ES2904533T3 - Compuesto antigangliósido para dirigirlo contra el cáncer y generar anticuerpos - Google Patents
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Abstract
Multímero de hidrato de carbono de gangliósido que comprende 4 gangliósidos de hidrato de carbono enlazados covalentemente a una molécula central de PAMAM, en el que uno o más de dichos hidratos de carbono de gangliósido es un hidrato de carbono de gangliósido de fórmula **(Ver fórmula)** o **(Ver fórmula)**
Description
DESCRIPCIÓN
Compuesto antigangliósido para dirigirlo contra el cáncer y generar anticuerpos
Campo técnico
La presente descripción se refiere a glicoconjugados de gangliósidos y su uso como vacunas antitumorales. Antecedentes de la técnica
Los gangliósidos son glucoesfingolípidos que contienen ácido neuramínico que se acumulan en la valva exterior de las membranas plasmáticas. Los gangliósidos, tales como GD2 y GD3, son marcadores tumorales prevalentes. Se expresan en neuroblastoma, melanoma, cáncer de pulmón microcítico, y gliomas (Hakomori, 1996, Cancer Research, 56: 5309), así como las células madre del cáncer de mama (Battula et al., 2012, The Journal of clinical investigations, 122: 2066), pero están ausentes en las células normales. Por lo tanto, GD2 y GD3 se han explotado como dianas tumorales, y son dianas clínicas validadas. La terapia parcial se puede lograr mediante la administración pasiva de anticuerpos monoclonales (mAbs) purificados anti-GD2 (Cheung et al., 1987, J Clin Oncol, 5: 1430) o anti-GD3 (Houghton et al., 1985, Proc Natl Acad Sci USA, 82: 1242). Sin embargo, la inmunidad pasiva tiene un alto coste financiero, efectos secundarios significativos, una frecuencia limitada de intervención, y una baja eficacia terapéutica (Navid et al., 2010, Current Cancer Drug Targets, 10: 200).
Como alternativa, muchos grupos han buscado gangliósidos de inmunoterapia activos (Astronomo y Burton, 2010, Nat Rev Drug Discov, 9: 308). Sin embargo, las serias dificultades asociadas con los gangliósidos incluyen inmunogenicidad deficiente, escasa solubilidad y malas formulaciones, acceso limitado y dificultad para preparar inmunógenos bien caracterizados y homogéneos, y el potencial de una selectividad deficiente con el riesgo de reactividad cruzada con gangliósidos no tumorales que están muy relacionados en estructura.
Por ejemplo, una lactona de GD2 conjugada químicamente con hemocianina de lapa californiana (KLH) es inmunogénica, y puede inducir anticuerpos que retrasan el crecimiento tumoral en ratones (Chapman et al., 2000, Clinical Cancer Research, 6: 4658). Los anticuerpos inducidos por esta vacuna actúan a través de un mecanismo de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) (Kim et al., 2011, Cancer Immunology, Immunotherapy, 60: 621). Sin embargo, la conjugación KLH-gangliósido produce productos químicamente heterogéneos (Danieshefsky y Allen, 2000, Angew Chem Int Ed, 39: 836), lo que constituye un grave inconveniente. Otros conjugados de gangliósidos han mostrado poca inmunogenicidad, y generalmente provocaron una respuesta de anticuerpos anti gangliósido baja y transitoria (Ragupathi et al., 2000, International Journal of Cancer, 85: 659). Incluso el gangliósido más inmunogénico, una vacuna GM2-KLH no proporcionó beneficios clínicos (Kirkwood et al., 2001, Journal of Clinical Oncology, 19: 2370), y se suspendió. Los enfoques experimentales adicionales incluyen mimotopos de GD2-péptido (Wondimu et al., 2008, Cancer Immunology, Immunotherapy, 57: 1079), péptidos que imitan a GD2 (Bolesta et al., 2005, Cancer Research, 65: 3410), y vacunas de ADN de mimotopo de GD2 (Zeytin et al., 2000, Cancer Gene Therapy, 7: 1426) que puede inducir inmunidad de reacción cruzada a GD2. Sin embargo, las respuestas inmunes no fueron muy efectivas para proteger al hospedante en paradigmas de terapia tumoral (Bleeke et al., 2009, European Journal of Cancer, 45: 2915). Thompson et al, Glycoconjugate Journal 14(7):837-45 (1997) divulgaaminofenil-GM1 y un tetrámero de GM1-PITC, y el uso de este último para la inhibición de toxinas bacterianas. El documento WO 2004/041310 divulga, entre otros, un multímero que comprende antígenos de hidratos de carbono asociados a tumores, unidos a un núcleo de PAMAM.
De este modo, todavía existe la necesidad de proporcionar un nuevo enfoque terapéutico que utilice gangliósidos como dianas.
Sumario
Según un aspecto, se proporciona un multímero de hidratos de carbono de gangliósido que comprende 4 gangliósidos de hidratos de carbono enlazados covalentemente a una molécula central de PAm A m , en el que uno o más de dichos hidratos de carbono de gangliósido es un hidrato de carbono de gangliósido de fórmula
o
En algunas formas de realización, el multímero de hidrato de carbono de gangliósido tiene la siguiente fórmula
en la que Ph es fenilo; X es O o S, y G es
El multímero de hidrato de carbono de gangliósido proporcionado en la presente memoria es inmunogénico contra tumores.
En ciertos aspectos, se proporciona en la presente memoria un multímero de hidrato de carbono de gangliósido como se describe en la presente memoria para uso como medicamento.
En ciertos aspectos, se proporciona en la presente memoria un multímero de hidrato de carbono de gangliósido como se describe en la presente memoria para uso en la prevención o el tratamiento de cáncer en un paciente que lo necesita.
En ciertos aspectos, se proporciona en la presente memoria un multímero de hidrato de carbono de gangliósido como se describe en la presente memoria para uso en la prevención o el tratamiento de un cáncer positivo a gangliósido.
En ciertos aspectos, se proporciona en la presente memoria una vacuna que comprende un multímero de hidrato de carbono de gangliósido como se describe en la presente memoria, y un portador.
Breve descripción de los dibujos
Ahora se hará referencia a los dibujos adjuntos, en los que:
la figura 1A ilustra la estructura de los gangliósidos GM1, GD3 y GD2; la figura 1B ilustra un esquema para la síntesis de análogos de GD2 y GD3 como se describe en la presente memoria; la figura 1C ilustra un esquema para la síntesis de un antígeno como se describe en la presente memoria;
la figura 2A ilustra un espectro de masas de análogo de aminofeniléter de GD2 (AP-GD2); la figura 2B ilustra un espectro de RMN H del análogo de aminofeniléter de GD2 (AP-GD2) en agua deuterada; la figura 2C ilustra un espectro de RMN H de dendrímero tetra-GD2 en agua deuterada;
la figura 3A ilustra datos representativos de FACScan que muestran la presencia de anticuerpos reactivos anti-GD2 de la clase IgG; la figura 3B ilustra diluciones en serie de sueros de ensayo o de control estudiados usando reactivos secundarios de IgG anti-ratón; la figura 3C ilustra el isotipado de los sueros que muestran el aumento de los isotipos IgG e IgM después de cada ronda de inmunización; la figura 3D ilustra células EL4-GD2+ que crecen exponencialmente en medios completos cultivados con los anticuerpos indicados, y su supervivencia/metabolismo cuantificado por MTT después de 24 horas;
la figura 4A ilustra la proliferación de células T evaluada por ensayos de incorporación de 3H-timidina, en los que las células tumorales se cultivaron a una relación 1:10 con células T purificadas de ratones vacunados o sin tratamiento previo; la figura 4B ilustra la proliferación de células T dependiente de GD2 medida por exclusión con Azul Tripán;
la figura 5A ilustra el volumen tumoral medido de ratones vacunados por vía intraperitoneal; la figura 5B ilustra los volúmenes tumorales medios medidos para ratones inmunizados frente a ratones de control; la figura 5C ilustra el volumen tumoral medido en ratones vacunados por vía intraperitoneal con tetra-GD2; la figura 5D ilustra los volúmenes tumorales medios para ratones inmunizados frente a ratones de control; la figura 5E ilustra el efecto de la terapia de transferencia adoptiva; la figura 5F ilustra la cuantificación de metástasis a los ganglios linfáticos;
la figura 6 ilustra células T purificadas de 2 grupos de ratones portadores de tumores sin tratamiento previo (control o vacunados) y perfiles de CD4/CD8 de las células cuantificadas por FACScan;
la figura 7 es un dato ELISA representativo para sueros que muestran anticuerpos reactivos anti-GD3 de la subclase IgG;
las figuras 8 y 9 representan los resultados de la vacunación con tetra-GD3; y
la figura 10 ilustra el recuento de nódulos metastásicos después de la vacunación usando la vacuna GD3. Descripción detallada
Se divulga en la presente memoria, pero no forma parte de la invención, un hidrato de carbono de gangliósido que consiste en
Se divulga específicamente en la presente memoria, pero no forma parte de la invención, un hidrato de carbono de gangliósido que consiste en
Como se usa en la presente memoria, G se refiere a parte del gangliósido respectivo (tal como GD2, GD3, GM2, y GT1b) que comprende solo el oligosacárido y los ácidos siálicos (por ejemplo, ácido n-acetilneuramínico, NANA), y correspondiente al gangliósido respectivo. Expresado de otra manera, G se refiere al oligosacárido y los ácidos siálicos del gangliósido correspondiente, excluyendo la porción de ceramida del gangliósido, que se reemplaza en la presente memoria por un resto de amino-arilo (tal como un aminofenilo). Ejemplos de G como se usa en la presente memoria incluyen los restos de GD3 y GD2 tales como
El término "arilo", como se usa en la presente memoria, se entiende que se refiere a grupos aromáticos de entre 6 y 10 miembros, por ejemplo fenilo o naftilo, preferentemente un fenilo. El anillo aromático puede estar sustituido en una o más posiciones del anulares, preferentemente no está presente ningún sustituyente, y el grupo amino está preferentemente en una posición para de un fenilo con respecto al resto de azúcar. Preferentemente, el "-arilo-NH2" es por tanto un 4-aminofenilo.
La expresión "opcionalmente sustituido", con respecto al arilo, significa opcionalmente sustituido con uno o más de un alquilo, arilo o halógeno, en cualquier posición o posiciones disponibles. Preferentemente, no hay sustituyentes.
La presente exposición proporciona un multímero de hidrato de carbono de gangliósido que comprende 4 gangliósidos de hidrato de carbono unidos covalentemente a una molécula central de PAMAM, en el que uno o más de dichos hidratos de carbono de gangliósido es un hidrato de carbono de gangliósido de fórmula
El gangliósido de hidrato de carbono puede ser un análogo de por lo menos uno de entre GD2, GD3, GM2, y GT1b.
En una forma de realización, el multímero de hidrato de carbono de gangliósido puede comprender en particular por lo menos un análogo de gangliósido de hidrato de carbono de GD2, o por lo menos un análogo de gangliósido de hidrato de carbono de GD3.
El multímero de hidrato de carbono de gangliósido es particularmente útil para prevenir o tratar el cáncer. En una forma de realización, el multímero de hidrato de carbono de gangliósido es útil para tratar el cáncer. En una forma de realización, el cáncer es un cáncer positivo a gangliósido. El cáncer puede ser en particular un neuroblastoma, un melanoma, un glioma, un cáncer de mama, o un cáncer de pulmón microcítico.
Se divulga en la presente memoria, pero no forma parte de la invención, un anticuerpo que se une específicamente al análogo de gangliósido de hidrato de carbono o al multímero de hidrato de carbono de gangliósido como se define en la presente memoria. En particular, el anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, o un anticuerpo humanizado. El anticuerpo puede ser útil para prevenir o tratar el cáncer. El cáncer puede ser un cáncer positivo a gangliósido. En particular, el cáncer puede ser neuroblastoma, melanoma, glioma, cáncer de mama, o cáncer de pulmón microcítico.
En una forma de realización, se proporciona una vacuna que comprende el multímero de hidrato de carbono de gangliósido como se define en la presente memoria, y un portador. La vacuna es particularmente útil para prevenir o tratar el cáncer. En particular, el cáncer puede ser un cáncer positivo a gangliósido. El cáncer puede ser particularmente un neuroblastoma, un melanoma, un glioma, cáncer de mama, o cáncer de pulmón microcítico.
El análogo de gangliósido de hidrato de carbono o el multímero de hidrato de carbono de gangliósido para los procedimientos o uso definidos en la presente memoria pueden formularse para inyección. En particular, la vacuna se puede formular para una administración transdérmica o una administración parenteral. Más particularmente, la administración parenteral puede ser una administración intramuscular, una administración subcutánea, o una administración intravenosa.
Se divulga en la presente memoria el diseño y caracterización de un análogo soluble en agua de hidrato de carbono GD2 y GD3 conjugado para formar un dendrímero (por ejemplo, tetrámero, en adelante "tetra-GD2" o "tetra-GD3").
Los hidratos de carbono de los gangliósidos tetraméricos conservan las características estructurales nativas de GD2 o GD3 de origen natural, por ejemplo, pero son inmunogénicos y provocan respuestas humorales y celulares antigangliósidos citotóxicas in vivo. Tetra-GD2, por ejemplo, es eficaz como vacuna contra el cáncer de GD2 en paradigmas profilácticos y terapéuticos. Se proporciona una vacuna antitumoral eficaz, dirigida a los hidratos de carbono de la superficie celular, que provoca rápidamente respuestas inmunitarias humorales y celulares que son protectoras en los paradigmas terapéuticos.
Los gangliósidos se acumulan en la valva exterior de las membranas celulares, con la ceramida y los lípidos incrustados y la cabeza de hidratos de carbono expuesta. Esto debería permitir el reconocimiento por parte del sistema inmunológico, debido a que los gangliósidos complejos son neoantígenos y se definen como marcadores tumorales. Además, incluso los gangliósidos antigénicos son inmunógenos deficientes. El sistema inmunológico puede reconocer un hidrato de carbono como "propio" sin montar una respuesta, o puede generar respuestas patológicas de reacción cruzada (por ejemplo, el síndrome de Guillain-Barré se debe a un anticuerpo anti-GM1).
Se generó un análogo de hidrato de carbono sintético de GD2 y GD3 que es inmunogénico y que puede usarse para generar inmunidad selectiva contra tumores.
Se cree que el análogo de G (tal como un análogo de por lo menos uno de GD2, GD3, GM2, y GT1b) puede ser multimérico, es decir, dimérico, trimérico, tetramérico, o cualquier otra forma adecuada para permitir un posicionamiento espacial adecuado.
Se cree, en particular, que el análogo de GD2 y GD3 puede ser multimérico, es decir, dimérico, trimérico, tetramérico, o cualquier otra forma adecuada para permitir un posicionamiento espacial adecuado de GD2 o GD3. Se divulga en la presente memoria un multímero de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 16 del análogo de gangliósido de hidrato de carbono como se describe en la presente memoria.
El siguiente esquema 1 ilustra un análogo de hidrato de carbono sintético inmunogénico de GD2 y GD3 en forma tetramérica.
El análogo comprende esencialmente un núcleo central multimérico (o como se muestra arriba, tetramérico) que permite enlazar covalentemente un espaciador que a su vez también está unido covalentemente al GD2 o GD3 deseado. Un ejemplo típico de dicho espaciador es -(C=X)-, en el que X es N o X (tal como -(C=S)- o -(C=O)-). El espaciador puede introducirse mediante el uso de la química del isocianato o isotiocianato. La figura 1c demuestra un ejemplo específico; sin embargo, la química sería aplicable a los compuestos de GD2/GD3-aminoarilo divulgados anteriormente.
Preferentemente, el núcleo central comprende un resto de etilendiamina al que se une una multiplicidad de grupos amino terminales (es decir, primarios) como se describe generalmente en el esquema 2
En el contexto de la presente invención, dicho núcleo es un compuesto de PAMAM, varios de los cuales están disponibles comercialmente (véase el catálogo de Aldrich en www.sigmaaldrich.com). Preferentemente, el núcleo multimérico central tiene una multiplicidad de grupos amino terminales (es decir, primarios). Ejemplos de compuestos de PAMAM incluyen PAMAM de generación 0.0
Las generaciones superiores de compuestos de PAMAM incluyen PAMAM en el que el terminal —NH2 se funcionaliza adicionalmente (parcial o completamente) con restos:
Una representación parcial de tal PAMAM de generación superior es la siguiente:
en la que los "brazos" restantes (que muestran una línea ondulada) también pueden tener opcionalmente restos de amidoamina para proporcionar un multímero de hasta 8 que se puede expandir más.
Un ejemplo de análogo de hidrato de carbono sintético inmunogénico de G (tal como GD2 y GD3) en un tetramérico cuando el núcleo central es una generación 0.0, como se muestra arriba, se puede ilustrar con lo siguiente
X es O o S, preferentemente X es S.
Los derivados de GD2 o GD3 se pueden sintetizar como se describe en Gilbert et al., 2002, J Biol Chem, 277: 327, aunque modificando el procedimiento de Tong et al., 2010, Chem Biol, 17: 183 para usar un p-D-lactopiranósido adecuadamente funcionalizado que porta un grupo amino que puede usarse para enlazar covalentemente GD2 o GD3 al núcleo multimérico central. Por ejemplo, el p-D-lactopiranósido funcionalizado puede ser un derivado amino
arílico de C1-p-D-lactopiranósido, o preferentemente un aminofenil-U-D-lactopiranósido, o más preferentemente un p-aminofenil-p-D-lactopiranósido.
El p-D-lactopiranósido funcionalizado se puede derivatizar adicionalmente de modo que el núcleo central multimérico (o como se muestra arriba, tetramérico) pueda unirse covalentemente. El p-D-lactopiranósido funcionalizado se puede hacer reaccionar con un reactivo adecuado para proporcionar un resto de carbonilo activado. Por ejemplo, el derivado de Cl-aminoarilo, o preferentemente un aminofenil-U-D-lactopiranósido, o más preferentemente un p-aminofenil-p-D-lactopiranósido, se puede hacer reaccionar con fosgeno, difosgeno, trifosgeno, tiofosgeno, carbonildimidazol, carbonato de disuccinimidilo, u otro reactivo adecuado, para proporcionar el correspondiente derivado de isocianato, isotiocianato, carbonilimidazolilo, o succinimidilcarbonilo.
El núcleo central multimérico se puede hacer reaccionar entonces con el p-D-lactopiranósido funcionalizado que tiene el resto de carbonilo activado descrito anteriormente para proporcionar la molécula inmunogénica deseada.
Como un enfoque sintético alternativo, el núcleo multimérico central (tal como PAMAM, como en la presente invención) se puede hacer reaccionar primero con un reactivo adecuado para proporcionar un resto de carbonilo activado como se describió anteriormente. Después, el p-D-lactopiranósido funcionalizado que comprende un grupo amino se puede añadir para proporcionar la molécula inmunogénica deseada.
Será evidente para una persona experta que si se requiere o se desea otro agente terapéutico adicional, las relaciones se ajustarán fácilmente. Se entenderá que el alcance de las combinaciones descritas en la presente memoria no está particularmente limitado, pero incluye en principio cualquier agente terapéutico útil para la prevención y el tratamiento del cáncer.
Se apreciará que la cantidad de un compuesto de la invención requerida para uso en el tratamiento variará no solo con el compuesto particular seleccionado sino también con la vía de administración, la naturaleza de la afección para la cual se requiere el tratamiento, y la edad y condición del paciente, y en última instancia quedará a criterio del médico encargado.
La dosis deseada puede presentarse convenientemente en una sola dosis, o como dosis dividida administrada a intervalos apropiados, por ejemplo como dos, tres, cuatro, o más dosis por día.
Las composiciones farmacéuticas incluyen aquellas adecuadas para administración transdérmica, o parenteral (incluyendo intramuscular, subcutánea, e intravenosa).
Los procedimientos para preparar una composición farmacéutica pueden incluir las etapas de asociar el compuesto como se define en la presente memoria y excipientes farmacéuticamente aceptables.
Los compuestos y combinaciones como se definen en la presente memoria también se pueden formular para administración parenteral (por ejemplo, mediante inyección, por ejemplo inyección en bolo o infusión continua), y se pueden presentar en forma de dosis unitaria en ampollas, jeringas precargadas, infusión de pequeño volumen, o en recipientes de múltiples dosis con un conservante añadido. Las composiciones pueden adoptar formas tales como suspensiones, disoluciones, o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes, y/o dispersantes. Alternativamente, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo, obtenido por aislamiento aséptico de un sólido estéril o por liofilización a partir de la disolución, para su constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo agua estéril o disolución salina, antes del uso.
A continuación se describe una forma de realización específica, seguida de ejemplos.
Se divulga un análogo de aminofeniléter-GD2 (en la presente memoria AP-GD2), que tiene la estructura de hidrato de carbono de GD2 correcta pero con un grupo aminofenilo que reemplaza la ceramida y lípidos (véase figura 1B). Este análogo es soluble en agua. En AP-GD2, el enlace entre el grupo fenilo y el primer azúcar está preferentemente en la configuración p, que es la configuración entre la ceramida y el primer azúcar en los gangliósidos nativos. Este enlace es crítico para mostrar una estructura adecuada y homogénea en todo el hidrato de carbono. La masa y la configuración esperadas se verificaron mediante espectrometría de masas (figura 2A) y espectroscopía de RMN, respectivamente (figura 2B).
AP-GD2 se convirtió en su correspondiente análogo de isotiocianatofenilo, y este intermedio se acopló a las aminas libres terminales de un núcleo dendrítico con enlazador de PAMAM G0 tetravalente (figura 1C). La formación del puente de tiourea entre AP-GD2 y el enlazador de PAMAM G0 se verificó mediante un desplazamiento químico de carbono a 178 ppm que aparece en el espectro de HMBC (NHC(S) NHPh). La formación del producto tetramérico se verificó mediante RMN 1H 1D. Los espectros de RMN 1H 1D mostraron un patrón de señal único para todas las unidades de azúcar, e indicaron una relación 40:36:8 de los NH de la amida, NHC(S) NHPh, H-orto, H-meta, NHAc/CH3/Hax o Heq, lo que demuestra que el dendrímero GD2 es de hecho tetravalente (figura 2C).
El antígeno tetra-GD2 se diseñó para usarse como inmunógeno en estudios terapéuticos de tumores. El fundamento del diseño de tetra-GD2 como inmunógeno potencial se basó en los siguientes conceptos. En primer lugar, la presentación de tetra-GD2 puede imitar más de cerca la presentación oligomérica de GD2 normalmente agrupados en balsas de membrana. En segundo lugar, el análogo del azúcar AP-GD2 se puede conjugar fácilmente con el enlazador de PAMAM a temperatura ambiente en condiciones suaves. En tercer lugar, la síntesis quimioenzimática garantiza la configuración apropiada de los enlaces glicosídicos, manteniendo así la conformación del hidrato de carbono completo. En cuarto lugar, los antígenos serían homogéneos y estarían bien caracterizados químicamente. En quinto lugar, el producto resultante sería soluble en agua y estable. Todas estas características son deseables para una vacuna, y pueden traducirse al AP-GD3 divulgado en la presente memoria.
Los ratones se inmunizaron hasta cuatro veces con tetra-GD2. Los sueros se recogieron cuatro días después de cada inmunización, y las muestras se analizaron para detectar la presencia de anticuerpos anti-gangliósido. La inmunización con tetra-GD2 generó títulos elevados y antisueros selectivos contra los gangliósidos del marcador tumoral GD2 y GD3 en 22 de 25 ratones (88%).
Los datos de los ensayos FACScan demostraron que los sueros de ratones inmunizados tenían anticuerpos que reaccionaban selectivamente con GD2 y GD3 de superficie celular en células tumorales (véanse figura 3A y Tabla 1). Sus sueros contenían anticuerpos de los isotipos IgG e IgM (según los reactivos secundarios específicos de isotipo utilizados). Los sueros se unieron a células EL4-GD2+ y/o EL4-GD3+. El suero de ratón normal preinmune (NMS) de control negativo no tuvo reactividad. Los mAb de control positivo muestran que las células EL4-GD2+ expresan GD2 pero no GD3, y que las células EL4-GD3+ expresan GD3 pero no GD2. En los controles celulares, los sueros no se unieron a las células Jurkat que no expresan GD2 o GD3, pero sí expresan muchos otros gangliósidos tal como GM1.
Tabla 1
Los sueros también se analizaron mediante ELISA para determinar la unión directa a gangliósidos inmovilizados. Los gangliósidos GD2, GD3, o los controles, se inmovilizaron en placas, y se evaluaron las diluciones indicadas de los sueros preinmunes de ensayo y control. Los anticuerpos generados a través de la vacunación se unieron selectivamente a GD2 (véase figura 3B). Una inmunización fue suficiente para provocar un aumento de IgG anti-GD2 circulante, ~2 veces por encima del fondo, y después de un refuerzo hubo un aumento de ~3 veces por encima del fondo (figura 3C). Los anticuerpos también se unieron a GD3, pero no se unieron a GM1. Se detectaron isotipos de IgG anti-GD2 e IgM anti-GD2. Los isotipos de IgG aumentaron después de cada refuerzo, lo que sugiere la maduración de las células B y el cambio de clase (figura 3C). Estos datos de ELISA son consistentes con los resultados obtenidos por FACScan.
Los anticuerpos de ratones vacunados con tetra-GD2 destruyeron a las células EL4-GD2+ en cultivo (figura 3D). Las células EL4-GD2+ se destruyeron mediante suero inmune en ausencia de complemento, un efecto que se ha dado a conocer para algunos mAb anti-GD2 (Yoshida et al., 2001, Cancer Research, 61: 4244) (por ejemplo, el mAb 3F8 destruye la célula, pero el mAb ME361 no lo hace). Además, la muerte de las células EL4-GD2+ se confirmó contando las células teñidas con el colorante vital azul de tripán, y evaluando su morfología.
Juntos, estos datos validan tetra-GD2 como inmunógeno para generar y madurar una inmunidad humoral citotóxica.
Se ha demostrado que las vacunas de glucopéptidos podrían activar el sistema inmunológico adaptativo al unirse a la clase II de histocompatibilidad (MHC II) (Avci et al., 2011, Nature Medicine, 17: 1602). Esto sugirió que la inmunidad mediada por células T también podría ser activada por tetra-GD2. En consecuencia, se ensayaron células T primarias en una reacción de linfocitos mixtos (MLR) que mide la incorporación de 3H-timidina. Como estimuladores de células diana de la activación de células T, se utilizaron EL4-GD2+ tratadas con mitomicina, y se utilizaron células Jurkat (GD2—) como control negativo (figura 4A). Las células EL4-GD2+ o Jurkat tratadas con mitomicina no incorporan 3H-timidina (188 ± 4 cpm y 107 ± 5 cpm, respectivamente); por tanto, actúan solo como estimuladores.
Las células T de ratones vacunados dos veces con tetra-GD2 proliferaron de manera robusta cuando se expusieron a células EL4-GD2+, pero no proliferaron cuando se expusieron a células Jurkat. En los controles celulares, las células T de ratones no vacunados no proliferaron cuando se expusieron a células EL4-GD2+ o a Jurkat. En los controles positivos, el tratamiento con ConA estimuló la proliferación de células T de ratones de control o vacunados en un grado similar (21,457 ± 504 cpm y 19,834 ± 309 cpm, respectivamente). Se obtuvieron datos similares en ensayos relacionados contando, mediante exclusión con azul de tripán, el número de células T proliferantes en cada grupo (figura 4B). En estos ensayos, se sembraron 40,000 células T que respondieron de ratones vacunados con tetra-GD2 con células vivas Jurkat o EL4 como estimuladores. Después de 7 días in vitro, todas las células diana EL4 estaban muertas, mientras que las células Jurkat estaban vivas y multiplicándose.
Juntos, estos datos validan el tetra-GD2 como inmunógeno para generar inmunidad celular.
En un paradigma de prevención de tumores, se inmunizaron intraperitonealmente ratones C57/BI6 inmunocompetentes dos veces a intervalos de una semana, seguido de la implantación subcutánea de células EL4-GD2+ singénicas, que son muy agresivas y altamente metastásicas. Las células EL4 son singénicas, y crecen y se metastatizan muy rápidamente en estos ratones. Los ratones inmunizados (5<n<9) tenían tumores primarios de tamaño significativamente más pequeño que los ratones de control en todos los días medidos (11, 14, 16 después de la implantación del tumor) (figura 5A). Los experimentos de vacunas preventivas de tumores se reprodujeron de forma independiente tres veces (n total = 22 ratones inmunizados frente a n = 22 ratones de control). Para comparar los tres experimentos independientes, los volúmenes tumorales promedio de los ratones de control para cada experimento en el día 16 se estandarizaron al 100%. Usando este criterio, en general, los volúmenes tumorales en los ratones inmunizados se redujeron en un ~57% (figura 5B).
En un paradigma terapéutico de tumores, a los ratones se les implantó en primer lugar células EL4-GD2+, y cuando los tumores eran visibles/palpables, los ratones se inmunizaron dos veces con tetra-GD2 o vehículo de control. En este paradigma clínicamente más relevante, los ratones inmunizados (4<n<6) habían retrasado significativamente el crecimiento del tumor primario en comparación con los ratones de control, en todos los días medidos (figura 5C). Después de 18 días, todos los ratones de control desarrollaron tumores primarios con un promedio de ~6,000 mm3, y metástasis extensa en los ganglios linfáticos. Por el contrario, los ratones inmunizados tenían tumores primarios ~2,300 mm3.
Los datos de la vacuna terapéutica contra el tumor se reprodujeron en dos experimentos independientes (n = 13 ratones inmunizados frente a n = 18 ratones de control). Para comparar todos los experimentos, los volúmenes tumorales promedio de los ratones de control para cada experimento el día 18 se estandarizaron al 100%. Usando este criterio, en general, el volumen del tumor en los ratones inmunizados se redujo en ~51% (figura 5D).
Los ratones portadores de tumores subcutáneos recibieron, por inyección intraperitoneal, 4 * 106 células T purificadas de ratones donantes inmunizados con tetra-GD2. Los ratones transferidos de forma adoptiva (n = 6) habían retrasado significativamente el crecimiento del tumor primario en comparación con los ratones de control no tratados (n = 6), en todos los días medidos (figura 5E). Después de 14 días de crecimiento tumoral, los grupos de control desarrollaron tumores primarios con un promedio de ~1200 mm3. Por el contrario, el grupo transferido adoptivamente tenía tumores primarios ~500 mm3.
En particular, el grupo transferido adoptivamente no tenía evidencia de metástasis a los ganglios linfáticos o al timo, órganos que son los principales sitios de metástasis observados para los tumores EL4. La metástasis de tumores EL4 provoca un agrandamiento del tejido, y un aumento correspondiente del peso, que se puede cuantificar. Los ratones portadores de tumores (n = 6) tienen ganglios linfáticos más grandes que los ratones sin tratamiento previo que no portan tumores, el tamaño aumenta en ~10 veces. Los ratones que portaban tumores (n = 6) pero que recibían transferencia adoptiva de células T tenían ganglios linfáticos más pequeños, comparables a los ganglios linfáticos normales (figura 5F).
Las células T activadas después de la vacunación se caracterizaron además en cuanto a su fenotipo CD4 y CD8. Se aislaron células T de ratones vacunados portadores de tumores o ratones de control, y las células se cultivaron en placas que tenían GD2 inmovilizado sobre el plástico. Las células T de ratones vacunados proliferaron con fuerza en placas recubiertas con GD2. Por el contrario, las células T de los ratones de control no proliferaron en placas recubiertas con GD2. Aunque todos los ratones portan tumores y están expuestos a GD2, solo los ratones vacunados pueden responder a este antígeno. Los ensayos FACScan que caracterizan los cultivos mostraron que el fenotipo de las células en proliferación era predominantemente CD8+. La relación CD4/CD8 en estas células cambió debido a la expansión del subconjunto CD8, mientras que las células T de los ratones de control mantuvieron la relación CD4/CD8 normal (figura 6).
Estos datos indican que después de la vacunación, las células T activadas pueden responder al antígeno inmovilizado (multivalente) en ausencia de células presentadoras de antígeno.
La presencia de linfocitos infiltrantes de tumores se verificó inmunotiñendo criosecciones preparadas a partir de tumores primarios. Los tumores EL4 son células T "doblemente negativas", y no se tiñen con anticuerpos anti-CD4
o anti-CD8. En los ratones que recibieron transferencia adoptiva de células T de ratones inmunizados hubo un número significativamente mayor de células CD8+ infiltrantes en los tumores primarios, en comparación con los ratones portadores de tumores que no recibieron transferencia adoptiva. Los anticuerpos anti-CD4 detectaron células CD4+ infiltrantes en ambos grupos.
Juntos, los datos muestran que la vacunación es suficiente para manejar el crecimiento del tumor primario y la metástasis del tumor en un paradigma terapéutico realista, en el que la vacuna se administra después de que se establece el tumor.
Se ha desarrollado un nuevo dendrímero de hidrato de carbono GD2 tetravalente como inmunógeno de hidratos de carbono eficaz y como vacuna terapéutica contra el cáncer. La caracterización biofísica del inmunógeno sintético mostró que es un tetrámero homogéneo que mantiene los enlaces p deseados. La presentación de estructuras de hidratos de carbono oligoméricas al sistema inmunológico puede estimular respuestas antitumorales más genuinas y citotóxicas al imitar el GD2 en balsa en las membranas tumorales. Los estudios biológicos in vivo e in vitro demostraron que la vacuna induce anticuerpos citotóxicos anti-GD2 e inmunidad celular citotóxica. La inmunidad provocada por la vacuna puede retrasar el crecimiento y la metástasis de un tumor establecido. Los estudios in vivo divulgados en la presente memoria confirman que la vacuna de gangliósidos no solo puede prevenir el crecimiento tumoral, sino también suprimir el crecimiento tumoral establecido.
A partir de los datos generados para el dendrímero de hidrato de carbono GD2 tetravalente descrito en la presente memoria, se engloba aquí el desarrollo de otras vacunas contra el cáncer que se dirigen a los hidratos de carbono, y que están adaptadas a otros gangliósidos asociados a tumores tales como GD3. Se describe en la presente memoria un hidrato de carbono GD3 tetramérico, preparado a partir del análogo de aminofeniléter-GD3 (véase figura 1B), de manera similar a AP-GD2, que conserva las características estructurales nativas de GD3 de origen natural, predeciblemente es inmunogénico, y provocará respuestas citotóxicas humorales y celulares antigangliósidos in vivo.
Usando la misma estrategia sintética descrita para AP-GD2, se generó un análogo de dendrímero GD3 (tetra-GD3), y después de dos rondas de inmunización, se detectaron títulos altos de anticuerpos anti-GD3. Como se ve en la figura 7, se detectó la inmunidad humoral provocada por la vacunación con tetra-GD3.
La nueva vacuna GD3 se evaluó como agente anticanceroso in vivo, y se determinó que los ratones inmunizados tenían tumores primarios de tamaño significativamente más pequeño que los ratones de control en todos los días medidos (figura 8), y la metástasis estaba prácticamente ausente en los ganglios linfáticos (figura 9) y en los pulmones (figura 10). La vacuna GD3 reduce la metástasis pulmonar del melanoma (figura 10). Por consiguiente, se ha desarrollado un nuevo dendrímero de hidrato de carbono GD3 tetravalente como inmunógeno de hidratos de carbono eficaz, y como vacuna terapéutica contra el cáncer.
Ejemplo I
Síntesis de AP-GD2 y dendrímero tetra-GD2
Los hidratos de carbono se sintetizaron como se describió (Gilbert et al., 2002, J Biol Chem, 277: 327), mediante modificación del procedimiento para feniltio-GD2 (Tong et al., 2010, Chem Biol, 17: 183) en el que el análogo de tio-fenilo descrito originalmente se sustituyó por un p-aminofenil-p-D-lactopiranósido (AP-Lac), de Toronto Research Chemicals), para la posterior conjugación con el dendrímero (véase más adelante). AP-GD2 era soluble en agua (>20 mg/ml), y se purificó hasta >99% de pureza mediante exclusión por tamaño (columna Superdex 30 de 16 mm x 85 cm, g E Health Care). El peso molecular medido de AP-GD2 fue 1218 g/mol, y correspondió a los valores esperados. Las estructuras se verificaron mediante espectroscopía de RMN 1D y 2D y espectrometría de masas (EI-MS) (véanse las figuras 2A y B). La síntesis quimioenzimática de AP-GD2 tuvo un rendimiento final de ~90% de material puro.
Se añadió tiofosgeno (2 pl) a una disolución agitada de AP-GD2 (2 mg) en etanol al 80% (300 pl), y la mezcla se dejó reposar a temperatura ambiente durante 3 h, cuando la cromatografía de capa fina (acetato de etilo-metanol, 4:1) mostró que todo el material de partida había reaccionado y se había formado un solo producto. La concentración casi hasta sequedad dio un sólido al que se le añadió agua. La filtración con lavado del producto con agua dio la disolución de isotiocianatofenil GD2, que se liofilizó hasta un polvo blanco (1.8 mg, rendimiento del 90%). Los volátiles de una disolución metanólica de PAMAM G0 (Dendritech, Inc) se evaporaron a presión reducida, y el residuo resultante se disolvió en dimetilformamida (DMF). Se añadió gota a gota una disolución de isotiocianatofenil GD2 (1.8 mg) en DMF (110 pl) a una disolución de DMF agitada (100 pl) de N,N-diisopropiletilamina (0.5 pl) y PAMAM G0 (2 pl de 0.854 pg/pl). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 20 h, hasta que no se detectó material de partida mediante TLC. La mezcla de reacción se diluyó con 3 ml de agua y se dializó contra agua (corte de MW 2 kDa, Spectrum Laboratories Inc.). La disolución resultante se liofilizó para dar GD2 tetravalente basado en PAMAM como un polvo blanco con un rendimiento del 80% (1.34 mg). El GD2 tetravalente basado en PAMAM se verificó mediante espectroscopía de RMN 1D y 2D. Se obtuvieron células de linfoma de ratón EL4-GD2+ (células EL4 de tipo salvaje) y de leucemia Jurkat de ATCC. Las células EL4-GD3+ se
desarrollaron por selección negativa de EL4-GD2+ con los mAb anti-GD2, seguido de subclonación de dilución limitante. Las células EL4-GD3+ son estables y tienen las mismas propiedades de crecimiento y cinética in vitro que las células EL4-GD2+. Todas las células se cultivaron en medio RPMI 1640 (Wisent INC) suplementado con suero bovino fetal al 5%, glutamina 2 mM, Hepes 10 mM, y penicilina/estreptomicina a 37°C en atmósfera humidificada con CO2 al 5%. La citometría de flujo mostró que todas las líneas celulares expresan niveles iguales de GM1 de superficie celular. La citometría de flujo, y la cromatografía de capa fina de extractos de gangliósidos, confirmaron que las células EL4-GD2+ expresan Gd2 pero no GD3, que las células EL4-GD3+ expresan GD3 pero no GD2, y que las células Jurkat no expresan ni GD2 ni GD3.
Ejemplo II
Caracterización in vivo de tetra-GD2
Inmunización para caracterización FACS y ELISA de sueros
Se administró intraperitonealmente tetra-GD2 (50 |jg) en PBS a ratones C57/BI6. Después de 10 días, los ratones se reinmunizaron intraperitonealmente (25 jg ) subcutáneamente (25 jg ) en PBS. Cuatro días después, se recolectaron muestras de sangre para análisis.
FACScan: 2 * 105 células de células EL4-GD2+ , EL4-GD3+ , y Jurkat se lavaron con amortiguador de FACS (PBS, 0.5% de BSA, 0.05% de NaN3), y se incubaron durante 20 minutos en hielo con 2 j l de antisuero de ratón (dilución 1:50) o mAb anti-GD2 de control positivo (13 nM) o mAb anti-GD3 (13 nM). Las células se lavaron 2x con amortiguador de FACS enfriado en hielo, y se incubaron durante 20 minutos en hielo con IgG anti-ratón conjugada con FITC o IgM anti-ratón conjugada con FITC (Sigma). Las células se lavaron con amortiguador de FACS, y se estudiaron recientemente en un citómetro de flujo (Becton-Dickinson), y los datos se analizaron utilizando el software CellQuest. Se utilizaron IgG o IgM de ratón y sueros de ratón normales como anticuerpos de control negativo. Se utilizaron células Jurkat como células de control negativo.
ELISA de unión directa: se inmovilizaron gangliósidos (Advanced ImmunoChemical Inc.) sobre placas de poliestireno Corning Strip Well de 96 pocillos (10 ng/pocillo) (Fisher Scientific). A continuación, los pocillos se "bloquearon" con disolución salina amortiguada con fosfato que contenía albúmina de suero bovino al 0.5% (PBS-BSA al 0.5%) durante una hora. Los pocillos se incubaron durante dos horas con anticuerpos primarios, incluyendo sueros de ensayo, sueros de ratón de control pre-sangrado, IgG de ratón (Sigma), o anticuerpos monoclonales anti-gangliósido específicos. Las placas se lavaron tres veces con PBS-BSA al 0.5%, seguido de anticuerpo anti ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Sigma) específico para isotipos IgG de ratón, o isotipo IgM de ratón. Después de tres lavados con PBS-BSA al 0.5% y dos con PBS, se añadió el sustrato colorimétrico TMB One Solution (Promega), y la reacción se detuvo con H2SO4 0.5 N. Las placas se leyeron a 450 nm (Benchmark Plus, Bio-Rad) (31).
Isotipado de los sueros: se recogió sangre después de cada ronda de inmunización utilizando un sistema de recogida de sangre capilar (Microvette, Sardstedt), y se centrifugó a 10000 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente para la separación del suero. El isotipado de la Ig presente en el suero se realizó a continuación usando un kit de subisotipado de ratón (Calbiochem, n° de cat. 386445) siguiendo las especificaciones del fabricante. Los experimentos se realizaron 4 veces por triplicado para cada suero.
Citotoxicidad evaluada mediante ensayos de MTT
Las células EL4-GD2+ (5,000/ pocillo, en placas de 96 pocillos, Corning) se cultivaron en medio regular suplementado con los reactivos indicados. El perfil de supervivencia/metabólico de las células se cuantificó después de 24 h utilizando el reactivo de sal de tetrazolio (MTT, Sigma) y absorción de UV. Los ensayos se realizaron 5 veces cada uno por cuadriplicado. Los reactivos de ensayo incluyen mAb anti-GD2 de control positivo (concentración final 7 nM), IgG de ratón normal de control negativo (concentración final 7 nM). Los sueros se recogieron de ratones sin tratamiento previo (control negativo), o de ratones de ensayo vacunados dos veces por vía intraperitoneal. En estos experimentos, la vacunación se realizó en los días 3 y 10, y los sueros se recolectaron el día 13. Los tiempos para la recolección de suero siguieron las líneas de tiempo del paradigma terapéutico del tumor (véase más abajo). Los sueros se semipurificaron, y se aplicaron ~50 jg/pocillo de anticuerpos séricos. Una pequeña fracción de los anticuerpos séricos serían anticuerpos anti-gangliósido, mientras que los controles de mAbs contienen 100% de IgG anti-gangliósido.
Reacción de linfocitos mixtos (MLR) evaluada por ensayo de incorporación de 3H-timidina
Las células EL4-GD2+ y las células Jurkat de control se trataron con 25 jg/m l de mitomicina (Sigma) durante 1 hora para detener su proliferación. Después de lavar las células tres veces con medio para eliminar la mitomicina, se sembraron en placas de 96 pocillos a 2 * 105 células/pocillo. Se obtuvieron suspensiones de células individuales de esplenocitos a partir de ratones inmunizados dos veces (como antes) y a partir de ratones de control inyectados con vehículo. Las células se separaron siguiendo el protocolo del imán EASYSEPTM (Stem Cell Tech). Se
obtuvieron cantidades similares de células T de cada bazo de ratón (>95% de pureza, datos no mostrados). Las células T se sembraron en placas en una relación de 10:1 con células EL4 o Jurkat tratadas con mitomicina. Como controles, se usaron cultivos de células T solas (sin células tumorales estimulantes) o células T tratadas con Concanavilina A. Después de 5 días de cultivo, se añadieron 0.1 jCi/pocillo de 3H-timidina (Sigma-Aldrich). La 3H-timidina incorporada al ADN se contó mediante centelleo de líquidos, y los datos se dan a conocer como cpm promedio ± sd.
Ejemplo III
Estudios de prevención de tumores
Inmunización para estudios de prevención de tumores
Los ratones C57BL/6 se vacunaron por vía intraperitoneal cuatro veces, cada una con una semana de diferencia (50 |jg cada vez). Los ratones de control recibieron solo inyecciones de vehículo. Una semana después de la cuarta vacunación, se inyectaron por vía subcutánea 5 * 105 EL4-GD2+. Diez días después de la exposición al tumor, se midieron los tumores en los tiempos indicados después de la implantación del tumor.
Inmunización para estudios terapéuticos del tumor
Se inyectaron por vía subcutánea 5 * 105 células EL4-GD2+ en ratones C57BL/6, en el flanco izquierdo. Después de tres días, cuando el tumor era visible/palpable, los ratones se aleatorizaron y se vacunaron dos veces por vía intraperitoneal en el lado derecho, con vehículo de control o con dendrímero tetra-GD2 (50 jg en PBS). Los tumores se midieron en los tiempos indicados después de la implantación del tumor.
Estudios terapéuticos de transferencia de células T adoptivas
Los ratones C57BL/6 se vacunaron por vía intraperitoneal dos veces (con una semana de diferencia) con 50 jg de tetra-GD2. Siete días después de la segunda inmunización, las células T del bazo y los ganglios linfáticos se aislaron usando el kit de enriquecimiento de células T de ratón por selección negativa EasySep (Stemcell Technologies). Se inyectaron por vía intraperitoneal aproximadamente 4 * 106 células T a ratones C57BL/6 a los que se les había inyectado por vía subcutánea 2.5 * 105 células EL4-GD2+ 3 días antes de la transferencia adoptiva. Los tumores se midieron en los tiempos indicados, y los ratones se sacrificaron 14 días después de la implantación del tumor con el fin de disecar los ganglios linfáticos inguinales y axilares ipsilaterales y evaluar la metástasis.
Evaluación del crecimiento tumoral
El tumor primario se midió con un calibre digital, y los datos se analizaron mediante la siguiente ecuación: V (mm3) = 0.5 * anchura * (longitud)2. Después de la eutanasia, los ratones fueron disecados y examinados microscópicamente en busca de pruebas de metástasis en los ganglios linfáticos y el timo (órganos en los que se sabe que se encuentran las células EL4).
Las diferencias en el crecimiento tumoral para los dos grupos se analizaron mediante pruebas de la t de Student de dos colas; con significancia a p<0.05 (*) y p<0.01 (**). En otro lugar, ANOVA de una vía con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey-Kramer comparó los cinco grupos diferentes. Una diferencia entre los resultados se consideró significativa a p<0.05 (*) y p<0.01 (**).
Ejemplo IV
Caracterización in vivo de tetra-GD3
Seguridad. Los ratones vacunados no mostraron ningún signo de efectos adversos que pudieran predecirse a partir de efectos secundarios conocidos. Todos los criterios de valoración medidos fueron negativos, incluyendo los que se notificaron como problemáticos en ensayos clínicos que utilizaron otras formas de antígenos GD2 o GD3 (hiperalgesia, cambios en el comportamiento, movilidad, y aprendizaje/memoria). Los ratones hiperinmunizados no desarrollaron inmunidad de reacción cruzada a los gangliósidos normales, y no hubo alteraciones en los perfiles hematológicos, los perfiles de enzimas hepáticas o renales.
Usando la misma estrategia sintética que se describe en el Ejemplo I, se generó el análogo de dendrímero GD3 (tetra-GD3). Después de dos rondas de inmunización, se detectaron títulos altos de anticuerpos anti-GD3, pero no de Abs anti-GM1. La evaluación de la seguridad, como antes, no reveló problemas.
Figura 7. Muestra la inmunidad humoral provocada por la vacunación con tetra-GD3. Datos de ELISA representativos para sueros que muestran anticuerpos reactivos anti-GD3 de la subclase IgG. Los controles negativos son suero normal de prevacunación de ratón e Ig de ratón (Sigma). La unión es selectiva para GD3,
mientras que las placas de ELISA GM1 son negativas (no se muestran). Los datos mostrados son n = 8 muestras individuales promediadas ± sem.
La nueva vacuna GD3 se evaluó como agente anticanceroso in vivo. Se utilizó EL4-GD3+, que expresan altos niveles de GD3. En un paradigma preventivo, los ratones se inmunizaron dos veces antes de la implantación de una EL4-GD3+ singénica muy agresiva. En un modelo terapéutico de tumor clínicamente relevante, se realizó la transferencia adoptiva de células T de ratones donantes vacunados a ratones que portaban tumores subcutáneos establecidos. En ambos paradigmas, los ratones inmunizados tenían tumores primarios de tamaño significativamente más pequeño que los ratones de control en todos los días medidos (figura 8), y la metástasis estaba prácticamente ausente en los ganglios linfáticos (figura 9) y en los pulmones (figura 10).
La figura 8 ilustra los resultados de que la vacunación con tetra-GD3 protege contra la exposición al tumor GD3+. Los ratones se vacunaron por vía intraperitoneal con tetra-GD3 (2x, 1 semana de diferencia, 10 ug/ratón cada vez, sin adyuvante) antes de la implantación de tumor subcutáneo de células EL4-GD3+. Volúmenes promedio del tumor primario ± sd.
La figura 9 representa los resultados de que la vacunación con tetra-GD3 protege contra la exposición al tumor GD3+. Los ratones se vacunaron por vía intraperitoneal con tetra-GD3 (2x, 1 semana de diferencia, 10 ug/ratón cada vez, sin adyuvante) antes de la implantación de tumor subcutáneo de células EL4-GD3+. Volumen promedio de los ganglios linfáticos ± sd (indicativo de metástasis, medido mediante la detección de células EL4 en el ganglio linfático), n = 8 en cada grupo. Los ganglios linfáticos se muestran como ejemplo.
La figura 10 ilustra la observación de que la vacuna GD3 reduce la metástasis pulmonar de melanoma. Se inyectaron 5x105 células de melanoma B16-GD3 en la vena de la cola de ratones C57BL/6. Después de tres días, los ratones se asignaron al azar, y se vacunaron dos veces IP. Los ratones se sacrificaron después de 14 días. Se cuantificaron los pulmones con manchas oscuras de nódulos metastásicos (los tumores contienen melanina y se pueden ver fácilmente).
Claims (6)
1. Multímero de hidrato de carbono de gangliósido que comprende 4 gangliósidos de hidrato de carbono enlazados covalentemente a una molécula central de Pa Ma M, en el que uno o más de dichos hidratos de carbono de gangliósido es un hidrato de carbono de gangliósido de fórmula
2. Multímero de hidrato de carbono de gangliósido según la reivindicación 1, que presenta la fórmula
en la que Ph es fenilo; X es O o S, y G es
o
3. Multímero de hidrato de carbono de gangliósido según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, para uso como medicamento.
4. Multímero de hidrato de carbono de gangliósido según cualquiera de las reivindicaciones 1-2 o multímero de hidrato de carbono de gangliósido para uso según la reivindicación 3, para uso en la prevención o el tratamiento del cáncer en un paciente que lo necesita.
5. Multímero de hidrato de carbono de gangliósido para uso según la reivindicación 4, en el que el cáncer es un cáncer positivo a gangliósido.
6. Vacuna que comprende el multímero de hidrato de carbono de gangliósido según cualquiera de las reivindicaciones 1-2 o el multímero de hidrato de carbono de gangliósido para uso según las reivindicaciones 3-5, y un vehículo.
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