 여부는 ELISA에 의해 측정하였다. 마이크로타이터 플레이트 웰을 고트 항인간 카파 L 사슬(goat anti-human kappa light chain) (클론을 생산하는 인간 카파 사슬을 위해서) 또는 항인간 IgG (감마 사슬 선택성) (클론을 생산하는 완전항체를 위해서) 항체로 코팅하였다. PBST (0.05% Tween 20을 포함하는 살린 포스페이트 버퍼 용액)로 세척하고 나서, 감염자를 포함하는 웰의 희석 배양액을 각 마이크로타이터에 37℃에서 한시간동안 첨가하였다. 웰을 PBS-T로 세척하였고, 스파이시 라디시-콘주게이티드 고트 항인간 카파 L 사슬 (spicy radish-conjugated goat anti-human kappa light chain)의 퍼록시다제 또는 알칼라인 포스파타제-콘주게이티드 고트 항인간 (감마 사슬 선택성)을 첨가하고 나서, 실온에서 한시간동안 배양하였다. 웰을 PBS-T 및 o-페닐렌디아민 또는 p-니트로페닐포스페이트를 포함하는 기질 버퍼를 각각 첨가하였다. 30분 후에 각각 492 또는 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.
실시예 2. 상이한 버전의 인간화된 항체 P3의 수득
마우스 VHP3 및 VKP3 서열 (도 1 및 2)를 인간 서열과 비교하였다. 도 3 및 4는 가장 동질인 인간 서열을 보여주고 있다. 헬리칼 양극성 부위 또는 잠재적인 T 세포 에피토프를 마우스 P3 가변부 서열에서 탐색하였으며, 이 방법에 따라서 마우스 서열 내에 잠재적인 T 세포 에피토프를 브레이크(break) 또는 인간화하기 위한 아미노산 치환의 적절한 계획이 수립되었다.
VH3상의 분석(도 3)은 두 양극성 세그먼트를 만들었으며, 첫번째는 CDR1, FR2 및 CDR2의 약간의 잔기를 포함하고 있으며, 두번째는 FR3 및 CDR3의 말단을 포함하고 있다. 가장 동질인 인간 서열과 마우스 서열간의 주된 차이점은 결합부위의 3차원구조와 관련된 CDRs 또는 잔기에서 발견되었다. 그러한 이유로 아무스 VHP3 내의 어느 아미노산도 치환하지 않기로 결정하였다.
VKP3의 분석 역시 두 양극성 세그먼트를 만들었으며 (도 4), 첫번째는 FR1을 포함하며, 두번째는 CDR2 및 FR3의 약간의 잔기를 포함한다. 8,9,10,11 및 13 위치의 잔기를 가장 동질인 인간 서열의 동일한 위치의 잔기로 치환하기로 결정하였다. 아미노산 His, Lys, Phe, Met 및 Thr는 각각 Pro, Ser, Ser, Leu, 및 Ala로 치환하였다. 치환은 서열이 다음과 같은 프라이머 1, 2, 3 및 4를 이용하여 PCR 중첩에 의해서 이루어졌다 (Kammann et al. (1989) Rapid insertional mutagenesis of DNA by polymerase chain reaction (PCR), Nucleic Acids Res., 17: 5404) :
프라이머 1:
5' ATGACCCAGTCTCCTTCTTCTCTTTCCGCGTCAGTAGGAGAC 3'
프라이머 2:
5' AGCGTCGACTTACGTTT(TG)ATTTCCA(GA)CTT(GT)GTCCC 3'
프라이머 3:
5' GTCTCCTACTGACGCGGAAAGAGAAGAAGGAGACTGGGTCAT 3'
프라이머 4:
5' GGGGATATCCACCATGGAG(TA)CACA(GT)(TA)CTCAGGTCTTT(GA)T 3'
점돌연변이는 시퀀싱으로 확인하였다. 결과적인 구성은 P3Vkhu이었으며, 이는 PAG 4622 발현벡터 내에 클로닝되었다. 결과적인 구성은 P3VKhu-PAG4622이었다.
인간화된 항체 P3를 발현시키기 위해서, NS-0 세포를 P3VH-PAH4604 및 P3VKhu-PAG4622으로 감염시켰다.
P3hu 항체를 키메릭항체에 대해서 앞서 설명한 전기천공방법 및 확인방법에 따라서 감염시켰다.
실시예 3: 키메릭 MAb P3의 생물학적 활성
ELISA에 의해 측정된 항체에의 특성적인 결합은 Mab P3 키메릭의 생물학적 활성을 테스트하였다.
재조합 MAb P3에 대해서, 마이크로타이터 플레이트를 메탄올 내에서 GM3(NeuGc) 강글리오사이드로 코팅하였다. 한시간동안 37℃에서 건조시키고 나서, 비선택적인 결합을 1% 우혈청알부민(BSA)/Tris-HCl 버퍼로 차단하였으며 37℃에서 한시간동안 배양하였다. 웰을 PBS로 세척하고 정제된 재조합 Mab P3로 한시간동안 37℃에서 배양하였다. 웰을 tris-HCl로 세척하고 알칼라인 포스페타제와 콘주게이트된 고트 항인간 항체 (a goat anti- human antibody conjugated with alkaline phosphatase)를 첨가하였으며 한시간동안 37℃에서 배양하였다. 마지막으로 웰을 Tris-HCl로 세척하고 p-니트로페닐포스페이트를 포함하는 기질 버퍼를 첨가하였다. 30분 후에 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.
Mab T1 키메릭을 네거티브 콘트롤로 사용하였다. 도 5는 Mab P3 키메릭의 항원에 대한 선택적인 결합을 나타낸다.
실시예 4. 키메릭 MAb 1E10의 수득
cDNA 합성은 앞서 설명한 바와 같이 Mab 1E10을 제조하는 히브리도마 유래 RNA로 시작하여 역전사효소를 이용한 반응으로 수득하였다. 이 반응에 사용된 특정 프라이머의 서열은 다음과 같다:
VH:
5' GGGGCTAGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGT 3'
VK:
5' GCGTCTAGAACTGGATGGTGGGAAGATGGA 3'
cDNA VH1E10 및 cDNA VK1E10는 Taq Pol 및 특정 프라이머를 이용하여 PCR에 의해서 증폭되었다.
VH:
프라이머 1 (시그널 펩타이드):
5' GGGGATATCCACCATGG(AG)ATG(CG)AGCTG(TG)GT(CA)AT(CG)CTCTT 3'
프라이머 2 (CH1):
5' GGGGCTAGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGT 3'
VK:
프라이머 1 (시그널 펩타이드):
5' GGGGTTAACCACCATGAGG(GT)CCCC(AT)GCTCAG(CT)T(CT)CT(TG)GG(GA) 3'
프라이머 2 (Ck):
5' AGCGTCGACTTACGTTT(TG)ATTTCCA(GA)CTT(GT)GTCCC 3'
PCR 생성물을 TA 벡터 (TA cloning kit, Invitrogen) 내로 클로닝하였다. 12개의 독립적인 클론을 T7 DNA Pol (Pharmacia)을 이용하여 디데옥시법에 의해서 시퀀싱하였다 (도 7 및 8). 동질검색분석에 의해서 VH1E10 및 VK1E10에 대해 가장 동질적인 시퀀스 그룹을 결정하였다. VH1E10 및 VK1E10 시퀀스는 카밧 분류에 따르면 각각 미셀레니우스 그룹 및 V 그룹(groups miscellaneous and V )과 높은 동질성을 갖는다.
VH1E10에 대해서는 ECORV 및 NHEI를 제한효소로 사용하고 VK1E10에 대해서는 HincII 및 SALI를 제한효소로 사용하여 분해하고 나서, VH 및 VK에 대해서 각각 적절한 효소인 PAH4604 및 PAG4622로 전에 분해한 발현벡터 내로 클로닝하였다. 이 러한 발현벡터는 셰리 모리슨(Sherie Morrison, UCLA, California, USA)에 의해서 제공되었으며, 이들은 포유동물 세포내의 면역글로불린 발현에 적절하다. 벡터 PAH 4604는 인간 불변부 IgG1 및 인간 PAG 4622을 포함한다 (Coloma et al. (1992): Novel vectors for the expression of antibody molecules using variable regions generated by polymerase chain reaction, J. Immunol. Meth., 152: 89-104). 결과적인 구성은 1E10VH-PAH4604 및 1E10VK-PAG4622이었다.
NS-0 세포는 10 ㎍의 1E10VK-PAG4622으로 감염시켰고, L 사슬을 발현시키는 클론은 10 ㎍의 1E10VH-PAH4604로 감염시켰으며, 두경우 모두 DNA를 감염 전에 PvuI로 선형화시키고 에탄올로 침전시키고 나서, 50 ul의 of PBS에 용해시켰다.
약 107 세포들을 원심분리기로 수득하고, 전기천공 큐벳내에 0.5 ml 의 PBS 및 분해된 DNA 내에 재현탁시켰다. 얼음 위에서 10분을 경과시키고 셀에 200 볼트 및 960 oF의 펄스를 가하였고 추가적으로 10분동안 얼음 위에 두었다. 세포들을 D'MEM F12 및 10% 우태혈청을 포함하는 96 웰 플레이트에 분포시켰다. 2일 또는 4일 후에, 선택적 배양액 (각각 미코페놀산 0,45 ㎍/mL 또는 히스티디놀 10mM이 포함된 D'MEM F12)을 첨가하였다. 감염된 클론은 14일 후에 나안으로도 볼수 있었다.
감염된 클론을 포함하는 웰의 배양액 내에 인간 항체가 존재하는지 여부는 ELISA로 결정하였다. 마이크로타이터 플레이트를 고트 항-인간 카파 L 사슬 (클론 생성 인간 카파 사슬) 또는 항-인간 IgG (감마 사슬 특성) (클론 생성 완전항체) 항체로 코팅하였다. PBST로 세척하고 나서, 감염자를 포함하는 웰의 희석 배양액을 한시간동안 37℃에서 각각의 마이크로타이터 웰에 첨가하였다. 웰을 PBS-T로 세척을 하고, 스파이시 라디시-콘주게이트된 고트 항-인간 카파 L 사슬의 퍼록시다제 또는 알칼라인 포스파타제-콘주게이트된 고트 항-인간 IgG (감마 사슬 특성)을 첨가하고 나서 한시간동안 실온에서 배양하였다. 웰을 PBS-T로 세척을 하고, 각각 o-페닐렌디아민 또는 p-니트로페닐포스페이트를 포함하는 기질 버퍼를 첨가하였다. 30분 후에 492 또는 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.
실시예 5. 상이한 버전의 인간화된 항체 1E10의 수득
마우스 VH1E10 VK1E10 서열 (도 6 및 7)을 인간 서열과 비교하였고, 도 8 및 9는 가장 동질인 인간 서열을 나타내고 있다. 헬리칼 양극성 부위 또는 잠재적 T 세포 에피토프를 마우스 1E10 불변부 서열 상에서 검색하였고, 이 방법에 따라서 마우스 서열내에 잠재적인 T 세포를 브레이킹하거나 인간화하기 위해서 아미노산 치환에 대한 적절한 전략을 수립하였다
VH1E10 상의 분석에 의해서 (도 8) 양극성 세그먼트를 만들었고, 첫번째는 FR1을 포함하고 두번째는 FR2를 포함하며, 세번째는 FR3를 포함한다. 5, 40, 42 및 87 (카밧 넘버링에 따르면 83) 위치의 잔기를 가장 동질의 인간 서열 상의 동일한 위치의 잔기로 치환하기로 결정하였다. 아미노산 Gln, Arg, Glu 및 they은 각각Val, Ala, Gly 및 Arg로 치환하였다.
치환은 상이한 세트의 프라이머를 이용하여 PCR 중첩에 의해서 이루어졌다 (Kammann et al. (1989) Rapid insertional mutagenesis of DNA by polymerase chain reaction (PCR), Nucleic Acids Res., 17: 5404).
H 사슬의 5번 위치의 돌연변이를 위한 프라이머는 다음의 서열을 가지는 프라이머 1, 2, 3 및 4이었다:
프라이머 1:
5' CAGGTTCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCT 3'
프라이머 2:
5' GGGGCTAGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGT 3'
프라이머 3:
5' AGCTCCAGACTGCACCAGCTGAACCTG 3'
프라이머 4:
5' GGGGATATCCACCATGG(AG)ATG(CG)AGCTG(TG)GT(CA)AT(CG)CTCTT 3'
5 위치의 점변이를 서열로 체크하고 나서, 40 및 42 위치의 돌연변이를 도입하였다.
H 사슬의 40 및 42 위치의 돌연변이에 대한 프라이머는 다음과 같다:
프라이머 1:
5' TGGGTGAGGCAGGCGCCTGGGCAGGGACTTGAG 3'
프라이머 2:
5' GGGGCTAGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGT 3'
프라이머 3:
5' CTCAAGTCCCTGCCCAGGCGCCTGCCTCACCCA 3'
프라이머 4:
5' GGGGATATCCACCATGG(AG)ATG(CG)AGCTG(TG)GT(CA)AT(CG)CTCTT 3'
40 및 42 위치의 점 변이를 서열로 체크하고 나서, 87 위치(카밧 넘버링에 따르면 83)의 변이를 도입하였다.
H 사슬의 87 위치(카밧 넘버링에 따르면 83)의 변이에 대한 프라이머는 다음과 같다:
프라이머 1:
5' CTCAGCAGGCTGCGGTCTGAGGACTCT 3'
프라이머 2:
5' GGGGCTAGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGT 3'
프라이머 3:
5' AGAGTCCTCAGACCGCAGCCTGCTGAG 3'
프라이머 4:
5' GGGGATATCCACCATGG(AG)ATG(CG)AGCTG(TG)GT(CA)AT(CG)CTCTT 3'
결합 부위의 3차원 구조에 잔기가 관련되어 있으므로 다른 치환은 수행하지 않았다.
점변이는 시퀀싱으로 확인하였다. 결과적인 구성은 1E10VHhu이었으며, PAH4604 발현 벡터내에 클로닝하였다. 결과 구성은 1E10VH-PAH4604이었다.
VK1E10의 분석을 또한 3 양극성 세그먼트를 만들었으며, 첫번째 세그먼트는 FR1을 포함하고, 두번째는 CDR1을 포함하며, 세번째는 FR3을 포함한다. 7, 8 및 15 위치의 잔기를 가장 동질인 인간 서열내 동일한 위치의 잔기로 치환하는 것으로 결정하였다. 아미노산 Thr, Thr 및 Leu를 각각 Ser, Pro 및 Val로 치환하였다. 치환은 다음의 서열을 가지는 프라이머 1, 2, 3 및 4를 이용하여 PCR 중첩에 의해서 이루어졌다 (Kammann et al. (1989) Rapid insertional mutagenesis of DNA by polymerase chain reaction (PCR), Nucleic Acids Res., 17: 5404):
L 사슬의 7, 8 및 15 위치의 돌연변이를 위한 프라이머는 다음과 같다:
프라이머 1:
5' CAGATGACACAGTCTCCTTCCTCCCTGTCTGCCTCTGTGGGAGACAGAGTC 3'
프라이머 2:
5' AGCGTCGACTTACGTTT(TG)ATTTCCA(GA)CTT(GT)GTCCC 3'
프라이머 3:
5' GACTCTGTCTCCCACAGAGGCAGACAGGGAGGAAGGAGACTGTGTCATCTG 3'
프라이머 4:
5' GGGGTTAACCACCATGAGG(GT)CCCC(AT)GCTCAG(CT)T(CT)CT(TG)GG(GA) 3'
점변이는 시퀀싱에 의해서 확인하였다. 결과적인 구성은 1E10Vkhu이었으며 PAG 4622 발현 벡터 내로 클로닝되었다. 결과적인 구성은 1E10VKhu-PAG4622이었다.
인간화된 항체 1E10를 발현시키기 위해서, NS-0 세포를 1E10VHhu-PAH4604 및 1E10VKhu-PAG4622를 이용하여 감염시켰다.
1E10hu 항체는 키메릭 항체에 대해서 앞서 설명한 전기천공 및 확인방법에 의해서 감염시켰다.
실시예 6: 키메릭 MAb1E10의 생물학적 활성
ELISA에 의해 측정된 항체에 대한 선택적 결합은 Mab 1E10 키메릭의 생물학적 활성을 테스트하였다.
재조합 MAb 1E10에 대해서, 마이크로타이터 플레이트를 Mab P3로 코팅하였다. PBST로 세척하고 나서, 비선택적인 결합은 1%의 우혈청알부민(BSA)/PBST로 차단하고, 37℃에서 한시간동안 배양하였다. 웰을 세척하고 정제된 재조합 Mab 1E10으로 한시간동안 37℃에서 배양하였다. 웰을 PBST로 세척하고 알칼라인 포스파타제와 콘주게이트된 고트 항인간 항체를 첨가하고, 한시간동안 37℃에서 배양하였다. 마지막으로, 웰을 PBST로 세척하고 p-니트로페닐포스페이트를 포함하는 기질버퍼를 첨가하고 나서, 30 분후에 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.
Mab C5 키메릭을 네거티브 콘트롤로 사용하였다.
도 10은 Mab 1E10 키메릭이 Mab P3에 선택적으로 결합하는 것을 보여준다.
본원발명은 생명공학분야에 관한 것이며, 특히 유전자 공학에 의해서 수득한 신규한 재조합 항체에 대한 것이며, 구체적으로 마우스 단일클론 항체 P3 (MAb P3) 및 이의 항-유전자형 마우스 단일클론 항체 1E10 (MAbai 1E10)로부터 수득한 키메릭 및 인간화된(humanized) 항체에 대한 것이다.
더욱 구체적으로, 본 발명은 N-글리콜릴화 시알산(N-glycolylated sialic acid)을 포함하는 강글리오사이드에 결합하는 항체에 관한 것이며, 아세틸화된 형태의 강글리오사이드에 관한 것은 아니며, 중성 글리코리피드(glycolipid)에 대한 것도 아니다. N-글리콜릴화 시알산을 포함하는 강글리오사이드는 유방암 및 흑색종에서 널리 발현되는 항원이다. 반면, MAbai 1E10의 항종양 효과는 실험 모델에서 제시되어 왔다.
본원발명은 또한 앞서 언급한 암, 특히 유방암 및 흑색종의 진단 및 치료에 유용한 재조합 항체를 포함하는 약학조성물에 관한 것이다.

Claims (16)

  1. 삭제
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  8. 삭제
  9. 마우스 항-유전자형 단일클론 항체 1E10으로부터 유래하고 기탁번호 ECACC 97112901를 갖는 히브리도마 세포주에 의해 제조된 인간화 단일클론 항체에 있어서, H 사슬 및 L 사슬(heavy and light chains)의 가변부(variable domains)가 다음의 서열을 포함하는 인간화 단일클론 항체:
    H 사슬
    CDR1: SYDIN
    CDR2: WIFPGDGSTKYNEKFKG
    CDR3: EDYYDNSYYFDY
    FR1: QVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFT
    FR2: WVRQRPEQGLEWIG
    FR3: KATLTTDKSSSTAYMQLSRLTSEDSAVYFCAR
    FR4: WGQGTTLTV
    L 사슬
    CDR1: RASQDISNYLN
    CDR2: YTSRLHSG
    CDR3: QQGNTLPWT
    FR1: DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISC
    FR2: WYQQKPDGTVKLLIY
    FR3: VPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFC
    FR4: FGGGTKLESK
    L 사슬
    Position 7: Thr by Ser
    Position 8: Thr by Pro
    Position 15: Leu by Val
    H 사슬
    Position 5: Gln by Val
    Position 40: Arg by Ala
    Position 42: Glu by Gly
    Position 87 (카밧 넘버링에 따르면 83): Thr by Arg.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 청구항 9에 있어서, H 사슬의 불변부(constant region)이 감마-1 사슬의 아미노산 서열을 포함하고, L 사슬의 불변부(constant region)이 카파-1 사슬의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 모두 인간 면역글로불린으로부터 유래한 인간화 단일클론 항체.
  13. 청구항 9의 인간화 단일클론 항체를 생산하는 세포주.
  14. 유방 및 흑색종 악성종양, 그 전이 및 재발 치료용 약학조성물에 있어서, 청구항 9의 인간화 단일클론 항체를 포함하는 약학조성물.
  15. 유방 및 흑색종 악성종양, 그 전이 및 재발의 체내(in vivo) 국소화(localization) 및 확인(identification)용 약학조성물에 있어서, 청구항 9의 인간화 단일클론 항체를 포함하는 약학조성물.
  16. 삭제
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