TWI719351B - 於疫苗中作為佐劑的包含ｇｍ３神經節苷脂的合成變體之奈米粒子 - Google Patents
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Abstract
本發明描述獲得藉由GM3神經節苷脂之不同合成變體所形成之奈米粒子化佐劑的方法。取決於合成的GM3之神經醯胺中的脂肪酸之細微結構，該佐劑可用特化方式特異性刺激針對伴隨的抗原之體液或細胞免疫反應。特別地，本發明提供免疫原性疫苗組成物，其包括胜肽、多肽或蛋白質以及上述奈米粒子，其是經由將腦膜炎雙球菌的外膜複合物(outer membrane complex，OMC)的硫水性蛋白質分散在含有GM3神經節苷脂之完全合成變體之溶液中而形成。
Description
本發明是關於免疫奈米技術與免疫腫瘤學的領域，特別是關於用於治療患有由致癌病毒引起的癌症和/或慢性感染的個體之治療性疫苗。特別地，它描述了專門用於特異性刺激這些患者中的細胞或體液免疫效應物(effector)的奈米微粒佐劑，並提供相應的疫苗組成物。
經過數十年的臨床試驗不成功的結果，治療性癌症疫苗未能成為對患者有益之有效且低毒性的治療方法。近來用免疫檢查點抑制劑抗體(Ab)獲得的臨床成功已經刺激了免疫腫瘤學(包含癌症疫苗)的商業和科學興趣。這些治療性疫苗的失敗可能是由於諸如抗原的錯誤選擇、使用相對無效率的載體/佐劑以及將該疫苗用作單一療法(亦即不與允許的其他免疫調節劑組合使用，這是考量校正腫瘤微環境所產生的負面影響)的因素(Branca MA et al (2016) Nat Biotech 34 (10): 1019-24)。傳統上，癌症疫苗在其製劑中使用歸類為自身相關腫瘤抗原的蛋白質，儘管它們在腫瘤細胞中異常表現，也存在於正常組織中。缺乏這些疫苗臨床有效性的確鑿證據可能部分歸因於中心耐受過程，通過該過程消除了具有針對大多數這些抗原之高親和力(avidity)的受體的T細胞(Tran E. et al (2017) Nat Immunol 18 (3): 255-62)。因此，基於這種類型的抗原的癌症疫苗的成功將取決於能夠增強效應T細胞的特異性反應的新型專用佐劑的使用，其在開始時相對較弱，但之後以腫瘤變為天然新抗原之來源的方式增加。這允許細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)之有力的多特異性和個人化作用移動，能夠根除惡性病變。
最近，現有技藝反映了關於以引入腫瘤新抗原來選擇成功的癌症疫苗之抗原的觀點的變化。這些新抗原之具吸引力的來源是個體腫瘤突變的個人化檢測。這類型抗原之另一種更有限的來源來自病毒致癌蛋白質的序列。雖然這些突變胜肽對於免疫系統具有新的優勢(它們不存在於正常組織中)，因此具有更高的免疫原性，用這些新抗原設計的新疫苗的成功還取決於最大化CTL反應的新型佐劑的能力，經由局部持久性(local persistence)尋求抗原的最佳可用性(availability)，該局部持久性允許抗原呈現細胞(antigen-presenting cell，APC)在成功成熟的情況下呈現(presentation)並且另外規避(circumvent)腫瘤微環境(tumor microenvironment，TME)的免疫抑制作用。另一方面，在實踐中，新表位的辨識是無效的(ineffective)程序。定序研究辨識個體腫瘤中數千個的體細胞突變，生物資訊程式預測可結合至特定MHC的數百個突變的胜肽，但是當它們被分離並藉由質譜法研究時，絕大多數這些新表位在真實腫瘤中未被發現，更糟糕的是，只有少數能夠刺激CTL反應。這表示目前預測和驗證新表位的方法遠非常態用於將個人化免疫療法帶入臨床實踐(Editorial, (2017) Nat Biotech 35 (2): 97)。
對於所有類型的疫苗，選擇合適的佐劑是實現所欲之成功的關鍵因素。治療性癌症疫苗的主要目的是刺激B淋巴細胞、T細胞和先天免疫介質(mediators of innate immunity)的活化和增生，使誘導的體液與細胞免疫效應物能夠識別且破壞腫瘤細胞，從而增加病患的存活與生活品質。為了達到這個目的，理想的佐劑必須首先優化APC的抗原的可用性。其次，它必須有效地刺激這些APC，使得它們表達必需的共同刺激訊號並分泌特定的細胞激素(cytokine)和趨化介素(chemokine)。第三，它必須能夠以中和免疫抑制作用的方式調節TME。現今，沒有具有所有這些特徵的佐劑。
如Khong H.等人所解釋的(Khong H. et al (2016) J. Immunother. Cancer 4: 56)，此技藝中用於癌症疫苗之最有希望的佐劑變異體是微米和奈米粒子，因為它們可以表現出作為疫苗接種增強劑的幾種所需性質。藉由調節顆粒大小、剛度(stiffness)和淨電荷，可設計這些顆粒製備以使伴隨的抗原有效地靶向特定的APC。直徑在500-2000nm範圍內的顆粒疫苗優先由APC在注射部位捕獲並移至淋巴結(lymph node，LN)，而20至200nm的顆粒被動地排出至LN，在那裡它們被位於該處的APC捕獲(captured)。用於這些目的的最常用的微米和奈米粒子是脂質體、蛋白脂質體、合成聚合物與天然聚合物。在此技藝中已經詳細描述了這些奈米粒子中的每一種的優點與限制。
與本發明特別相關的是Xu F.等人的描述(Xu F.等人（2016）ACS Nano Vol.10：1189-1200)合成奈米粒子佐劑，其在它的組成物中含有GM3神經節苷脂(ganglioside)。藉由用插入GM3神經節苷脂的脂質膜塗覆直徑為40至80nm的金奈米粒子而獲得此佐劑。在此方式中，可有利地解決醣脂-受體(glycolipid-receptor)特異性相互作用原理，特別是唾液基-乳糖(sialyl-lactose)與Siglec1(CD169)的相互作用，其在活化的樹突細胞(dendritic cell，DC)中過度表現，在LN中具有CD4+T細胞的突觸的主角(protagonist)。雖然這些塗覆GM3的奈米粒子選擇性地在體內累積在膕的(popliteal)LN的CD169+
DC中，但是從用參考抗原進行的免疫作用實驗中沒有證據其具有作為佐劑的潛力或它們在腫瘤模型中的功效。在另一方面，此原理僅在直徑為40至80nm的奈米粒子中有作用。
Molina等人在美國專利第7,776,346號描述藉由將由腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitidis)細菌的外膜蛋白質複合物(outer membrane protein complex，OMPC)與神經節苷脂GM3的疏水性接合形成的非常小尺寸蛋白脂質體(very small size proteoliposome，VSSP)與一些弱免疫原性抗原相關聯以製備有效免疫原的方法，可認為其是最接近本發明的技術方案。再者，獲得這些VSSP的方法已有一些細節描述在Rodríguez等人的US 6,149,921中，強調用於獲得這些蛋白脂質體的GM3神經節苷脂必須從生物來源獲得，主要來自於由工業生產單株抗體形成之大部分的融合瘤(hybridoma)。Estévez等人(Estévez et al (2000) Vaccine Vol. 18: 90-197)教示可使用從犬紅血球獲得的GM3以產生這些VSSP。在該技藝中已知(如Lee H等人(Lee H et al (2011) Int J Mass Spectr Vol 305: 138-150)所解釋的)從任何天然來源獲得的GM3神經節苷脂由不同分子種類的可變混合物組成，其中寡糖的結構相同但神經醯胺(ceramide)的結構在脂肪酸組成方面不同。除了使用動物或腫瘤來源的成分來生產藥物製備的不便之外，使用生物來源的GM3大幅防止獲得具有必需的高可再現特性之VSSP。
應該確定的是，在描述於本發明之前，沒有先前的技術方案或科學出版物描述藉由使用具有化學定義結構之不同完全合成的GM3的製造方法獲得的VSSP變體(variant)。這些合成的變體亦具有作為治療性疫苗專用佐劑的驚人性質，這取決於其製備中使用的GM3神經節苷脂的分子細微結構，並且相較於用來自生物源的GM3所產生的VSSP，此特化(specialization)提供具備有利性質的新佐劑。因此，本發明的新穎性在於提供含有全合成的GM3神經節苷脂的新VSSP奈米粒子化佐劑，基本上但不限於GM3結構具有包含硬脂酸(GM3 (18：0))的神經醯胺，主要用於誘導針對伴隨抗原的有效抗體反應，或包含油酸(GM3 (18：1)的神經醯胺)，特別有效誘導特異性CTL效應物反應。
在本發明的實施例中，我們描述包含藉由GM3神經節苷脂的完全合成變體與細菌腦膜炎雙球菌的外膜複合物的疏水性蛋白質結合形成的奈米粒子之佐劑，基本上但不限於在GM3神經節苷脂的神經醯胺中具有硬脂酸或油酸的組成物。
在另一實施例中，本發明是關於胜肽、多肽或蛋白質疫苗組成物，其包括上述的奈米粒子化佐劑，以及任選地另一佐劑，其可為(但不限於)明礬(alum)或油性佐劑。特別地，在這些疫苗組成物中的抗原是生長因子受體的細胞外結構域(extracellular domain)或其部分，例如HER1、HER2或HER3單獨或組合使用；或與GnRH荷爾蒙相關的胜肽PyrGnRHm1-TT。該疫苗組成物可用於製備用於治療致癌病毒(oncogenic virus)的癌症或慢性病毒感染的藥物。
在特定實施例中，本發明是關於單獨或組合包括本發明之奈米粒子化佐劑物品的疫苗組成物用於刺激病患的抗原特異性體液或細胞免疫反應的用途。
此外，本發明的另一個目的是一種治療方法，用於對於有需要這種治療的個體皮下(subcutaneously，SC)、皮內、肌肉內、結節內(intranodally)、瘤內、或直接施用於黏膜上投予本發明的疫苗組合物，在每兩週一次的頻率至少總共五個誘導劑量期間，並且隨後以每月維持劑量至少六個月。該組成物可同時、交錯或交替投予。
疫苗組成物
藉由將來自腦膜炎雙球菌的OMPC的疏水性蛋白質分散在GM3神經節苷脂的完全合成變體溶液中形成的奈米粒子化佐劑與作為抗原的胜肽、多肽或蛋白質的結合而形成用於本發明中的疫苗組成物。特別地，這些胜肽、多肽或蛋白質可為生長因子受體的完整細胞外結構域或其部分，並且亦可關於在一些階段與腫瘤進展相關的荷爾蒙，例如GnRH，但不限於它們。
包含在本發明的VSSP之一的GM3神經節苷脂的神經醯胺中存在的脂肪酸的類型將取決於疫苗的目的；如果所需效果有利於Ab反應，則使用硬脂酸(GM3 18：0)，而如果有利於CTL反應，則使用油酸(GM3 18：1)。亦可藉由將兩種疫苗配方的免疫作用(immunization)充分結合而在宿主中誘導針對相同抗原的Ab和CTL的雙重反應。含有GM3(18：0)的VSSP和具有GM3(18：1)的那些VSSP均可單獨使用或與其他佐劑(例如但不限於明礬或油性配方)組合使用。
相較於用含有從天然來源獲得的神經節苷脂的奈米粒子佐劑化的疫苗配方，使用以GM3 (18:0)作為佐劑的VSSP之本發明的疫苗組成物在誘導的體液反應、腫瘤細胞株的血清學識別、腫瘤細胞中受體活化的血清學抑制以及這些細胞的存活性(viability)降低方面具有優異的品質。
相較於用含有從天然來源獲得的神經節苷脂的奈米粒子佐劑化的疫苗配方，使用以GM3 (18:1)作為佐劑的VSSP之本發明的疫苗組成物誘導更有效的CTL反應。
治療應用與治療方法
本發明提供專用於針對生長因子受體家族誘導Ab或CTL反應的疫苗組成物，其構成了免疫腫瘤學中此感興趣的抗原系統之特別有用的解決方案，因為已知Ab反應和特異性CTL反應皆是有效的，但難以在單一疫苗配方與單一投予方案中進行優化。
本發明的目的亦引入專用於產生針對一些階段與腫瘤進展相關荷爾蒙(但不限於GnRH荷爾蒙)的高力價(titer)中和抗體的疫苗配方。
本發明的另一目的是提供治療性疫苗組成物，其可產生強烈的(powerful)Ab或CTL之特異性反應，特別是在患有致癌病毒的慢性病毒感染或癌症的免疫功能低下的病患(immunocompromised patient)中。
本發明的疫苗組成物可藉由下列方法投予至病患：SC、皮內、肌肉內、結節內、瘤內途徑或直接施用於黏膜上。
可用本發明的疫苗組合物治療的癌症類型中有上皮來源的癌(carcinomas of epithelial origin)。更特別地，這些癌症的實例包含肺癌(小細胞與非小細胞類型)、肝細胞癌、胃癌、胰腺癌、頭頸癌、膠質母細胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、前列腺癌、唾液腺癌、腎癌、外陰和甲狀腺腫瘤、肛門癌和陰莖癌。
在本發明的疫苗組成物中，在人體中用於生長因子受體的細胞外結構域或其部分的劑量範圍為200μg至1 mg，較佳為在400μg至900μg範圍內。在本發明的疫苗組成物中，所使用的GnRH胜肽劑量範圍是在500 μg至3 mg範圍中，較佳為在1 mg至2.5 mg範圍內。VSSP投予範圍在100μg與mg之間，較佳為在200μg至600μg之間(根據OMPC含量)。
該組成物在至少總共五次誘導劑量期間以每兩週一次的頻率投予至個體，隨後以每月維持劑量投予至少六個月。如果所欲之效果是在宿主中誘導針對相同抗原的Ab和CTL的雙重反應(dual response)，則免疫作用(immunization)可同時、交錯或交替地與兩種疫苗配方組合。
獲得奈米粒子佐劑
VSSP GM3(18:0)
首先，腦膜炎雙球菌的OMPC分散在反應器中含有脫氧膽酸鈉(sodium deoxycholate)(10-40mM)和十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate)之混合物的(1-10mM)Tris-HCL緩衝溶液中，並且攪拌時間範圍為1至36小時。接著，加入質量為OMPC的0.1至3倍之合成神經節苷脂(GM3 18:0)，並且延長攪拌時間。而後，藉由超過濾或透析除去洗滌劑(detergent)。將超過濾的殘餘溶液濃縮以將其濃度調整至所欲之劑量，其為0.1至1mg/ml的OMPC，並藉由在無菌的0.2μm孔徑膠囊中過濾滅菌。
獲得奈米粒子佐劑
VSSP GM3(18:1)
首先，腦膜炎雙球菌的OMPC分散在反應器中含有脫氧膽酸鈉(sodium deoxycholate)(10-40mM)和十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate)之混合物的(1-10mM)Tris-HCL緩衝溶液中，並且攪拌時間範圍為1至36小時。接著，加入質量為OMPC的0.1至3倍之合成神經節苷脂(GM3 18:1)，並且延長攪拌時間。而後，藉由超過濾或透析除去洗滌劑。將超過濾的殘餘溶液濃縮以將其濃度調整至所欲之劑量，其為0.1至1mg/ml的OMPC，並藉由在無菌的0.2μm孔徑膠囊中過濾滅菌。
具有
VSSP GM3(18:0)
作為佐劑之
HER1
、
HER1+HER2
與
HER3
的製備
用於誘導有效的特異性體液免疫反應之本發明的較佳疫苗組成物(其含有HER1或HER1+HER2或HER3作為生長因子受體和VSSP GM3(18:0)作為佐劑)由以下方法製備：在溶液中或冷凍乾燥的HER1或HER1+HER2或HER3抗原的各個小瓶的內容物以及VSSP GM3 18:0溶液，預先儲存在4和20℃之間，在注射之前於病患床邊分別混合10-30分鐘，使得抗原質量的最終比例和VSSP GM3(18:0)的最終比例(根據OMPC含量)在300μg至2mg的範圍內。
具有
VSSP GM3(18:1)
作為佐劑之
HER1
、
HER1+HER2
與
HER3
的製備
用於誘導有效的特異性細胞免疫反應之本發明的較佳疫苗組成物(其含有HER1或HER1+HER2或HER3作為生長因子受體和VSSP GM3(18:1)作為佐劑)由以下方法製備：在溶液中或冷凍乾燥的HER1或HER1+HER2或HER3抗原的各個小瓶的內容物以及VSSP GM3(18:1)溶液，預先儲存在4和20℃之間，在注射之前於病患床邊分別混合10-30分鐘，使得抗原質量的最終比例和VSSP GM3(18:1)的最終比例(根據OMPC含量)在300μg至2mg的範圍內。
具有
VSSP GM3(18:0)
作為佐劑之
GnRHm1-TT
胜肽疫苗組成物的製備
藉由在生物合成過程中用L-脯胺酸(EHWSYPLRPG)取代其通常在天然GnRH(EHWSYGLRPG)序列中佔第六個位置的胺基酸L-甘胺酸，以製備GnRHm1-TT胜肽。為了完成其建構(construct)，在合成過程中，依照固相方法(Hougten et al.,(1986)Biotechniques 4: 522-6)，添加破傷風類毒素(tetanus toxoid)的表位(epitope) QYIKANSKFIGITEL
(Junco JA et al (2007) Vaccine 25: 8460-68)；用於本發明目的之如此製備的胜肽在下文中稱為PyrGnRHm1-TT。
用於誘導有效的特異性體液免疫反應之本發明的較佳疫苗組成物(其含有PyrGnRHm1-T和VSSP GM3(18:0)作為佐劑)可由以下方法製備：在溶液中或冷凍乾燥的PyrGnRHm1-TT抗原的各個小瓶的內容物以及VSSP18:0，預先儲存在4和20℃之間，在注射之前於病患床邊分別混合10-30分鐘，使得抗原質量的最終比例和VSSP GM3(18:0)的最終比例(根據OMPC含量)在600μg至4mg的範圍內。
實例
實例
1.
在攜帶
MCA203
腫瘤的小鼠中投予
VSSP GM3 (18:1)
不會增加脾臟中
CD11b+GR1+
細胞的數量。
在第0天藉由SC途徑用1×106
個MCA203細胞接種四組雌性C57BL/6小鼠(每組3隻動物)。接著，在第11、12與18天，藉由SC途徑將VSSP GM3(天然來源)、VSSP GM3(18:1)與VSSP GM3(18:0)(200μg的OMPC)注射至三組的小鼠，第四組小鼠留著作為未處理的對照組且對其投予磷酸鹽緩衝液。在第22天，犧牲動物並藉由流式細胞術分別分析萃取的脾臟以確定CD11b+
Gr1+
細胞的數量。若與剛接受緩衝液的帶腫瘤小鼠相比，用VSSP GM3(18:1)(圖1)處理的動物顯示出相似數量的這些調節細胞。在另一方面，在注射VSSP GM3(天然來源)與VSSP GM3(18:0)的動物之脾臟中，CD11b+
Gr1+
細胞顯著增加(相同字母p＞0.05，不同字母p＜0.05，ANOVA和Tukey測試)。
實例
2.
與
OVA/VSSP GM3(
天然來源
)
和
OVA/VS3 GM3(18:0)
相比，用
OVA/VSSP GM3(18:1)
疫苗接種誘導
T CD8+
細胞的特異性細胞毒性增加三倍。
在以三種不同配方的OVA抗原(一種使用VSSP GM3(天然來源)奈米粒子，另一種用VSSP GM3(18:1)以及第三種使用VSSP GM3(18:0)作為佐劑)進行免疫作用的雌性C57BL/6小鼠(每組3隻動物)中比較活體內CTL抗原特異性反應。在第0、1與7天SC投予疫苗(200μgOMPC)。平行地，從用CFSE(在37℃下5分鐘)差異標記的幼小動物獲得脾細胞。在與SIINFEKL胜肽(1μM，37℃和5%CO2
下90分鐘)培養後，將高度標記細胞(Highly labelled cell)(5μM)作為標的細胞，而不加載胜肽的較低標記細胞(lower labelled cells)(0.33μM)作為對照組。在最後一次免疫作用之後，進行洗滌以去除自由胜肽(free peptide)，並且以相同比例混合兩種脾細胞並且注射至接種疫苗的動物中。16小時後，取出接種疫苗之小鼠的腹股溝淋巴結，藉由流式細胞術測量兩種螢光強度。根據公式：100-[(CFSE高/CFSE低)×100]，計算特異性細胞溶解(specific lysis)的百分比。OVA/VSSP GM3(18:1)疫苗(圖2)誘導60%特異性細胞溶解，其值比OVA/VSSP GM3(天然來源)和OVA/VSSP GM3(18:0)疫苗所造成的高了近3倍。
實例
3.
與包含從天然來源獲得的
GM3
之奈米粒子相比，在治療性癌症疫苗中使用含有
GM3(18:1)VSSP
作為佐劑的奈米粒子改善其抗腫瘤效果。
在第0天用3×105
個EG.7腫瘤細胞(遺傳修飾的EL4胸腺瘤(thymoma)的變體，以表現OVA作為neo抗原)SC接種三組雌性C57BL/6小鼠(每組10隻動物)。接著，在第4、5與11天，用兩種不同的OVA疫苗配方進行藉由SC途徑的三次連續免疫作用：第一次(200μg/劑量)在VSSP GM3(天然來源)中佐劑化，第二次在VSSP GM3(18:1)(200μg/劑量)中佐劑化。第三組小鼠用相同方案注射磷酸鹽緩衝液並作為實驗的對照組。接種腫瘤後7天，每週測量腫瘤體積(tumor volume，TV)兩次。當腫瘤顯示壞死或腫瘤直徑超過17mm時，將動物犧牲。在實驗的第20天(圖3)，觀察到OVA/VSSP GM3(18:1)治療性疫苗相對於OVA/VSSP GM3(天然來源)配方的優勢(TV平均：VSSP GM3(18:1)560mm3
；天然740mm3
；對照組1640mm3
)(p=0.037ANOVA以及Tukey測試)。更重要地，發現在用OVA/VSSP GM3(18:1)製劑治療的組中，儘管EG7是侵略性模型(aggressive model)，50%的動物仍未顯示腫瘤進展(在控制組中，發現100%的動物有腫瘤進展(progression))。在用OVA/VSSP GM3(天然來源)疫苗接種的動物中，只有20%顯示沒有進展(p=0.012，卡方測試(Chi square test))。
實例
4.
藉由
HER3/VSSP GM3
疫苗製劑
(18:0)
誘導高效價的
HER3
特異性抗體。
用含有200μg的HER3 ECD混合200μg的GM3 VSSP(18:0)之疫苗製劑對BALB/c小鼠(n=5)進行SC免疫作用。在第0、14、28與42天，進行免疫作用(immunization)。在第35天(第一次萃取(extraction))和第56天(第二次萃取)萃取血液以處理血清，並藉由ELISA測定針對HER3 ECD的特異性抗體效價。用10μg/mL的HER3 ECD塗覆測量盤(plate)並在37℃培養。在阻擋(blocking)之後，加入血清稀釋液(1/100、1/1000、1/5000、1/10000)。使用抗鼠IgG Ab/過氧化物酶共軛物(peroxidase conjugate)(Sigma)和相應的受質(substrate)顯現反應。
經免疫的小鼠發展特異性IgG，效價高達1/5000(圖4)。此結果證實GM3 VSSP(18:0)活化針對非常差的免疫原性抗原(例如自體腫瘤抗原)的體液免疫反應之潛力。
實例
5.
藉由在
VSSP GM3(18:0)
或
VSSP GM3(
天然來源
)
中佐劑化的二價
HER1+HER2
疫苗誘導特異性
IgG
之比較。
用含有在200μg的VSSP GM3(天然來源)(第1組)或200μg的VSSP GM3(18:0)(第2組)中佐劑化之100μg的HER1 ECD和100μg的HER2 ECD的混合物之疫苗製劑，對於BALB/c小鼠(n=5)進行免疫作用。在第0、14和28天，藉由SC途徑進行免疫作用。在第35天進行血液萃取與處理。藉由ELISA測定針對HER1和HER2 ECD的特異性抗體效價。為此，將盤塗覆5μg/mL的HER1 ECD或5μg/mL的HER2 ECD，並在37℃下培養。在阻擋(blocking)之後，加入血清稀釋液(1/100、1/1000、1/10 000、1/50 000、1/100 000)。使用抗鼠IgG Ab/鹼性磷酸酶共軛物和相應的受質(substrate)顯現反應。免疫前血清(pre-serum)作為陰性對照組(negative control)。
所有免疫的小鼠皆發展特異性IgG Ab。與使用VSSP GM3(天然來源)作為佐劑的第1組中產生的Ab效價相比，對於HER1 ECD特異性的抗體效價在第2組較高，該組使用的佐劑是GM3 VSSP(18:0)(圖5a)。在另一方面，即使以針對HER2 ECD產生的特異性抗體而言，在第1組和第2組中誘導的Ab效價之間沒有顯著差異，第2組中的效價也有增加的趨勢，其中該組疫苗製劑具有GM3 VSSP(18:0)作為佐劑。鑑於在識別HER2 ECD中觀察到的趨勢，使用從免疫血清中單離的純化的多株抗體(polyclonal antibody，PcAb)進行針對HER2 ECD次結構域(在絲狀噬菌體(filamentous phage)上表現的次結構域I、II、III和IV)之效價測定(titration)。為此目的，用10μg/mL的PcAb塗覆ELISA盤並在37℃下培養。而後，加入表現HER2之不同次結構域的噬菌體樣品，並用與過氧化物酶複合(conjugated)的抗噬菌體抗體(GE-Healthcare)偵測比色信號。來自使用GM3 VSSP(18:0)作為佐劑的動物的PcAb顯示比使用VSSP GM3(天然來源)的動物所純化的抗體對於HER2 ECD次結構域I、III和IV具有更高的反應性(圖5b)。
實例
6.
與使用
VSSP GM3(
天然來源
)
作為佐劑化的疫苗相比，用
VSSP GM3(18:0)
佐劑化的
HER1+HER2
二價疫苗誘導的抗體對於
HER1+/HER2+
腫瘤細胞株具有較高的識別。
用含有在200μg的VSSP GM3(天然來源)或200μg的VSSP GM3(18:0)中佐劑化之100μg的HER1 ECD和100μg的HER2 ECD的混合物之疫苗製劑，對於BALB/c小鼠(n=5)進行SC免疫作用。在第0、14和28天，進行免疫作用，並且使用相當於第35天的血清，藉由流式細胞術評估對於表現HER1與HER2(A431外陰上皮癌(ATCC-CRL 1555)、H125非小細胞肺癌(ATCC-CRC 5801)與SKBR3乳癌(ATCC-HTB 30))的腫瘤細胞株之識別。為了進行測量，用含有2%胎牛血清之磷酸鹽緩衝鹽水阻擋(block)來自每種細胞株的105
個細胞，而後用1/200稀釋之來自每個處理組的血清混合物培養。使用抗鼠IgG Ab/FITC(Sigma)共軛物並藉由在流式細胞儀中獲得至少5000個細胞來觀察在特異性Ab與腫瘤細胞中HER1和HER2受體的結合。在評估的每組中，使用免疫前血清的混合物作為陰性對照組。由VSSP GM3(18:0)佐劑化的疫苗製劑誘導的血清以更高的強度識別所評估的腫瘤細胞株(圖6)。
實例
7.
與使用
VSSP GM3(
天然來源
)
的組成物相比，在
GM3 VSSP(18:0)
中佐劑化的二價
HER1+HER2
疫苗誘導抗體對於
H125
腫瘤細胞株的存活性
(viability)
影響增加。
將H125細胞(105
)與從BALB/c小鼠(其以含有1/20稀釋倍數之GM3 VSSP(18:0)或VSSPGM3(天然來源)中佐劑化之100μg的HER1 ECD和100μg的HER2 ECD的混合物之二價疫苗製劑每15天以三劑量進行免疫)獲得的血清之混合物培養72小時。免疫前血清的混合物以相同的稀釋倍數作為陰性對照組，而使用10μM的AG1478酪胺酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor)作為陽性對照組。使用MTT比色測定法進行免疫血清對於細胞存活性的影響之測定，在540nm和630nm下進行吸光度讀數。細胞存活性由下式確定：細胞存活性 (%) 
與使用VSSP GM3(天然來源)的組成物相比，在GM3 VSSP(18:0)中佐劑化的疫苗誘導的血清顯著降低細胞存活性。(圖7)
實例
8.
與使用
VSSP GM3(
天然來源
)
的製劑相比，在
GM3 VSSP(18:0)
中佐劑化的
HER1
疫苗誘導對
HER1+
腫瘤細胞株具有更高反應性的
Ab
。
用含有在400μg的VSSP GM3(天然來源)或400μg的VSSP GM3(18:0)中佐劑化之200μg的HER1 ECD的疫苗製劑，對於C57BL/6小鼠(n=5)進行SC免疫作用。在第0、14、28和42天進行免疫作用，而在第56天，藉由流式細胞術對動物進行放血以評估針對強表現HER1的MDA-MB468乳癌細胞株(ATCC-HTB 132)的血清反應性。基本上，用含有2%胎牛血清的磷酸鹽緩衝鹽水阻擋(block)105
個細胞，而後用來自每個處理組的1/100稀釋的血清混合物培養。藉由抗鼠IgG Ab/FITC(Sigma)共軛物和藉由在流式細胞儀中獲得至少5000個細胞來觀察與腫瘤細胞的HER1受體結合的特異性Ab。所評估的每組之免疫前血清混合物作為陰性對照組。與使用VSSP GM3(天然來源)的組成物相比，在VSSP GM3(18:0)中佐劑化的疫苗所誘導的血清與腫瘤細胞更強烈地反應(圖8)。
實例
9.
與使用
VSSP GM3(
天然來源
)
的組成物相比，在
VSSP GM3(18:0)
中佐劑化的
HER1
疫苗誘導
Ab
增加抑制
HER1
活化之能力。
用以下疫苗製劑之一對四組C57BL/6小鼠(n=5)進行SC免疫作用：
第 1 組：
在200μg的VSSP GM3(天然來源)中佐劑化的200μg的HER1-ECD
第 2 組：
在200μg的GM3 VSSP(18:0)中佐劑化的200μg的HER1-ECD
第 3 組：
在400μg的VSSP GM3(天然來源)中佐劑化的200μg的HER1-ECD
第 4 組：
在400μg的GM3 VSSP(18:0)中佐劑化的200μg的HER1-ECD
在第0、14、28、42天進行免疫作用，並且使用相當於第56天的血清評估所產生的Ab在EGF存在下抑制HER1磷酸化(phosphorylation)的能力。簡而言之，將H292肺癌細胞(CRL1848)與1/100稀釋的血清混合物培養2小時。接著，用100ng/mL的EGF刺激細胞10分鐘以誘導HER1的活化。藉由西方點墨法，使用用於偵測磷酸化的HER1和β-肌動蛋白的特異性Ab測量血清對HER1磷酸化的影響。用EGF處理的細胞作為HER1活化的對照組。將1/100稀釋倍數的免疫前血清的混合物作為HER1抑制的陰性對照組，而使用10μM的AG1478酪胺酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor)作為陽性對照組。將實驗照片提交進行密度測定(densitometry)分析以進行數據標準化(data normalization)。從使用GM3 VSSP(18:0)作為佐劑的疫苗免疫的動物獲得的血清在磷酸化方面表現出比使用VSSP GM3(天然來源)組成物注射的小鼠組的血清有更強的對HER1受體活化的抑制，在200μg和400μg劑量下也是如此(圖9)。此結果證實含有GM3 VSSP(18:0)的疫苗作為佐劑在誘導的體液免疫反應的品質方面的優勢。
實例
10. PyrGnRHm1-TT/VSSP GM3(18:0)
疫苗配方對於哥本哈根大鼠的前列腺之影響。
使用8-12週年齡的雄性哥本哈根大鼠。將動物分成3組，每組10隻動物。
第 1 組：
注射安慰劑(Montanide ISA 51 VG/VSSP GM3(18：0)
第 2 組：
用PyrGnRHm1-TT/Montanide ISA 51 VG進行免疫作用
第 3 組：
用PyrGnRHm1-TT/Montanide ISA 51 VG/VSSP GM3(18:0)進行免疫作用
關於免疫原(immunogen)的製備，將
PyrGnRHm1-TT胜肽分散在蒸餾水與VSSP奈米粒子中直到它達到最終濃度為在250μL中有750μg的胜肽與120μg的VSSP。而後，用Montanide ISA 51 VG按比例配製此混合物50:50(v/v)。大鼠每兩週頻率接受4次免疫作用(immunization)。
與用安慰劑進行免疫作用相比，用Montanide ISA 51 VG乳化的PyrGnRHm1-TT胜肽免疫作用產生前列腺尺寸顯著降低(p＜0.05)。然而，當胜肽PyrGnRHm1-TT在VSSP GM3(18:0)存在下乳化時(p＜0.01)，此差異更大得多(圖10)。
實例
11.
使用
PyrGnRHm1-TT
胜肽誘導
R3327-H Dunning
模型中的抗腫瘤反應
將Dunning R3327-H鼠腫瘤模型的(2×2×2mm)腫瘤片段(fragment)SC移植至成年哥本哈根大鼠植的右後肢的遠端區域。將動物分為接受不同處理的四組：
第 1 組：
安慰劑：
Montanide ISA 51 VG / VSSP GM3 (18:0)
第 2 組：
去勢的(castrated)
第 3 組：
用PyrGnRHm1-TT胜肽/Montanide ISA 51 VG進行免疫作用
第 4 組：
用PyrGnRHm1-TT胜肽/Montanide ISA 51 VG/VSSP GM3 (18:0)進行免疫作用
當腫瘤達到直徑約10mm的時候，開始用相應的疫苗進行免疫作用。每15天投予共7次免疫作用。
雖然觀察到安慰劑組(第1組)腫瘤明顯增長(圖11)，但去勢的與經免疫作用的組別(第2、3和4組)顯示對腫瘤生長的顯著抑制(p＜0.01)。在用VSSP GM3(18:0)存在下乳化的PyrGnRHm1-TT胜肽進行免疫作用的大鼠中，此效果更加顯著(p=0.005)。
圖 1.
藉由流式細胞術測量攜帶MCA203腫瘤並用含有不同GM3分子種類的VSSP奈米粒子處理的小鼠脾臟中CD11b+
GR1+
細胞的累積。
圖 2.
藉由流式細胞術測量用OVA/VSSP GM3 (18：1)、OVA/VSSP GM3(18：0)和OVA/VSSP GM3 (天然來源)免疫的小鼠中誘導的活體內抗原特異性CTL反應。
圖 3.
使用VSSP奈米粒子作為含有不同GM3分子種類的佐劑的OVA疫苗處理的EG7模型中的抗腫瘤作用。圖顯示在實驗的第20天每組的腫瘤體積的個別值及其平均。虛線表示的值是當低於該值時，腫瘤被分類為沒有進展。在右邊，顯示治療而沒有腫瘤進展的各組中動物的頻率。
圖 4.
藉由ELISA測量在VSSP GM3 (18:0)中佐劑化的HER3疫苗製劑所誘導的IgG效價(titer)。
圖 5a.
藉由ELISA測量VSSP GM3 (18:0)中佐劑化的HER1 + HER2二價疫苗製劑與VSSP GM3(天然來源)中佐劑化者所誘導之針對HER1和HER2特異性Ab效價的比較。
圖 5b.
藉由ELISA測量VSSP GM3 (18:0)中佐劑化的二價HER1 + HER2疫苗製劑與VSSP GM3(天然來源)中佐劑化者所誘導之針對DEC-HER2次結構域(subdomain)的特異性Ab效價的比較。
圖 6.
藉由流式細胞術測量GM3 VSSP (18:0)中佐劑化的二價疫苗製劑HER1 + HER2與VSSP GM3(天然來源)中佐劑化者所誘導的抗體對HER1+/HER2+之識別的比較。
圖 7.
藉由MTT比色測定法(MTT colorimetric assay)測量對GM3 VSSP (18:0)中佐劑化的二價HER1 + HER2疫苗製劑與VSSP GM3(天然來源)中佐劑化者所誘導之Ab對H125 HER1+/HER2+腫瘤細胞存活性(viability)的影響之比較。
圖 8.
藉由流式細胞術測量GM3 VSSP (18:0)中佐劑化的HER1疫苗製劑與VSSP GM3(天然來源)中佐劑化者所誘導的抗體對腫瘤細胞株MDA-MB468(HER1+)的識別之比較。
圖 9.
藉由西方墨點法(Western Blot)測量VSSP GM3 (18:0)或VSSP GM3(天然來源)中佐劑化的HER1疫苗製劑所誘導的抗體對HER1活化的抑制作用之比較。
圖 10.
有和無VSSP GM3(18:0)的PyrGnRHm1-TT胜肽之免疫作用對哥本哈根大鼠前列腺(Copenhagen rat prostate)重量的影響。
圖 11.
植入Dunning R3327-H腫瘤細胞株的哥本哈根大鼠的腫瘤生長速率之評估。
Claims (11)
- 一種佐劑，其包括結合全合成的GM3神經節苷脂(ganglioside)與細菌腦膜炎雙球菌的外膜複合物的疏水性蛋白質所形成的奈米粒子，其中在該全合成的GM3神經節苷脂的神經醯胺中的該脂肪酸是選自由以下所組成之群組：- 硬脂酸(18：0)、及- 油酸(18：1)。
- 一種疫苗組成物，其包括申請專利範圍第1項之佐劑以及胜肽、多肽或蛋白質作為抗原。
- 如申請專利範圍第2項之疫苗組成物，其任選地包括選自由以下所組成之群組的另一佐劑：-明礬(alum)以及-油性佐劑。
- 如申請專利範圍第2項之疫苗組成物，其中該抗原為生長因子受體的細胞外結構域或其部分。
- 如申請專利範圍第4項之疫苗組成物，其中該生長因子受體為單獨的HER1、HER2、HER3或其組合。
- 如申請專利範圍第2項之疫苗組成物，其中該抗原是PyrGnRHm1-TT胜肽。
- 如申請專利範圍第2至6項中任一項之疫苗組成物，其係用於製造治療癌症的藥物。
- 如申請專利範圍第2至6項中任一項之疫苗組成物，其係用於製造治療致癌病毒(oncogenic virus)的慢性病毒感染的藥物。
- 一種如申請專利範圍第1項之佐劑用於製造刺激抗原特異性體液免疫反應的藥物之用途，其中該脂肪酸是硬脂酸(18：0)。
- 一種如申請專利範圍第1項之佐劑用於製造刺激抗原特異性細胞免疫反應的藥物之用途，其中該脂肪酸是油酸(18：1)。
- 一種如申請專利範圍第1項之佐劑的組合用於製造優化病患之抗原特異性體液與細胞免疫反應的藥物之用途。
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