ES2348312T3 - Vacuna her-2/neu a base de múltiples péptidos. - Google Patents
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Abstract
Vacuna contra enfermedades cancerosas asociadas con el oncogén HER-2/neu, en la que dicha vacuna comprende una mezcla, como mínimo, de tres péptidos diferentes que tienen una longitud de 9 a 30 aminoácidos y cada secuencia se encuentra en el dominio extracelular de la proteína HER-2/neu, en la que, como mínimo, un péptido tiene la secuencia 378 a 394 del dominio extracelular de la proteína HER-2/neu, como mínimo, otro tiene la secuencia 545 a 560 del dominio extracelular de la proteína HER-2/neu y, como mínimo, otro péptido tiene la secuencia 610 a 623 del dominio extracelular de la proteína HER-2/neu y en la que cada uno de los péptidos está conjugado a un transportador.
Description
La presente invención se refiere a una vacuna a base de
múltiples péptidos contra enfermedades cancerosas asociadas con el
oncogén HER-2/neu.
El antígeno tumoral HER-2/neu, producto génico del
protooncogén erbB2/neu, es una proteína de 185 kDa que pertenece a
la familia de los receptores del factor de crecimiento epidérmico.
Comprende un dominio extracelular rico en cisteína (ECD) con
diversos sitios de glicosilación, un dominio transmembrana
hidrofóbico, y un dominio tirosina quinasa conservado intracelular.
HER-2/neu se detecta débilmente en células epiteliales de tejidos
normales pero se sobreexpresa en el 20 hasta el 30 % de cánceres
primarios de mama, ovario, colon, pulmón y próstata, y se ha
asociado con un mal pronóstico y un alto riesgo de recidiva del
cáncer. La sobreexpresión parece ser estable y homogénea en tumores
primarios, así como sus metástasis. Por lo tanto, HER-2/neu es una
diana atractiva de la inmunoterapia del cáncer.
La inmunoterapia pasiva con anticuerpos monoclonales es
un tratamiento contra enfermedades cancerosas que se lleva a cabo
de forma rutinaria. Por lo tanto, la inducción de respuestas de
anticuerpos antitumorales humorales mediante inmunización con
péptidos activos se ha convertido en un concepto de tratamiento
favorable. Actualmente, la terapia con Trastuzumab, también
conocido como Herceptin®, un anticuerpo monoclonal (mAb) específico
de Her-2/neu, es estándar para el tratamiento de cánceres de mama
avanzados que sobreexpresan la oncoproteína Her-2/neu. La eficacia
terapéutica de este mAb sugiere que dirigir anticuerpos hacia
tumores diana tiene una actividad preventiva significativa. Sin
embargo, la utilidad de la inmunoterapia pasiva está limitada por
la distribución de tejido inadecuada y la necesidad de infusiones
múltiples con costes asociados elevados.
Actualmente, existen diversas estrategias de vacuna
dirigidas a HER-2/neu. Una estrategia de vacuna de este tipo
requiere el desarrollo de un método para superar la tolerancia
inmune a la propia proteína HER-2/neu.
El documento EP1236740 se refiere a una vacuna que
comprende dos péptidos con una longitud de 13 y 16 aminoácidos y
una secuencia, que se encuentran en el dominio extracelular de la
proteína HER-2/neu. Los péptidos utilizados permiten una
inmunización activa contra enfermedades cancerosas asociadas con el
oncogén HER-2/neu, pero inducen una inhibición menor del
crecimiento de tumores que el Trastuzumab.
Por lo tanto, un objetivo de la presente invención es
dar a conocer una vacuna contra una enfermedad cancerosa que tiene
asociada una sobreexpresión de la proteína HER-2/neu, que induce
una fuerte inmunidad para establecer una memoria inmune y de este
modo evitar los inconvenientes de los tratamientos contra el cáncer
convencionales y ofrecer una alternativa convincente a otros
métodos de vacunación conocidos. Un objetivo adicional de la
presente invención es dar a conocer una vacuna, que se puede
administrar al paciente por vía oral y nasal (mucosal) sin perder
su fuerte propiedad inmunogénica.
La presente invención se basa en el descubrimiento de
que el objetivo anterior se puede conseguir si la vacuna es una
vacuna a base de múltiples péptidos – múltiples epítopos -contra
enfermedades cancerosas asociadas con el oncogén HER-2/neu, es
decir, la vacuna comprende una combinación específica de péptidos
que presentan diferentes secuencias de aminoácidos que se
encuentran en el dominio extracelular de la proteína HER-2/neu.
Además, se ha encontrado que, a efectos de mejorar la
respuesta inmune, la vacuna debería comprender opcionalmente un
adyuvante de estimulación inmune o sistema de liberación, en el
caso de que la vacuna se tuviera que administrar por vía oral o
nasal sin perder su fuerte propiedad inmunogénica, la vacuna
- comprende
- opcionalmente un adyuvante mucosal o un sistema de
- liberación de antígeno mucosal que
- se utiliza como transporta dor
- mucosal.
Por lo tanto, la presente invención da a conocer una
vacuna contra enfermedades cancerosas asociadas con el oncogén HER-
2/neu, en la que dicha vacuna comprende una mezcla, como mínimo, de
tres péptidos diferentes que tienen una longitud de 9 a 30
aminoácidos y cada secuencia se encuentra en el dominio
extracelular de la proteína HER-2/neu, en la que, como mínimo, uno
de los tres péptidos tiene la secuencia 378 a 394 del dominio
extracelular de la proteína HER-2/neu, como mínimo, otro tiene la
secuencia 545 a 560 del dominio extracelular de la proteína HER-
2/neu y, como mínimo, el otro péptido tiene la secuencia de 610 a
623 del dominio extracelular de la proteína HER-2/neu, y en la que
cada uno de los péptidos está conjugado a un transportador.
La vacuna de la presente invención induce una inmunidad
fuerte y establece una memoria inmune contra enfermedades
cancerosas asociadas con el oncogén HER-2/neu. De este modo, la
vacuna aporta profilaxis contra estas enfermedades cancerosas.
Adicionalmente, la vacuna de la presente invención se puede
utilizar para tratar una enfermedad cancerosa que ya existe o para
acompañar tratamientos contra el cáncer convencionales. La
aplicación de la vacuna de la presente invención puede evitar
completa o parcialmente los inconvenientes considerables descritos
anteriormente de las inmunoterapias contra el cáncer
convencionales/pasivas.
En particular, el péptido que tiene la secuencia de 378
a 394 del dominio extracelular de la proteína HER-2/neu es ID SEQ
1: PESFDGDPASNTAPLQP.
El péptido que tiene la secuencia de 545 a 560 del
dominio extracelular de la proteína HER-2/neu es ID SEQ 2:
RVLQGLPREYVNARHC.
El péptido que tiene la secuencia de 610 a 623 del
dominio extracelular de la proteína HER-2/neu es ID SEQ 3:
YMPIWKFPDEEGAC.
Los péptidos de la presente invención también se pueden
unir a otros péptidos o polipéptidos o a otros grupos químicos,
tales como grupos glicosilo, lípidos, fosfatos, grupos acetilo, o
similares, tales como, por ejemplo, poliglicol, polietilenglicol,
ácido poli-láctico (PLA), ácido poli-láctico-co-glicólico (PLGA),
dendrímeros de lisina. Estas sustancias no tienen una influencia
negativa sobre la actividad biológica de los péptidos.
Es preferente que el péptido ID SEQ 1 se una
adicionalmente a cualquier enlazador conocido en la técnica, pero
preferentemente a un enlazador de glicina y/o a un residuo de
cisteína C-terminal, más preferentemente al enlazador GGGGGC.
Por lo tanto, la vacuna preferente de la presente
invención comprende una mezcla del péptido ID SEQ 1 unido a un
enlazador de glicina y/o a un residuo de cisteína C-terminal, en
particular al enlazador GGGGGC, y el péptido ID SEQ 2, así como el
péptido ID SEQ 3.
Además, es preferente que cada uno de los péptidos de
la presente invención esté conjugado a un transportador, en
particular para la inmunización sistémica.
Los péptidos utilizados se pueden conjugar mediante
cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, mediante
ingeniería genética o por medios químicos, los cuales incluyen la
unión de un transportador y un grupo funcional por reacción
química. Mediante ingeniería genética, la conjugación del
transportador, que puede ser una molécula proteica, al péptido se
puede realizar insertando una secuencia de ADN o ARN que codifica
la secuencia total del conjugado en el sistema de expresión que
expresa el conjugado total.
De forma adicional, los péptidos se pueden unir al
transportador por medio de otro enlazador. De este modo, el
enlazador actúa como espaciador que confiere flexibilidad, o en
caso de que se desee, rigidez al péptido conjugado. La naturaleza
química del espaciador puede variar, dependiendo de la reactividad
de los grupos funcionales del transportador y del péptido,
respectivamente, y dependiendo de la necesidad con respecto a
flexibilidad o rigidez. Como ejemplo, se pueden mencionar
secuencias espaciadoras, tales como los residuos de cisteína en el
extremo C-terminal o glicina, tal como (G)x.
Cada uno de los péptidos de la presente invención se
puede conjugar al transportador de forma simple o múltiple, en
diferentes combinaciones como monooligómeros, dioligómeros o
trioligómeros. Dichas conjugaciones se describen, por ejemplo, en
la publicación de Th. H. Turpen, S.J. Reinl, Y. Charoenvit, S.L.
Hoffmann, V. Fallarme en Bio/Technology, 1995, Vol. 13, páginas 53
a 57, mediante ejemplos de la conjugación de epítopos a
transportadores macromoleculares, o de Wagner y otros, 2005 J.
Immunol. 174:976-982.
Es preferente que el propio transportador tenga un
efecto inmune, lo que significa que el propio transportador es
inmunogénico.
El transportador se selecciona del grupo que comprende
péptidos inmunogénicos, secuencias de proteína de estimulación
inmune, tales como islas GPC, hemocianina de lapa (KLH), toxoide
tetánico (TT), subunidad B de la toxina del cólera (CTB), bacterias
o fantasmas bacterianos, liposomas, quitosomas, virosomas,
microsferas, células dendríticas, o similares.
En una realización preferente, cada péptido de la
presente invención se conjuga preferentemente con KLH, TT o CTB
como transportador mediante una reacción química.
En otra realización preferente, cada péptido de la
presente invención se conjuga preferentemente con un virosoma o con
bacterias ácido lácticas probióticas (LAB) o fantasmas bacterianos
como transportadores.
Los virosomas se basan en liposomas y contienen
proteínas virales embebidas en sus membranas. Estas proteínas
permiten que las membranas del virosoma se fusionen con células del
sistema inmune y, de este modo, liberen su contenido, la vacuna,
antígenos específicos, en este caso los péptidos de la presente
invención, directamente a sus dianas. Una vez los virosomas han
liberado los antígenos, los virosomas se degradan completamente
dentro de las células. El origen de los virosomas puede ser un
virus de la gripe.
Además, es preferente que la vacuna comprenda un
adyuvante. Los adyuvantes son substancias biológicas que aumentan
las respuestas inmunes humorales y/o celulares cuando se
suministran con un antígeno de vacuna, en este caso con los
péptidos de la presente invención. En la presente invención es
preferente que el adyuvante se utilice para una inmunización
sistémica.
Los adyuvantes se seleccionan del grupo que comprende,
por ejemplo, interleuquinas, toxinas bacterianas, paredes celulares
bacterianas o partículas de las mismas, partículas de lípidos,
hidróxido de aluminio, derivado del escualeno, monofosforil lípido
A, o similares.
Además, es preferente que la vacuna se pueda
administrar por vía oral o nasal. Sin embargo, la mayor parte de
los antígenos de proteína y/o péptido que incluyen los antígenos de
vacuna purificados son muy poco inmunogénicos cuando se administran
por vía oral y nasal. De este modo, es fundamental la
coadministración de adyuvantes mucosales para inducir respuestas
inmunes eficaces.
La ventaja de una vacuna mucosal se basa en una mayor
conformidad del paciente con la vacunación y una eficacia
potencialmente superior debido a la inducción de respuestas inmunes
tanto sistémicas como mucosales, siendo ésta también importante,
por ejemplo, para tumores situados en las mucosas.
Los adyuvantes mucosales se podrían seleccionar del
grupo que comprende toxina zonula occuldens, toxina termolábil (LT)
producida por E.coli enterotoxigénica, toxina colérica de Vibrio
cholerae (CTB) o de origen no bacteriano, por ejemplo, liposomas, o
similares.
Un adyuvante mucosal preferente es la subunidad B de la
toxina del cólera, bacterias ácido lácticas, fantasmas bacterianos
o mutantes de los mismos.
En la presente invención también es preferente que cada
uno de los péptidos de la presente invención se conjugue con el
adyuvante mucosal, es decir, cada uno de los péptidos de la
presente invención se acopla al adyuvante mucosal, por ejemplo,
mediante una reacción química y no sólo se mezcla con el adyuvante
mucosal. De este modo, el adyuvante mucosal actúa como
transportador de los péptidos.
En otra realización preferente de la presente invención
se utilizan bacterias ácido lácticas probióticas (LAB) como
transportadores mucosales, en particular, como sistemas de
liberación de antígeno mucosales. Se sabe que algunas bacterias
ácido lácticas (LAB) tienen propiedades promotoras de Th1 y se han
utilizado, por lo tanto, para la vacunación contra las enfermedades
alérgicas de Th-2 parcial (Repa y otros Vaccine 2002; Daniel y
otros 2006, Allergy).
En la presente invención se muestra que IL-12, que
promueve respuestas de Th1, aumenta la actividad antitumoral de la
vacuna a base de múltiples péptidos. Por lo tanto, es preferente
aplicar una bacteria ácido láctica determinada, que induce la
inducción de IL-12 y respuestas de Th-1, junto con la vacuna a base
de polipéptidos de la presente invención. Es de particular interés
utilizar estas bacterias como sistema de expresión para la
producción de los péptidos y también utilizarlas como sistema de
liberación mucosal. Por lo tanto, se puede crear una vacuna de
tumor oral/ mucosal.
En particular, en la presente invención se utilizan
preferentemente cepas de Lactobacillus plantarum o Lactococcus
lactis como transportadores mucosales.
La producción de dichos transportadores mucosales y la
producción de vacunas que incluyen dichos transportadores se
describen, por ejemplo, en Repa y otros, Vaccine, 2003, 22, páginas
87 a 95 o en Daniel y otros, Allergy, 2006.
Además, es preferente que se añada un adyuvante
inmunogénico adicional a la vacuna de la presente invención, más
preferentemente interleuquina 12 (IL-12) o un agonista de IL-12 o
una sustancia que estimula la producción de IL-12.
Además, la vacuna de la presente invención puede
comprender adicionalmente aditivos que se utilizan en general en
dicha aplicación como estabilizantes, antidegradantes, etc.
La vacuna de la presente invención se puede producir de
diversas formas mediante ingeniería genética o por medios químicos,
por ejemplo, un método de síntesis en fase sólida. Dichos métodos
se describen, por ejemplo, en el documento US 5.869.445.
Un ejemplo de un método de producción de ingeniería
genética es la manipulación de organismos, tales como E. coli o las
bacterias ácido lácticas mencionadas anteriormente. Éstas se
manipulan de modo que expresen los péptidos como tales o los
conjugados totales que comprenden el péptido y el transportador
acoplado al mismo.
La vacuna de la presente invención también se puede
aplicar de diferentes formas. La vacuna se puede administrar, por
ejemplo, por vía intramuscular, subcutánea, oral, intranasal o
generalmente mucosal, si la vacuna se encuentra en forma de cápsula
o pastilla o dispersada en comida, tal como yogur, si se utilizan
las bacterias ácido lácticas como transportadores de vacuna, o un
sistema de liberación específica. Si la vacuna contiene variantes
de ácidos nucleicos funcionales de los péptidos también se puede
administrar mediante un procedimiento ex-vivo, que incluye la
eliminación de células de un organismo, la inserción de la vacuna
de la presente invención en estas células y la colocación de las
células tratadas otra vez en el organismo.
La vacuna de la presente invención con o sin
coadministración de IL-12 se puede administrar al paciente según
cualquier programa de tratamiento.
Sin embargo, un tratamiento repetido con IL-12 en un
solo intervalo de tres semanas no mostró ningún efecto beneficioso
o perjudicial, tal como se ha dado a conocer para un tratamiento en
un intervalo de una semana (Boggio y otros, J. Exp. Med 1998; 188:
589-96). Por lo tanto, es preferente que se administren al paciente
tres péptidos de la presente invención 4 veces en intervalos de 14
a 21 días y además que un día después de la administración de los
tres péptidos se prosiga con la coaplicación de IL-12 o un agonista
de IL-12 o una formulación que induzca la producción de IL-12 en un
tratamiento de cinco días, en los que en los primeros dos días se
administra IL-12 en una concentración inferior a la de los últimos
tres días. Es preferente que la primera concentración de IL-12 sea
la mitad que la segunda.
La vacuna de la presente invención se puede utilizar
para el tratamiento profiláctico o agudo de mamíferos que pueden
desarrollar tipos de cáncer asociado al oncogén HER-2/neu o en
combinación con otras quimioterapias o para la prevención de la
metástasis que prosigue la intervención quirúrgica.
Figura 1: Diseño experimental: se inmunizaron repetidamente
ratones MMTV-c-neu (es decir, ratones transgénicos Her-2/neu,
que desarrollan de forma espontánea cáncer de mama) con A)
los conjugados de péptido HER-2/neu (15 µg cada uno) o solamente TT, B) la coadministración con IL-12 o C) con IL-12 solamente, en intervalos mensuales hasta el sacrificio. En un experimento separado se inmunizaron ratones BALB/c tal como se ha descrito para los ratones MMTV-c-neu y se sacrificaron 10 días después de la cuarta inmunización. Figura 2: Efectos inmunoprotectores de la vacunación específica de HER-2/neu sobre la formación de tumores y la progresión de tumores en ratones transgénicos MMTV-c-neu. Panel superior: Se analizó el tiempo de desarrollo de un tumor mediante el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier. Se vacunaron ratones (n = 8) con péptidos HER-2/neu conjugados a TT (0), péptidos HER-2/neu conjugados a TT y coaplicación de IL-12 (♦), TT solo (■), IL-12 sola (n=5, o) según el diseño experimental que se muestra en la figura 1. El grupo de control (•) permaneció sin tratar. Panel inferior: Progresión del tumor expresada en semanas hasta que el volumen cumulativo del tumor alcanzó 1000 mm3/ratón. *p<0,05. Figura 3: Se incubaron lisados de células SK-BR-3 con sueros de ratones inmunizados con adyuvante y TT como grupo de control (carril C), con un Ab monoclonal murino anti HER-2/neu humana como control positivo (carril mAb), con sueros de ratones inmunizados con péptidos conjugados P1 -P3, P5 e ID SEQ 1 a 3 (carriles 1-7, el carril 4 se refiere a ID SEQ 1, el carril 6 se refiere a ID SEQ 2 y el carril 7 a ID SEQ 3) o una combinación de P1+P2 (carril 1+2), P3+P5 (carril 3+5), e ID SEQ 2 + ID SEQ 3 (carril 6+7). Se detectó la Her
2/neu precipitada mediante Ab de conejo anti HER-2/neu humana
y Ab de cerdo anti conejo conjugado a AP.
Figura 4: Anticuerpos específicos de Her-2/neu medidos por
ELISA. Suero de péptidos = sueros de ratones inmunizados con
conjugado péptido/tétanos; suero de control = sueros de
ratones inmunizados con toxoide tetánico.
Figura 5: Inmunización de los ratones con el conjugado de
péptido de ID SEQ 1 y CTB (P4 se refiere a ID SEQ 1) o una
mezcla de ID SEQ 1 y CTB (figura 5a); la dilución del suero
fue para IgG1 1:10.000, para IgG2a e IgG2b 1:2.000 (figura 5
b); IgA en lavados broncoalveolares (1:1) (figura 5c).
Figura 6: Inhibición de células SK-BR-3 con IgG anti ID SEQ 2
y 3 (denominadas P6 y P7) y anti ID SEQ 1 (denominada P4) y
anti TT con una concentración de 150 µg/ml, Trastuzumab (Herceptin) con una concentración de 50 µg/ml.
Figura 7: Inhibición de células SK-BR-3 con IgG anti ID SEQ 1 y 2 y 3 (denominadas P4, P6 y P7) y anti TT con una concentración de 75 µg/ml Trastuzumab (Herceptin) con una concentración de 50 µg/ml.
Figura 8: Ensayo de proliferación de [3H]-timidina que
demuestra el efecto de inhibición de una forma dependiente de
la dosis de la IgG de conejo sobre el crecimiento de células
SK-BR-3. Los datos se expresan en porcentaje de inhibición;
los valores cpm de los pocillos sin tratar se consideraron el
100%.
Figura 9: Producción de citoquinas por células esplénicas
después de la estimulación in vitro con TT. Se inmunizaron
ratones BALB/c (n=5 por grupo) con péptidos conjugados a TT
con o sin la coadministración sistémica de IL-12 o con TT
solo. Se cultivaron esplenocitos con TT y se calcularon las
concentraciones de citoquina en los sobrenadantes mediante
ELISA. A: niveles de IFN-γ; B: niveles de IL-4; C: proporción IFN-γ /IL-4. El asterisco indica p<0,05 (Prueba Turkey-Kramer). Método y ejemplos Ratones Los ratones transgénicos FVB/N hembras utilizados para el oncogén c-neu de rata activado (MMTV-c-neu, 5-9 semanas de vida) y los ratones BALB/c (8 semanas de vida) se compraron a Charles
River (Sulzfeld, Alemania). La sobreexpresión del oncogén c-neu se llevó a cabo mediante un promotor de virus de tumor mamario de ratón (MMTV) y estos ratones transgénicos para el oncogén c-neu de rata activado desarrollan de forma espontánea tumores mamarios a la edad de ~30 semanas de vida. Las glándulas mamarias se inspeccionaron semanalmente para observar la aparición y progresión de los tumores. Tumores
Los tumores se midieron con un calibre y se calculó el
volumen según: x2 x y/2, en la que x e y representan las
dimensiones corta y larga del tumor. El volumen tumoral total por
ratón se calculó añadiendo todos los volúmenes de tumores. Las
masas de crecimiento progresivo de >3mm x 3mm se consideraron
tumores. Los ratones se sacrificaron por motivos éticos en el
momento en el que se superó el volumen tumoral total de 2.000 mm3.
Los tumores se extirparon y se almacenaron a -80oC.
Todos los experimentos fueron autorizados por el Comité
de Experimentación Animal de la Universidad de Medicina de Viena y
el Ministerio de Educación, Ciencia y Cultura de Austria.
Antígenos
Se realizó un barrido de la secuencia de proteína del
dominio extracelular (ECD) de HER-2/neu humana mediante predicción
asistida por ordenador para buscar epítopos inmunogénicos en base a
la hidrofilicidad, accesibilidad, flexibilidad, distribución de las
cargas o propensiones hacia estructura secundaria. A continuación
se sintetizaron siete péptidos, de 14 a 21 aminoácidos de longitud,
con un residuo de cisteína C-terminal adicional, química de N-alfafluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) de PiChem (Austria).
Tabla 1: Péptidos ensayados
- Péptido
- Secuencia Aminoácidos
- P1
- 115-132 AVLDNGDPLNNTTPVTGA
- P2
- 149-162 LKGGVLIQRNPQLC
- P3
- 274-295 YNTDTFESMPNPEGRYTFGAS
- ID SEQ 1
- 378-394 PESFDGDPASNTAPLQP
- P5
- 489-504 PHQALLHTANRPEDE
- ID SEQ 2
- 545-560 RVLQGLPREYVNARHC
- ID SEQ 3
- 610-623 YMPIWKFPDEEGAC
Además, para los experimentos se sintetizó el péptido
ID SEQ 1 (PESFDGDPASNTAPLQP) con un enlazador de glicina adicional
y un residuo de cisteína C-terminal, en particular con el enlazador
GGGGGC.
Conjugación de péptidos
Los péptidos se acoplaron a las proteínas
transportadoras toxoide tetánico (TT) o hemocianina de lapa (KLH) o
a la subunidad B de la toxina del cólera (tal como la que se
incluye en la vacuna del cólera Dukoral®) utilizando el reactivo
entrecruzador heterobifunctional m-maleimidobenzoil-Nhidroxisuccinimida (MBS) [Pierce, Rockford, IL]. Los
transportadores en la vacuna mucosal están acoplados a los péptidos
según Wagner S y otros 2005; J. Immunol 174:976-982. Los grupos
amino de las proteínas transportadoras se activaron en primer lugar
mediante la adición de un exceso molar de 25 veces de MBS durante
30 minutos a temperatura ambiente. Se eliminó el exceso de MBS
mediante una columna de desalinización (columna PD-10 de Amersham
Bioscience, Little Chalfont, UK). En una segunda etapa se añadieron
los péptidos en una proporción molar de 40:1 péptido respecto a
proteína transportadora. Se produjo entrecruzamiento en los
residuos de cisteína de los péptidos a las 3 horas a temperatura
ambiente. Los péptidos no enlazados se eliminaron mediante diálisis
contra PBS.
Vacunación
- 1.
- Se inmunizaron ratones Balb/c (n=5/grupo) con tres péptidos de la presente invención. Estos péptidos se inyectaron individualmente (25 µg/ratón) o en una combinación de tres péptidos (30 µg /ratón). Previamente a la inyección los conjugados de péptidos se mezclaron con adyuvante de Gerbu (Gerbu Technik, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se administraron por vía
subcutánea en un volumen de 100 µl. El grupo de control recibió los transportadores y adyuvantes utilizados solos. Las inmunizaciones se llevaron a cabo 4 veces en intervalos de 21 días. Siete días después de la última inmunización los animales se sacrificaron. Se tomaron muestras de sangre de los ratones mediante el sangrado de la cola antes de la inmunización y siete días después de la última inmunización.
- 2.
- Se inmunizaron ratones BALB/c (n=5/grupo) y ratones MMTV- c-neu transgénicos (n=8/grupo) con la combinación de los tres péptidos de la presente invención acoplados a toxoide
tetánico (conjugados TT) utilizando 15 µg de cada conjugado
de péptido. Los grupos de control recibieron TT o IL-12 solos
o se dejaron sin inmunizar. Previamente a la inyección, los
antígenos se mezclaron con adyuvante de Gerbu (Gerbu Technik,
Gaiberg, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del
fabricante y se administraron por vía subcutánea en un
volumen de 100 µl. A un ratón recombinante se le administró IL-12 (Strathmann Biotec, Hamburg, Alemania), reconstituida en PBS que contenía el 0,01% albúmina de suero de ratón (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), por vía intraperitoneal en un volumen de 100 µl. Durante los primeros dos tratamientos de cinco días se dieron un total de 50 ng de inyecciones de IL12, seguidos de 100 ng de inyecciones de IL-12 en las inmunizaciones posteriores. Las inmunizaciones y los tratamientos con IL-12 se llevaron a cabo de acuerdo con el programa que se muestra en la figura 1. Las muestras de sangre se recogieron mediante el sangrado de la cola previamente a la inmunización y durante el sacrificio. Los ratones BALB/c se sacrificaron diez días después de la cuarta inmunización. Los ratones MMTV-c-neu se inmunizaron repetidamente en intervalos de un mes hasta el sacrificio.
3. Se inmunizaron conejos con la vacuna a base de múltiples
péptidos o toxoide tetánico y posteriormente se recogió
sangre mediante punción de una vena de la oreja previamente a
la inmunización y después de la misma. Se llevaron a cabo
inmunizaciones con la mezcla de los péptidos en conejos en
los laboratorios de Charles River (Kissleg, Alemania). Según
el programa que se llevó a cabo en los ratones las
inmunizaciones se realizaron 4 veces en intervalos de 14-21
días. Las muestras de sangre se utilizaron para los ensayos
in vitro.
Se extirparon los bazos, corazones, hígados, riñones y
pulmones de los ratones para su análisis histopatológico.
Vacunación y desarrollo de los tumores
Se investigó la capacidad de la vacuna de la presente
invención y el efecto de la coaplicación de IL-12 para retrasar el
desarrollo de tumores espontáneo y la progresión de los tumores en
ratones transgénicos MMTV-c-neu FVB/N que expresaban una forma
activada de c-neu de rata que daba como resultado un desarrollo de
tumores rápido. El programa de la inmunización se empezó con
ratones de 6-10 semanas de vida según el diseño experimental que se
muestra en la figura 1 con péptidos Her-2/neu acoplados combinados
con el tratamiento sistémico con IL-12 o sin el mismo. Los ratones
se inmunizaron mensualmente hasta el sacrificio. Se monitorizaron
las glándulas mamarias semanalmente para controlar el número y
tamaño de los tumores.
Los primeros tumores se observaron en los ratones no
tratados y de control que recibieron IL-12 sola a la edad de 22-26
semanas. A las ocho semanas (30-34 semanas de edad) todos los
ratones de estos grupos desarrollaron tumores mientras que se
observó un retraso significativo (p<0,05) en la aparición de
tumores en los grupos vacunados (figura 2A): en el 37,5% (3/8) de
los ratones inmunizados con péptidos y en el 57,1% (4/7) de los
ratones inmunizados con el péptido + IL-12 el intervalo sin tumores
se prolongó hasta 56 días. Por el contrario, en el grupo que
recibió la proteína transportadora TT sola solamente un ratón
permaneció sin tumores durante este periodo de tiempo.
La monitorización de los volúmenes de los tumores
reveló una progresión de los tumores rápida en controles no
inmunizados. Por el contrario, los grupos vacunados con péptidos se
caracterizaron por una progresión más lenta de tumores aparecidos
en una etapa anterior. Tal como se indica en la figura 2B, los
controles no inmunizados alcanzaron un volumen total de tumor de
1.000 mm3 a las 21,5 semanas después de la primera inmunización.
Este periodo se superó para los ratones inmunizados con péptidos
hasta 6,5 semanas (27 semanas después de la primera inmunización;
p=0,08). En ratones tratados con la vacuna de péptidos
coadministrada con IL-12 el periodo de tiempo hasta un volumen de
tumor de 1.000 mm3 se prolongó de forma significativa (p<0,05)
hasta 8,5 semanas (29 semanas después de la primera inmunización)
en comparación con los ratones de control. No se observó una
reducción significativa en la progresión de tumores en el grupo de
ratones que recibieron IL-12 o TT solos, alcanzando los volúmenes
de tumor de 1.000 mm3 a las 23 o 25 semanas después de la primera
inmunización, respectivamente.
Líneas celulares
Se compraron las líneas celulares de cáncer de mama
humanas SK-BR-3 (HTB 30) y HTB 132 a ATCC (Manassas, Virginia,
USA). Las líneas celulares de melanoma humanas 518.A2 fueron
suministradas gentilmente por B. Jansen (Departamento de
Dermatología, Universidad de Viena, Austria). La línea celular
murina de tumor mamario Tg1-1 fue suministrada gentilmente por T.J.
Kipps (División de Hematología/Oncología, Universidad de
California, Escuela de medicina de San Diego School, CA). Las
células se cultivaron en un medio que contenía el 10% de suero
bovino fetal (PAA Laboratories, Linz, Austria), 50 unidades/ml de
penicilina y 50 µg/ml de estreptomicina (GIBCO, Life Technologies LTD, Paisley, Escocia, UK) en una atmósfera humidificada que contenía el 5% de CO2. Las células SK-BR-3 se mantuvieron en medio McCoy 5A, las células 518.A2 y Tg1-1 en medio DMEM. Las células HTB 132 se mantuvieron en medio Leibovitz L-15 y condiciones exentas de CO2. Todos los medios se compraron a GIBCO, Life Technologies LTD, Paisley, Escocia, UK. Preparación de lisados de células
Se utilizó la línea celular humana de cáncer de mama
SK-BR-3 como fuente de proteína Her-2/neu. Para la lisis de las
células se utilizó solución salina tamponada con Tris (TBS, pH 7,4)
que contenía el 1% de Triton X-100 y cóctel inhibidor de la
proteasa 1 x EDTA completo libre (“1 x Complete EDTA free protease
inhibitor mix”) (Roche, Mannheim, Alemania). Se suspendieron
aproximadamente 30 x 106 células SK-BR-3 en un ml de tampón de
lisis, se agitó intensamente en vórtex y se incubaron sobre hielo
durante 15 minutos. Después de la ruptura, las muestras se
centrifugaron durante 10 min a 800 g a temperatura ambiente. Los
sobrenadantes se eliminaron de los restos celulares y se
almacenaron a -80oC hasta su utilización. Antes de su utilización
los lisados de células se diluyeron 1:3 con TBS 0,1 M pH 7,4 y se
filtraron a través de un filtro de 0,45 µm. Inmunoprecipitación
Se incubaron alícuotas de lisado de células que contenían 3,5 mg de proteína con 40 µl de suero de ratones
almacenado o 1 µg de anticuerpo monoclonal anti-c-erbB-2 (Zymed, San Francisco, CA) y 20 µl de proteína A+G agarosa (Oncogene, Uniondale, NY) y se incubaron durante toda la noche a 4oC. Los inmunoprecipitados se dejaron sedimentar y se lavaron dos veces en TBS 0,1 M y en el mismo tampón que contenía el 0,5% de Nonidet P40.
- A
- continuación, las proteínas inmunoprecipitadas se separaron
- mediante
- una SDS-PAGE 6% y se analizaron mediante transferencia
- Western.
Análisis por transferencia Western
Los precipitados se separaron sobre geles SDS-PAGE 6% y
se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Schleicher &
Schuell, Dassel, Alemania). Las transferencias Western se llevaron
a cabo utilizando Na2HPO4 40 mM, NaH2PO4 7 mM, 1% de leche en polvo,
0,05% p/v de azida sódica, 0,5% p/v de Tween-20, pH 7,5 para el
bloqueo, lavado y diluciones de los anticuerpos. Para la detección
del Her-2/neu precipitado se incubaron membranas con anticuerpos de
conejo anti-Her-2/neu humano (diluidos 1:100; Zymed, San Francisco,
CA, USA). Se detectó la Ig de conejo enlazada mediante anticuerpo
de cerdo anti-conejo marcado con fosfatasa alcalina (diluido 1:500;
DAKO A/S, Dinamarca). El sustrato fosfato de 5-bromo-4-cloro-3indolilo/nitroazul de tetrazolio se convirtió in situ en un
compuesto azul denso mediante la fosfatasa alcalina
inmunolocalizada.
Se pudo demostrar que sólo los tres péptidos de la
presente invención tienen la capacidad de inducir respuestas
inmunes específicas anti-her-2/neu (véase figura 3).
Preparaciones microsomales
Las células se rompieron en un tampón de lisis (fosfato
de Na 50 mM pH 7,4, EDTA 2 mM, sacarosa 250 mM, cóctel inhibidor de
proteasa 1 X Completo (“1 X Complete protease inhibitor mix”)
(Roche, Mannheim, Alemania) utilizando un homogenizador de tejido
dounce (“dounce tissue grindler”). Los núcleos sin romper se
separaron mediante centrifugación a 1.000 x g. A continuación, los
sobrenadantes se centrifugaron a 32.000 g durante 1 hora a 4oC. Los
sedimentos se solubilizaron en un tampón que contenía fosfato de Na
100 mM pH 7,4, NaCl 500 mM, EDTA 2 mM y 1% de Triton X-100. Se
estimó el contenido en proteína utilizando un ensayo DC (Bio-Rad
Laboratories, Hercules, CA) de acuerdo con las instrucciones del
fabricante. Las muestras se almacenaron a 4oC hasta su utilización.
ELISA
a) Respuestas de Ab específicos de péptido
Se recubrieron placas de microtitulación de 96 pocillos (Nunc-Immuno Plate, Nalge Nunc International, Dinamarca) con 5 µg/ml de péptidos conjugados a KLH o 5 µg/ml de KLH en tampón carbonato 100 mM, pH 9,6 durante toda la noche a 4oC. Los sitios de unión no específica se bloquearon durante 4 horas con PBS que contenía el 3% de leche en polvo. Los sueros de ratones inmunizados con conjugados péptido-TT se diluyeron 1:100 en PBS-tw (0,05% v/v
Tween 20) que contenía el 0,5% de leche en polvo, se añadieron a
las placas recubiertas con antígeno y se incubaron durante toda la
noche a 4oC. Los sueros de los ratones inmunizados con conjugados
péptido-TT e IL-12 como adyuvante adicional se diluyeron 1:200
1:4.000 para la medición de IgG2a específica y 1:8.000-1:100.000
para IgG1 específica.
Las titulaciones de anticuerpos en sueros de ratones
inmunizados i.n. con conjugados péptidoS-CTB se midieron tal como
se ha descrito anteriormente. Las IgG1 se detectaron en sueros
diluidos 1:10.000 y las IgG2a a una dilución 1:2.000. Se añadió
IgG2a o IgG1 de rata anti-ratón (Pharmingen, San Diego, CA, USA)
diluida 1:500 en PBS-tw que contenía el 0,5% de leche en polvo a
las placas. Se detectó la Ig de rata unida con anticuerpos
conjugados de ratón anti-HRP de rata (Jackson Immunolab, West
Grove, Pa, USA), diluidos 1:2.000 en PBS-tw que contenía el 0,5% de
leche en polvo. El desarrollo de color se llevó a cabo con sustrato
TMB (R&D Systems, MN, USA), la reacción se paró con H2SO4 0,1 M, y
se midió la densidad óptica a 450 nm (630 nm como longitud de onda
de referencia).
b) Respuestas de Ab específicos de Her-2/neu
Se llevó a cabo el recubrimiento con 5 µg/ml de mAB Trastuzumab y el bloqueo de los sitios de unión no específicos tal como se ha descrito anteriormente. A continuación, se incubaron
placas de 96 pocillos con 50 µg/pocillo de una preparación microsomal de células SK-BR-3 o HTB 132 diluidas en PBS que contenía el 0,5% de Triton X-100 durante 2 horas a temperatura ambiente. Después del lavado y el bloqueo las placas se incubaron durante toda la noche a 4oC con antisueros de ratón diluidos 1:250 en PBS. Se detectó la Ig enlazada con Ig de oveja anti-ratón marcada con HRP diluida 1:500 en PBS (Amersham Life Science, Buckinghamshire, Inglaterra). El desarrollo de color se llevó a cabo tal como se ha descrito. Se presentan los valores de la DO de cada muestra después de restar los valores de control.
La vacuna de la presente invención induce una respuesta
de anticuerpo significativa hacia la HER-2/neu humana a diferencia
del suero de control (sueros de ratones inmunizados con toxoide
tetánico) (figura 4). Después de la inmunización con la vacuna de
la presente invención e IL-12 se observó una tendencia hacia
niveles aumentados de anticuerpos de estos isotipos.
También la aplicación mucosal de los conjugados
péptido/CTB condujo a la inducción de respuestas de anticuerpos
específicas. Se indujeron tanto anticuerpos IgG1 como IgG2a. Se
pudo demostrar que el sistema de administración mucosal tiene la
capacidad de inducir respuestas inmunes del tipo Th1. Los datos
muestran que los adyuvantes mucosales, tales como CTB, pueden
inducir respuestas inmunes sistémicas de Th1 parcial y también IgA
local. Los efectos sólo se consiguen si los péptidos están
conjugados a CTB y no sólo mezclados con el adyuvante mucosal
(figura 5 a hasta c).
Ensayo de proliferación celular
Se sembraron células tumorales en placas de microtitulación de 96 pocillos (Costar, Coming, NY) a una densidad óptima para el crecimiento lineal: 1 x 104 células/pocillo para células SK-BR-3 y 5 x 103/pocillo para células 518A2. Se dejaron adherir las células durante toda la noche a 37oC. Se añadió la IgG total aislada de sueros de ratones y conejos inmunizados con conjugados de péptido Her-2/neu simples (figura 6) o mezclados (fig. 7, 8) o TT a una concentración de 150 µg /ml (figura 6) o a concentraciones crecientes (0, 18,75, 37,5, 75 µg /ml) (figuras 7, 8) y Trastuzumab, un mAb IgG1 anti-Her-2/neu humanizado comprado a Roche (Hertfordshire, UK), a una concentración de 50 µg/ml. Las células se incubaron durante 72 horas a 37oC, a continuación se pulsaron durante 16 horas a 37oC con 0,5 µCi de [3H]timidina/pocillo (Perkin Elmer Life Sciences, Boston, MA) y posteriormente se recolectaron. Se midió la [3H]-timidina incorporada en un contador 1205 Betaplate Liquid Scintillation Counter (Wallac Oy, Turku, Finlandia). Se calculó el porcentaje de inhibición de la proliferación comparando los valores cpm de las células tratadas con los de las células no tratadas, que se consideraron el 100%.
La figura 6 muestra que los anticuerpos inducidos
después de la inmunización con 2 péptidos (ID SEQ 2 y 3) o
solamente con 1 péptido (ID SEQ 1) pueden inducir una reducción del
20% del crecimiento de células tumorales in vitro; en comparación,
el Trastuzumab, conduce a un 40% de inhibición del crecimiento
tumoral in vitro.
La figura 7 muestra que los anticuerpos obtenidos de la
inmunización con una mezcla de los tres péptidos de la presente
invención induce una inhibición superior al 60% del crecimiento de
tumores, que es incluso superior a la inducida por el ab monoclonal
Trastuzumab. Estos datos muestran que la combinación de los tres
péptidos supone una gran ventaja para la efectividad de la vacuna
de péptidos y es superior a la inmunización con péptidos simples o
combinaciones de sólo dos péptidos.
Además, se pudo demostrar que la proliferación de las
células SK-BR-3 que expresaban niveles elevados de HER-2/neu se
inhibió de una forma dependiente de dosis mediante los anticuerpos
específicos de péptido oscilando entre el 39% y el 66 % a una
respuesta de anticuerpo de 18,75 µg/ml a 75 µg/ml, respectivamente (figura 8). Citometría de flujo
Se recogieron las células Tgl-1 de matraces de cultivo
y se lavaron en un tampón de tinción que comprendía HBSS (GIBCO,
Life Technologies LTD) y el 5% de FCS termoinactivado. Se incubaron
5 x 106 células con 50 µl de sueros inmunes almacenados diluidos
1:5 en el tampón de tinción o con 10 µg del anticuerpo monoclonal anti-c-erbB-2 (NeoMarkers, Fremont, CA) en el mismo tampón. Después de la incubación las células se lavaron con el tampón de tinción y se tiñeron con anticuerpos anti-ratón bovinos conjugados con FITC (Santa Cruz, CA, USA) diluidos 1:100 en el mismo tampón. Todas las incubaciones se llevaron a cabo sobre hielo durante 45 minutos. Después del lavado final las células se resuspendieron en HBSS/FCS 0,5%. Se midió la fluorescencia mediante un FACScan (Becton Dickinson). Se determinaron la intensidad media de fluorescencia del canal y el porcentaje de células positivas utilizando el software CellQuestTM Pro.
Los análisis de FACS revelaron que los sueros de
ratones inmunizados con la vacuna de la presente invención con o
sin IL-12 fueron capaces de unirse a las células Tgl-1 que
expresaban c-neu, de forma similar a la del Ab de control
monoclonal dirigido tanto contra HER-2/neu humana como de rata.
Utilizando una reserva de sueros de ratones inmunizados con TT
también se observó una tinción débil de las células mientras que no
se detectó unión a Tg1-1 con anticuerpo IgG anti-ratón conjugado a
FITC (no se muestran los datos).
La especificidad por c-neu de los anticuerpos inducidos
se probó adicionalmente por la capacidad de inmunoprecipitar la
proteína c-neu de los lisados de tumores. Por el contrario, los
sueros de control obtenidos de los ratones vírgenes y de ratones
inmunizados con TT no mostró reactividad con c-neu (no se muestran
los datos).
Medición de la liberación de citoquina in vitro
Se llevó a cabo un experimento separado en ratones BALB para estudiar la producción de citoquina in vitro: se extirparon los bazos en condiciones estériles y se prepararon tal como se conoce en la técnica. Brevemente, los bazos se homogenizaron y los esplenocitos se estimularon con la vacuna de péptidos de la presente invención a una concentración de 25 µg/pocillo o con TT a una concentración de 5 µg/pocillo. Los pocillos de control se cultivaron sólo con medio. Se recogieron los sobrenadantes después de 46 horas y se mantuvieron congelados hasta su análisis. Se midieron los niveles de IFN-γ mediante ELISA (no se muestran). Se midieron los niveles de IL-2 e IL-4 con kits ELISA de ratón comerciales (Endogen, Woburn, MA, USA).
Dado que se midieron cantidades significativas de IFN-g
en los cultivos de células esplénicas de ratones inmunizados con
péptidos + IL-12, se pudo demostrar que IL-12 induce la producción
de INF-gamma y tiene un papel central en la mejora de la vacuna de
múltiples epítopos (figura 9).
Análisis estadístico
Se realizaron comparaciones de intervalos sin tumores
para todos los grupos mediante una generalización de la prueba de
Gehan Wilcoxon. Se analizaron las diferencias de los grupos en el
tiempo hasta un volumen de tumor de 1.000 mm3 mediante pruebas
Kruskal-Wallis. Se llevaron a cabo comparaciones post hoc para
todas las parejas de grupos aplicando pruebas Tukey-Kramer. Se
aplicó el mismo procedimiento para las citoquinas. Un valor de p
por debajo de 0,05 se consideró significativo.
En resumen, se pudo demostrar que la vacuna de la
presente invención, es decir, la vacuna de múltiples epítopos, es
eficaz en la prevención de tumores que sobreexpresan c-neu in vivo
y que este efecto se podía incrementar mediante la coadministración
de IL-12. La inducción de una fuerte inmunidad mediante la vacuna
de la presente invención conduce al establecimiento de una memoria
inmunológica, evitando potencialmente la reaparición del tumor.
Mediante la extrapolación de los presentes resultados se espera una
inmunización activa con una vacuna de múltiples epítopos de este
tipo, una eficacia profiláctica pero también una buena eficacia
terapéutica contra enfermedades mínimas de tumores de rápido
crecimiento o resistentes a los fármacos. Además, la presente
vacuna se podría administrar como una vacuna mucosal sin perder su
elevada actividad de inmunización, la cual es una forma atractiva
de vacuna para todos los tumores localizados en las superficies
mucosales.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Bio Life Science Forschungs-und Entwicklungsges.m.b.H.
<120> Vacuna HER-2/neu a base de múltiples péptidos
<130> K 52 448
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<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 17
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<223> Péptido HER-2/neu
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Claims (12)
- REIVINDICACIONES
- 1.
- Vacuna contra enfermedades cancerosas asociadas con el oncogén HER-2/neu, en la que dicha vacuna comprende una mezcla, como mínimo, de tres péptidos diferentes que tienen una longitud de 9 a 30 aminoácidos y cada secuencia se encuentra en el dominio extracelular de la proteína HER-2/neu, en la que, como mínimo, un péptido tiene la secuencia 378 a 394 del dominio extracelular de la proteína HER-2/neu, como mínimo, otro tiene la secuencia 545 a 560 del dominio extracelular de la proteína HER-2/neu y, como mínimo, otro péptido tiene la secuencia 610 a 623 del dominio extracelular de la proteína HER-2/neu y en la que cada uno de los péptidos está conjugado a un transportador.
-
- 2.
- Vacuna contra enfermedades cancerosas asociadas con el oncogén HER-2/neu, según la reivindicación 1, en la que, como mínimo, un péptido que tiene la secuencia 378 a 394 del dominio extracelular de la proteína HER-2/neu está acoplado a un enlazador de glicina adicional y/o a un residuo de cisteína C-terminal.
-
- 3.
- Vacuna contra enfermedades cancerosas asociadas con el oncogén HER-2/neu, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que cada péptido está conjugado a un transportador de forma simple o múltiple.
-
- 4.
- Vacuna contra enfermedades cancerosas asociadas con el oncogén HER-2/neu, según la reivindicación 3, en la que el transportador es inmunogénico.
-
- 5.
- Vacuna contra enfermedades cancerosas asociadas con el oncogén HER-2/neu, según las reivindicaciones 3 ó 4, en la que el transportador se selecciona del grupo que comprende hemocianina de lapa (KLH), toxoide tetánico (TT), la subunidad B de la toxina del cólera (CT, CTB), toxina termolábil (LT) o mutantes o la subunidad B (LTB) de E. coli, fantasmas bacterianos, liposomas, quitosomas, virosomas o células dendríticas.
-
- 6.
- Vacuna contra enfermedades cancerosas asociadas con el oncogén HER-2/neu, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la vacuna comprende un adyuvante.
-
- 7.
- Vacuna contra enfermedades cancerosas asociadas con el oncogén HER-2/neu, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la vacuna comprende un adyuvante mucosal.
-
- 8.
- Vacuna contra enfermedades cancerosas asociadas con el oncogén HER-2/neu, según la reivindicación 7, en la que el
adyuvante mucosal es la subunidad B de la toxina del cólera (CTB), una bacteria ácido láctica o un mutante de la misma. -
- 9.
- Vacuna contra enfermedades cancerosas asociadas con el oncogén HER-2/neu, según las reivindicaciones 7 u 8, en la que el adyuvante mucosal se utiliza como transportador.
-
- 10.
- Vacuna contra enfermedades cancerosas asociadas con el oncogén HER-2/neu, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el transportador mucosal es una bacteria ácido láctica probiótica con una capacidad promotora de IL-12/ activadora de Th1 para su aplicación oral/mucosal.
-
- 11.
- Vacuna contra enfermedades cancerosas asociadas con el oncogén HER-2/neu, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la vacuna además comprende interleuquina 12 o un agonista de IL-12 o una sustancia que promueve la producción de IL-12.
-
- 12.
- Utilización de la vacuna, según las reivindicaciones 1 a 11, para la preparación de un medicamento para su administración a un mamífero, a efectos de mantener su respuesta biológica en el tratamiento de las enfermedades cancerosas asociadas con el oncogén HER-2/neu, en la que el patrón de administración de la medicación comprende las etapas de:
- a.
- administración de dicha vacuna 4 veces en intervalos de 14 a 21 días y
- b.
- administración/coadministración posterior de interleuquina 12 o un agonista de IL-12 o una sustancia que promueve la producción de IL-12 en un tratamiento de cinco días, en la que IL-12 se administra en dos concentraciones diferentes.
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