WO2002081661A2 - Combinaciones inmunoterapéuticas para el tratamiento de tumores que sobre-expresan gangliósidos - Google Patents

Combinaciones inmunoterapéuticas para el tratamiento de tumores que sobre-expresan gangliósidos Download PDF

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Ana María VÁZQUEZ LÓPEZ
Rolando Pérez Rodríguez
Alexis Pérez González
Adriana CARR PÉREZ
Yildian Díaz Rodríguez
Mauro A ALFONSO FERNÁNDEZ
Adriana María ROJAS DEL CALVO
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Definitions

  • the present invention relates to human medicine, specifically to therapeutic vaccines that induce an immune response against tumors that overexpress gangliosides.
  • Gangliosides are normal components of the plasma membranes of most mammalian cells. Although these glycosphingolipids are expressed in normal tissues, they are very attractive targets for immunotherapy due to the changes that occur in their expression patterns during the oncogenic transformation of cells (Hakomori, S. Ann. Rev. Biochem. 50; 1981: 733-764; Hakomori, Cancer Res. 45; 1985: 2405-2414; Irie RF, et al. In: Therapeutic monoclonal antibodies. Borrebaeck CAK, and Larrick JW (Eds.) M Stockton Press, 1990, pp. 75- 94).
  • Gangliosides are very poorly immunogenic both because they are their own antigens and because of their saccharide nature.
  • Some strategies, which have been explored to increase the immunogenicity of these antigens, are based on their presentation to the immune system in a different molecular environment.
  • One of these strategies has been the use of conjugated vaccines consisting of the covalent binding of the saccharide antigen to highly immunogenic dependent T-transport proteins, which has allowed obtaining a relatively long-lasting antibody response against certain gangliosides and the generation of IgG antibodies.
  • the titres of this antibody response after re-immunizations were lower compared to those obtained in response to classic independent thymus antigens (Helling, F et al. Cancer Res. 54; 1994: 197-203; Helling, F et al Cancer Res. 55; 1995: 2783-2788; Livingston PO et al. Cancer Immunol lmmunother 45; 1997: 10-19)
  • Novel vaccine compositions have been reported to induce an immune response against N-acetylated and N-glycolylated gangliosides.
  • These vaccines are based on the hydrophobic conjugation of gangliosides with very small proteoliposomes (VSSP) made up of the Neisseria meningitidis outer membrane protein complex (gangliosides / VSSP) (Estévez F. Y col. Vaccine 18; 1999: 190-197; US Patents 5,788,985 and US 6,149,921).
  • VSSP very small proteoliposomes
  • Vaccines consisting of GM3 / VSSP ganglioside or N-glycolyl GM3 ganglioside (NeuGcGM3) / VSSP have been shown to consistently produce high titers of specific IgM and IgG antibodies against GM3 and NeuGcGM3.
  • Administration of the GM3 / VSSP vaccine significantly increases the survival of mice carrying B16 melanoma, decreases tumor volumes and increases the ability to reject subcutaneous implantation of this tumor (Alonso et al. Int. J Oncology 15; 1999: 59-66; Carr A. et al. Melanoma Research (accepted for The idiotypic network theory proposed by Jeme 1974 (Jeme, NK Ann. Immunol.
  • Another alternative idea to induce antibodies against gangliosides that involves the use of Ab2 antibodies is the strategy that exploits the possibility that an epitope of saccharide nature can be represented by a protein epitope in the antibody molecule, making it more immunogenic.
  • anti-ld antibodies that mimic highly expressed gangliosides in tumor cells such as GM3, GD3, and GD2 have been obtained (Yamamoto, S et al. J. Nati. Cancer Inst 82; 1990: 1757-1760; Chapman, PB et al J. Clin Invest 88; 1991: 186-192; Cheung NK V, et al Int J Cancer 54; 1993: 499-505; Saleh MN. et al.
  • a mAb called P3 (with ECACC Deposit Number 94113026) is known, which has the particular characteristic of specifically recognizing N-glycolylated sialic acid in monosialo- and disialogangliosides.
  • This mAb Ab1 recognizes antigens present in human melanoma and breast tumors.
  • a gamma-type anti-idiotype mAb (not internal image) was obtained from mAb P3, identified as 1 E10 (ECACC Deposit Number 97112901), capable of producing an anti-tumor effect against murine breast and melanoma tumors (US Patent 6,063,379; Vázquez et al Hybridoma 14; 1995: 183-186; Vázquez et al Oncology Reports 7; 2000: 751 -756).
  • the present invention describes a pharmaceutical composition, or combination of pharmaceutical compositions, for immunotherapy of tumors that overexpress gangliosides, and that contains at least two of the components mentioned below:
  • A An idiotypic vaccine whose active ingredient is an anti-ganglioside antibody (Ab1);
  • a vaccine whose active ingredient is a ganglioside is a ganglioside.
  • Said pharmaceutical composition, or combination of pharmaceutical compositions may contain A and B, or A and C, or B and C.
  • the invention relates to that pharmaceutical composition, or combination of pharmaceutical compositions, where A can be an idiotypic vaccine whose active ingredient is the deposited murine anti-ganglioside antibody P3 with ECACC Deposit Number 94113026; and where B can be a idiotypic vaccine whose active ingredient is the murine anti-idiotype antibody E10 deposited with Deposit Number ECACC 97112901 and where C can be a vaccine whose active ingredient is the N-glycolyl GM3 gangliosides (NeuGcGM3) or N- acetyl GM3 (NeuAcGM3).
  • a and B, or A and C, or B and C are administered simultaneously or alternately.
  • the pharmaceutical composition, or combination of pharmaceutical compositions described in the present invention can be used for the treatment of tumors that overexpress gangliosides.
  • tumors that overexpress gangliosides.
  • gangliosides Preferably in the treatment of cancer of the breast, lung, digestive system, urogenital system, melanomas, sarcomas and tumors of neuroectodermal origin.
  • Also disclosed in the present invention is a method comprising administering the pharmaceutical composition, or combination of pharmaceutical compositions described above, to mammals for the prevention or treatment of breast, lung, digestive system, urogenital system, melanomas, sarcomas, and tumors. of neuroectodermal origin.
  • gangliosides as antigen are carried out as described by Estévez et al in Vacccine 18, 1999: 190-197 and in US Patents 5,788,985 and US 6,149,921, where natural or synthetic gangliosides are used as proteoliposome components made up of the protein complex of the outer membrane of Neisseria meningitidis (VSSP-G). These gangliosides could be (NeuGcGM), GD3 or (NeuAcGM). 2. Preparation of idiotypic vaccines:
  • compositions are prepared as described in US Patents 5,817,513 and US 6,063,379, where said vaccines contain murine anti-ganglioside monoclonal antibodies (mAbs) such as mAb P3 (ECACC Deposit Number 94113026) or mAbs.
  • mAbs murine anti-ganglioside monoclonal antibodies
  • Murine anti-idiotypes such as mAb 1 E10 (ECACC Repository Number 97112901) that recognize monoclonal anti-ganglioside antibodies. 3.
  • Immunotherapeutic combinations that cause potentiation of the immune response and the anti-tumor effect between vaccines containing gangliosides and idiotypic vaccines, or between the latter, in animal models:
  • the referred procedures can be used in mice or other species of mammals, being able to include all the variants of combinations of the different components mentioned above.
  • Animals are immunized with 3 to 10 doses ranging from 25 ⁇ g to 1 mg of murine ganglioside-recognizing mAb, with a dose interval ranging from 7 to 14 days. During this immunization period animals receive between 3 to 10 doses in a range between 60 to 1000 ⁇ g of the ganglioside-containing vaccine, with a time interval between doses of 7 to 14 days.
  • Another immunotherapeutic combination is in which animals receive between 3 to 10 doses in a range between 25 ⁇ g to 1 mg of a specific anti-idiotype mAb against an anti-ganglioside antibody, with a time between each dose that ranges from 7 to 14 days. During this immunization period, animals receive between 3 to 10 doses in a range between 60 to 1000 ⁇ g of the ganglioside-containing vaccine, with a time interval between doses of 7 to 14 days.
  • Vaccines can be formulated as separate products or within the same vaccine formulation for the situation in which they are supplied simultaneously. In case the administration is alternate, the animals receive the vaccines at intervals of 3-7 days between one type of vaccine and the other.
  • the vaccines are administered in an adjuvant that can be alumina (62.5 ⁇ g -2.5 mg), Montanide ISA 51 (0.1-1.2 ml / dose), or another appropriate one.
  • the total volume of a dose is 10 ⁇ l at 2 ml.
  • Vaccines containing the ganglioside (s) can be administered intradermally, subcutaneously, intramuscularly, intraperitoneally, intramucosally, or combinations thereof. Vaccines containing the antibodies can be administered by these same routes. The administration of said immunotherapeutic combinations in animals induces an increase in both the antibody response and the cellular immune response of the treated animals.
  • the size of the tumors, the tumor volume and survival of the treated animals are compared with groups of control animals, which were treated with each of the vaccines separately or with control preparations. After treatment with the aforementioned immunotherapeutic combinations in animals, a lower tumor incidence, a decrease in tumor growth and an increase in survival are observed, not only compared to the group treated only with the adjuvants, but with respect to the treated groups. with the different vaccines separately.
  • Immunotherapeutic combinations that potentiate the immune response and the anti-tumor effect between vaccines containing gangliosides and idiotypic vaccines, or between the latter, in patients:
  • the aforementioned procedures can be applied to patients in different clinical stages with tumors that overexpress gangliosides.
  • tumors of the digestive system the urogenital system, the lung, the breast, melanomas, sarcomas or of neuroectodermal origin.
  • the procedure consists of an induction phase where patients receive between 3 and 10 doses in a range between 0.1 to 5 mg of murine mAb that recognizes the ganglioside, with a time between each dose that will range from 7 to 14 days. These patients will receive during this phase between 3 to 10 doses in a range of 60 a. 1000 ⁇ g of the vaccine containing the ganglioside, with a time between each dose that will range from 7 to 14 days.
  • a second immunotherapeutic combination is in which patients are immunized with 3 to 10 doses ranging from 0.1 to 5 mg of a specific anti-idiotype mAb against an anti-ganglioside antibody, with a time between each dose ranging from 7 to 14 days.
  • a third immunotherapeutic combination is in which patients are immunized with murine mAb that recognizes ganglioside, with the same doses, frequency and intervals mentioned above, and that during this period patients receive between 3 to 10 doses in a range between 0.1 to 2 mg of a specific anti-idiotype mAb against an anti-ganglioside mAb.
  • Vaccines can be formulated as independent products or within the same vaccine formulation for the case in which they are supplied simultaneously.
  • the vaccines are administered in an adjuvant that could be alumina (1-5 mg / dose), Montanide ISA 51 (0.6-1.2 ml / dose), or another appropriate one.
  • the total volume of a dose ranges from 10 ⁇ l to 2 ml.
  • the vaccine containing the ganglioside or gangliosides can be administered intradermally, subcutaneously, intramuscularly, intramucosally or other route.
  • Antibody-containing vaccines can be administered by these same routes.
  • blood samples are taken to measure blood biochemistry parameters and specific antibody titers.
  • Lymphocytes are also obtained from patients for studies of cellular immunity. These extractions are carried out with a frequency that can be from one week to three months.
  • a maintenance phase is performed where patients can receive re-immunizations of each of the vaccines at the aforementioned concentrations, at intervals between 1 -6 months, simultaneously or at different times, for a period of 1 to 2 years .
  • the administration of said immunotherapeutic combinations in patients induces an increase in both the antibody response and the cellular immune response, and have an impact on tumor growth.
  • Example 1 Induction of anti-idiotype (T2) and anti-anti-idiotype (T3) T cells activation, in the syngeneic model by immunization with the murine mAb P3.
  • lymphocytes obtained to proliferate in vitro were measured by adding concentrations to the cultures of 25-150 ⁇ g / mL of both the murine mAb P3 and its anti-idiotype mAb 1E10 (ECACC Deposit Number 97112901).
  • Murine mAbs of the same isotype as the aforementioned mAbs were taken as controls. Positive proliferation indices were considered equal to or greater than 3. Lymphocytes obtained after immunization of Balb / c mice with Mab P3 were shown to proliferate specifically in the presence of Mab P3, and no proliferation was observed when confronted with Mab murine A3 (IgM) (Alfonso M. Y col. Hybridoma 14; 1995: 209-216).
  • IgM Mab murine A3
  • Example 2 Induction of anti-idiotype (T2) and anti-anti-idiotype (T3) T cells activation in mice by immunization with the chimeric P3 antibody.
  • the chimeric P3 antibody whose amino acid sequences of its heavy chain (VH) and light chain (VL) variable regions are shown in Figures 8 and 9 respectively, was used to immunize Balb / c female mice, 6-8 weeks old old.
  • 100 ⁇ g of the antibody emulsified in ACF were used subcutaneously, followed by re-immunization with 50 ⁇ g of the antibody emulsified in AIF seven days later.
  • the lymph nodes were collected and the lymphoproliferative capacity of these cells was measured by adding to the cultures: the chimeric P3 antibody, the chimeric E10 antibody 1, whose sequences of the variable regions are shown in Figures 13 and 14 , the murine mAb P3 and the murine mAb 1E10.
  • the murine mAb C5 Patent Application WO 97/33916 A1
  • the lymphocytes of mice immunized with the chimeric P3 antibody specifically proliferated when cultured in the presence of this chimeric antibody, as well as in the presence of the chimeric mAb 1 E10 and its murine varianrtes, and not against the antibodies used as isotype controls . Demonstrating that the chimeric P3 antibody maintains the ability to induce a specific proliferation of anti-idiotype (T2) and anti-anti-idiotypic T cells (T3) ( Figure 2).
  • Example 3 Enhancement of the anti-tumor effect produced by the GM3-VSSP / Montanide ISA 51 vaccine by the combination with the vaccine composed of the murine mAb 1E10 adsorbed on alumina gel.
  • a group of 6-57 week old female C57BL / 6 mice were immunized subcutaneously with 50 ⁇ g of the murine mAb 1E10 adsorbed on alumina gel on days 0, 14, 28 and 42.
  • the mice were immunized intramuscularly with 120 ⁇ g of GM3-VSSP / Montanide ISA 51 on days 7, 21, 35 and 49.
  • Another group of mice was similarly immunized, but initiating immunizations with the vaccine preparation containing the GM3 ganglioside.
  • Control groups immunized at the same time intervals and the same number of doses of each of the vaccines separately or immunized only with phosphate buffered saline were used in these experiments. All groups were inoculated with 10,000 murine B16 tumor cells subcutaneously on day 63. Tumor size was measured in all groups. For the statistical analysis of tumor size measurements, all groups were compared with respect to the control group that only received PBS using the Mixed Linear Model. Vaccination with mAb 1E10 did not protect against a 10,000 melanoma cell challenge B16. The VSSP-GM3 vaccine caused a delay in tumor growth (p ⁇ 0.05).
  • Antibody titers were measured by an ELISA assay, with OD values equal to or greater than 0.1 based on methanol being considered positive.
  • NeuGcGM-VSSP / Montanide ISA 51 vaccine toxicity consisted of erythema and local pain, induration at the injection site, fever. Light toxicity grade l / ll according to WHO criteria.
  • Example 5 Immunization scheme in cancer patients with the vaccine containing the anti-idiotype mAb 1E10 and using alumina gel as an adjuvant.
  • the administration of the vaccine preparation to the patients produced a slight toxicity, classified as grade I and II according to the WHO criteria.
  • a strong IgG-type Ab3 antibody response developed, detectable after receiving 2 6 3 doses of the vaccine preparation.
  • the analysis of the specificity of this response showed that the sera of all the patients had a higher recognition of the mAb 1 E10 than the rest of the mAbs of the same isotype used as controls, which suggested the induction of a specific response against the idiom of mAb 1 E10.
  • Example 6 Combination immunization scheme of the vaccine containing mAb 1 E10 and the NeuGcGM-VSSP vaccine.
  • Example 7 Recognition of tumor tissues by mAb 14F7.
  • MAb 14F7 has been shown to recognize NeuGcGM3 (patent WO9940119). The present example shows recognition results of this mAb from various human tumor locations.
  • Tissues were fixed in a 10% buffered formalin solution and dehydrated, clarified, and embedded in paraffin. Histopathology was evaluated in sections stained with hematoxylin eosin.
  • Consecutive cuts made from the blocks evaluated histologically were used to perform the immunolabelling by the streptavidin peroxidase biotin complex method previously described (Hsu, SM and Ralne, L. 1981.J Histochem Cytochem., 29: 1349-1353).
  • the deparaffinized and rehydrated sections were treated with 3% hydrogen peroxide (methanol solution) for 30 minutes, to eliminate endogenous peroxidase activity.
  • the sections were incubated with MaM 14F7 (purified) for 1 hour at room temperature. Subsequently, biotinylated anti-mouse serum and streptavidin peroxidase complex (Dakopatts) were added at room temperature.
  • the peroxidase reaction was revealed using 5 mL of a Tris-HCI buffered solution, 0.005 mL of 30% H 2 0 2, and 3 mg of 3-3 diaminobenzidine.
  • the sheets were washed with running water contrasted with Mayer's hematoxylin, coated with a mounting medium containing balsam and covered with coverslips. Reaction with the enzyme produces a carmelite-brown coloration.
  • Fresh biopsy fragments of pathological tissue were obtained within one hour of surgical excision. All the tissues were washed with saline solution, immediately frozen in liquid nitrogen and kept frozen at -80 ° C. The frozen fragments were cut in Leica cryostat at -25 ° C obtaining serial sections at 5 ⁇ m that were dried in air and they were used immediately or stored at -20 ° C wrapped in aluminum foil and post-fixed in 4% paraformaldehyde for 20 minutes.
  • TABLE II shows the immunohistochemical study of mAb 14F7 in new locations of human pathological tissues where a strong recognition in the membrane and cytoplasm of more than 50% of tumor cells is observed.
  • mice were immunized subcutaneously with 100 ⁇ g of the chimeric P3 antibody in ACF followed by re-immunization with 50 ⁇ g of the antibody emulsified in AIF. Three days later the lymph node cells were collected and the proliferation experiment was carried out in the presence of different concentrations of the different chimeric and murine antibodies.
  • FIG. 3 Kinetics of murine B16 tumor growth in mice immunized with the therapeutic combinations of the idiotypic vaccine containing the anti-idiotype mAb 1E10 and the GM3-VSSP vaccine, as detailed in Example 3.
  • Figure 4 Comparative study of metastatic skin lesions in a patient with melanoma. The photos were taken prior to immunization with the NeuGcGM / VSSP / ISA 51 vaccine, 2 and 4 months after treatment. Depigmented halos are seen around some of the lesions, stabilized lesions, lesions that decreased, and one lesion that increased in size.
  • Figure 5 Comparative study by Computerized Axial Tomography of the metastatic lesions in the right vertex of the lung, with a size of 18x20 mm in a patient with malignant melanoma, prior to immunization with the NeuGcGM / VSSP / ISA 51 vaccine and 4 months after the immunization. Stabilization of the lesion is observed.
  • Figure 6 Recognition of F (ab ') 2 fragments of mAb 1E10 and other mAbs of the same isotype by the sera of patients immunized with the idiotypic vaccine containing mAb 1 E10 and alumina gel as an adjuvant.
  • Figure 7 Recognition of the GM3 (NeuGc) (N-glycolylated) and GM3 (N-acetylated) gangliosides by the sera of the patients immunized with the idiotypic vaccine containing the mAb 1E10 and the alumina gel as an adjuvant.

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Abstract

La presente invención se relaciona con el campo de la inmunología y particularmente con combinaciones inmunoterapéuticas empleadas para impedir el crecimiento de células tumorales y/o eliminar dichas células.Mediante la presente invención se observa un efecto terapéutico anti-tumoral por la combinación de vacunas idiotípicas cuyo principio activo es un anticuerpo antigangliósido (Ab1), con vacunas idiotípicas cuyo principio activo es un anticuerpo anti-idiotipo obtenido contra un anticuerpo antigangliósido (Ab2), o con vacunas cuyo principio activo es uno o más gangliósidos. Se describen combinaciones de estas vacunas que provocan un sinergismo del efecto anti-tumoral que induce cada una de las vacunas por separado. Las combinaciones referidas pueden ser aplicadas a pacientes en diferentes estadios clínicos de tumores que sobre-expresan gangliósidos.

Description

COMBINACIONES INMUNOTERAPÉUTICAS PARA EL TRATAMIENTO DE TUMORES QUE SOBRE-EXPRESAN GANGLIÓSIDOS.
Sector Técnico La presente invención se relaciona con la medicina humana, específicamente con vacunas terapéuticas que inducen una respuesta inmune contra tumores que sobre-expresan gangliósidos. Técnica Anterior Los gangliósidos son componentes normales de las membranas plasmáticas de la mayoría de las células de los mamíferos. Aunque estos glicoesfingolípidos están expresados en tejidos normales, ellos son dianas muy atractivas para la inmunoterapia debido a los cambios que ocurren en sus patrones de expresión durante la transformación oncogénica de las células (Hakomori, S. Ann. Rev. Biochem. 50; 1981 :733-764; Hakomori, Cáncer Res. 45; 1985:2405-2414; Irie RF, y col. In: Therapeutic monoclonal antibodies. Borrebaeck CAK, and Larrick JW (Eds.). M Stockton Press, 1990, pp. 75-94).
Los gangliósidos resultan muy poco inmunogénicos tanto por ser antígenos propios como por su naturaleza sacarídica. Algunas estrategias, las cuales han sido exploradas para incrementar la inmunogenicidad de estos antígenos, están basadas en su presentación al sistema inmune en un diferente ambiente molecular. Una de estas estrategias ha sido el uso de vacunas conjugadas consistentes en la unión covalente del antígeno sacarídico a proteínas transportadoras T dependientes muy inmunogénicas, lo cual ha permitido la obtención de respuesta de anticuerpos de relativa larga duración contra ciertos gangliósidos y la generación de anticuerpos IgG, aunque los títulos de esta respuesta de anticuerpos luego de las re-inmunizaciones fueron menores en comparación con las obtenidas en respuesta a antígenos timo independientes clásicos (Helling, F y col. Cáncer Res. 54; 1994:197-203; Helling, F y col. Cáncer Res. 55; 1995:2783-2788; Livingston PO y col. Cáncer Immunol lmmunother 45; 1997:10-19)
Nuevas composiciones vacunales se han reportado que inducen una respuesta inmune contra gangliósidos N-acetilados y N-glicolilados. Estas vacunas se basan en la conjugación hidrofóbica de los gangliósidos con proteoliposomas de muy baja talla (VSSP, siglas en inglés) conformados por el complejo de proteínas de la membrana externa de la Neisseria meningitidis (gangliósidos/ VSSP) (Estévez F. Y col. Vaccine 18;1999:190-197; Patentes US 5,788,985 y US 6,149,921). Las vacunas compuestas por gangliósido GM3/ VSSP o el gangliósido N-glicolil GM3 (NeuGcGM3)/ VSSP han demostrado producir consistentemente altos títulos de anticuerpos IgM e IgG específicos contra GM3 y NeuGcGM3. La administración de la vacuna GM3/ VSSP incrementa significativamente la sobrevida de ratones portadores del melanoma B16, disminuye los volúmenes tumorales e incrementa la capacidad de rechazar la implantación subcutánea de este tumor (Alonso y col. Int. J Oncology 15; 1999: 59-66; Carr A. Y col. Melanoma Research (aceptado para publicar). La teoría de la red idiotípica propuesta por Jeme 1974 (Jeme, N.K. Ann. Immunol. 125C; 1974:373-389), concebía al sistema inmune como una red de anticuerpos que podían interactuar entre ellos y con un gran número de antígenos naturales, a través de sus regiones variables o idiotipos (Id), y que a través de esta interacción entre idiotipo-anti-ld se regulaba el sistema inmune. A partir del surgimiento de esta teoría se abrieron nuevas estrategias para la inmunoterapia activa del cáncer basadas en el uso de vacunas anti- idiotipo, donde la vacunación se realiza con el anticuerpo que reconoce al antígeno tumoral (Ab1 ) y que a su vez induce la generación dentro del organismo de anticuerpos anti-idiotipos (Ab2) y estos a su vez imitan funcionalmente al antígeno nominal y generan respuesta de anticuerpos anti-anti-idiotipos (Ab3) contra el antígeno tumoral (Schmolling J, y col. Hybridoma 14; 1995:183-186). Por otra parte, se han reportado muchos ejemplos de vacunas que contienen anticuerpos anti-idiotipos, anti-ld o (Ab2), capaces de inducir respuestas inmunes contra antígenos tumor-asociados (Raychauhuri, S. y col. J. Immuno 137; 1986:1743-1749; Raychauhuri, S. y col. J. Immunol 139; 1987:3902-3910 ; Bhattacharya-Chatterjee, M. y col. J. Immunol 139; 1987:1354-1360; Bhattacharya-Chatterjee, M. y col J. Immunol 141 ; 1988:1398-1403; Herlyn, D. y col. Intern. Rev. Immunol 4; 1989:347-357; Chen, Z-J. y col. Cell. Imm. Immunother. Cáncer; 1990:351-359; Herlyn, D. y col. In Vivo 5; 1991 :615-624; Furuya, A. y col. Anticancer Res 12; 1992:27-32; Mittelman, A. y col. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89; 1992:466-470; Durrant, LG. Y col. Cáncer Res. 54; 1994:4837-4840; Mittelman, A. y col. Cáncer Res. 54; 1994:415-421 ; Schmitt.H. y col. Hybridoma 13; 1994:389-396; Chakrobarty, M. y col. J. Immunother. 18; 1995:95-103; Chakrobarty, M. y col. Cáncer Res. 55; 1995:1525-1530; Foon, KA. y col. Clin. Cáncer Res. 1 ; 1995:1285-1294; Herlyn, D. y col. Hybridoma 14; 1995:159-166; Sclebusch, H. y col. Hybridoma 14; 1995:167-174; Herlyn, D. Y col. Cáncer Immunol. Immunother. 43; 1996:65-76). Otra ¡dea alternativa para inducir anticuerpos contra gangliósidos que involucra el uso de anticuerpos Ab2, es la estrategia que explota la posibilidad de que un epitopo de naturaleza sacarídica pueda ser representado por un epitopo proteico en la molécula del anticuerpo, haciéndolo más inmunogénico. De hecho, anticuerpos anti-ld que mimetizan gangliósidos altamente expresados en células tumorales como el GM3, GD3 y GD2, han sido obtenidos (Yamamoto, S y col. J. Nati. Cáncer Inst 82; 1990:1757-1760; Chapman, P.B. y col. J. Clin. Invest 88; 1991 :186-192; Cheung N-K V, y col. Int J Cáncer 54; 1993:499-505; Saleh MN. Y col. J Immunol 151 ; 1993:3390-3398; Sen G. Y col. J Immunotherapy 21 ; 1998: 75-83). Resultados prometedores se han obtenido en ensayos clínicos donde algunos de estos anticuerpos monoclonales (AcMs Ab2) han sido usados junto con BCG o QS21 como adyuvantes para tratar pacientes con cáncer (McCaffery M. Y col. Clin Cáncer Res 2; 1996: 679-686.; Foon KA. Y col. Clin Cáncer Res 4; 1998:1117-1124). Del estado del arte es conocido un AcM denominado P3 (con Número de depósito ECACC 94113026), el cual tiene la particular característica de reconocer específicamente al ácido siálico N-glicolilado en monosialo- y disialogangliósidos. Este AcM Ab1 reconoce antígenos presentes en los tumores de mama y melanomas humanos. (Patente US 5,788,985; Vázquez A. M. y col. Hybridoma 14; 1995:551-556; Moreno E. y col. Glycobiology 8; 1998: 695-705; Marquina G. y col. Cáncer Res 56; 1996:5165-5171 ; Carr A. y col. Hybridoma 19 (3); 2000:241-247).
A partir del AcM P3 se obtuvo un AcM anti-idiotipo de tipo gamma (no imagen interna), identificado como 1 E10 (Número de Depósito ECACC 97112901 ), capaz de producir efecto anti-tumoral contra tumores murinos de mama y melanoma (Patente US 6,063,379; Vázquez y col. Hybridoma 14; 1995:183-186; Vázquez y col. Oncology Reports 7; 2000:751 -756).
En el estado del arte no aparecen antecedentes del uso combinado de vacunas que contienen gangliósidos con composiciones farmacéuticas que contienen anticuerpos anti- gangliósidos (Ab1) o anti-idiotipos (Ab2) o versiones recombinantes (anticuerpos quiméricos o humanizados) de dichos anticuerpos (denominadas vacunas idiotípicas); ni del uso de combinaciones de vacunas idiotípicas Ab1 con vacunas idiotípicas Ab2. La presente invención involucra el uso de todas las posibles combinaciones de las vacunas antes descritas, con el objetivo de potenciar el efecto que producen cada una de ellas por separado. Descripción detallada de la invención:
En la presente invención se describe una composición farmacéutica, o combinación de composiciones farmacéuticas, para la inmunoterapia de tumores que sobre-expresan gangliósidos, y que contiene al menos dos de los componentes mencionados a continuación: (A) Una vacuna idiotípica cuyo principio activo es un anticuerpo anti-gangliósido (Ab1 );
(B) Una vacuna idiotípica cuyo principio activo es un anticuerpo anti-idiotipo (Ab2) específico contra un anticuerpo anti-gangliósido; y
(C) Una vacuna cuyo principio activo es un gangliósido. Dicha composición farmacéutica, o combinación de composiciones farmacéuticas puede contener A y B, o A y C, o B y C.
Preferiblemente la invención se refiere a aquella composición farmacéutica, o combinación de composiciones farmacéuticas, donde A puede ser una vacuna idiotípica cuyo principio activo sea el anticuerpo murino anti-gangliósido P3 depositado con Número de Depósito ECACC 94113026; y donde B puede ser una vacuna idiotípica cuyo principio activo es el anticuerpo anti-idiotipo murino 1 E10 depositado con Número de Depósito ECACC 97112901 y donde C puede ser una vacuna cuyo principio activo sean los gangliósidos N-glicolil GM3 (NeuGcGM3) o N-acetil GM3 (NeuAcGM3). Más preferible aún es cuando en la composición farmacéutica, o combinación de composiciones farmacéuticas de la invención los componentes A y B, o A y C, o B y C, se administran de forma simultánea o alterna.
La composición farmacéutica, o combinación de composiciones farmacéuticas descritas en la presente invención pueden ser usadas para el tratamiento de tumores que sobréexpresan gangliósidos. Preferiblemente en el tratamiento de cáncer de mama, pulmón, sistema digestivo, sistema urogenital, melanomas, sarcomas y tumores de origen neuroectodérmico.
En la presente invención también se describe un método que comprende la administración a mamíferos de la composición farmacéutica, o combinación de composiciones farmacéuticas descritas anteriormente para la prevención o tratamiento de cáncer de mama, pulmón, sistema digestivo, sistema urogenital, melanomas, sarcomas y tumores de origen neuroectodérmico.
1. Preparación de vacunas que contienen gangliósidos:
La preparación de las vacunas que contienen como antígeno uno o más gangliósidos se realiza como se describe por Estévez y col en Vacccine 18, 1999: 190-197 y en las Patentes US 5,788,985 y US 6,149,921 , donde los gangliósidos naturales o sintéticos son usados como componentes de proteoliposomas conformados por el complejo proteico de la membrana externa de la Neisseria meningitidis (siglas en inglés, VSSP-G). Dichos gangliósidos pudieran ser (NeuGcGM), GD3 o (NeuAcGM). 2. Preparación de vacunas idiotípicas:
Las composiciones farmacéuticas se preparan como se describe en las Patentes US 5,817,513 y US 6,063,379, donde dichas vacunas contienen como principio activo a los anticuerpos monoclonales (AcM) murinos anti-gangliósidos tales como el AcM P3 (Número de Depósito ECACC 94113026) o a los AcM murinos anti-idiotipos tales como el AcM 1 E10 (Número de Depósito ECACC 97112901) que reconocen a los anticuerpos monoclonales anti-gangliósidos. 3. Combinaciones inmunoterapéuticas que provocan una potenciación de la respuesta inmunológica y del efecto anti-tumoral entre vacunas que contienen a los gangliósidos y vacunas idiotípicas, o entre estas últimas, en modelos animales: Los procedimientos referidos pueden ser utilizados en ratones u otras especies de mamíferos, pudiéndose incluir todas las variantes de combinaciones de los diferentes componentes antes mencionados. Los animales se inmunizan con 3 a 10 dosis en un rango de 25 μg a 1 mg del AcM murino que reconoce al gangliósido, con un intervalo entre las dosis que oscila entre 7 y 14 días. Durante este período de inmunización los animales reciben entre 3 a 10 dosis en un rango entre 60 a 1000 μg de la vacuna que contiene al gangliósido, con un intervalo de tiempo entre las dosis de 7 a 14 días. Otra combinación inmunoterapéutica es en la que los animales reciben entre 3 a 10 dosis en un rango entre 25 μg a 1 mg de un AcM anti-idiotipo específico contra un anticuerpo anti- gangliósido, con un tiempo entre cada dosis que oscila de 7 a 14 días. Durante este período de inmunización los animales reciben entre 3 a 10 dosis en un rango entre 60 a 1000 μg de la vacuna que contienen el gangliósido, con un intervalo de tiempo entre las dosis de 7 a 14 días.
La administración de ambos tipos de vacunas puede ser simultánea o alterna. Las vacunas pueden ser formuladas como productos separados o dentro de una misma formulación vacunal para la situación en que se suministren de forma simultánea. En caso de que la administración sea alterna, los animales reciben las vacunas a intervalos de 3-7 días entre un tipo de vacuna y la otra.
Las vacunas son administradas en un adyuvante que puede ser alúmina (62.5 μg -2.5 mg), Montanide ISA 51 (0.1-1.2 ml/dosis), u otro apropiado. El volumen total de una dosis es de 10 μl a 2 mi.
Las vacunas que contienen al o los gangliósidos pueden ser administradas por vía intradérmica, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, intramucosal o combinaciones de éstas. Las vacunas que contienen a los anticuerpos pueden ser administradas por esas mismas vías. La administración de las referidas combinaciones inmunoterapéuticas en animales induce un incremento tanto en la respuesta de anticuerpos como de la respuesta inmune celular de los animales tratados.
Se compara el prendimiento de los tumores, el volumen tumoral y sobrevida de los animales tratados en comparación con grupos de animales controles, los cuales fueron tratados con cada una de las vacunas por separado o con preparaciones controles. Después del tratamiento con las referidas combinaciones inmunoterapéuticas en los animales se observa una menor incidencia tumoral, una disminución del crecimiento tumoral y un aumento en la sobrevida, no sólo en comparación con el grupo tratado sólo con los adyuvantes, sino con respecto a los grupos tratados con las diferentes vacunas por separado.
4. Combinaciones inmunoterapéuticas que provocan una potenciación de la respuesta inmunológica y del efecto anti-tumoral entre vacunas que contienen a los gangliósidos y vacunas idiotípicas, o entre estas últimas, en pacientes: Los procedimientos antes referidos pueden ser aplicados a pacientes en diferentes estadios clínicos con tumores que sobre-expresen a los gangliósidos. Dentro de estos tipos se encuentran tumores del sistema digestivo, del sistema urogenital, de pulmón, de mama, melanomas, sarcomas o de origen neuroectodérmico.
El procedimiento consiste en una fase de inducción donde los pacientes reciben entre 3 y 10 dosis en un rango entre 0.1 a 5 mg de AcM murino que reconozca al gangliósido, con un tiempo entre cada dosis que oscilará de 7 a 14 días. Estos pacientes recibirán durante esta fase entre 3 a 10 dosis en un rango de 60 a . 1000 μg de la vacuna que contienen el gangliósido, con un tiempo entre cada dosis que oscilará de 7 a 14 días. Una segunda combinación inmunoterapéutica es en la que los pacientes se inmunizan con 3 a 10 dosis en un rango entre 0.1 a 5 mg de un AcM anti-idiotipo específico contra un anticuerpo anti-gangliósido, con un tiempo entre cada dosis que oscila entre 7 y 14 días. Estos pacientes recibirán durante esta fase entre 4 a 6 dosis en un rango de 60 a 1000 μg de la vacuna que contienen el gangliósido, con un tiempo entre cada dosis que oscilará entre 7 y 14 días. Una tercera combinación inmunoterapéutica es en la que los pacientes se inmunizan con el AcM murino que reconoce al gangliósido, con las mismas dosis, frecuencia e intervalos antes mencionados, y que durante este período los pacientes reciben entre 3 a 10 dosis en un rango entre 0.1 a 2 mg de un AcM anti-idiotipo específico contra un AcM anti-gangliósido. Las vacunas pueden formularse como productos independientes o dentro de una misma formulación vacunal para el caso en que se suministren de forma simultánea. Las vacunas son administradas en un adyuvante que pudiera ser alúmina (1-5 mg/dosis), Montanide ISA 51 (0.6-1.2 ml/dosis), u otro apropiado. El volumen total de una dosis oscila entre 10 μl y 2 mi.
La vacuna que contienen al o los gangliósidos puede ser administrada por vía intradérmica, subcutánea, intramuscular, intramucosal u otra vía. Las vacunas que contienen anticuerpos pueden ser administradas por esas mismas vías. En este período de vacunación se realizan extracciones de sangre para medición de parámetros de bioquímica sanguínea y títulos de anticuerpos específicos. También se obtienen linfocitos de los pacientes para estudios de la inmunidad celular. Dichas extracciones se realizan con una frecuencia que puede ser desde una semana a tres meses. Posteriormente, se realiza una fase de mantenimiento donde los pacientes pueden recibir reinmunizaciones de cada una de las vacunas a las concentraciones antes mencionadas, a intervalos entre 1 -6 meses, de forma simultánea o en diferentes momentos, por un período de 1 a 2 años. La administración de las referidas combinaciones inmunoterapéuticas en los pacientes induce un incremento tanto en la respuesta de anticuerpos como de la respuesta inmune celular, y tienen impacto sobre el crecimiento del tumor. Ejemplos de Realización:
Ejemplo 1: Inducción de la activación de células T anti-idiotipo (T2) y anti-anti-idiotipo (T3), en el modelo singénico mediante la inmunización con el AcM muríno P3. Ratones hembras Balb/c y atímicos del mismo fondo genético, de 6-8 semanas de edad, fueron inmunizadas con 100 μg del AcM murino P3 (anti-gangliósidos N-glicolilados) (Número de Depósito ECACC 94113026; Vázquez y cois, Hybridoma 14; 1995: 551-558; Moreno y col. Glycobiolgy 8; 1998: 695-705) emulsificado en adyuvante completo de Freund (ACF) por vía subcutánea, seguido de una re-inmunización con 50 μg de este AcM emulsionado en adyuvante incompleto de Freund (AIF) siete días después. El día 10, los ganglios linfáticos fueron colectados y se obtuvieron los linfocitos presionando los ganglios con el émbolo de una jeringuilla. La suspensión celular obtenida se utilizó en experimentos de proliferación celular, la cual fue medida por la incorporación de timidina tritiada. Se midió la capacidad de los linfocitos obtenidos de proliferar in vitro al adicionar a los cultivos concentraciones entre 25-150 μg/mL tanto del AcM murino P3 como de su AcM anti-idiotipo 1E10 (Número de Depósito ECACC 97112901). Se tomaron como controles AcMs murinos del mismo isotipo que los AcMs antes mencionados. Se consideraron índices de proliferación positivos aquellos iguales o mayores a 3. Se demostró que los linfocitos obtenidos luego de la inmunización de los ratones Balb/c con el AcM P3 proliferaban específicamente en presencia del AcM P3 , y no se observó proliferación al enfrentarlo al AcM murino A3 (IgM) (Alfonso M. Y col. Hybridoma 14; 1995: 209-216). Esta proliferación fue dependiente de la presencia de células T, al no obtenerse de células provenientes de ratones atímicos. La inmunización con el AcM murino P3 indujo no sólo la proliferación de células T contra el idiotipo del AcM P3 (T2), sino también activa la proliferación de células T anti-anti-idiotipo (T3), pues los linfocitos fueron capaces de proliferar in vitro también contra el AcM murino anti-idiotipo 1E10 (lgG1), y no contra el AcM C5 del mismo isotipo (lgG1) (Figura 1 ).
Ejemplo 2: Inducción de la activación de células T anti-idiotipo (T2) y anti-anti-idiotipo (T3) en ratones mediante la inmunización con el anticuerpo P3 quimérico. El anticuerpo P3 quimérico, cuyas secuencias de aminoácidos de sus regiones variables de las cadenas pesada (VH) y ligera (VL) se muestran en las Figuras 8 y 9 respectivamente, fue utilizado para inmunizar ratones hembras Balb/c, de 6-8 semanas de edad. En la primera inmunización se utilizaron 100 μg del anticuerpo emulsificado en ACF por vía subcutánea, seguido de una re-inmunización con 50 μg del anticuerpo emulsionado en AIF siete días después. El día 10 los ganglios linfáticos se colectaron y se procedió a medir la capacidad linfoproliferativa de estas células al adicionar a los cultivos: el anticuerpo P3 quimérico, el anticuerpo 1 E10 quimérico, cuyas secuencias de las regiones variables se muestran en las Figuras 13 y 14, el AcM P3 murino y el AcM murino 1E10. Como controles se utilizaron el AcM murino C5 (Solicitud de Patente WO 97/33916 A1) y su variante recombinante. Los linfocitos de los ratones inmunizados con el anticuerpo P3 quimérico proliferaron específicamente cuando se cultivaron en presencia de este anticuerpo quimérico, al igual que en presencia del AcM 1 E10 quimérico y de sus varianrtes murinas, y no así contra los anticuerpos utilizados como controles de isotipo. Demostrándose que el anticuerpo P3 quimérico mantiene la capacidad de inducir una proliferación específica de células T anti- idiotipo (T2) y anti-anti-idiotípica (T3) (Figura 2).
Ejemplo 3: Potenciación del efecto anti-tumoral producido por la vacuna GM3- VSSP/Montanide ISA 51 por la combinación con la vacuna compuesta por el AcM murino 1E10 adsorbido en gel de alúmina. Un grupo de ratones hembras C57BL/6 de 6-8 semanas de edad se inmunizaron por vía subcutánea con 50 μg del AcM murino 1E10 adsorbido en gel de alúmina los días 0, 14, 28 y 42. Los ratones se inmunizaron por vía intramuscular con 120 μg de GM3-VSSP/Montanide ISA 51 los días 7, 21 , 35 y 49. Otro grupo de ratones se inmunizó de forma similar, pero iniciando las inmunizaciones con la preparación vacunal que contienen el gangliósido GM3. Grupos controles inmunizados a los mismos intervalos de tiempo y el mismo número de dosis de cada una de las vacunas por separado o inmunizados sólo con solución salina tamponada con fosfato se utilizaron en estos experimentos. A todos los grupos se les inoculó 10 000 células del tumor murino B16 por vía subcutánea el día 63. En todos los grupos se midió el tamaño tumoral. Para el análisis estadístico de las mediciones del tamaño tumoral se compararon todos los grupos con respecto al grupo control que sólo recibió PBS mediante el Modelo Lineal Mixto. La vacunación con el AcM 1E10 no protegió contra un reto de 10,000 células del melanoma B16. La vacuna VSSP-GM3 provocó un retardo del crecimiento tumoral (p<0.05). Las combinaciones de las vacunas GM3-VSSP y del AcM 1 E10 tuvieron un efecto aún mayor que la vacuna GM3-VSSP sobre el retardo tumoral (p<0.05) (Figura 3). Ejemplo 4: Esquema de inmunización en pacientes con cáncer con la vacuna NeuGc- GM3-VSSP utilizando Montanide ISA 51 como adyuvante.
Con el objetivo de demostrar la seguridad e inmunogenicidad de la inmunización con la vacuna NeuGcGM/ VSSP usando como adyuvante Montanide ISA 51 (Patentes US 5,788,985 y US 6,149,921), se realizó un ensayo clínico en el que se inmunizaron 20 pacientes con melanoma maligno avanzado, los cuales no eran elegibles para ningún otro tratamiento onco-específico.
Los pacientes recibieron 9 dosis del preparado vacunal que contienen 200 μg del gangliósido. Estas dosis fueron administradas los días 0, 14, 28, 42, 56, 84, 1 12, 140, 168. Los pacientes se reinmunizaron cada 28 días después del sexto mes a criterio de los clínicos hasta completar 1 año de tratamiento. Se realizaron extracciones de sangre para determinación de la bioquímica sanguínea y de los títulos de anticuerpos contra el gangliósido NeuGcGM en los días 0, 14, 28, 56, 112, 168, 224, 280, 332.
Los títulos de anticuerpos se midieron mediante un ensayo de ELISA considerándose como positivo los valores de DO iguales o mayores de 0,1 referido al metanol. La toxicidad de la vacuna NeuGcGM-VSSP/Montanide ISA 51 consistió en eritema y dolor local, induración en el sitio de inyección, fiebre. Toxicidad ligera grado l/ll según criterio de la OMS.
Los pacientes desarrollaron títulos de anticuerpos específicos contra NeuGcGM entre 80 y 2560, detectándose en 100% de los pacientes la presencia de anticuerpos de tipo IgM, 100% de IgG y 75% IgA (TABLA I).
En el paciente 01 que entró al ensayo con diagnóstico de melanoma maligno avanzado(Enfermedad Metastásica Evolutiva, siglas EME), luego de dos meses de tratamiento se observó regresión y estabilización de algunas lesiones cutáneas y la presencia de despigmentación alrededor de lesiones en las que se demostró por estudios anatomopatológicos en biopsias de las lesiones, la presencia de infiltrado inflamatorio y necrosis (Figura 4).
En el paciente 02 con diagnóstico de melanoma maligno avanzado se observó la estabilización de una lesión metastásica pulmonar en el vértice derecho 18 - 20 mm, durante al menos 4 meses (Figura 5). TABLA I: Títulos de anticuerpos contra NeuGcGM en pacientes con melanoma maligno avanzado inmunizados con la vacuna NeuGcGM/ VSSP/ Montanide ISA 51
Figure imgf000012_0001
Ejemplo 5: Esquema de inmunización en pacientes con cáncer con la vacuna que contienen el AcM anti-idiotipo 1E10 y utilizando gel de alúmina como adyuvante.
Con el objetivo de demostrar la seguridad e inmunogenicidad de la inmunización con la vacuna que contienen al AcM anti-idiotipo 1 E10 (Patentes US 5,817,513 y US 6,063,379) y utilizando el gel de alúmina como adyuvante, se realizó un ensayo clínico en el que se inmunizaron 20 pacientes con melanoma maligno avanzado, lo cuales no eran elegibles para ningún otro tratamiento onco-específico.
Los pacientes recibieron 4 dosis del preparado vacunal que contienen 2 mg del AcM 1 E10. Se realizaron extracciones de sangre para determinación de bioquímica sanguínea y títulos de anticuerpos contra el idiotipo del AcM 1 E10 y contra el gangliósido NeuGcGM3 antes de comenzar el tratamiento y 14 días después de cada inmunización. Los títulos de anticuerpos se midieron mediante un ensayo de ELISA considerándose como positivo los valores de DO ¡guales o mayores de 0.15
La administración del preparado vacunal a los pacientes produjo una toxicidad ligera, clasificada de grado I y II de acuerdo a los criterios de la OMS. En 16 de los 17 pacientes evaluables se desarrolló una fuerte respuesta de anticuerpos Ab3 de tipo IgG, detectable luego de recibir 2 6 3 dosis del preparado vacunal. El análisis de la especificidad de esta respuesta arrojó como resultado que los sueros de todos los pacientes tuvieron un mayor reconocimiento del AcM 1 E10 que del resto de los AcMs de igual isotipo utilizados como controles, lo que sugirió la inducción de una respuesta específica contra el idiotipo del AcM 1 E10. Esto se corroboró al observar que los sueros de los pacientes reconocían fuertemente a los fragmentos F(ab')2 del AcM 1E10 con un título medio de 1 :15000 (títulos de 1 : 0000 a más de 1 :100000), con poco o ningún reconocimiento de los fragmentos F(ab')2 del resto de los AcMs controles de igual isotipo (Figura 6) Los anticuerpos generados contra el GM3(NeuGc) fueron, en general, tanto de tipo IgM como IgG, con título medio de 1 :4000 y 1 :800, respectivamente (Figura 7).
Una paciente que entró al ensayo con diagnóstico de melanoma maligno con enfermedad metastásica hepática, luego del tratamiento se observó una estabilización de la enfermedad por 8 meses y la sobrevida de la paciente fue de 15 meses. Ejemplo 6: Esquema de inmunización combinada de la vacuna que contienen al AcM 1 E10 y de la vacuna NeuGcGM-VSSP.
Una paciente con diagnóstico de metástasis de melanoma maligno metastásico, la cual había tenido como tratamiento previo a la vacunación cirugías con intervalos mensuales desde su diagnóstico, recibió 6 dosis de la vacuna 1 E10 adsorbida a gel de alúmina (2 mg del AcM por dosis) los días 0,14,28,42,56. Además recibió de forma alterna los días 7, 21 , 35, 49, 63 la vacuna que contenía 200ug NeuGcGM-VSSP (200ug del gangliósido) y Montanide ISA 51 como adyuvante. Posteriormente fue re-inmunizada en dos ocasiones a intervalos mensuales con ambas vacunas simultáneamente. Durante el período de vacunación no aparecieron nuevas lesiones y la paciente mantuvo buen estado general. Ejemplo 7: Reconocimiento de tejidos tumorales por el AcM 14F7. El AcM 14F7 se ha demostrado reconoce NeuGcGM3 (patente WO9940119). En el presente ejemplo se muestran resultados de reconocimiento de este AcM de diversas localizaciones tumorales humanas.
Los tejidos fueron fijados en una solución de formalina tamponada a 10% y se deshidrataron, clarificaron y se incluyeron en parafina. La histopatología se evaluó en cortes teñidos con hematoxilina eosina.
Cortes consecutivos confeccionados a partir de los bloques evaluados histológicamente fueron usados para realizar el inmunomarcaje por el método del complejo biotina estreptavidina peroxidasa descrito previamente (Hsu, S. M. y Ralne, L. 1981.J Histochem Cytochem., 29:1349-1353 ). Los cortes desparafinados y rehidratados se trataron con 3% de peróxido de hidrógeno (solución de metanol) durante 30 minutos, para eliminar la actividad peroxidasa endógena. Los cortes se incubaron con el AcM 14F7 (purificado) durante 1 hora a temperatura ambiente. Posteriormente se añadió suero anti-ratón biotinilado y complejo estreptavidina peroxidasa (Dakopatts) a temperatura ambiente. Entre las incubaciones, los cortes se lavaron con una solución salina tamponada con Tris- HCI. La reacción de la peroxidasa (POD) se reveló al usar 5 mL de una solución tamponada de Tris-HCI, 0,005 mL de H202 a 30 % y 3 mg de 3-3 diaminobencidina. Las láminas se lavaron con agua corriente contrastadas con hematoxilina de Mayer, recubiertas con un medio de montaje que contiene bálsamo y tapadas con cubreobjetos. La reacción con la enzima produce una coloración carmelita-marrón.
Los fragmentos de biopsias frescas de tejido patológico se obtuvieron dentro de la hora posterior a la exéresis quirúrgica. Todos los tejidos se lavaron con solución salina, se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido y se conservaron congeladas a -80° C. Los fragmentos congelados fueron cortados en criostato Leica a -25°C obteniéndose cortes seriados a 5 μm que se secaron al aire y se utilizaron inmediatamente o se conservaron a - 20°C envueltos en papel de aluminio y fueron postfijados en paraformaldehído a 4% durante 20 minutos. La TABLA II se muestra el estudio inmunohistoquímico del AcM 14F7 en nuevas localizaciones de tejidos patológicos humanos donde se aprecia un fuerte reconocimiento en la membrana y el citoplasma de más del 50% de las células tumorales. La tinción fue muy intensa en carcinomas de colon, útero, ovario, sarcomas, metástasis ganglionares y cerebrales de mama, así como metástasis de melanoma maligno. TABLA II: Resultados de la inmunotinción con el AcM 14F7 en diferentes localizaciones tumorales.
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* Intenso mareaje en más del 50% de las células tumorales en citoplasma y membrana Breve descripción de las figuras: Figura 1. Ratones Balb/c eutímicos y atímicos fueron inmunizados por vía subcutánea con 100 μg del AcM murino P3 emulsionado en ACF seguido de una re-inmunización con 50 μg del AcM emulsionado en AIF. Tres días después se colectaron las células de los ganglios linfáticos y se llevó a cabo el experimento de proliferación en presencia de diferentes concentraciones de los AcMs P3, A3, 1E10 y C5. Figura 2. Ratones Balb/c fueron inmunizados por vía subcutánea con 100 μg del anticuerpo P3 quimérico en ACF seguido de una re-inmunización con 50 μg del anticuerpo emulsionado en AIF. Tres días después se colectaron las células de los ganglios linfáticos y se llevó a cabo el experimento de proliferación en presencia de diferentes concentraciones de los diferentes anticuerpos murinos y quiméricos.
Figura 3. Cinética del crecimiento del tumor murino B16 en ratones inmunizados con las combinaciones terapéuticas de la vacuna idiotípica que contienen al AcM anti-idiotipo 1E10 y de la vacuna GM3-VSSP, según se detalla en el Ejemplo 3. Figura 4: Estudio comparativo de las lesiones metastásicas en piel en paciente con melanoma. Las fotos fueron tomadas previo a la inmunización con la vacuna NeuGcGM/ VSSP/ ISA 51, 2 y 4 meses después del tratamiento. Se observan halos despigmentados alrededor de algunas de las lesiones, lesiones estabilizadas, lesiones que disminuyeron y una lesión que aumentó de tamaño. Figura 5: Estudio comparativo por Tomografía Axial Computarizada de las lesiones metastásicas en el vértice derecho pulmonar, con un tamaño de 18x20 mm en paciente con melanoma maligno, previo a la inmunización con la vacuna NeuGcGM/ VSSP/ ISA 51 y 4 meses posterior a la inmunización. Se observa estabilización de la lesión. Figura 6: Reconocimiento de los fragmentos F(ab')2 del AcM 1E10 y de otros AcMs de igual isotipo por los sueros de los pacientes inmunizados con la vacuna idiotípica que contienen el AcM 1 E10 y gel de alúmina como adyuvante.
Figura 7: Reconocimiento de los gangliósidos GM3(NeuGc) (N-glicolilado) y GM3 (N- acetilado) por los sueros de los pacientes inmunizados con la vacuna idiotípica que contienen el AcM 1E10 y al gel de alúmina como adyuvante.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Una combinación inmunoterapéutica, para la inmunoterapia de tumores que sobre- expresan gangliósidos, que contiene al menos dos de los siguientes componentes: (A) Una vacuna idiotípica cuyo principio activo es un anticuerpo anti-gangliósido (Ab1);
(B) Una vacuna idiotípica cuyo principio activo es un anticuerpo anti-idiotipo (Ab2) específico contra un anticuerpo monoclonal anti-gangliósido; y
(C) Una vacuna cuyo principio activo es un gangliósido.
2. Una combinación inmunoterapéutica según la reivindicación 1 , caracterizada porque la misma contiene A más B, o A más C, o B más C.
3. Una combinación inmunoterapéutica según las reivindicaciones 1 y 2, caracterizada porque el principio activo de A es el anticuerpo murino anti-gangliósido P3 (Número de Depósito ECACC 94113026).
4. Una combinación inmunoterapéutica según las reivindicaciones de la 1 a la 3, caracterizada porque el principio activo de B es el anticuerpo anti-idiotipo murino 1 E10
(Número de Depósito ECACC 97112901).
5. Una combinación inmunoterapéutica según las reivindicaciones de la 1 a la 4, caracterizada porque el principio activo de C es el gangliósido NeuGcGM3.
6. Una combinación ¡nmunoterapéutica según las reivindicaciones de la 1 a la 4, caracterizada porque el principio activo de C es el gangliósido NeuAcGM3.
7. Una combinación ¡nmunoterapéutica, según las reivindicaciones de la 1 a la 6, caracterizada porque A y B, o A y C, o B y C se administran de forma simultánea o alterna.
8. Uso de cualquiera de las combinaciones inmunoterapéuticas de las reivindicaciones de la 1 a la 7 para el tratamiento de tumores que sobre-expresan gangliósidos.
9. Uso según la reivindicación 8 para el tratamiento de cáncer de mama, pulmón, sistema digestivo, sistema urogenital, melanomas, sarcomas y tumores de origen neuroectodérmico.
10. Método para controlar el crecimiento y/o proliferación de células tumorales que sobre- expresan gangliósidos, caracterizado porque dicho método comprende la administración a mamíferos de una de las combinaciones de las reivindicaciones de la 1 a la 7.
11. Método según reivindicación 11, donde los mamíferos son humanos.
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