BR112012022059B1 - Vacina de mucosa produtora de uma iga de mucosa antígenoespecífica e igg do sangue e método para produzir uma vacina de mucosa - Google Patents
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Abstract
vacina de mucosa produtora de uma iga de mucosa antígeno-específica e igg do sangue e método para produzir uma vacina de mucosa produtora de uma iga de mucosa antígeno-específica e uma igg do sangue. vacina de mucosa produtora de uma iga de mucosa antígeno específica e igg do sangue, em níveis capazes de exercer uma indução imune efetiva e um efeito preventivo de infecção, dita vacina sendo compreendendo: (a) um veículo ad consistindo de um peptídeo sintético e um lipídio, sendo que o peptídeo sintético e um lipidío, sendo que o peptídeo sintético consiste de sequências de aminoácidos knlm, onde n é de 4 a8 e m é de 11 a 20; (b) um polímero carboxivinil; e (c) uma proteína antigênica, em uma quantidade incapaz de produzir uma iga de mucosa suficiente e igg de sangue para exercer uma indução imune eficaz e um efeito de prevenção de infecção quando utilizado por si. a vacina de mucosa da invenção tem um anticorpo produzindo a capacidade que é mais potente do que aquelas vacinas de mucosa da técnica anterior, e como resultado, ela pode exercer um efeito excelente mesmo com uma quantidade extremamente pequena de um antígeno.
Description
[001] A presente invenção refere-se a uma vacina de mucosa indutora de uma IgA de mucosa e uma IgG do sangue eficazmente.
[002] Os documentos de patente 1 e 2 fazem uma descrição detalhada da falta de mérito nas vacinas ou toxóides inativados convencionais, bem como declaram atualmente a relação do desenvolvimento de vacinas e imuno-adjuvantes de mucosa.
[003] Como descrito nos documentos de patente 1 e 2, o requerimento da troca de uma vacina convencional sendo inoculada subcutaneamente ou intramuscularmente na vacina de mucosa induzindo a produção de um anticorpo IgA sobre a mucosa que é uma rota de infecção viral natural, é amplamente e profundamente reconhecida. Especialmente, como a próxima geração de vacina no século 21, é desejável desenvolver uma vacina de mucosa indutora da produção do anticorpo IgA, imunidade tópica ou imunidade de mucosa, e ser produzida de modo prático em todo o mundo, mas essa vacina ainda não foi conseguida.
[004] Na resposta a esses problemas, os inventores da presente invenção inventaram um veículo fármaco-antígeno (AD), que é um complexo de uma proteína B surfactante pulmonar e/ou uma proteína C surfactante pulmonar e um lipídio, e uma vacina de mucosa consistindo desse veículo AD e um antígeno (Documento de Patente 1). Os inventores da presente invenção também descobriram que através do ajuste da proporção em peso de V/A da quantidade do veículo AD (V) para a quantidade do antígeno (A), a produção seletiva de um anticorpo IgA e a produção de ambos, os anticorpos IgA e IgG são conversível, e então desenvolvida uma vacina de mucosa com base no referido mecanismo de ação (Documento de Patente 2). Os documentos de patente 1 e 2 também descrevem a eficácia de dos fragmentos (peptídeos) das proteínas B e C surfactantes pulmonares.
[005] Ademais, como resultado de um estudo sobre as várias variantes dos fragmentos de proteína surfactante pulmonar para seus efeitos melhorados na produção de anticorpo, os inventores da presente invenção inventaram um veículo AD compreendendo como um componente um peptídeo sintético KnLm (onde n é 4 a 8 e m é 11 a 20) o qual, apesar de ser um peptídeo de porte menor do que os peptídeos parciais descritos nos documentos de patente 1 e 2, tem um indutor de produção de anticorpo potente ou um efeito melhorado, especialmente para uma produção exclusiva de um anticorpo secretor de IgA, bem como um excelente e eficaz efeito indutor sobre a produção de ambas, a IgA secretora e a IgG do sangue, e uma vacina de mucosa consistindo desse veículo AD e um antígeno (Documento de Patente 3).
[006] Em uma formulação de gotas nasais cuja rota de administração é idêntica àquela para uma vacina de mucosa, com o propósito de aumentar a viscosidade para sustentar a eficácia contra uma polinose (alergia de pólen) ou uma alergia, um polímero carboxivinil (CVP) ou um hidroxipropil celulose (HPC) é empregada amplamente e um agente espessante tal como alginato de sódio também é empregado. Por exemplo, uma vacina de mucosa contendo HPC (documento de patente 4), uma formulação de vacina de mucosa contendo CVP (Documento de patente 5) e uma vacina influenza para spray nasal (Documento de Patente 6) também são conhecidos. O documento de patente 7 também descreve uma vacina de mucosa consistindo de um antígeno, um adjuvante [especialmente poli(I:C)] e um agente espessante (alginato de sódio e do gênero). Documento de Patente 1: WO 2005/097182 Documento de patente 2: WO 2007/018152 Documento de Patente 3: WO 2009/123119 Documento de patente 4: JP-A-2008-231343 Documento de Patente 5: WO 2001/017556 Documento de Patente 6: JP-A-03-38529 Documento de Patente 7: JP-A-2009-209086
[007] Embora a vacina de mucosa do documento de patente 3 tem uma capacidade de produção de anticorpo potente, tem um defeito, em comum com as outras vacinas de mucosa, ou seja, requer um antígeno em uma quantidade maior do que em uma vacina injetável percutaneamente.
[008] Para um tratamento eficaz com a vacina, uma vacina em uma quantidade suficiente para as áreas de prevalência de sua infecção alvo deve ser requerida, mas em vista da escala de produção do antígeno atual é difícil produzir uma quantidade aumentada na vacina de mucosa. Consequentemente é desejado transmitir uma capacidade de produção de anticorpo potente para a vacina de mucosa.
[009] Um objetivo da presente invenção é prover uma vacina de mucosa aperfeiçoada tendo uma capacidade mais potente na produção de anticorpos do que aqueles das vacinas de mucosa descritos no documento de patente 3 e, como resultando, sendo capaz de exercer um efeito excelente comparável a uma vacina injetável subcutaneamente, mesmo com uma quantidade extremamente pequena de um antígeno.
[0010] Os inventores, como meios para aperfeiçoar ainda a capacidade de indução dos anticorpos das vacinas de mucosa do documento de patente 3, os gelantes examinados (CVP, HPC) empregados em uma vacina de gotas nasais ou em uma vacina aplicável na mucosa se eles podem funcionar no veículo AD para aumentar a quantidade do antígeno a ser liberado para um antígeno presente na célula através do prolongamento da liberação nasal e, desse modo, indução de uma IgA imune da mucosa e uma IgG imune do sangue, e as informações a seguir foram confirmadas. (1) quando comparado com as vacinas de mucosa (antígeno + peptídeo sintético + lipídeo) no documento de patente 3 ou nas vacinas de mucosa (antígeno + CVP) nos documentos de patente 5 e 6, uma vacina de mucosa consistindo de “antígeno + peptídeo sintético + lipídeo + CVP” tem uma capacidade de indução de anticorpos excelente, e seu efeito excede o escopo de proteção previsto a partir de uma simples combinação do documento de patente 3 (antígeno + peptídeo sintético + lipídeo) e os documentos de patentes 5 e 6 (antígeno + CVP). (2) Um excipiente, HPC, conhecido amplamente como um gelante para uma vacina de mucosa similarmente a CVP, não tem a capacidade de indução do anticorpo, e pode não ser esperado que exerça um efeito indutor da IgA de mucosa e um indutor da IgG no sangue quando utilizado com um antígeno bem como um antígeno e um veículo AD. (3) mesmo quando reduzindo a quantidade do antígeno a cerca de 1/5 ou menos que a quantidade requerida na vacina de mucosa (antígeno + peptídeo sintético + lipídeos) no documento de patente 3, a vacina de mucosa “antígeno + peptídeo sintético + lipídios + CVP” tem um efeito mais potente na indução do anticorpo.
[0011] A invenção foi estabelecida com base nas novas descobertas acima.
[0012] Consequentemente, a invenção é uma vacina de mucosa produzindo uma IgA de mucosa e um IgG do sangue antígeno- específico em níveis capazes de exercer uma indução imune eficaz e um efeito preventivo da infecção, a qual compreende: (a) um veículo AD consistindo de um peptídeo sintético e um lipídio, onde o peptídeo sintético consistindo da sequência de aminoácidos KnLM (onde n é 4 a 8 e m é 11 a 20); (b) um polímero carboxivinil; e (c) uma proteína antigênica, em uma quantidade incapaz de produzir uma IgA de mucosa e uma IgG do sangue suficiente para exercer uma indução imune eficaz e um efeito preventivo da infecção quando utilizado sozinho.
[0013] Na vacina da mucosa da presente invenção, a proteína antígeno (c) está em uma quantidade, mesmo em combinação com o veículo AD (a) ou em combinação com o polímero carboxivinil (b), incapaz de produzir IgA de mucosa e IgG do sangue antígeno específico suficiente para exercer uma indução imune eficaz e um efeito preventivo da infecção.
[0014] Em um aspecto dessa vacina de mucosa, o peptídeo sintético consiste da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1 ou 2.
[0015] Em um outro aspecto dessa vacina de mucosa, o lipídio é pelo menos uma fosfatidil colina, dipalmitoilfosfatidil colina, fosfatidil serina, fosfatidil glicerol, fosfatidil inositol, fosfatidil etanolamina, ácido fosfatídico, ácido láurico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico e ácido oléico. Mais especificamente, os lipídios são uma mistura de dipalmitoilfosfatidil colina, fosfatidil glicerol e ácido palmítico.
[0016] Em um aspecto adicional dessa vacina de mucosa, o antígeno é um antígeno inativado derivado do patógeno, um antígeno purificado, um antígeno parcialmente purificado, um antígeno recombinante, uma toxina desintoxicada, ou um alergênico causador de uma alergia.
[0017] A presente invenção também se refere a um método para produzir uma vacina de mucosa produtora de uma IgA de mucosa e uma IgG do sangue antígeno-específico em níveis capazes de exercer uma indução imune eficaz e um efeito preventivo da infecção, o qual compreende: (a) um veículo AD consistindo de um peptídeo sintético e um lipídeo, onde o peptídeo sintético consistindo da sequência de aminoácidos KnLm (onde n é 4 a 8 e m é 11 a 20); (b) um polímero carboxivinil; e (c) uma proteína antigênica, em uma quantidade incapaz de produzir uma IgA de mucosa e uma IgG do sangue suficiente por exercer uma indução imune efetiva e um efeito preventivo da infecção quando utilizado sozinho, dito método compreendendo: [1] suspender os referidos (a) e (c) em água; [2] repetir o aquecimento e a agitação uma vez ou mais; [3] congelar e liofilizar; [4] suspender a forma liofilizada em salina fisiológica para ajustar a uma concentração predeterminada; e [5] adicionar uma solução ao referido (b).
[0018] Como utilizado aqui, a fase “quantidades de uma IgA de mucosa e uma IgG do sangue capaz de exercer uma indução imune eficaz” significa qualquer quantidade de IgA e IgG de modo que resulte na inibição dos valores de hemaglutinação (HI) do sangue não menor que o critério de avaliação internacional.
[0019] Na descrição a seguir, uma composição consistindo de um peptídeo sintético e lipídeos, pode ser referida como um “veículo AD”, e uma composição consistindo do veículo AD e um antígeno pode ser referida como uma “vacina de mucosa’. Esses “veículos AD” e a “vacina de mucosa” são substancialmente idênticas àquelas descritas no documento de patente 3. Adicionalmente, uma composição da vacina de mucosa combinada com um CVP pode ser referido como uma “vacina de mucosa adicionada de CVP”. Nessa invenção, os “lipídeos” abrangem a descrição dos documentos de patente 1 e 3, e o “peptídeo sintético” e o “veículo AD” abrangem a descrição do documento de patente 3.
[0020] A vacina de mucosa adicionada ao CVP da presente invenção tem um efeito indutor de anticorpos IgA e IgG em vacinas antígeno-específicas e uma inibição de hemaglutinação potente (HI) do anticorpo induzido, que excede o padrão de proteção internacional. Esses efeitos são extremamente marcados também quando comparado com as vacinas de mucosa descritos no documento de patente 3 ou a “vacina antígeno+CVP” (documentos de patente 5 e 6), e são efeitos excelentes que pode não ser previstos a partir do efeito da vacina de mucosa do documento 3 ou do efeito CVP dos documentos de patente 5 e 6.
[0021] Devido à referida capacidade de indução potente do anticorpo, um efeito preventivo requerido pode ser acompanhado mesmo quando o antígeno estiver contido apenas em uma quantidade menor que aquela de uma vacina de mucosa convencional. Assim, a vacina de mucosa adicionada de CVP da presente invenção pode exercer um efeito de indução do anticorpo potente mesmo quando a quantidade do antígeno empregada for reduzida a 1/5 ou menor que a quantidade em uma vacina de mucosa convencional (antígeno + peptídeo sintético + lipídeos). Por exemplo, como mostrado no Experimento 2, a vacina de mucosa do documento de patente 3, usando um antígeno influenza como um antígeno, mostra um valor de inibição de hemaglutinação (HI) menor que HI=40, o qual é um critério de avaliação internacional de uma vacina influenza, mesmo quando a quantidade do antígeno é 0,2 μ g, enquanto a vacina de mucosa adicionada de CVP da invenção exibe um efeito de imunidade protetora excelente refletido pelos valores HI de 100 ou mais mesmo com uma quantidade de antígeno de 0,1 μ g ou 0,03 μ g.
[0022] Adicionalmente, a composição sozinha (veículo AD, CVP) da vacina de mucosa adicionada de CVP da invenção não tem efeito para as células de reconhecimento do estímulo do antígeno, e consequentemente, tem uma possibilidade extremamente baixa de desenvolvimento de um efeito colateral não esperado, tal como, doenças autoimunes ou exacerbação da alergia após vacinação devido a qualquer antígeno além de outro antígeno de vacina.
[0023] Ademais, de acordo com o método para produzir uma vacina de mucosa da presente invenção, uma vacina de mucosa tendo uma capacidade adicional maior de produção de IgA de mucosa e IgG do sangue antígeno-especifica pode ser produzida.
[0024] A figura 1 ilustra os resultados do Experimento 1, os quais indicam os níveis de IgA na lavagem nasal (esquerda) e os níveis de IgG do soro (direita) quando os camundongos são tratados nasalmente tanto com as vacinas do Exemplo 1 e dos Exemplos Comparativos 1 a 5 ou um antígeno HA;
[0025] A figura 2 ilustram os resultados do Experimento 1, os quais indicam os valores HI exibidos por um anticorpo HA do vírus anti-influenza quando os camundongos são tratados nasalmente tanto com as vacinas do Exemplo 1 e Exemplos Comparativos 1 e 5, quanto com o antígeno HA OU o veículo HÁ+AD como um controle de referência.
[0026] A figura 3 ilustra os resultados do Experimento 2, os quais indicam a mudança nos níveis de expressão das moléculas do marcador de ativação (MHC II, CD40, CD80 (B7-1) e CD86(B7- 2)) sobre a membrana celular, quando as células dendríticas presentes no antígeno são estimuladas com a endotoxina (LPS), poli(I:C) e SF-10 (CVP+veículo AD) respectivamente. O gráfico esquerdo mostra a proporção (%) das células positivas na contagem celular total, os quais indicam um aumento na expressão de cada molécula da membrana (as células mostradas acima do negativo cortam o valor limite como indicado na barra próximo ao centro, o qual foi determinado com base no tratamento com salina empregado como controle nos pontos do gráfico à direita). O lado direito mostra os resultados da medida da citometria de fluxo, na qual a quantidade das moléculas do marcador de membrana sobre a membrana celular é visualizada.
[0027] A figura 4 ilustra os resultados do Experimento 4, os quais indicam a relação entre a quantidade PFU do vírus influenza infectado e da taxa de sobrevivência.
[0028] A figura 5 ilustra os resultados do Experimento 4, os quais indicam a mudança na % de sobrevivência quando o camundongo (10 camundongos por grupo) foram imunizados intranasalmente tanto com as vacinas do Exemplo 1, Exemplo 5, Exemplo Comparativo 5 ou Exemplo Comparativo 6, e então infectado com 50 PFU do vírus influenza.
[0029] A figura 6 ilustra os resultados do Experimento 4, que são as mudanças na % de sobrevivência quando os camundongos (10 camundongos por grupo) imunizados intranasalmente tanto com a vacina do Exemplo 1, Exemplo 5, Exemplo Comparativo 5 ou Exemplo Comparativo 6, e então infectado com 800 PFU do vírus influenza.
[0030] A figura 7 ilustra as imagens de microscopia eletrônica de transmissão, os resultados do Experimento 6. A figura 7A ilustra a vacina de mucosa do Exemplo Comparativo 1; A figura B ilustra a vacina de mucosa adicionada de CVP do Exemplo 1 e a imagem parcialmente ampliada do mesmo (figura da direita).
[0031] A figura 8 ilustra os resultados da citometria de fluxo no Experimento 7, que demonstra a quantidade do antígeno marcado com fluorescência detectado nas células dendríticas. Provendo que os níveis de fluorescência detectados nas células dendríticas tratadas apenas com o antígeno HA é 1, com aumentos de muitas vezes na quantidade da fluorescência promovida sobre cada condição de medida são indicados sobre a ordenada com “dobra versus HA” = [MFI em cada medida da amostra] / [MFI nas células dendríticas tratadas apenas com HA}. MFI: Intensidade média de fluorescência **: p < 0,01 vs. HA (n = 3).
[0032] A figura 9 ilustra o resultado do Experimento 8, no qual os níveis de expressão da molécula do marcador de ativação (CD96) sobre a membrana celular foram medidos quando os antígenos presentes nas células dendríticas foram estimulados com poli(I:C) e SF-10 (CVP+veículo AD), respectivamente. O □ indica a ausência da proteína antigênica HA, enquanto o ■ indica a presença da proteína antigênica HÁ. MFI: intensidade média de fluorescência, *:p < 0,05 vs. Adjuvante sozinho (n = 3).
[0033] A figura 10 ilustra os resultados do Experimento 9, nos quais os níveis de expressão CD86 sobre a membrana das células dendríticas preparada a partir de um tecido de cavidade nasal dos camundongos foi medido. O camundongo foi imunizado intranasalmente com o adjuvante SF-10 (CVP+veículo AD) na presença ou ausência do antígeno. MFI:intensidade média de fluorescência.
[0034] A vacina de mucosa adicionada de CVP da invenção consiste da composição a seguir.
[0035] Peptídeo sintético: - Um peptídeo sintético consiste da sequência de aminoácido de KnLm (onde n é 4 a 8, e m é 11 a 20). KnLm tem os resíduos n x K(Lis) no lado N-terminal e os resíduos m x L no lado C- terminal. Os referidos peptídeos sintéticos podem ser qualquer um dos peptídeos a seguir. Em parênteses, a abreviação de um peptídeo é indicada. O resíduo do aminoácido é indicado como uma letra código única. - SEQ ID NO:1 (K6L16): KKKKKKLLLLLLLLLLLLLLLL - SEQ ID NO:1(K6L11): KKKKKKLLLLLLLLLLL - A SEQ ID NO: 1 (K6L16) consiste de resíduos 6K(Lis) sobre o lado N-terminal e resíduos 16 L no lado C-terminal, e SEQ ID NO:2 (K6L11) consiste dos resíduos 6K(Lis) no lado N-terminal e resíduos 11 L no lado C-terminal. Estes peptídeos sintéticos devem ser àqueles preparados de acordo com os métodos de síntese química conhecidos cuja pureza são 95% ou maior.
[0036] Lipídio: - Um fosfolipídio contido em um surfactante pulmonar, tal como fosfatidil colina, dipalmitoilfosfatidil colina, fosfatidil serina e fosfatidil glicerol é preferivelmente empregado. De outra forma, o fosfatidil inositol, fosfatidil etanolamina, ácido fosfatídico, esfingomielina, e do gênero podem também ser empregados. Os ácidos graxos, ácido láurico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido palmitoleico, ácido oléico, e do gênero podem ser empregados. Também é possível empregar um lipídio derivado a partir dos animais aquáticos tais como baleia e golfinho cujos pulmões são inflados dinamicamente.
[0037] Polímero carboxivinil (CVP): - O CVP é um polímero hidrofílico obtido por meio do ácido acrílico de polimerização como um componente principal, e disponível comercialmente tal como, Hivis Wako 103, Hivis Wako 104, Hivis Wako 105, Produto da Sigma Corporation pAA130 (Sigma, St. Louis, MO, Catálogo No. 181293), pAA450 (Sigma, Cat No. 181285) e pAA1250 (Sigma, Catálogo No. 306215) pode ser empregado. Entre esses, Hivis Wako 104; e produtos da Sigma Corporation pAA130 e pAA1250 que serão empregados amplamente na produção de cosméticos e géis farmacêuticos são preferidos. Após a produção, uma solução com 0,2 a 2,0% em peso de CVP em água pura ou salina fisiológica sob tratamento ultrassônico, uma solução neutralizante de NaOH pode ser empregada para ajustar o pH de 5,0 a 10,5, enquanto é preferido empregar um pH no qual a estabilidade do antígeno da vacina não é afetado adversamente. Por exemplo, um antígeno de vacina de influenza dividido é ajustado a um pH de 6,8 a 8,0, preferivelmente, o pH de 7,0 a 7,2.
[0038] Antígeno: - O antígeno inclui moléculas de antígeno tal como um antígeno bacteriano altamente purificado para vacinação cuja pureza é de cerca de 90% ou maior, um antígeno viral, uma proteína tal como um toxóide, uma glicoproteína, um alergênico, um sacarídeo polimérico e um ácido nucléico. Por exemplo, o antígeno para uma vacina contra um vírus da varicela, um vírus de sarampo, um vírus de caxumba, um poliovírus, um rotavírus, um vírus influenza, um adenovírus, um vírus das herpes, um vírus da síndrome da infecção aguda respiratória severa (SARS), um vírus West Nile, um vírus Hantaan, um vírus da dengue, um vírus de encefalite Japonesa, um vírus da febre amarela, um vírus de encefalite do carrapato (“tick-borne”), um vírus HIV, um vírus da hepatite C, uma Bordetella pertussis, um meningococcus, um influenza B, um Pneumovirus, um Vibrião cólera, um Plasmodium, um patógeno da doença do sono e do gênero é contemplado.
[0039] O antígeno é empregado em quantidade, quando utilizado sozinho, ou especialmente quando combinado com o veículo AD (a) ou combinado com um polímero carboxivinil (CVP), que é ajustado de modo que a IgA de mucosa antígeno-específica e a IgG do sangue em uma quantidade produtora de uma indução imune efetiva não são produzidas.
[0040] A proteína antigênica influenza contém uma proteína M, uma neuraminase, uma nucleoproteína, e do gênero em adição à molécula do antígeno HA. Na descrição a seguir, a quantidade de proteína antigênica significa uma quantidade de proteína total incluindo as moléculas antigênicas listadas acima. A quantidade da molécula do antígeno HA sozinha foi cerca de 50% da proteína antigênica total no caso da vacina influenza do lote empregado.
[0041] A seguir é feita uma descrição do método para preparar um veículo e uma vacina de mucosa adicionada de CVP a partir dos materiais descritos acima.
[0042] Preparação do veículo AD: - Os vários lipídios a partir daqueles listados são misturados em uma proporção apropriada e suspensos em uma mistura clorofórmio:metanol (2:1 (v/v)), por exemplo, em uma concentração de lipídio de 10 mg/mL, e empregado como um componente de lipídio. O peptídeo sintético é dissolvido em etanol, por exemplo, em uma concentração de 5:0 mg/mL. Então esses componentes de lipídios e peptídeo sintético são misturados. A proporção da mistura envolve cerca de 0,2 a cerca de 12,0% em peso seco para o peptídeo sintético, e cerca de 88 a cerca de 99,8% em peso seco para o lipídio. Essa mistura é evaporada em uma secadora a cerca de 40°C usando um evaporador giratório e re-suspensão em 10% de etanol em uma concentração apropriada; agitada e misturada por cerca de 15 minutos em um banho-maria a cerca de 45°C para resultar em uma dispersão uniforme, que é então congelada e seca. Essa substância seca é armazenada a cerca de -30°C, e a cada período de uso é suspensa com água pura ou salina fisiológica, e então submetida a uma onda ultrassônica, um homogeneizador, uma misturador, um agitador e do gênero, para formar uma dispersão uniforme.
[0043] Preparação da vacina de mucosa adicionada de CVP: - O veículo AD acima mencionado, CVP e o antígeno são misturados em uma proporção adequada. Assim, no caso de uma vacina influenza, a solução do veículo AD é misturada na solução de estoque da vacina de modo que a proporção da quantidade do veículo AD (V) para a proteína antigênica (A) seja em uma base em peso seco, ou seja, V/A torna-se um valor desejado. O peso seco da proteína antigênica (A) a ser administrada em um camundongo único é cerca de 0,01 a cerca de 10 μ g/kg de peso corpóreo, preferivelmente, cerca de 0,03 a cerca de 5,0 μ g/kg do peso corpóreo. Essa quantidade da proteína antigênica é 1/5 ou menos da quantidade do antígeno (cerca de 0,1 a cerca de 50 μ g/kg do peso corpóreo, preferivelmente, cerca de 0,3 a cerca de 30 μ g/kg do peso corpóreo) na vacina de mucosa do documento de patente 3 (antígeno + veículo AD).
[0044] Na referida quantidade de antígeno, o V/A para indução da produção do anticorpo IgA predominantemente e seletivamente é preferivelmente de cerca de 0,1 a cerca de 1,0. Por outro lado, o V/A para indução da produção de ambos os anticorpos IgA e IgG é cerca de 1,0 a cerca de 100, preferivelmente, cerca de 5 a cerca de 20. No V/A descrito acima, cerca de 60% ou mais do antígeno é ligado ao veículo AD, e a vacina imune de mucosa resultante é capaz de induzir a produção do anticorpo IgA e/ou a produção eficiente do anticorpo IgG.
[0045] A concentração CVP da solução de vacina nasal para a qual o CVP foi adicionado é cerca de 0,1% a 1,0%, preferivelmente, 0,3% a 0,8%. O veículo AD, o antígeno e o CVP podem ser misturados uniformemente usando um homogeneizador, um misturador, um agitador, e do gênero.
[0046] Tipicamente, como mostrado no Exemplo 1 descrito abaixo, a proteína antigênica e o veículo AD são misturados, e então submetidos a um tratamento ultrassônicos por 3 minutos, e então agitados por vórtex durante 2 horas a temperatura ambiente, e finalmente combinada com um volume igual de 1% da solução CVP em salina fisiológica, produzindo, desse modo, a vacina de mucosa adicionada de CVP. Esse método é idêntico ao método descrito no documento de patente 3, exceto pela adição de CVP. Todavia, esse método é desvantajoso uma vez que ele pode permitir que o antígeno viral se tornasse inativado devido ao calor gerado pelo tratamento ultrassônico e o processo de tratamento ultrassônico possui uma dificuldade para manter uma condição constante em vista do tipo de instrumento empregado, o tamanho do oscilador, o estado do oscilador e do gênero.
[0047] Consequentemente, um método de produção exemplificado no Exemplo 7 é preferido, dito método compreendendo as etapas a seguir: (1) suspender o veículo AD e a proteína antigênica na água (água pura); (2) repetir o aquecimento e a agitação uma vez ou mais; (3) congelar e liofilizar; (4) suspender as amostras liofilizadas em salina fisiológica para ajustar em uma concentração predeterminada; e (5) adicionar a solução CVP dissolvida em salina fisiológica.
[0048] Esse é um excelente método servindo não apenas para resolver os problemas acima mencionados associados com o tratamento ultrassônico, mas também para capacitar uma produção ainda mais melhorada de IgA e IgG antígeno- específicos.
[0049] A vacina de mucosa adicionada de CVP assim preparada pode ser utilizada em uma dosagem única, mas ela é utilizada, preferivelmente, em duas dosagens (imunização inicial e imunização secundária) ou três dosagens (imunização inicial, imunização secundária e imunização terciária). O referido tratamento de imunização repetido permite que o título de anticorpo de IgA e IgG antígeno-específico a ser acentuadamente aumentada. As vacinas em duas ou três dosagens são conduzidas em intervalos de 1 semana a 3 semanas, preferivelmente, cerca de 2 semanas. A administração da vacina de mucosa adicionada de CVP da presente invenção pode ser feita pela cavidade nasal bem como na cavidade oral ou na cavidade vaginal (ver, por exemplo, o Boletim da “Lubrizol Pharmaceutical”, Polymers for Pharmaceutical Applications, “Lubrizol Advanced Materials, Inc.”, 2008).
[0050] A presente invenção é descrita em detalhes a seguir, a partir dos Exemplos, mas a invenção não está limitada aos exemplos a seguir:
[0051] Um veículo AD foi preparado como descrito abaixo. Dipalmitoilfosfatidil colina (DPPC), fosfatidil glicerol (PG) e ácido palmítico (PA), foram misturados em uma proporção de 75:25:10 (p/p/p) e suspensa em uma mistura de metanol- clorofórmio (2:1 (v/v)) em uma concentração como um fosfolipídio de 10 mg/ml para obter um componente de lipídio. Um peptídeo sintético K6L16 (KKKKKKLLLLLLLLLLLLLLLLL) (produto da GenScript Inc.) tendo uma pureza de 95% ou mais foi dissolvido em metanol a 5,0 mg/mL. A solução do componente de lipídio (DPPC:PG:PA = 75:25:10, p/p/p) e a solução do peptídeo K6L16 foi misturada em uma proporção em peso do componente fosfolipídio K6L16 = 100:2 e evaporada em uma secadora a 40°C usando um evaporador giratório. Essa foi suspensa em etanol a 10% em uma concentração como um fosfolipídio de 4 mg/ml, agitada e misturada por cerca de 15 minutos em um banho-maria a cerca de 45°C para resultar em uma dispersão uniforme. Essa foi congelada e seca, e então armazenada como um veículo AD a -30°C.
[0052] Então, o veículo acima mencionado AD foi empregado para preparar uma vacina de mucosa adicionada de CVP, como descrito abaixo.
[0053] O veículo AD seco congelado foi utilizado como sendo suspenso em salina fisiológica apenas antes do uso. O antígeno de vacina influenza (HA) empregado foi A/NewCaledonia/20/99(H1N1) provido pela “The Research Foundation for Microbial Diseases of Osaka University” a 1,94 mg de proteína/mL (solução de tampão de fosfato de sódio, cloreto de sódio, solução de timerosal: contendo, por ml, 3,53 mg de hidrato de hidrogênio fosfato de sódio, 0,54 mg de di-hidrogênio fosfato de sódio, 8,50mg de cloreto de sódio e 0,008 mg de timerosal). A vacina e o veículo Ad foram misturados em tal proporção como aquela proporção da quantidade da proteína na solução do antígeno (A) para a quantidade de fosfolipídio na solução do veículo AD (V), ou seja, VA = 10, submetido a um tratamento ultrassônico envolvendo Liga e Desliga, três vezes repetidamente em intervalos de 30 segundos para acompanhar o tratamento ultrassônico durante 3 minutos no total, incluindo Liga (“ON”) durante 90 segundos e Desliga (“OFF”) durante 90 segundos no total (modelo S-250D, Branson Ultrasonics Danbury), então agitado durante 2 horas a temperatura ambiente e dissolvida na salina fisiológica, e então combinado com um CVP a 1% neutralizado (Hivis Wako 104) em uma concentração final de 0,5%. Assim, a composição contida em 4μ l no total a ser administrado em ambas as cavidades nasais de um camundongo único com 2 μ l sendo determinado para cada narina é uma quantidade da proteína do antígeno na vacina influenza (HA)/quantidade de fosfolipídio na solução do veículo AD/peso de CVP = 0,2 μ g/2,0 μ g/20 μ g. O pH dessa vacina de mucosa adicionada de CVP estava dentro da faixa para permitir a antigenicidade da proteína antigênica HA a ser mantida (7,0 a 7,2).
[0054] Daqui em diante, a vacina de mucosa adicionada de CVP foi designada como “HA+SF-10”. Embora a quantidade de SF-10 seja veículo AD (2,0 μ g)+CVP (20μ g)=22 μ g, como descrita acima, a descrição a seguir emprega a designação SF-10 (2,0 μ g) para representar a quantidade do fosfolipídio do veículo AD, a qual serve como uma base para o efeito de veículo do adjuvante. As quantidades de SF-10 em outros Exemplos são indicadas como valores excluindo as quantidades CVP.
[0055] De acordo com o método no Exemplo 1, uma vacina de mucosa adicionada de CVP na qual a quantidade da proteína antigênica HA foi de 0,1 μ g foi preparada. A proporção da mistura da proteína antigênica HA, o veículo AD e CVP foram idênticos àquela no Exemplo 1 (ou seja, contendo o veículo AD em uma quantidade 10 vezes a quantidade da proteína antigênica e CVP em uma concentração final de 0,5%).
[0056] De acordo com o método no Exemplo 1, uma vacina de mucosa adicionada de CVP na qual a quantidade da proteína antigênica HA foi de 0,03 μ g foi preparada. A proporção da mistura da proteína antigênica HA, o veículo AD e CVP foram idênticos àquela do Exemplo 1 (ou seja, contendo o veículo AD em uma quantidade 10 vezes a quantidade da proteína antigênica e CVP em uma concentração final de 0,5%).
[0057] A vacina de mucosa do documento de patente 3 (HA+veículo AD) foi preparada. A proteína antigênica HA e o veículo AD foram idênticos àqueles do Exemplo 1, e a preparação da vacina foi conduzida do mesmo modo do Exemplo 1. A quantidade de proteína antigênica HA foi 0,2 μ g e a quantidade do veículo AD foi 2,0 μ g.
[0058] A vacina de mucosa descrita nos documentos de patente 5 e 6 (HA+CVP) foi preparada. A proteína antigênica HA e o CVP foram idênticos àqueles do Exemplo 1, e a preparação da vacina foi conduzida do mesmo modo do Exemplo 1. A quantidade de proteína antigênica HA foi 0,2 μ g e a concentração final de CVP foi 0,5%.
[0059] A vacina de mucosa descrita no documento de patente 4 (HA+HPC) foi preparada. A proteína antigênica HA foi idêntica àquela no Exemplo 1, e HPC foi comercialmente disponível na HPC 6,0-10,0 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd). A preparação da vacina foi conduzida do mesmo modo que no Exemplo 1. A quantidade de proteína antigênica HA foi 0,2 μ g e a quantidade de HPC foi de 20 μ g.
[0060] A vacina de mucosa (HA+veículo AD+HPC) foi preparada através da combinação do veículo HA+AD do documento de patente 3 com HPC. O veículo HÁ+AD foi idêntica àquela do Exemplo Comparativo 1 e HPC foi idêntico àquela no Exemplo Comparativo 3, embora a preparação da vacina tenha sido conduzida do mesmo modo que a do Exemplo 1. A quantidade da proteína antigênica HA de 0,2 μ g, a quantidade do veículo AD foi de 2,0 μ g, e a quantidade de HPC foi de 20 μ g.
[0061] A vacina de mucosa (HA+poli (I:C)) contendo uma poli(I:C) (Alexis Corp.) que é um ligante de um receptor do tipo Toll (TLR) de uma célula dendrítica e que estimula um antígeno fortemente presente na célula para promover a produção de anticorpos foi preparada de acordo com o método descrito em uma publicação (Asahi-Ozaki Y., et al., “Microbes infect.”, 2006; 8:2706-2714; Ichinohe t., et al., “J. Virol”, 2005; 79(5):2910-2919). A quantidade da proteína antigênica HA é 0,2 μ g, e a quantidade de poli(I:C) é 2 μ g.
[0062] O antígeno HA foi diluído com salina fisiológica e empregado como uma vacina. A dose da proteína antigênica HA por animal foi de 0,2 μ g.
[0063] Usando camundongos, a produção de anticorpos melhorando o efeito das vacinas de mucosa nasal foi testada. 1. Vacina de mucosa - HA+SF-10 (Exemplo 1) - HA+veículo AD (Exemplo Comparativo 1) - HA+CVP (Exemplo Comparativo 2) - HA+HPC (Exemplo Comparativo 3) - HA+veículo AD+HPC (Exemplo Comparativo 4) - HA+poli (I:C) (Exemplo Comparativo 5) - HA sozinho (Exemplo Comparativo 6) 2. Animais
[0064] Camundongos fêmeas BALB/c (6-8 semanas de idade) comprado da Japan SLC, Inc. (Shizuoka, Japão), foram utilizadas. Todos os experimentos animais foram conduzidos em uma formação de animais infectados (nível P2) no Instituo para Experimentação Animal, “The University of Tokushima, School of Medicine”, de acordo com o guia do Comitê para Experimentação Animal da Universidade de Tokushima, Escola de Medicina. 3. Método de Imunização
[0065] Na administração da vacina nasal, 2 μ l de 5 vacinas de mucosa descritos na Seção 1 acima foi respectivamente administrada para cada narina, instilando, desse modo, 4 μ l no total em ambas as cavidades nasais de cada camundongo sob anestesia com Ketalar 962,6 mg/kg) e Selactar (12,4 mg/kg). Como controle, grupos tratados com salina fisiológica e Exemplo Comparativo 6 (proteína antigênica HA sozinho) em uma quantidade idêntica de modo que a solução de vacina foram empregadas. Cada grupo consistiu de 9 a 10 camundongos.
[0066] A imunização para estímulo secundário foi conduzida através da administração nasal de dose idêntica de vacinas em duas semanas após a imunização inicial. Após a imunização secundária por duas semanas, a imunização terciária foi conduzida por um método similar, e em duas semanas após a última imunização as amostras foram tomadas. Embora a vacina tenha sido dada três vezes no total, a imunização secundária como a imunização final apresentou resultados quase similares. 4. Preparação da cavidade nasal do camundongo e lavagens alveolares.
[0067] Nas duas semanas após a imunização terciária, a cavidade nasal/lavagens alveolares e o soro foram preparados para medida da Iga e IgG antígeno específica do vírus HA. Os procedimentos foram os mesmos para a descrição de uma publicação (Mizuno D. Ide-Kurihara M, Ichinomiya t., Kubo I., Kido H.. O surfactante pulmonar modificado é um potente adjuvante que estimula a produção da IgA de mucosa em resposta ao antígeno do vírus influenza. “J. Immunol.”, 2006; 176:1122-30).
[0068] Um camundongo tratado com a vacina foi anestesiado com pentobarbital para uma toracolaparotomia, e o duto traqueal foi cortado para inserir um cateter venoso Atom 3Fr tendo nódulos (Atom Medical Corporation, Tokyo, Japn) dentro do pulmão, ao qual então 1 mL de salina fisiológica foi infundida e então recuperada. Esse procedimento foi repetido três vezes e os 3 mL resultantes no total foram empregados como uma lavagem alveolar. Após coleta do lavado alveolar, um cateter venoso Atom foi inserido através do duto da traqueia cortada na direção da cavidade nasal, para a qual 1 mL da salina fisiológica foi infundida e os fluidos saindo do nariz foram recolhidos. Os fluidos foram empregados como lavados nasais. Em adição, um sangue foi tomado a partir do coração, centrifugado durante 10 minutos a 5000 rpm para preparar um soro. 5. Quantificação do anticorpo anti-influenza.
[0069] Os níveis de IgA e IgG específicos anti-influenza na cavidade nasal/lavagem alveolares e soro foram quantificados pela análise ELISA, de acordo com a descrição da publicação acima mencionada (Mixuno D., et al., “J. Immunoo.”, 2006, 176:1122-30).
[0070] A análise ELISA foi conduzida de acordo com o método para um Kit de quantificação ELISA para camundongo, obtido de BETHYL LABORATORIES, INC, (Texas, Estados Unidos). Para cada poço de uma imunoplacaNunc de 96 poços (Nalgen Nunc International, Nova York, Estados Unidos), 1 μ g da vacina e 100 μ L de um 1 μ g/ml da solução de PBS da albumina de soro bovino (BSA, SIGMA, Missouri, Estados Unidos) foram adicionados, e deixados passar por uma reação de imobilização em fase sólida durante a noite a 4°C. Em seguida, o fluido da vacina foi removido por lavagem três vezes com um fluido de lavagem (50 mM de Tris) 0,14 M de NaCl, 0,05% da Tween 20, pH 8,0). Para cada poço, 200 μ L de uma solução tampão 50 mM de Tris-HCl (pH 8,0) contendo 0,15 M de NaCl e 1% de BSA foi adicionado, e uma reação de bloqueio foi conduzida durante 1 hora a temperatura ambiente. Após a lavagem de cada poço por três vezes, com o fluido de lavagem, 100 μ L de lavado nasal, as lavagens pulmonar ou o soro, que foram diluídos apropriadamente com uma solução de tempão de ligação na amostra (50 mM de Tris, 0,15M de NaCl, 1% de BASA, 0,05% de Tween 20, com pH 8,0), foram adicionados, e reagidos durante 2 horas a temperatura ambiente. Uma peroxidase de rábano silvestre IgA e IgG anti-camundongo de cabra (HRP) (BETHYL LABORATORIES INC.) foi empregada como um anticorpo secundário, e um Sistema de Substrato de Peroxidase TMB Microwell (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc. Maryland, Estados Unidos) foi empregado para conduzir uma reação cromogênica. A reação foi finalizada através da adição de 100 μ L de um 2M H2SO4 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) em cada poço, e a absorbância a 450 nm foi medida usando SPECTRAmax PLUS 384. Como um padrão para a quantificação, a absorbância obtida similarmente usando 10 ng do purificado de IgA e IgG anti-influenza obtido da lavagem pulmonar acima mencionada foi empregada. 6. Resultados
[0071] Os resultados da indução do anticorpo HA antiinfluenza são mostrados para a IgA nos lavados nasais (Figura 1, esquerda) e para a IgG no sangue (Figura 1, direita). Os respectivos valores medidos são mostrados na Tabela 1. A figura 2 e a Tabela 2 mostram as titulações HI dos respectivos grupos de teste. (1) grupo tratado apenas com o antígeno HA (Exemplo Comparativo 6) apresentou um nível IgA antígeno-específico de 24,77 ng/mL e o nível IgG de 0,54 μ g/mL, enquanto o grupo de tratamento HA+SF-10 (Exemplo 1) apresentou um nível de IgA antígeno-específico de 3307,60 ng/mL e o nível IgG de 568,75 μ g/mL, mostrando um aumento de 132 vezes para o IgG nos lavados nasais e o aumento de 1137 vezes para a IgG no soro. Foi confirmado que a vacina de mucosa adicionada CVP (HA+SF- 10) da presente invenção teve um efeito de indução do anticorpo extremamente potente (Figura 1, Tabela 1). (2) A produção de anticorpo no grupo de tratamento HA+SF10 (Exemplo 1) foi maior que 15,6 vezes para a IgA antígeno- específica e por 150 vezes para a IgG quando comparado com o veículo HA+veículo AD (Exemplo Comparativo 1) e maior que 10,7 vezes para a IgA antígeno-específica e por 115,4 vezes para o IgG quando comparado com o HA+CVP (Exemplo Comparativo 2) (Figura 1, Tabela 1). Os efeitos de indução do referido anticorpo ultrapassou em muito o escopo previsto para o HA+SF-10 a partir de uma combinação simples da vacina de mucosa conhecida (HA+veículo AD) do documento de patente e o conhecido CVP dos documentos de patente 5 e 6. (3) A produção do anticorpo pelo grupo de tratamento HA+HPC (Exemplo Comparativo 3) foi similar a ou menos que no grupo tratado apenas com HA (Exemplo Comparativo 6). A produção do anticorpo pelo grupo de tratamento HA+veículo AD+HPC (Exemplo Comparativo 4) foi menor que no grupo do HA+veículo AD (Exemplo Comparativo 1) (figura 1, tabela 1). Com base nesses resultados, HPC, que é amplamente conhecido como um gelante em uma formulação de gotas nasais ou uma vacina de mucosa aditiva similar ao CVP foi confirmado por não ter um efeito melhorado na indução imune quando utilizado em combinação com o antígeno e o veículo AD. Consequentemente, a melhora através da adição do CVP do efeito adjuvante do veículo AD assumiu por ser atribuível à natureza do veículo AD mais do que um efeito simples para aumentar a viscosidade da vacina. (4) A produção do anticorpo no grupo de tratamento HA+SF-10 (Exemplo 1) foi maior em 11,4 vezes para a IgA no lavado nasal e em 2,3 vezes para a IgG no soro quando comparado com o grupo HA+poli (I:C) (Exemplo Comparativo 5) (Figura 1, tabela 1). Com base nesses resultados, a vacina de mucosa adicionada CVP (HA+SF-10) da invenção foi confirmado como tendo um efeito indutor imune mais potente do que poli (I:C) que estimula o antígeno presente nas células potencialmente para promover a produção do antígeno. TABELA 1
[0072] Embora sob o critério de avaliação internacional da vacina influenza para proteção imune, na qual uma vacine excedendo a titulação de inibição de hemaglutinação (HI) > 40 é julgado como efetivo, apenas 50% das amostras no HA + veículo AD (Exemplo Comparativo 1) excedeu HI > 40, com o valor médio de HI=39. Ao contrário, o HA+SF-10 (Exemplo 1) mostrou um HI>40 em todas as amostras, e o valor médio foi mais alto que HI=213,3, e exibiu um efeito protetor viral potente, que foi 1,56 vezes aquele de HA+poli(I:C) (Exemplo Comparativo 5), o qual demonstrou HI = 137,0 (Figura 2, Tabela 2). TABELA 2
[0073] Um antígeno presente nas células dendríticas preparado pelo método da publicação (Mizuno, D. et al., “J. Immunol.”, 2006, 176:1122-1130) foi estimulada com cada uma de uma endotoxina (LPS: 100 ng/1x105 células) (Grauer O., et al., “Histochem. Cell Biol.”, 2002; 117:251-362), poli(I:C) (10 μ g/1x106 células) e SF-10 (veículo AD adicionado de CVP 10 μ g/1x105 células), e os níveis de expressão das moléculas do marcador de ativação da membrana celular (MHC II, CD40, CD80 (B7-1) e CD86(B7-2)) foram medidos.
[0074] Os resultados estão mostrados na figura 3. LPS e poli(I:C) aumentou a expressão de CD40 e CD86 notavelmente e ativou o antígeno presente nas células dendríticas, enquanto o SF-10 sozinho não aumento a expressão de MHC II, CD40, CD40, CD80 e CD86 sobre o antígeno presente nas células dendríticas, mostrando um nível quase igual à expressão no controle (célula não tratada).
[0075] Com base nesses resultados, assumiu-se que SF-10 não estimulou diretamente o antígeno presente nas células dendríticas sem o antígeno, ou seja, SF-10 estimula o antígeno efetivamente liberado para o antígeno presente nas células dendríticas induzindo, desse modo, a produção de anticorpo.
[0076] Cada vacina de mucosa adicionada de CVP do Exemplo 1 (quantidade proteína antigênica HA 0,2 μ g). Exemplo 2 (quantidade da proteína antigênica HA 0,1 μ g) e o Exemplo 3 (quantidade da proteína antigênica HÁ, 0,03 μ g) foi administrada ao camundongo (10 animais em cada grupo) similarmente ao Experimento 1, e a IgA nos lavados nasais antígeno-específico e o IgG no sangue foram medidos similarmente ao Experimento 1.
[0077] Os resultados estão mostrados na tabela 3. Exemplo 1 (quantidade da proteína antigênica HA, 0,2 μ g) e Exemplo 2 (quantidade da proteína antigênica HA: 0,1 mg) apresentou um efeito indutor do anticorpo quase igual. Além disso, o Exemplo 3 (quantidade de proteína antigênica HA 0,03 μ g) cuja quantidade de proteína antigênica é 1/6 ou menos daquela no Exemplo 1 também apresentou um efeito indutor mais potente do anticorpo quando comparado com o Exemplo Comparativo 2: HA+ veículo AD (quantidade de proteína antigênica HA 0,2 μ g) e Exemplo Comparativo 3: HA+CVP (quantidade de proteína antigênica HA 0,2 μ g) no Experimento 1 (Tabela 1). Assim, o grupo de tratamento do Exemplo 3 apresentou um nível de IgA antígeno específica que foi 11,7 vezes aquele no Exemplo Comparativo 2 e 8,0 vezes aquele no Exemplo Comparativo 3, e uma quantidade de IgG que foi 77,2 vezes aquela no Exemplo Comparativo 2 e 60,1 vezes aquela do Exemplo Comparativo 3.
[0078] Com base nesses resultados, a vacina de mucosa adicionada de CVP da invenção foi confirmada por ser capaz de produzir uma quantidade suficiente do anticorpo com o antígeno em uma quantidade menor do que aquela nas vacinas de mucosa do documento de patente 3 (HA+Veículo AD) e documentos de patente 5 e 6 (HA+CVP). Também com relação ao efeito de inibição da hemaglutinação (Efeito HI), a vacina de mucosa adicionada de CVP apresentou um efeito protetor suficiente realizado por HI=198,0 mesmo com uma quantidade de proteína antigênica HA de 0,03 μ g. Tabela 3:
Exemplo 4:
[0079] De acordo com o método do Exemplo 1, uma vacina de mucosa adicionada de CVP tendo uma quantidade de 0,3 μ g do veículo AD e uma quantidade de 0,03 μ g da proteína antigênica HA foi preparada. A proporção da mistura da proteína antigênica HA, do veículo AD e CFP foi idêntica aquele no Exemplo 1 (ou seja, contendo o veículo AD em uma quantidade 10 vezes aquela quantidade da proteína antigênica e CVP em uma concentração final de 0,5%).
[0080] Cada vacina de mucosa adicionada CVP do Exemplo 1 (veículo AD: 2,0 μ g, quantidade da proteína antigênica de HA: 0,2 μ g) e Exemplo 4 (veículo AD: 0,3 μ g, quantidade da proteína antigênica de HA: 0,03 μ g) foi administrada ao camundongo (10 animais em cada grupo) similarmente ao Experimento 1, que foi então infectado no dia 14 após o estímulo da segunda vacinação (imunização 3 vezes no total) com 50 PFU e 800 PFU de um vírus influenza (A/PR8(N1H1)/μ L).
[0081] Como mostrado na figura 4, a quantidade viral de infecção capaz de obter uma dose letal de 50% (LD50) foi PFU<5, e na ausência do tratamento com vacina todos os camundongos morreram dentro de 9 dias em 50 PFU e 8 dias a 100 PFU ou mais após a infecção.
[0082] O efeito da vacinação na taxa de sobrevivência foi mostrado nas Figuras 5 e 6. Em ambas o controle (salina fisiológica) e o Exemplo Comparativo 6 (apenas a proteína antigênica HA), todos os animais morreram dentro de 7 a 9 dias após a infecção viral com 50 PFU e 7 dias após a infecção viral com 800 PFU. No Exemplo Comparativo 5 (HA+poli(I:C)), 9 dos 10 animais morreram dentro de 9 dias após a infecção viral com 800 PFU.
[0083] Por outro lado, todos os camundongos tratados com as vacinas de mucosa adicionadas de CVP do Exemplo 1 e do Exemplo 4 sobreviveram por 15 dias após a infecção viral com 50 PFU. A infecção viral com 800 PFU matou 1 dos 10 animais tratados com a vacina do Exemplo 1 (após 8 dias ou mais tarde) e 5 dos 10 animais tratados com a vacina do Exemplo 4 (após 10 dias ou mais tarde).
[0084] Com base nesses resultados, a vacina de mucosa adicionada da invenção foi confirmada para ter um efeito excelente de prevenção da infecção. Exemplo 5:
[0085] Processo de fabricação B não envolvendo o tratamento ultrassônico.
[0086] Um pó do veículo AD seco e congelado foi dissolvido em uma água pura e adicionado ao fluido de proteína antigênica HA similar aquela do Exemplo 1, e então essa solução de mistura foi combinada com uma quantidade igual de um 1,0% de CVP dissolvido em uma água pura para preparar uma suspensão. Essa suspensão foi aquecida, sem tratamento ultrassônico, a 42°C durante 10 minutos usando um banho-maria, e a cada tempo de 3 a 7 minutos durante o tratamento por aquecimento a solução foi agitada usando um misturador por 10 segundos para conseguir a uniformidade. Após o tratamento por aquecimento, a suspensão foi congelada durante a noite a -30°C a -75°C, e liofilizada para fazer um pó seco. O pó seco e congelado foi armazenado a -30°C. Apenas antes do uso, o pó seco congelado foi suspenso em salina fisiológica para obter uma vacina de mucosa adicionada de CVP. A solução de vacina foi ajustada de modo que 4 μ l no total a ser administrado em ambas as cavidades nasais de um camundongo com 2 μ l foi dada em cada narina da solução contendo CVP a 0,5%; 0,2 μ g da proteína antigênica HA e 2,0 μ g do fosfolipídio do veículo AD. Em seguida essa vacina de mucosa adicionada de CVP foi designada como HA+SF-10B. Exemplo 6:
[0087] Processo de fabricação C não envolvendo o tratamento ultrassônico.
[0088] Um pó de veículo AD seco congelado dissolvido em uma água pura foi misturado com o fluido de proteína antigênica HA similar àquele do Exemplo 1. Essa suspensão foi aquecida a 42°C durante 10 minutos usando um banho-maria, e em tempos de 3 e 7 minutos durante o tratamento de aquecimento, a solução foi agitada usando um misturador durante 10 segundos para conseguir uniformidade. Após o tratamento por aquecimento, a suspensão foi congelada durante a noite a -30°C a -75°C e liofilizada para fazer o pó seco. O pó seco congelado foi armazenado a -30°C. Apenas antes do uso, o pó seco congelado foi agitado gentilmente com uma solução CVP 0,5% previamente dissolvida em salina fisiológica enquanto evita qualquer espuma para obter uma vacina de mucosa adicionada de CVP. Quatro μ l no total a ser administrado em ambas as cavidades nasais de uma camundongo com 2 μ l sendo dado em cada narina da solução contendo 0,2 μ g da proteína antigênica HA e 2,0 μ g do fosfolipídio do veículo AD. Daqui em diante essa vacina de mucosa adicionada de CVP é designada como HA+SF-10-C.
[0089] Cada vacina de mucosa adicionada de CVP do Exemplo 1 (daqui em diante designado como “HA+SF-10-A”), Exemplo 5 (HA+SF-10-B) , e Exemplo 6 (HA+SF-10-C) foi inoculado ao camundongo (10 animais em cada grupo) similarmente ao Experimento 1 (três vezes em intervalos de 2 semanas), e os anticorpos IgA e IgG anti-influenza foram medidos similarmente ao Experimento 1 .
[0090] Os resultados estão mostrados na Tabela 4. Exemplo 6 (HA+SF-10-C) apresentou um efeito indutor de anticorpo em cerca de 2 a 4 vezes para o nível de IgA e cerca de 2 vezes para o nível de IgG, quando comparado com Exemplo1 (HA+SF-10- A) e Exemplo 5 (HA+SF-10-B). Assim, o método do Exemplo 6 (Processo de fabricação C) foi assumido para o resultado em seu excelente efeito de indução do anticorpo devido a etapa sem tratamento ultrassônico é envolvido e a solução CVP é adicionado na etapa final. TABELA 4 Comparação dos efeitos indutores do anticorpo através da diferença nos processos de fabricação de vacina antiinfluenza A/Nova titulação do anticorpo Caledonia (μ g/mL)
[0091] A forma de cada componente nas vacinas de mucosa adicionada CVP da invenção (proteína antigênica HA, veículo AD e CVP) foi analisado através de uma microscopia eletrônica de transmissão. Como mostrado na figura 7, o CVP participa de uma regra de aumento substancial na ligação entre o antígeno e o veículo AD.
[0092] CVP foi empregado como um agente espessante (Documentos de Patente 5 e 6) que e um dos polímeros espessantes para o aperfeiçoamento da permanência de um ingrediente ativo na cavidade nasal da mesma maneira como a hidroxipropil celulose (Documento de Patente 4), alginato de sódio (Documento de patente 7) e outros excipientes. Entretanto, como mostrado pelos resultados do Experimento 6, o CVP na presente invenção foi revelado, em uma combinação com o veículo AD, para aperfeiçoar a ligação entre o antígeno e o veículo AD, e para aumentar a quantidade do antígeno a ser incorporada dentro das células apresentando antígeno, melhorando assim, o efeito do veículo Ad.
[0093] SF-10 (Veículo AD+CVP) (20 μ g) do Exemplo 1 e a proteína antigênica HA (2 μ g) do Exemplo 1 que foi marcado com um corante fluorescente ATTO 488 foram misturados e então adicionada às células dendríticas derivada da medula óssea do camundongo (2x105 células), e após 1 hora de incubação da intensidade de fluorescência da célula dendrítica marcada com a proteína antigênica HA marcada com o corante fluorescente foi medida em uma citometria de fluxo. Também a poli (I:C) (10 μ g) do Exemplo Comparativo 5 e a proteína antigênica HA marcada com fluorescência (2 μ g) foram misturados e a intensidade da fluorescência das células dendríticas foi medida similarmente. A fluorescência apresentada pelas células dendríticas reflete a ligação e a incorporação da proteína antigênica HA marcada com o corante fluorescente às células.
[0094] Os resultados estão mostrados na Figura 8. Embora poli(I:C) não promovem a ligação e a incorporação da proteína antigênica HA marcada com o corante fluorescente às células dendríticas, SF-10 apresentou um efeito promotor significante.
[0095] Com base nesses resultados, a vacina de mucosa SF-10 da presente invenção foi confirmada por promover a ligação e a incorporação da proteína antigênica para as células apresentando antígenos aumentando, desse modo, a produção do anticorpo e exercendo uma capacidade excelente de prevenção da infecção.
[0096] A seguir foram adicionados às células dendríticas derivadas, cultivadas da medula óssea de camundongos (2x105 células) em 1 mL de meio cRPMI, e a ativação das células dendríticas após 1 hora foi medida através da citometria de fluxo empregando como um índice do aumento na expressão de CD86 que é um dos marcadores de ativação da célula dendrítica. O citômetro FACSCalibur (BD Biosciences, Massachusetts, Estados Unidos) foi utilizado para medir e o software CellQest (BD Biosciences, Massachusetts, Estados Unidos) foi utilizado para o processamento dos dados para determinar a expressão de CD86. - salina fisiológica; - salina fisiológica + proteína antigênica HA; - SF-10; - SF-10 + proteína antigênica HA; - poli (I:C); - poli(I:C) + proteína antigênica HA
[0097] A proteína antigênica HA (2 μ g) e SF-10 (20 μ g) foram àquelas descritas no Exemplo 1, enquanto poli (I:C) (10 μ g) foi idêntica aquela do Exemplo Comparativo 5. Os resultados são mostrados na figura 9. Enquanto poli (I:C) por si só aumentou a expressão de CD86 (marcador de ativação das células dendríticas) similarmente ao Experimento 2, a expressão de CD86 foi adicionalmente aumentada mesmo quando da adição do antígeno. Do contrário, SF-10 não ativou as células dendríticas, per se, mas a expressão CD86 na presença do antígeno foi aperfeiçoada em cerca de 2 vezes.
[0098] Com base nesses resultados, o adjuvante de mucosa adicionado de CVP da invenção, ou seja, SF-10 assumiu a liberação do antígeno eficazmente para as células dendríticas apresentando antígeno para ativá-los, desse modo, a induzir a produção de anticorpo.
[0099] Os resultados similares foram obtidos quando do uso de CD40 que também é um dos marcadores de ativação das células dendríticas.
[00100] De modo a examinar a ativação das células dendríticas devido a uma liberação aumentada do antígeno por SF-10 que foi confirmado IN VITRO no Experimento 8, em um camundongo individual (IN VIVO), os materiais seguir, idênticos àquele do Experimento 8 foram administrados nas cavidades nasais dos camundongos. - salina fisiológica - salina fisiológica + proteína antigênica HA; - SF-10; - SF-10 + proteína antigênica HA;
[00101] O experimento animal seguiu a linha do Experimento 1. A proteína antigênica HA (0,2 μ g) e SF-10 (2 μ g) foram aquelas do Exemplo 1, enquanto Poli (I:C) (2 μ g) foi idêntico aquele no Exemplo Comparativo 5.
[00102] O camundongo foi decapitado 48 horas após a inoculação nasal e os tecidos nas cavidades nasais foram colhidos e tratados com uma colagenase (1 mg/mL, agitação a 37°C durante 30 minutos). Após a filtragem através de uma malha seguido pela centrifugação (4°C, 10 minutos, 20xg), células dendríticas foram preparadas a partir das células recuperadas por VarioMACS (Miltenyl Biotech, Bergisch Gladbach, Alemanha), usando contas magnéticas conjugadas Anti-CD11c (N-418) (Miltenyl Biotechn, Bergisch Gladbach, Alemanha) e Coluna LS, de acordo com as instruções do fabricante. Então, o aumento na expressão de CD86 foi medido pelo método similar aquele do Experimento 8.
[00103] Os resultados estão mostrados na Figura 10. A ativação da célula dendrítica devido a um aumento na liberação do antígeno por SF-10 foi confirmado também nas cavidades nasais do camundongo.
[00104] O CVP foi investigado por sua concentração preferível. Exceto para empregar pAA130 fabricado pela Sigma Corporation como CVP em concentrações de 0,1%; 0,25%; 0,5%; 0,75% ou 1,0%, uma vacina de mucosa adicionada de CVP foi preparada pelo método do Exemplo 6, e as quantidades de IgA antígeno-específica e IgG do soro do lavado nasal do camundongo foram medidos pelo método do Experimento 1.
[00105] Os resultados estão mostrados na Tabela 5, os quais indicam que ambos IgA e IgG foram aperfeiçoadas na resposta para o aumento da quantidade de CVP até uma concentração de CVP pAA130 de 0,5%. Após alcançar o pico a 0,5% de CVP, uma concentração maior de CVP tendeu a não reduzir o efeito de indução do anticorpo. TABELA 5
Claims (6)
1. Vacina de mucosa produtora de uma IgA de mucosa antígeno- específica e IgG do sangue, dita vacina sendo caracterizada pelo fato de compreender: (a) um veículo fármaco-antígeno (AD) consistindo de um peptídeo sintético e um lipídio, sendo que o peptídeo sintético consiste de sequências de aminoácidos KnLm, onde n é de 4 a 8 e m é de 11 a 20; (b) um polímero carboxivinil; e (c) uma proteína antigênica.
2. Vacina de mucosa, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de o peptídeo sintético consistir da sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 ou 2.
3. Vacina de mucosa, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizada pelo fato de o lipídio ser pelo menos um de fosfatidil colina, dipalmitoilfosfatidil colina, fosfatidil serina, fosfatidil glicerol, fosfatidil inositol, fosfatidil etanolamina, ácido fosfatídico, ácido láurico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico e ácido oléico.
4. Vacina de mucosa, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizada pelo fato de os lipídios serem uma mistura de dipalmitoilfosfatidil colina, fosfatidil glicerol e ácido palmítico.
5. Vacina de mucosa, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizada pelo fato de a proteína antigênica ser um antígeno inativado derivado do patógeno, um antígeno purificado, um antígeno parcialmente purificado, um antígeno recombinante, uma toxina desintoxicado ou um alergênico causador de uma alergia.
6. Método para produzir uma vacina de mucosa, conforme definida na reivindicação 1, dito método sendo caracterizado pelo fato de compreender: (1) suspensão os citados (a) e (c) em água; (2) repetir o aquecimento e a agitação uma ou mais vezes; (3) congelar e liofilizar; (4) suspender a forma liofilizada em salina fisiológica para ajustar a uma concentração predeterminada; e (5) adicionar uma solução da citada etapa (b).
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