BR112020008668A2 - nanopartículas que contêm variantes sintéticas de gangliosídeo gm3 como adjuvantes em vacinas - Google Patents
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Abstract
A presente invenção refere-se à forma de obter adjuvantes nanoparticulados baseados em variantes sintéticas diferentes do gangliosídeo GM3. Dependendo da estrutura fina do ácido graxo presente na ceramida do GM3 sintético, podem ser obtidos adjuvantes que servem para estimular especificamente e de uma maneira especializada a imuno resposta humoral ou celular contra antígenos acompanhantes. Em particular, a presente invenção provê composições vacinais imunogênicas que compreendem peptídeos, polipeptídeos ou proteínas e as nanopartículas acima mencionadas, que são formadas através da dispersão de proteínas hidrofóbicas do complexo da membrana externa (CPME) da bactéria Neisseria meningitidis com variantes totalmente sintéticas do gangliosídeo GM3.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "NANO- PARTÍCULAS QUE CONTÊM VARIANTES SINTÉTICAS DE GAN- GLIOSÍDEO GM3 COMO ADJUVANTES EM VACINAS",
[001] A presente invenção refere-se aos campos da imunonano- tecnologia e da imuno-oncologia, especialmente com as vacinas tera- pêuticas para o tratamento de indivíduos com câncer e/ou infecções crônicas causadas por vírus oncogênicos. Ela descreve em particular- mente adjuvantes nanoparticulados especializados especificamente em estimular os imuno efetores celulares ou humorais nestes pacien- tes e também provê as composições vacinais correspondentes.
[002] Depois de décadas de resultados mal sucedidos em ensai- os clínicas, o campo das vacinas terapêuticas de câncer não conse- guiu se transformar em um tratamento eficaz e de baixa toxicidade com benefício para os pacientes. Os êxitos clínicos recentes obtidos com os anticorpos (Acs) immune checkpoint inhibitors incentivaram o interesse comercial e científico na imuno-oncologia, incluindo as vaci- nas de câncer. A partir desta perspectiva, os fracassos destas vacinas terapêuticas podem ter sido devidos a fatores tais como uma seleção incorreta dos antígenos, o emprego de veículos/adjuvantes relativa- mente ineficientes e o emprego das ditas vacinas de forma isolada, na ausência de uma combinação com outros imunomoduladores que permitem corrigir o efeito negativo exercido pelo microambiente tumo- ral (Branca M.A. e colabs. (2016) Nat Biotech 34(10): 1019-24).
[003] Tradicionalmente, as vacinas de câncer têm empregado em sua formulação proteínas que são classificadas como os próprios antí- genos associados a tumores que, embora se expressem de forma desviada nas células tumorais, também estão presentes nos tecidos normais. A falta de evidências sólidas da eficácia na clínica dessas vacinas pode ser devida em parte ao processo de tolerância central através do qual ocorre a eliminação das células T que têm receptores de alta avidez contra a maior parte desses próprios antígenos (Tran E. e colabs. (2017) Nat Immunol 18(3): 255-62). Portanto, o êxito das va- cinas de câncer baseadas nesse tipo de antígenos irá depender do uso de novos adjuvantes especializados com capacidade de potencia- lizar uma resposta específica de células T efetoras, relativamente fraco no início, de forma tal que se convertem em tumor em uma fonte de neo-antígenos de maneira natural. Isto permite mobilizar uma podero- sa ação de linfócitos T citotóxicos (LTC) multiespecífica e personaliza- da, capaz de erradicar lesões malignas.
[004] Recentemente, o estado da técnica reflete uma mudança na valoração dos antígenos para a elaboração de vacinas de câncer bem-sucedidas que consiste na seleção de neo-antígenos tumorais. Uma fonte atrativa destes neo-antígenos advém da detecção persona- lizada das mutações tumorais individuais. Outra fonte mais limitada deste tipo de antígeno provém das sequências de proteínas virais on- cogênicas. Embora a vantagem destes peptídeos murados é que eles são novos para o sistema imunológico (não estão presentes nos teci- dos normais) e, portanto, mais imunogênicos, o êxito das novas vaci- nas elaboradas com estes neo-antígenos também irá depender de no- vos adjuvantes que sejam capazes de maximizar as respostas de LTC, procurando uma disponibilidade ideal do antígeno mediante uma per- sistência local que permita a sua apresentação pelas células apresen- tadoras de antígeno (APC) em um contexto de maturação acertado e adicionalmente corrigir o efeito imunossupressor do microambiente tumoral. Por outro lado, a identificação de verdadeiros neo-epítopos é um procedimento ineficaz na prática. Os estudos de sequência identifi- cam milhares de mutações somáticas em tumores individuais e os programas bioinformáticos predizem centenas de peptídeos mutados com capacidade de se unir a MHC específicos. Mas a grande maioria desses neo-epítopos não se encontra nos tumores reais quando estes se isolam e são estudados por espectrometria de massa e, pior ainda, apenas uns poucos deles têm a capacidade de estimular uma resposta LTC. Isto significa que a metodologia vigente de predição e validação de neo-epítopos está longe de poder ser usada rotineiramente para levar a imunoterapia personalizada à prática clínica (Editorial, (2017) Nat Biotech 35(2): 97).
[005] Em todo tipo de vacinas, a seleção do adjuvante apropriado é um elemento crucial para obter o êxito desejado. O objetivo essenci- al de uma vacina terapêutica de câncer é induzir a ativação e prolifera- ção de linfócitos B, T e mediadores da imunidade inata de forma tal que apareçam imuno efetores humorais e celulares capazes de reco- nhecer e destruir as células tumorais, proporcionando um aumento na sobrevivência e qualidade de vida dos pacientes. Neste sentido, um adjuvante ideal deve em primeiro lugar otimizar a disponibilidade dos antígenos para as APC. Em segundo lugar, deve obter uma estimula- ção eficaz dessas APC para que expressem os sinais coestimuladores necessários e secretem citocinas e quimioquinas específicas. Em ter- ceiro lugar, deve poder modular o MAT de maneira tal que os efeitos imunossupressores sejam neutralizados. Hoje não existe na prática um adjuvante com todas essas características.
[006] Tal como explicam Khong H. e colabs. (Khong H. e colabs. (2016) J Immunother Cancer 4: 56), dentro das variantes de adjuvan- tes para vacinas de câncer que se evidenciam com maior interesse estão as micro e nanopartículas devido às quais podem ter várias das propriedades desejadas, entre elas também atuar como veículos vaci- nais. Esses preparados em partículas podem ser elaborados de forma tal que é possível dirigir com eficácia o antígeno acompanhante a APC específicas, mediante a regulação dos tamanhos de partícula, da rigi-
dez e da carga líquida. Vacinas em partículas com diâmetros na faixa de 500 a 2.000 nm são de preferência capturadas pela APC no sítio de injeção e movidas aos linfonodos (LN), enquanto que as partículas en- tre 20 e 200 nm drenam passivamente aos LN onde são tomadas pe- las APC residentes. As micro e nanopartículas mais utilizados para estes fins são lipossomas, proteolipossomas, polímeros sintéticos e polímeros naturais. As vantagens e limitações de cada um desses sis- temas foram descritas em detalhes no estado da técnica.
[007] Particularmente pertinente para esta invenção é a descrição por Xu F. e colabs. (Xu F. e colabs. (2016) Acs Nano Vol. 10: 1189- 1200) de um adjuvante nanoparticulado sintético que contém o gangli- osídeo GM3 em sua composição. Esse adjuvante foi obteve ao recu- perar nanopartículas de ouro de diâmetros entre 40 e 80 nm com uma membrana lipídica onde foi inserido o gangliosídeo GM3. Desta forma, é possível usar vantajosamente o princípio da interação específica de glicolípido-receptor para efetuar a direcionalização, em particular a in- teração de sialil-lactose com Siglec1 (CD169), marcador que está su- perexpresso em células dendríticas (DC) ativadas, protagonistas da sinapse com as células T CD4+ nos LN. Embora essas nanopartículas revestidas com GM3 possam ser acumuladas in vivo seletivamente nas DC CD169+ presentes nos LN popliteais, não há evidências de suas possibilidades como adjuvante em experimentos de imunização com antígenos de referência nem tampouco nenhuma evidência de eficácia em modelos tumorais. Por outro lado, este princípio só é fun- cional em nanopartículas na faixa de diâmetros entre 40 e 80 nm.
[008] Molina e colabs. descrevem na patente US 7.776.346 for- mas de preparar imunógenos eficazes mediante a associação de pro- teolipossomas de tamanho muito pequeno (VSSP), formados mediante a conjugação hidrofóbica ao complexo de proteínas da membrana ex- terna (CPME) da bactéria Neisseria meningitidis com o gangliosídeo
GM3 com determinados antígenos pouco imunogênicos, o que pode ser considerado como a solução técnica mais próxima à presente in- venção. Por sua vez, a forma de obter essas VSSP foi descrita com certo detalhe por Rodríguez e colabs. na patente US 6.149.921, enfati- zando que o gangliosídeo GM3 que é empregado para obter estes pro- teolipossomas deve ser obtida de fontes biológicas, principalmente da massa de hibridomas resultante da produção industrial de Acs mono- clonais. Do mesmo modo, Estévez e colabs. (Estévez e colabs. (2000) Vaccine Vol. 18: 90-197), ensinam que também é possível produzir esses VSSP mediante o emprego de GM3 obtido a partir de eritrócitos caninos. Tal como, por exemplo, ensinam Lee H e colabs. (Lee H e colabs. (2011) Int J Mass Spectr Vol 305: 138-150) é sabido no estado da técnica que o gangliosídeo GM3 obtido de qualquer fonte natural é constituído por uma mistura variável de diferentes espécies molecula- res onde a composição do oligossacarídeo é fixa, mas varia a cerami- da, aparecendo tipos diferentes de ácido graxo. Além da inconveniên- cia de empregar componentes de origem animal ou tumoral para pro- duzir preparados farmacêuticos, o emprego de GM3 de origem biológi- ca impede razoavelmente a obtenção de VSSP com as características altamente reprodutíveis necessárias.
[009] É procedente estabelecer em relação à presente invenção que nenhuma solução técnica anterior ou publicação científica descre- ve variantes de VSSP, obtidos em um processo de fabricação que emprega diferentes GM3 totalmente sintéticos com estrutura quimica- mente definida, que têm a surpreendente propriedade de que o seu uso especializado como adjuvante de vacinas terapêuticas depende, em última instância, do gangliosídeo GM3 molecularmente homogêneo empregado em sua obtenção e como a dita especialização contribui com adjuvantes com propriedades vantajosas com respeito ao VSSP produzido com GM3 proveniente de fontes biológicas. Portanto, a no-
vidade da presente invenção consiste na provisão de dois novos adju- vantes nanoparticulados do tipo VSSP. Um deles emprega o ganglio- sídeo GM3 totalmente sintético cuja ceramida contém ácido esteárico GM3 (18:0) e é útil principalmente para induzir potentes respostas de Acs contra antígenos acompanhantes. O outro adjuvante é obtido me- diante o emprego do gangliosídeo GM3 totalmente sintético cuja ce- ramida contém ácido oleico GM3 (18:1) e é particularmente eficaz na indução de respostas efetoras específicas de células LTC.
[0010] Em uma modalidade, os objetos da presente invenção são adjuvantes que compreendem nanopartículas formadas mediante a associação de variantes totalmente sintéticas do gangliosídeo GM3 a proteínas hidrofóbicas do complexo de membrana externa da bactéria N. meningitidis, e em particular estes adjuvantes possuem o ácido es- teárico ou o ácido oleico na ceramida do gangliosídeo GM3.
[0011] Em um segundo aspecto, a presente invenção refere-se a composições vacinais que compreendem os adjuvantes nanoparticu- lados acima mencionados e peptídeos, polipeptídeos ou proteínas co- mo antígeno e eventualmente outro adjuvante que pode ser a alumina ou um adjuvante oleoso, sem nenhuma limitação a estes. Em particu- lar, os antígenos que fazem parte dessas composições vacinais são os domínios extracelulares dos receptores de fatores de crescimento ou porções destes tais como HER1, HER2 ou HER3 sozinhos ou combi- nados; ou o peptídeo PyºGnNRHm1-TT, gerado a partir do hormônio GnRH. As ditas composições vacinais podem ser empregadas na fa- bricação de um medicamento para o tratamento do câncer ou de in- fecções virais crônicas com vírus oncogênicos.
[0012] Em uma modalidade particular, a presente invenção refere- se ao uso das composições vacinais que compreendem os adjuvantes nanoparticulados objeto da presente invenção, quer estejam sozinhos ou combinados, na estimulação da imuno resposta específica de antí- geno humoral ou celular de um paciente.
[0013] Além disso, um objeto da presente invenção é um método de tratamento para administrar a um indivíduo com necessidade das mesmas as composições vacinais da presente invenção por via subcu- tânea (SC), intradérmica, intramuscular, intratumoral ou por aplicação direta sobre as mucosas, com uma frequência quinzenal durante pelo menos um total de cinco doses de indução e posteriormente doses mensais de manutenção por pelo menos seis meses. As ditas compo- sições podem ser administradas de maneira simultânea, escalonada ou alternada.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Composições vacinais
[0014] As composições vacinais que são empregadas na presente invenção são formadas mediante a união do adjuvante nanoparticula- do formado mediante a dispersão de proteínas hidrofóbicas do CPME da bactéria N. meningitidis com variantes totalmente sintéticas do gan- gliosídeo GM3 a peptídeos, polipeptídeos ou proteínas como antíge- nos, em particular os domínios extracelulares completos dos recepto- res de fatores de crescimento ou porções destes, hormônios associa- dos em determinadas etapas com a progressão tumoral, tal como a GnRH, sem nenhuma limitação a esta.
[0015] O tipo de ácido graxo que contém a ceramida do gangliosí- deo GM3 que faz parte dos VSSP da presente invenção vai ficar de- pendendo da intencionalidade da vacina; no caso em que se deseje favorecer uma resposta do Acs, será utilizado o ácido esteárico (GM3 18:0) ao passo que, quando se deseja uma resposta LTC será empre- gado o ácido oleico (GM3 18:1). Também é possível induzir no hospe- deiro uma resposta dual de Acs e LTC contra o mesmo antígeno ao combinar de maneira conveniente as imunizações com ambas as for-
mulações vacinais. Tanto os VSSP que contêm GM3 (18:0) quanto aqueles que têm GM3 (18:1) podem ser usados sozinhos ou fazendo parte de adjuvantes combinados com outros agentes tais como a alu- mina ou adjuvantes oleosos, sem nenhuma limitação a apenas estes últimos.
[0016] As composições vacinais da presente invenção que utilizam o GM3 (18:0) como adjuvante induzem uma maior qualidade em com- paração com as formulações vacinais que empregam como adjuvante o gangliosídeo obtido de uma fonte natural em termos de: a resposta humoral, o reconhecimento de linhas tumorais, a inibição da ativação dos receptores nas células tumorais, assim como a diminuição da via- bilidade das mesmas.
[0017] As composições vacinais da presente invenção que utilizam o GM3 (18:1) como adjuvante induzem uma maior qualidade em com- paração com as formulações vacinais que empregam como adjuvante o gangliosídeo obtido de uma fonte natural em termos de: a resposta LTC. Aplicação terapêutica e métodos de tratamento
[0018] A presente invenção provê composições vacinais especiali- zadas em induzir respostas de Acs ou LTC, contra a família dos recep- tores de fatores de crescimento, o que constitui uma solução peculiar- mente útil para esse sistema antigénico de interesse em imuno- oncologia, onde é sabido que tanto a resposta de Acs quanto as res- postas LTC especificas são eficazes mas difíceis de otimizar em uma só formulação vacinal e com um só esquema de administração.
[0019] Também é proposto na presente invenção a introdução de formulações vacinais especializadas em gerar títulos elevados de Acs neutralizantes contra hormônios associados em determinadas etapas, com a progressão tumoral, em particular a GNRH, embora sem ne- nhuma limitação a este hormônio.
[0020] Outro objeto da presente invenção é a provisão de compo- sições vacinais terapêuticas com capacidade de gerar potentes res- postas de Acs ou LTC específicas, sobretudo em pacientes imu- nocomprometidos que sofrem de câncer ou infecções virais crônicas com vírus oncogênicos.
[0021] As composições vacinais da presente invenção podem ser introduzidas no paciente por via: SC, intradérmica, intramuscular, intra- tumoral ou por aplicação direta sobre as mucosas.
[0022] Entre os tipos de câncer que podem ser tratados com as composições vacinais objeto da presente invenção estão incluídos os carcinomas de origem epitelial. Mais particularmente, entre os exem- plos desses cânceres estão incluídos o câncer de células epiteliais es- camosas, o câncer de pulmão incluindo aquele de células pequenas, aquele de células não pequenas, o adenocarcinoma do pulmão e o carcinoma escamoso do pulmão, o câncer hepatocelular, o câncer gástrico incluindo o gastrointestinal, o câncer do pâncreas, da cabeça e do pescoço, o gliobastoma, o câncer cervical, do ovário, do fígado, da bexiga, da mama, do cólon, do reto, o câncer coloretal, do útero, da mama, da próstata, o carcinoma de glândulas salivais, do rim, da prós- tata, da vulva, da tireóide, o carcinoma anal e o carcinoma do pênis.
[0023] A faixa de dose a ser empregada em seres humanos dos domínios extracelulares dos receptores de fatores de crescimento ou porções destes nas composições vacinais da presente invenção fica entre 200 ug e 1 mg, de preferência de 400 ug a 900 ug. A faixa de dose a ser empregada da GnRH nas composições vacinais da presen- te invenção fica entre 500 ug e 3 mg, de preferência de 1 mg a 2,5 mg. Os VSSP são administrados em uma faixa entre 100 ug e 1 mg, de preferência de 200 ug a 600 ug (de acordo com o conteúdo do CPME).
[0024] As ditas composições são administradas nos indivíduos com uma frequência quinzenal durante pelo menos um total de cinco doses de indução e posteriormente doses mensais de manutenção por pelo menos seis meses. Se for desejado induzir no hospedeiro uma resposta dual de Acs e LTC contra o mesmo antígeno, podem ser combinadas as imunizações com ambas as formulações vacinais de maneira simultânea, escalonada ou alternada. Obtenção do adjuvante nanoparticulado VSSP GM3 (18:0)
[0025] Em primeiro lugar, o CPME de N. meningitidis é dispersado em uma solução tampão de Tris-HCL que contém uma mistura de de- soxicolato de sódio (10 a 40 mM) e dodecil sulfato de sódio (1 a 10 mM) em um reator com agitação por um tempo entre 1 e 36 horas. À seguir, é adicionada uma massa do gangliosídeo sintético (GM3 18:0) entre 0,1 e 3 vezes a massa adicionada do CPME e a agitação é am- pliada. Em seguida, os detergentes são eliminados através de um sis- tema de ultrafiltração ou diálise. A solução remanescente ultrafiltrada é concentrada para ajustar a sua concentração à dosagem desejada en- tre 0,1 e 1 mg/ml de CPME e é esterilizada por meio de filtração em cápsula estéril com tamanho de poro de 0,2 um. Obtenção do adjuvante nanoparticulado VSSP GM3 (18:1)
[0026] Em primeiro lugar, o CPME de N. meningitidis é dispersado em uma solução tampão de Tris-HCL que contém uma mistura de de- soxicolato de sódio (10 a 40 mM) e dodecil sulfato de sódio (1 a 10 mM) em um reator com agitação por um tempo entre 1 e 36 horas. À seguir, é adicionada uma massa do gangliosídeo sintético (GM3 18:1) entre 0,1 e 3 vezes a massa adicionada de CPME e a agitação é am- pliada. Em seguida, os detergentes são eliminados através de um sis- tema de ultrafiltração ou diálise. A solução remanescente ultrafiltrada é concentrada para ajustar a sua concentração à dosagem desejada en- tre 0,1 e 1 mg/ml de CPME e é esterilizada por meio de filtração em cápsula estéril com tamanho de poro de 0,2 um. Preparação das composições vacinais de HER1, HER1 +HER2 E
HER3 com o VSSP GM3 (18:0)
[0027] A composições vacinais preferidas na presente invenção que contêm HER1 ou HER1 +HER2 ou HER3 como receptores de fa- tores de crescimento e VSSP GM3 (18:0) como adjuvante e cuja finali- dade é obter a indução de uma potente imuno resposta humoral espe- cífica podem ser preparadas da seguinte forma: o conteúdo de frascos individuais do antígeno HER1 ou de HER1 +HER2 ou HER3 em solu- ção ou liofiizados, e VSSP GM3 18:0, conservados entre 4 e 20ºC, são misturados em separado durante 10 a 30 minutos ao lado do leito do paciente antes de ser injetado, de forma tal que a proporção final da massa de antígeno e de VSSP GM3 (18:0) (de acordo com o con- teúdo do CPME) esteja na faixa de 300 ug a 2 mg. Preparação das composições vacinais de HER1, HER1 +HER2 E HER3 com o VSSP GM3 (18:1)
[0028] As composições vacinais preferidas na presente invenção que contêm HER1 ou HER1 +HER2 ou HER3 como receptores de fa- tores de crescimento e de VSSP GM3 (18:1) como adjuvante e cuja finalidade é obter a indução de uma potente imuno resposta celular específica podem ser preparadas da seguinte forma: o conteúdo dos frascos individuais de antígeno HER1 ou de HER1I1 +HER2 E HER3, em solução ou liofilizados, e VSSP GM3 (18:1), conservados entre 4 e 20ºC, são misturados em separado durante 10 a 30 minutos ao lado do leito do paciente antes de ser injetado, de forma tal que a propor- ção final da massa do antígeno e de VSSP GM3 (18:1) (de acordo com o conteúdo do CPME) esteja na faixa de 300 ug a 2 mg. Preparação das composições vacinais de GARHmM1-TT VSSP GM3 (18:0)
[0029] O peptídeo GNRHm1-TT foi gerado mediante a substituição no processo biossintético do aminoácido L-Glicina da sexta posição que normalmente ocupa na sequência da GNRH natural (EHWSYGL-
RPG), por uma L-Prolina (EHWSYPLRPG). Para completar a sua construção, no próprio processo de síntese foi adicionado o epítopo QYIKANSKFIGITEL do toxoide tetânico (Junco J.A. e colabs. (2007) Vaccine 25: 8460-68), de acordo com o método de fase sólida (Houg- ten e colabs, (1986) Biotecniques 4:522-6); para os efeitos da presente invenção, de agora em diante o dito peptídeo será denominado PyrGnNRHm1-TT.
[0030] As composições vacinais preferidas na presente invenção que contêm PyrGnRHm1-TT e VSSP GM3 (18:0) como adjuvante e cuja finalidade é obter a indução de uma potente imuno resposta hu- moral específica podem ser preparadas da seguinte forma: os conteú- dos dos frascos individuais do antígeno PyrGnNRHm1-TT em solução ou liofilizado, e de VSSP 18:0, conservados entre 4 e 20ºC, são mistu- rados em separado durante 10 a 30 minutos ao lado do leito do paci- ente antes de injetar os mesmos, de forma tal que a proporção final da massa de antígeno e de VSSP GM3 (18:0) (de acordo com o conteúdo de CPME) esteja na faixa de 600 ug a 4 mg.
[0031] Figura 1. Acumulação de células CD11b+GR1+ no baço de ratos portadores do tumor MCAZO03 e tratados com nanopartículas de VSSP contendo diferentes espécies moleculares de GM3, medida por citometria de fluxo.
[0032] Figura 2. Resposta de CTL específica de antígeno in vivo induzida em ratos imunizados com OVA/VSSP GM3 (18:1), OVA/VSSP GM3 (18:0) e OVA/VSSP natural medida por citometria de fluxo.
[0033] Figura 3. Efeito antitumoral no modelo EG7 do tratamento com vacinas de OVA e nanopartículas adjuvantes de VSSP contendo diferentes espécies moleculares de GM3. A gráfica mostra os valores individuais de volume tumoral de cada grupo e sua média, no 20º dia do experimento. A linha descontínua representa o valor abaixo do qual foi considerado que os tumores não progrediram. À direita é mostrada a frequência de animais em cada grupo que não tiveram progressão tumoral com os tratamentos.
[0034] Figura 4. Títulos de Acs IgG induzidos pelo preparado vaci- nal HER3 adjuvado em VSSP GM3 (18:0), medidos por ensaio ELISA.
[0035] Figura 5a. Comparação de títulos de Acs específicos versus HERI e HER2 induzidos pelo preparado vacinal bivalente HER1+HER2 adjuvado em VSSP GM3 (18:0) com o adjuvado em VSSP natural, medidos por ensaio ELISA.
[0036] Figura 5b. Comparação de títulos de Acs específicos versus os subdomínios de DEC-HER?2 induzidos pelo preparado vacinal biva- lente de HERI+HER2 adjuvado em VSSP GM3 (18:0) com o adjuvado em VSSP natural, medidos por ensaio ELISA.
[0037] Figura 6. Comparação do reconhecimento de linhas tumo- rais de HER1 +/HER2+ por Acs induzidos pelo preparado vacinal biva- lente de HER1 +HER2 adjuvado em VSSP GM3 (18:0) com o adjuva- do em VSSP natural, medidos por citometria de fluxo.
[0038] Figura 7. Comparação do efeito de Acs induzidos pelo pre- parado vacinal bivalente de HERI+HER2 adjuvado em VSSP GM3 (18:0) com o adjuvado em VSSP natural em relação à viabilidade da linha tumoral H125 HER1+/HER2+, medidos por ensaio calorimétrico de MTT.
[0039] Figura 8. Comparação do reconhecimento da linha tumoral MDA-MB468 (HER1+) por Acs induzidos pelo preparado vacinal HER1 adjuvado em VSSP GM3 (18:0) com respeito ao adjuvado em VSSP natural, medidos por citometria de fluxo.
[0040] Figura 9. Comparação da inibição da ativação de HER1 por Acs induzidos pelo preparado vacinal HER1 adjuvado em VSSP GM3 (18:0) com respeito ao adjuvado em VSSP natural medida por Western
Blot.
[0041] Figura 10. Efeito da imunização com o peptídeo PyrGn- RHm1-TT com e sem VSSP GM3 (18:0) no peso da próstata de ratos Copenhagen.
[0042] Figura 11. Avaliação da velocidade de crescimento tumoral em ratos Copenhagen implantados com a linha tumoral Dunning R3327-H.
EXEMPLOS Exemplo 1. A administração de VSSP GM3 (18:1) em ratos porta- dores do tumor MCAZ203 não aumenta o número de células CD11 b+GR1 + no baço.
[0043] Quatro grupos de ratos C57BL/6 fêmeas (3 animais por grupo) foram inoculados pela via SC no dia O com 1 x 10º células de MCAZ203. Em seguida, nos dias 11, 12 e 18, foram injetados VSSP na- tural, VSSP GM3 (18:1) e VSSP GM3 (18:0) (200 ug de CPME) pela via SC aos ratos de três desses grupos, e o quarto grupo ficou como controle não tratado ao qual foi administrado tampão de fosfato. No dia 22 os animais foram sacrificados e os baços extraídos processados individualmente para determinar por citometria de fluxo o número de células CD11b*Gr1*. Pôde ser apreciado (Figura 1) como nos animais tratados com VSSP GM3 (18:1) a média da quantidade dessas células esplênicas não aumentou em relação à média da quantidade induzida pelo tumor nos animais do grupo de controle. Por outro lado, os valo- res médios das quantidades dessas células CD11b+Gr1+ aumentaram de maneira significativa nos baços dos animais injetados com VSSP natural e VSSP GM3 (18:0) (mesmas letras p > 0,05; letras diferentes Pp < 0,05, testes ANOVA e Tukey). Exemplo 2. A vacinação com OVA/VSSP GM3 (18:1) induz três ve- zes mais citotoxicidade específica das células T C08+, em compa- ração com OV A/VSSP natural e OVA/VSSP GM3 (18:0).
[0044] A resposta LTC específica de antígeno in vivo foi avaliada de modo comparativo em ratos fêmeas C55BL/6 (3 animais por grupo) imunizadas com três formulações diferentes do antígeno OVA, empre- gando como adjuvantes nanopartículas de VSSP natural, VSSP GM3 (18:1) ou VSSP GM3 (18:0). As vacinas foram administradas pela via SC nos dias O, 1 e 7 (200 ug de CPME). Paralelamente, foram obtidos esplenócitos de animais virgens que foram marcados de maneira dife- rencial com CFSE (5 min a 37ºC). As células de marcação alta (5 uM) foram usadas como células brancas ao serem pulsadas com o peptí- deo SIINFEKL (1 uM; 90 min a 37ºC e 5% de CO»), enquanto que as células de marcação baixa (0,33 uM) foram usadas como controle sem carga peptídica. Depois da última imunização, foi feita uma lavagem para remover o peptídeo livre e ambos os tipos de esplenócitos foram misturados em proporções iguais e injetados nos animais vacinados. Depois de transcorridas 16 horas, foram extraídos os gânglios linfáti- cos inguinais dos ratos vacinados e então foi medido por citometria de fluxo o total de eventos correspondentes às duas intensidades de fluo- rescência. A porcentagem de lise específica foi calculadas de acordo com a fórmula: 100 - [[CFSEaro/CFSEpaixo) X 100]. Tal como é observa- do na Figura 2, a vacina de OVA/VSSP GM3 (18:1) induz cerca de 60% de lise específica, um valor quase três vezes maior que aquele alcançado pelas vacinas de OVA/VSSP natural e OVA/VSSP GM3 (18:0).
Exemplo 3. O emprego de nanopartículas adjuvantes VSSP GM3 (18:1) em vacinas terapêuticas de câncer tem maior efeito antitu- moral do que aquelas que empregam VSSP natural.
[0045] Três grupos de ratos C57BL/6 fêmeas (10 animais por gru- po) foram inoculados pela via SC no dia O com 3 x 10º células de EG.7 (variante de timoma EL4 modificado geneticamente para expressar OVA como neo-antígeno tumoral). A seguir, nos dias 4, 5 e 11, foram realizadas 3 imunizações SCs sucessivas com duas formulações vaci- nais diferentes de OVA (50 ug/dose) adjuvada em VSSP natural e a segunda formulação adjuvada em VSSP GM3 (18:1) (200 ug/dose). O terceiro grupo de ratos foi injetado com tampão de fosfato com a mesma frequência e foi usado como controle do experimento. A partir do 7º dia de inoculação, o volume tumoral (VT) do tumor foi medido 2 vezes por semana. Os animais foram sacrificados quando o tumor evi- denciou necrose ou quando o tamanho tumoral excedeu 17 mm de diâmetro. No 20º dia do experimento (Figura 3) foi apreciada a vanta- gem da vacina terapêutica de OVA/VSSP GM3 (18:1) em relação à formulação de OVA/VSSP natural (médias de VT: VSSP GM3 (18:1) 560 mm?; VSSP natural 740 mm; controle 1.640 mm*') (p = 0,037 tes- tes ANOVA e Tukey). Foi mais importante verificar como no grupo tra- tado com o preparado OVA/VSSP GM3 (18:1) 50% dos animais não evidenciaram progressão tumoral em um modelo agressivo como EG7 (grupo de controle com 100% de animais em progressão). Dos animais vacinados com OVA/VSSP natural, apenas 20% puderam evitar a pro- gressão (p = 0,012, teste de Chi quadrado).
Exemplo 4. Indução de altos títulos de Acs específicos por HER3, pelo preparado vacinal HER3/VSSP GM3 (18:0).
[0046] Ratos da linha BALB/c (n = 5) foram imunizados pela via SC com um preparado vacinal que continha 200 ug de DEC-HER3 misturados com 200 ug de VSSP GM3 (18:0). As imunizações foram realizadas nos dias 0, 14, 28 e 42. O sangue foi extraído para proces- sar o soro no 35º dia (1º extração) e no 56º dia (2º extração) e por meio de ensaio ELISA foram determinados os títulos de Acs específi- cos versus DEC-HER3. Para tal, as placas foram revestidas com 10 pg/ml de DEC-HER3, e incubadas a 37ºC. Depois do bloqueio corres- pondente, foram adicionadas diluições do soro (1/100, 1/1.000, 1/5.000, 1/10.000). A reação foi visualizada ao utilizar um conjugado de Acs anti-lgG murino/peroxidase (Sigma), e o substrato da enzima correspondente.
[0047] Os ratos imunizados desenvolveram Acs específicos de iso- tipo IgG, que alcançaram títulos de até 1/5.000 (Figura 4). Este resul- tado demonstra a capacidade de VSSP GM3 (18:0) de ativar o ramo humoral do sistema imunológico contra antígenos muito pouco imuno- gênicos tais como os antígenos tumorais autólogos. Exemplo 5. Indução de maiores títulos de Acs IgG específicos do preparado vacinal bivalente HERI+HER2 adjuvado em VSSP GM3 (18:0) com respeito ao adjuvado em VSSP natural.
[0048] Ratos da linha BALB/c (n = 5) foram imunizados com os preparados vacinais que continham a mistura de 100 ug de DEC- HER1 e 100 ug de DEC-HER?2 adjuvado em 200 ug de VSSP natural (Grupo 1) ou 200 ug de VSSP GM3 (18:0) (Grupo 2). As imunizações foram realizadas pela via SC nos dias 0, 14 e 28. O sangue foi extraí- do para processar o soro no 35º dia. Por meio da técnica ELISA, foram determinados os títulos de Acs específicos versus DECs de HER1 e HER2. Para tal, as placas foram revestidas com 5 pg/ml de DEC- HER1 ou 5 ug /ml de DEC-HER2, e foram incubadas a 37ºC. Depois do bloqueio correspondente, foram adicionadas diluições do soro (1/100, 1/1.000, 1/10.000, 1/50.000, 1/100.000). A reação foi visualiza- da ao utilizar um conjugado anti-lgG murino/fosfatase alcalina (Sigma), e o substrato da enzima correspondente. O soro pré-imune foi utilizado como controle negativo.
[0049] Todos os ratos imunizados desenvolveram Acs específicos de isotipo IgG. Os títulos de Acs específicos pelo DEC-HER1 foram superiores no Grupo 2, onde o adjuvante utilizado foi o VSSP GM3 (18:0), com respeito aos títulos de Acs desenvolvidos no Grupo 1, no qual o adjuvante foi o VSSP natural (Figura 5a). Por outro lado, embo- ra para os Acs específicos versus DEC-HER2 não foram obtidas dife-
renças significativas entre os títulos de Acs induzidos nos Grupos 1 e 2, houve uma tendência para um aumento dos títulos no Grupo 2, no qual o preparado vacinal utilizou o VSSP GM3 (18:0) como adjuvante. Dada a tendência observada no reconhecimento de DEC-HER?2, foi realizada uma titulação dos anticorpos policlonais purificados (AcPs) a partir dos soros imune contra os subdomínios de DEC-HER2: subdo- mínios |, Il, Ill e IV, expressos em relação a fagos filamentosos. Para tal, as placas de ELISA foram revestidas com 10 pg/ml dos AcPs e in- cubadas a 37ºC. Em seguida foram adicionadas as amostras de fagos que expressam os diferentes subdomínios de HER2 e o sinal calorimé- trico foi desenvolvido com um anticorpo anti-fago conjugado a peroxi- dase (GE-Healthcare). Pode ser apreciado na (Figura 5b) que os AcPs provenientes de animais nos quais o VSSP GM3 (18:0) foi empregado como adjuvante, tiveram mais reatividade contra os subdomínios |, Ill e IV do DEC-HER2, que os anticorpos provenientes de animais nos quais o VSSP natural foi empregado como adjuvante.
Exemplo 6. Maior reconhecimento de linhas tumorais HER1 +/HER2+ pelos Acs induzidos pelo preparado vacinal bivalente HER1+HER2 adjuvado em VSSP GM3 (18:0) com respeito ao adju- vado em VSSP natural.
[0050] Ratos da linha BALB/c (n = 5) foram imunizados pela via SC com preparados vacinais que continham a mistura de 100 ug de DEC-HER1 e 100 ug de DEC-HER2 adjuvada em 200 ug de VSSP natural ou adjuvada em 200 ug de VSSP GM3 (18:0). As imunizações foram realizadas nos dias O, 14 e 28, e no 35º dia o soro correspon- dente foi utilizado para avaliar o reconhecimento de linhas tumorais que expressam HER1 e HER?2. As linhas utilizadas foram: carcinoma epitelial de vulva A431 (ATCC-CRL 1555), carcinoma de pulmão de células não pequenas H125 (ATCC-CRC 5801) e carcinoma de mama SKBR3 (ATCC-HTB 30). A medição foi feita por meio de citometria de fluxo. Para tal, 10º células de cada linha celular foram bloqueadas com soro fetal de vitela a 2% em solução salina de tampão de fosfato e em seguida incubadas com uma diluição 1/200 de uma mistura de soros de cada grupo tratado. A união dos Acs específicos aos receptores HER1 e HER2 nas células tumorais foi visualizada ao utilizar um con- jugado de Ac anti-lgG murino/isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Sigma) e por meio da aquisição de 5.000 células como mínimo no ci- tômetro de fluxo. Como controle negativo, foi utilizada uma mistura de soros pré-imunes para cada grupo avaliado. Os soros induzidos pelo preparado vacinal adjuvado em VSSP GM3 (18:0) reconheceram com maior intensidade as células das linhas tumorais avaliadas (Figura 6). Exemplo 7. Maior diminuição da viabilidade da linha tumoral H125 causada pelos Acs induzidos pelo preparado vacinal bivalente HER1+HER2 adjuvado em VSSP GM3 (18:0) com respeito ao adju- vado em VSSP natural.
[0051] Células da linha H125 foram incubadas durante 72 horas 105, com misturas de soro diluídas 1/20 provenientes de ratos BALB/c imunizados com três doses a cada quinze dias dos preparados vaci- nais bivalentes da mistura de 100 ug de DEC-HER1 e 100 ug de DEC- HER?2, adjuvado em VSSP GM3 (18:0) ou em VSSP natural. Como controle negativo, foi utiizada uma mistura de soros pré-imunes à mesma diluição dos soros imunes. Como controle positivo, foram utili- zados 10 uM do inibidor de tirosina cinase AG1478. A determinação do efeito dos soros imunes sobre a viabilidade celular foi feita por meio do ensaio calorimétrico de MTT, e a leitura das absorbâncias foi feita a 540 nm e a 630 nm. A viabilidade celular foi determinada por meio da fórmula: Viabilidade celular (%) = (AS40nm — A630nm) soro imune X 100 (AS40nm — A630nm) soro pré-imune
[0052] A Figura 7 mostra que os soros induzidos pelo preparado vacinal adjuvado em VSSP GM3 (18:0) diminuíram de maneira signifi- cativa a viabilidade celular com respeito ao preparado vacinal adjuva- do em VSSP natural. Exemplo 8. Maior reconhecimento de linhas tumorais HER1+ pe- los Acs induzidos pelo preparado vacinal HER1I adjuvado em VSSP GM3 (18:0) com respeito ao adjuvado em VSSP natural.
[0053] Ratos da linha C57BL/6 (n = 5) foram imunizados pela via SC com os preparados vacinais que continham 200 ug de DEC-HER1 adjuvado em 400 ug de VSSP natural ou adjuvado em 400 ug de VSSP GM3 (18:0). As imunizações foram realizadas nos dias O, 14, 28 e 42, e no 56º dia o soro correspondente foi utilizado para avaliar o reconhecimento da linha de carcinoma de mama MDA-MB468 (ATCC- HTB 132), que apresenta uma alta expressão de HER1I em sua mem- brana. A medição foi feita por meio da tecnologia de citometria de flu- xo. Para tal, 10º células da linha celular foram bloqueadas com soro fetal de vitela a 2% em solução salina de tampão de fosfato e em se- guida foram incubadas com uma diluição 1/100 da mistura de soros de cada grupo tratado. A união dos Acs específicos aos receptores HER1 nas células tumorais foi visualizada ao utilizar um conjugado de Ac an- ti-lgG murino/FITC (Sigma) e através da aquisição de 5.000 células como mínimo no citômetro de fluxo. Como controle negativo, foi utili- zada uma mistura de soros pré-imunes para cada grupo avaliado. Os soros induzidos pelo preparado vacinal adjuvado em VSSP GM3 (18:0) reconheceram com maior intensidade as células da linha tumo- ral avaliada (Figura 8). Exemplo 9. Maior inibição da ativação de HER1 pelos Acs induzi- dos pelo preparado vacinal HER1 adjuvado em VSSP GM3 (18:0) com respeito ao adjuvado em VSSP natural.
[0054] Foram empregados ratos da linha C57BL/6 que foram divi- didos em quatro grupos (n = 5), e foram imunizados pela via SC com os preparados vacinais a seguir:
[0055] Grupo 1: 200 ug de DEC-HER1 adjuvado em 200 ug de VSSP natural Grupo 2: 200 ug de DEC-HER1 adjuvado em 200 ug de VSSP GM3 (18:0)
[0056] Grupo 3: 200 ug de DEC-HER1 adjuvado em 400 ug de VSSP natural Grupo 4: 200 ug de DEC-HER1 adjuvado em 400 ug de VSSP GM3 (18:0)
[0057] As imunizações foram realizadas nos dias 0, 14, 28e 42, e no 56º dia o soro correspondente foi utilizado para avaliar a capacida- de dos Acs gerados de inibir a fosforilação de HER1 na presença de EGF. Para tal, as células da linha de carcinoma pulmonar H292 (CRL 1848) foram incubadas durante 2 horas com uma mistura de soros, a uma diluição de 1/100. Em seguida, as células foram estimuladas com 100 ng/ml de EGF durante 10 minutos para induzir a ativação de HER1. O efeito dos soros sobre a fosforilação de HER1 foi medido por meio da técnica de Western Blot, ao utilizar Acs específicos para a de- tecção de HER1 fosforilado e B-actina. Como controle de ativação de HER1 foram utilizadas células tratadas com EGF. Como controle ne- gativo de inibição de HER1 foi empregada uma mistura de soros pré- imunes, a uma diluição de 1/100, e como controle positivo de inibição foram utilizados 10 uM do inibidor de tirosina cinase AG1478. A foto- grafia obtida foi utilizada para realizar a densitometria que permitiu normalizar os dados.
[0058] Os soros dos grupos que foram imunizados com os prepa- rados vacinais que utilizaram como adjuvante o VSSP GM3 (18:0) ini- biram ainda mais a ativação do receptor HER1 em termos de fosforila- ção do que os soros dos grupos que empregaram o VSSP natural co- mo adjuvante tanto à dose de 200 ug quanto à dose de 400 ug, sendo mais marcante esta inibição na dose de 400 ug (Figura 9). Este resul- tado demonstra a superioridade do preparado vacinal que contém co-
mo adjuvante o VSSP GM3 (18:0) em termos de qualidade da imuno resposta humoral induzida. Exemplo 10. Efeito sobre a próstata da formulação vacinal PyrGnRHm1-TTVSSP GM3 (18:0) em ratos Copenhagen.
[0059] Foram utilizados ratos Copenhagen machos de 8 a 12 se- manas de idade. Os animais foram divididos em 3 grupos de 10 ani- mais cada um.
[0060] Grupo 1: Placebo (Montanide ISA 51 VG/VSSP GM3 18:0
[0061] Grupo 2: Imunizado com PyrºGnRHm1-TT/Montanide ISA 51 vG
[0062] Grupo 3: Imunizado com Pyr"GnRHm1-TT/Montanide ISA 51 VG/VSSP GM3 18:0
[0063] Para a preparação do imunógeno, o peptídeo PyrGNRHm1- TT foi ressuspenso em água destilada e VSSP até alcançar uma con- centração final de 750 ug de peptídeo e 120 ug de VSSP/250 ul. Então essa mistura foi formulada proporcionalmente 50:50 (v/v) com Monta- nide ISA 51 VG. Os animais receberam 4 imunizações com uma fre- quência quinzenal.
[0064] A imunização com o peptídeo Pyr(GNRHm1-TT emulsionado em Montanide ISA 51 VG produziu uma diminuição significativa do ta- manho da próstata, em comparação com o placebo (p < 0,05). Esta diferença, no entanto, foi muito maior quando o peptídeo Pyºr(GNRHm1- TT foi emulsionado com VSSP (p < 0,01) (Figura 10). Exemplo 11. Indução de resposta antitumoral no modelo Dunning R3327-H ao empregar o peptídeo PyrGnNRHm1-TT
[0065] Ratos Copenhagen adultos foram transplantados com SC na zona distal da extremidade posterior direita com fragmentos de tu- mor de (2 x 2 x 2 mm) do modelo tumoral murino Dunning R3327-H. Os animais foram divididos em quatro grupos que receberam diferen- tes tratamentos:
[0066] Grupo 1: Placebo: Montanide ISA 51 VG/VSSP GM3 18:0
[0067] Grupo 2: Castrados
[0068] Grupo 3: Imunizados com o peptídeo PyrGnRHm1- TT/Montanide ISA 51 VG
[0069] Grupo 4: Imunizados com o peptídeo PyrGnRHm1- TT/Montanide ISA 51 VG/VSSP GM3 18:0
[0070] Quando os tumores alcançaram um diâmetro de cerca de mm, as imunizações foram iniciadas de acordo com o tratamento correspondente para cada grupo. Foi realizado um total de 7 imuniza- ções a cada 15 dias.
[0071] Na Figura 11 se observa no grupo placebo (Grupo 1) um crescimento abrupto do tumor, a diferença dos grupos castrados e imunizados (Grupos 2, 3 e 4), onde se vê uma marcante inibição do crescimento tumoral (p < 0,01). Esta diferença foi mais significativa na variante Pyr(GNRHm1-TT emulsionada com VSSP GM3 18:0 (p = 0,005).
Claims (18)
1. Adjuvante, caracterizado pelo fato de que compreende nanopartículas formadas por meio da associação de variantes total- mente sintéticas do gangliosídeo GM3 a proteínas hidrofóbicas do complexo de membrana externa da bactéria Neisseria meningitidis.
2. Adjuvante, de acordo com a reivindicação 1, caracteriza- do pelo fato de que o ácido graxo presente na ceramida do gangliosí- deo GM;3 é o ácido esteárico (18:0).
3. Adjuvante, de acordo com a reivindicação 1, caracteriza- do pelo fato de que o ácido graxo presente na ceramida do gangliosí- deo GM3 é o ácido oleico (18:1).
4. Composição vacinal, caracterizada pelo fato de que compreende um adjuvante nanoparticulado, como definido em qual- quer uma das reivindicações 1 a 3, e peptídeos, polipeptídeos ou pro- teínas como antígeno.
5. Composição vacinal, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que compreende eventualmente um outro adjuvante selecionado do grupo que compreende: alumina e um adju- vante oleoso.
6. Composição vacinal, de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizada pelo fato de que o antígeno consiste em domínios ex- tracelulares dos receptores de fatores de crescimento ou porções dos mesmos.
7. Composição vacinal, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, caracterizada pelo fato de que os receptores de fatores de crescimento são HER1, HER2, HER3, sozinhos ou combi- nados.
8. Composição vacinal, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, caracterizada pelo fato de que o antígeno é o peptídeo PyrGNRHm1-TT.
9. Composição vacinal, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 8, caracterizada pelo fato de que serve para a fabri- cação de um medicamento para o tratamento do câncer.
10. Composição vacinal, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 8, caracterizada pelo fato de que serve para a fabri- cação de um medicamento para o tratamento de infecções virais crô- nicas com vírus oncogênicos.
11. Uso do adjuvante, como definido na reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que serve para estimular a imuno resposta humoral antígeno específica.
12. Uso do adjuvante, como definido na reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que serve para estimular a imuno resposta celular antígeno específica.
13. Uso da combinação de adjuvantes, como definidos na reivindicação 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que serve para otimi- zar a imuno resposta humoral e celular específica de antígeno em um paciente.
14. Uso das composições vacinais, como definidas em qualquer uma das reivindicações 4 a 8, caracterizado por ser para preparar um medicamento, em que o referido uso deve ser pela via SC, intradérmica, intramuscular, intratumoral ou diretamente sobre as mucosas, com uma frequência quinzenal durante pelo menos um total de cinco doses de indução e em seguida doses mensais de manuten- ção por pelo menos seis meses.
15. Uso, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que as composições vacinais são utilizadas de maneira simultânea, escalonada ou alternada.
16. Uso do adjuvante, como definido na reivindicação 2, caracterizado por ser para preparar um medicamento para estimular a imuno resposta humoral antígeno específica.
17. Uso do adjuvante, como definido na reivindicação 3, caracterizado por ser para preparar um medicamento para estimular a imuno resposta celular antígeno específica.
18. Uso da combinação de adjuvantes, como definidos na reivindicação 2 ou 3, caracterizado por ser para preparar um medica- mento para otimizar a imuno resposta humoral e celular específica de antígeno em um paciente.
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