RU2570394C2 - Мукозальная вакцина - Google Patents
Мукозальная вакцина Download PDFInfo
- Publication number
- RU2570394C2 RU2570394C2 RU2012140064/15A RU2012140064A RU2570394C2 RU 2570394 C2 RU2570394 C2 RU 2570394C2 RU 2012140064/15 A RU2012140064/15 A RU 2012140064/15A RU 2012140064 A RU2012140064 A RU 2012140064A RU 2570394 C2 RU2570394 C2 RU 2570394C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- antigen
- cvp
- carrier
- mucosal
- vaccine
- Prior art date
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 137
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 111
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 111
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 106
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 claims abstract description 89
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 73
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 73
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims abstract description 69
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 47
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims abstract description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 24
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 22
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 22
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 22
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 16
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 15
- KILNVBDSWZSGLL-KXQOOQHDSA-N 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC KILNVBDSWZSGLL-KXQOOQHDSA-N 0.000 claims abstract description 9
- ATBOMIWRCZXYSZ-XZBBILGWSA-N [1-[2,3-dihydroxypropoxy(hydroxy)phosphoryl]oxy-3-hexadecanoyloxypropan-2-yl] (9e,12e)-octadeca-9,12-dienoate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCC(O)CO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\C\C=C\CCCCC ATBOMIWRCZXYSZ-XZBBILGWSA-N 0.000 claims abstract description 9
- AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N alpha-glycerophosphate Natural products OCC(O)COP(O)(O)=O AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims abstract description 8
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 7
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 19
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 15
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 7
- 239000013566 allergen Substances 0.000 claims description 4
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 3
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 3
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 3
- 238000003303 reheating Methods 0.000 claims description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims description 2
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 claims 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 abstract description 9
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 abstract description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 46
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 38
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 27
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 27
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 26
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 25
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 23
- 229940115272 polyinosinic:polycytidylic acid Drugs 0.000 description 23
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 16
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 15
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 15
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 15
- 210000003928 nasal cavity Anatomy 0.000 description 15
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 14
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 13
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 11
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 10
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 9
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 9
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 9
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 8
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 8
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 8
- 229960003971 influenza vaccine Drugs 0.000 description 7
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 6
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 description 5
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 description 5
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 5
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 239000003580 lung surfactant Substances 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 5
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 5
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 5
- 229920002153 Hydroxypropyl cellulose Polymers 0.000 description 4
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 4
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 4
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 4
- POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-N dodecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCC(O)=O POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 4
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 4
- 235000010977 hydroxypropyl cellulose Nutrition 0.000 description 4
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 239000007923 nasal drop Substances 0.000 description 4
- 229940100662 nasal drops Drugs 0.000 description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 4
- TUNFSRHWOTWDNC-HKGQFRNVSA-N tetradecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCC[14C](O)=O TUNFSRHWOTWDNC-HKGQFRNVSA-N 0.000 description 4
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-2,4-dioxo-1,3-diazinane-5-carboximidamide Chemical compound CN1CC(C(N)=N)C(=O)NC1=O IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 3
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 3
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 description 3
- 235000010413 sodium alginate Nutrition 0.000 description 3
- 229940005550 sodium alginate Drugs 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- PORPENFLTBBHSG-MGBGTMOVSA-N 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycerol-3-phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC PORPENFLTBBHSG-MGBGTMOVSA-N 0.000 description 2
- TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 2
- 208000004262 Food Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- 206010016946 Food allergy Diseases 0.000 description 2
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylserin Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(=O)OCC(O)CO ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 239000005639 Lauric acid Substances 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 102000002689 Toll-like receptor Human genes 0.000 description 2
- 108020000411 Toll-like receptor Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 235000020932 food allergy Nutrition 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000003349 gelling agent Substances 0.000 description 2
- 239000007970 homogeneous dispersion Substances 0.000 description 2
- 239000001863 hydroxypropyl cellulose Substances 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 2
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 description 2
- 150000003905 phosphatidylinositols Chemical class 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 2-(2-methoxy-5-methylphenyl)ethanamine Chemical compound COC1=CC=C(C)C=C1CCN SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 2-Propenoic acid Natural products OC(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TWJNQYPJQDRXPH-UHFFFAOYSA-N 2-cyanobenzohydrazide Chemical compound NNC(=O)C1=CC=CC=C1C#N TWJNQYPJQDRXPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000000230 African Trypanosomiasis Diseases 0.000 description 1
- 208000035285 Allergic Seasonal Rhinitis Diseases 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000283153 Cetacea Species 0.000 description 1
- 201000006082 Chickenpox Diseases 0.000 description 1
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 241001125840 Coryphaenidae Species 0.000 description 1
- 241000725619 Dengue virus Species 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 1
- 101001086862 Homo sapiens Pulmonary surfactant-associated protein B Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 241000713196 Influenza B virus Species 0.000 description 1
- 241000710842 Japanese encephalitis virus Species 0.000 description 1
- YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N Ketamine Chemical compound C=1C=CC=C(Cl)C=1C1(NC)CCCCC1=O YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000111 LD50 Toxicity 0.000 description 1
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 description 1
- 241000712079 Measles morbillivirus Species 0.000 description 1
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 241000711386 Mumps virus Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 235000021360 Myristic acid Nutrition 0.000 description 1
- TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N Myristic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCC(O)=O TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002274 Nalgene Polymers 0.000 description 1
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000224016 Plasmodium Species 0.000 description 1
- 241000711902 Pneumovirus Species 0.000 description 1
- 208000000474 Poliomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 108010007125 Pulmonary Surfactant-Associated Protein C Proteins 0.000 description 1
- 102000007620 Pulmonary Surfactant-Associated Protein C Human genes 0.000 description 1
- 102100032617 Pulmonary surfactant-associated protein B Human genes 0.000 description 1
- 241000702670 Rotavirus Species 0.000 description 1
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 description 1
- 241000580858 Simian-Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 241000710771 Tick-borne encephalitis virus Species 0.000 description 1
- 206010046980 Varicella Diseases 0.000 description 1
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 241000710886 West Nile virus Species 0.000 description 1
- 241000710772 Yellow fever virus Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000240 adjuvant effect Effects 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- WORJEOGGNQDSOE-UHFFFAOYSA-N chloroform;methanol Chemical compound OC.ClC(Cl)Cl WORJEOGGNQDSOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 229940028617 conventional vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000005713 exacerbation Effects 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 1
- 208000029080 human African trypanosomiasis Diseases 0.000 description 1
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000001571 immunoadjuvant effect Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 239000000568 immunological adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940039412 ketalar Drugs 0.000 description 1
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 150000004682 monohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 1
- 210000002850 nasal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 229940097496 nasal spray Drugs 0.000 description 1
- 239000007922 nasal spray Substances 0.000 description 1
- -1 neuraminase Proteins 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000001331 nose Anatomy 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 235000020030 perry Nutrition 0.000 description 1
- 239000008252 pharmaceutical gel Substances 0.000 description 1
- DDBREPKUVSBGFI-UHFFFAOYSA-N phenobarbital Chemical compound C=1C=CC=CC=1C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O DDBREPKUVSBGFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002695 phenobarbital Drugs 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013643 reference control Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 201000002612 sleeping sickness Diseases 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 229940051021 yellow-fever virus Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0043—Nose
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
- A61K2039/541—Mucosal route
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
- A61K2039/541—Mucosal route
- A61K2039/543—Mucosal route intranasal
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55516—Proteins; Peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
- A61K47/32—Macromolecular compounds obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. carbomers, poly(meth)acrylates, or polyvinyl pyrrolidone
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Otolaryngology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к медицине и касается мукозальной вакцины, продуцирующей антиген-специфический IgA слизистой оболочки и IgG крови на уровнях, способных вызывать эффективную иммунную индукцию и эффект предотвращения инфекции, которая включает: (а) AD-носитель, состоящий из синтетического пептида и смеси дипальмитоилфосфатидилхолина, фосфатидилглицерина и пальмитиновой кислоты; (б) карбоксивиниловый полимер; и (в) антигенный белок. Группа изобретений также касается способа получения указанной мукозальной вакцины. Группа изобретений обеспечивает более мощную способность продуцировать антитела, чем у мукозальных вакцин данного уровня техники, и в результате отличный эффект даже при очень небольшом количестве антигена. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 12 ил., 5 табл., 6 пр.
Description
Область изобретения
[0001] Данное изобретение относится к мукозальной вакцине, эффективно индуцирующей IgA слизистых оболочек и IgG крови.
Уровень техники
[0002] В патентных документах 1 и 2 сделано подробное описание недостатков обычных инактивированных вакцин или анатоксинов, а также текущее состояние в связи с развитием мукозальных вакцин и иммуноадъювантов.
[0003] Как описано в патентных документах 1 и 2, необходимость перехода от обычной вакцины, которую вводят подкожно или внутримышечно, к мукозальной вакцине, вызывающей продукцию антитела IgA в слизистой оболочке, которая является природным путем передачи вирусной инфекции, широко и глубоко признается. Тем более, что вакцина следующего поколения в 21-м веке, мукозальная вакцина, вызывающая продукцию антитела IgA, местный иммунитет или мукозальный иммунитет, предпочтительно должна быть разработана и введена в практическое применение во всем мире, но до сих пор она еще не была получена.
[0004] В ответ на эти проблемы авторы данного изобретения создали носитель антигена-лекарства (antigen-drug vehicle, AD-носитель), который представляет собой комплекс белка В легочного сурфактанта и/или белка С легочного сурфактанта и липида(ов), и мукозальную вакцину, состоящую из этого AD-носителя и антигена (патентный документ 1). Авторы данного изобретения также обнаружили, что путем изменения массового соотношения V/A количества AD-носителя (V) и количества антигена (А), можно изменить селективную продукцию антитела IgA и продукцию обоих антител IgA и IgG, и затем разработали мукозальную вакцину на основе такого механизма действия (патентный документ 2). Патентные документы 1 и 2 также раскрывают эффективность фрагментов (пептидов) белков В и С легочного сурфактанта.
[0005] Кроме того, в результате исследования различных вариантов фрагментов белков легочного сурфактанта в отношении их эффекта на повышение продукции антитела авторы данного изобретения создали AD-носитель, содержащий в качестве компонента синтетический пептид KnLm (где n составляет от 4 до 8, a m составляет от 11 до 20), который, несмотря на то, что он меньшего размера, чем частичные пептиды, описанные в патентных документах 1 и 2, имеет мощное влияние на индукцию и повышение продукции антитела, особенно для исключительной продукции секреторного антитела IgA, а также отличное и эффективное индукторное влияние на продукцию и секреторного иммуноглобулина IgA слизистой, и IgG крови, а также мукозальную вакцину, состоящую из этого AD-носителя и антигена (патентный документ 3).
[0006] В составе назальных капель, путь введения которых идентичен таковому для мукозальной вакцины, с целью повышения вязкости для поддержания эффективности против поллиноза или аллергии, широко используется карбоксивиниловый полимер (CVP) или гидроксипропилцеллюлоза (НРС), а также используется гелеобразующий загуститель, такой как альгинат натрия. Например, также известны НРС-содержащая мукозальная вакцина (патентный документ 4), состав CVP-содержащей мукозальной вакцины (патентный документ 5) и назальный спрей вакцины против гриппа (патентный документ 6). Патентный документ 7 также раскрывает мукозальную вакцину, состоящую из антигена, адъюванта [особенно поли(I:С)] и загустителя (альгината натрия и т.п.).
Патентный документ 1: WO 2005/097182
Патентный документ 2: WO 2007/018152
Патентный документ 3: WO 2009/123119
Патентный документ: JP-A-2008-231 343
Патентный документ 5: WO 01/017556
Патентный документ 6: JP-A-03-38529
Патентный документ 7: JP-A-2009-209086
Сущность изобретения
Проблемы, решаемые изобретением
[0007] Хотя мукозальная вакцина патентного документа 3 обладает мощной способностью продуцировать антитела, она имеет недостаток, общий с другими мукозальными вакцинами, который заключается в том что антиген требуется в большем количестве, чем необходимо для чрескожной инъекционной вакцины.
[0008] Для эффективного лечения вакцина необходима в количестве, достаточном для областей распространения инфекции, на которую она направлена, но с учетом текущего масштаба производства антигена трудно производить повышенное количество мукозальной вакцины. Соответственно, желательно придать мукозальной вакцине дальнейшую мощную способность продуцировать антитела.
[0009] Целью изобретения является создание улучшенной мукозальной вакцины, имеющей более мощную способность продуцировать антитело, чем у мукозальных вакцин, описанных в патентных документах 3, и, как результат, способной оказывать хороший эффект, сопоставимый с подкожной инъекционной вакциной, даже с очень малым количеством антигена.
Средства для решения проблем
[0010] Изобретатели в качестве средств для дальнейшего повышения способности мукозальных вакцин патентных документов 3 индуцировать антитела рассмотрели гелеобразующие агенты (CVP, HPC), используемые в носовых каплях или вакцинах для применения на слизистых оболочках, чтобы понять, могут ли они работать в AD-носителе, увеличивая количество антигена, доставленного антигенпредставляющим клеткам, удлиняя назальный клиренс и тем самым индуцируя иммунный IgA слизистой и иммунный IgG крови, и было подтверждено следующее.
(1) По сравнению с мукозальными вакцинами (антиген+синтетический пептид+липиды) в патентном документе 3 или мукозальными вакцинами (антиген+CVP) в патентных документах 5 и 6 мукозальная вакцина, содержащая «антиген+синтетический пептид+липид+CVP», имеет гораздо лучшую способность индуцировать антитела, и ее влияние выходит далеко за рамки, предсказанные исходя из простой комбинации патентного документа 3 (антиген+синтетический пептид+липиды) и патентных документов 5 и 6 (антиген+CVP).
(2) Эксципиент, HPC, широко известный как гелеобразующий агент для носовых капель или мукозальной вакцины, аналогично CVP не способен индуцировать антитела, и нельзя ожидать, что он будет оказывать эффект индукции IgA слизистой и IgG крови при использовании с антигеном, а также с антигеном и AD-носителем.
(3) Даже при уменьшении количества антигена до примерно 1/5 или меньше от количества, необходимого в мукозальной вакцине (антиген+синтетический пептид+липиды) в патентном документе 3, мукозальная вакцина «антиген+синтетический пептид+липиды+CVP» имеет гораздо более мощный эффект, индуцирующий антитела.
[0011] Изобретение было создано на основе новых сведений, описанных выше.
[0012] Соответственно, изобретение представляет собой мукозальную вакцину, продуцирующую антиген-специфические IgA слизистой и IgG крови на уровнях, способных оказывать эффективную иммунную индукцию и эффект предотвращения инфекции, которая включает:
(а) AD-носитель, состоящий из синтетического пептида и липида(ов), где синтетический пептид состоит из аминокислотной последовательности KnLm (где n составляет от 4 до 8, a m составляет от 11 до 20);
(б) карбоксивиниловый полимер; и
(в) антигенный белок в количестве, не способном продуцировать достаточно IgA слизистой и IgG крови для оказания эффективной иммунной индукции и эффекта предотвращения инфекции, если использовать его в одиночку.
[0013] В мукозальной вакцине данного изобретения белковый антиген (в) находится в количестве, которое даже в сочетании с AD-носителем (а) или в сочетании с карбоксивиниловым полимером (б) не способно продуцировать антиген-специфические IgA слизистой и IgG крови, достаточные для оказания эффективной иммунной индукции и эффекта предотвращения инфекции.
[0014] В одном аспекте этой мукозальной вакцины синтетический пептид состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID №1 или 2.
[0015] В другом аспекте этой мукозальной вакцины липид представляет собой по меньшей мере один среди фосфатидилхолина, дипальмитоилфосфатидилхолина, фосфатидилсерина, фосфатидилглицерина, фосфатидилинозита, фосфатидилэтаноламина, фосфатидной кислоты, лауриловой кислоты, миристиновой кислоты, пальмитиновой кислоты, стеариновой кислоты и олеиновой кислоты. Более конкретно, липиды представляют собой смесь дипальмитоилфосфатидилхолина, фосфатидилглицерина и пальмитиновой кислоты.
[0016] В другом аспекте этой мукозальной вакцины антиген представляет собой полученный из возбудителя инактивированный антиген, очищенный антиген, частично очищенный антиген, рекомбинантный антиген, обезвреженный токсин или аллерген, вызывающий аллергию.
[0017] Данное изобретение также представляет собой способ получения мукозальной вакцины, продуцирующей антиген-специфический IgA слизистой и IgG крови на уровнях, способных оказывать эффективную иммунную индукцию и эффект предотвращения инфекции, которая включает:
(а) AD-носитель, состоящий из синтетического пептида и липида(ов), где синтетический пептид состоит из аминокислотной последовательности KnLm (где n составляет от 4 до 8, а m составляет от 11 до 20);
(б) карбоксивиниловый полимер и
(в) антигенный белок в количестве, не способном продуцировать достаточно IgA слизистой и IgG крови для оказания эффективной иммунной индукции и эффекта предотвращения инфекции, если использовать его в одиночку, где указанный способ включает:
(1) суспендирование указанного (а) и (в) в воде;
(2) повторное нагревание и перемешивание один или более чем один раз;
(3) замораживание и лиофилизацию;
(4) суспендирование лиофилизированной формы в физиологическом растворе для доведения до заранее определенной концентрации; и
(5) добавление раствора указанного (б).
[0018] Используемое в данном документе выражение «количество IgA слизистых и IgG крови, способное оказывать эффективную иммунную индукцию» означает любое такое количество IgA и IgG, которое дает значения ингибирования гемагглютинации (HI) крови не ниже, чем международные критерии оценки.
[0019] В следующем описании композиция, состоящая из синтетического пептида и липидов, может быть определена как «AD-носитель», а композиция, состоящая из AD-носителя и антигена, может быть определена как «мукозальная вакцина». Эти «AD-носитель» и «мукозальная вакцина» по существу идентичны тем, которые раскрыты в патентном документе 3. Кроме того, композиция мукозальной вакцины в сочетании с CVP может быть определена как «мукозальная вакцина с добавлением CVP». В этом изобретении понятие «липиды» включает раскрытие патентных документов с 1 по 3, а понятия «синтетический пептид» и «AD-носитель» включают раскрытие патентного документа 3.
Эффекты изобретения
[0020] Мукозальная вакцина с добавлением CVP данного изобретения имеет чрезвычайно высокий вакцинный эффект индукции антиген-специфических антител IgA и IgG и мощный эффект торможения гемагглютинации (HI) индуцированного антитела, которые намного превышают международный защитный стандарт. Эти эффекты также особо отмечены в сравнении с мукозальными вакцинами, описанными в патентном документе 3, или «вакцинным антигеном+CVP» (патентные документы 5 и 6), а также представляют собой прекрасные эффекты, которые не могут быть предсказаны из эффекта мукозальной вакцины патентного документа 3 или эффекта CVP патентных документов 5 и 6.
[0021] Благодаря такой мощной способности индуцировать антитела необходимого профилактического эффекта можно достичь, даже если антиген содержится в количестве, меньшем, чем в обычной мукозальной вакцине. Таким образом, мукозальная вакцина с добавлением CVP изобретения может оказать мощный эффект индукции антитела, даже если используемое количество антигена уменьшено до 1/5 или менее от количества в обычной мукозальной вакцине (антиген+синтетический пептид+липиды). Например, как показано в эксперименте 2, мукозальная вакцина патентного документа 3, использующая антиген гриппа в качестве антигена, демонстрирует значение ингибирования гемагглютинации (HI) меньше HI=40, что является международным критерием оценки вакцин против гриппа, даже тогда, когда количество антигена составляет 0,2 мкг, в то время как мукозальная вакцина с добавлением CVP изобретения демонстрирует прекрасный защитный иммунный эффект, который отражается значением HI=100 или более, даже с количеством антигена 0,1 мкг, или 0,03 мкг.
[0022] Кроме того, сама композиция (AD-носитель, CVP) мукозальной вакцины с добавлением CVP изобретения не имеет никакого эффекта стимуляции антигенраспознающих клеток, и, соответственно, она имеет крайне низкую способность вызывать неожиданные побочные эффекты, такие как аутоиммунные заболевания или поствакцинное обострение аллергии к любым другим антигенам, отличным от вакцинного антигена.
[0023] Кроме того, в соответствии со способом получения мукозальной вакцины изобретения эта мукозальная вакцина обладает еще более сильной способностью продуцировать антиген-специфические IgA слизистой и IgG крови.
Краткое описание графических материалов
[0024]
[Фиг.1] Результаты эксперимента 1, которые показывают уровни IgA в смыве носовой полости (слева) и уровни IgG в сыворотке (справа), когда мышам назально вводили какую-либо из вакцин примера 1 и сравнительных примеров с 1 по 5 или НА-антиген.
[Фиг.2] Результаты эксперимента 1, которые показывают значения HI, демонстрируемые антителом против НА вируса гриппа, когда мышам назально вводили какую-либо из вакцин примера 1 и сравнительных примеров 1 и 5, НА-антиген или HA+AD-носитель в качестве референсного контроля.
[Фиг.3] Результаты эксперимента 2, которые показывают изменение уровней экспрессии маркерных молекул активации (МНС II, CD40, CD80 (В7-1) и CD86 (В7-2)) на клеточной мембране, когда антигенпредставляющие дендритные клетки стимулировали эндотоксином (ЛПС), поли(I:С) и SF-10 (CVP+AD-носитель), соответственно. Левый график показывает соотношение (%) положительных клеток от общего числа клеток, которое указывает на повышенную экспрессию каждой мембранной молекулы (клетки демонстрируют значение выше отрицательной границы отсечки, как указывает столбец вблизи центра, которая была определена на основании обработки физиологическим раствором в качестве контроля в точечных графиках справа). Правый график показывает результаты измерения с помощью проточной цитометрии, в котором визуализируется количество маркерных молекул активации на клеточной мембране.
[Фиг.4] Результаты эксперимента 4, которые указывают на взаимосвязь между количеством PFU (plaque-forming unit, бляшкообразующих единиц) инфекционого вируса гриппа и выживаемостью.
[Фиг.5] Результаты эксперимента 4, которые являются изменениями в % выживаемости, когда мышей (10 мышей в группе) иммунизировали интраназально любой из вакцин примера 1, примера 5, сравнительного примера 5 или сравнительного примера 6, а затем инфицировали 50 PFU вируса гриппа.
[Фиг.6] Результаты эксперимента 4, которые являются изменениями в % выживаемости, когда мышей (10 мышей в группе) иммунизировали интраназально любой из вакцин примера 1, примера 5, сравнительного примера 5 или сравнительного примера 6, а затем инфицировали 800 PFU вируса гриппа.
[Фиг.7] Изображение, полученное с помощью трансмиссионного электронного микроскопа, результаты эксперимента 6. (А) Мукозальная вакцина сравнительного примера 1, (В) мукозальная вакцина с добавлением CVP примера 1 и ее частично увеличенное изображение (на фиг. справа).
[Фиг.8] Результаты проточной цитометрии в эксперименте 7, которые показывают количество флуоресцентно меченого антигена, обнаруженного в дендритных клетках. При условии, что уровни флуоресценции, обнаруженные в дендритных клетках, обработанных только антигеном НА, составляют 1, во сколько раз увеличение количества флуоресценции было усилено в условиях каждого измерения, указано на ординате с «Кратность в зависимости от НА»=[MFI в каждом измерении образца]/[MFI в дендритной клетке, обработанной только НА]. MFI: средняя интенсивность флуоресценции **: р<0,01 против НА (n=3).
[Фиг.9] Результат эксперимента 8, в котором измеряли уровни экспрессии маркерной молекулы активации (CD86) на клеточной мембране, где антигенпредставляющие дендритные клетки стимулировали с помощью поли(I:С) и SF-10 (CVP+AD-носитель), соответственно. □ указывает на отсутствие антигенного белка НА, в то время как ■ указывает на наличие антигенного белка НА. MFI: средняя интенсивность флуоресценции, *: р<0,05 против адъюванта в одиночку (n=3).
[Фиг.10] Результаты эксперимента 9, в котором измеряли уровни экспрессии CD86 на мембране дендритных клеток, полученных из тканей носовой полости мышей. Мышей иммунизировали интраназально с адъювантом SF-10 (CVP+AD-носитель) в присутствии или в отсутствие антигена. MFI: средняя интенсивность флуоресценции.
[Фиг.11] Результаты эксперимента, в котором в качестве антигенного белка использовали антиген респираторно-синцитиального вируса (RSV). Первая диаграмма отражает результаты эксперимента с IgG, а вторая - с IgA.
[Фиг.12] Результаты эксперимента, в котором в качестве антигенного белка использовали овальбумин (OVA), типичный антиген пищевой аллергии. Мышам вводили интраназально физиологический раствор, один OVA, в комбинациях с SF-10 (CVP+AD-носитель) и с адъювантом поли(I:С).
Режим для осуществления изобретения
[0025] Мукозальная вакцина с добавлением CVP изобретения включает следующую композицию.
Синтетический пептид
Синтетический пептид состоит из аминокислотной последовательности KnLm (где n составляет от 4 до 8, a m составляет от 11 до 20). KnLm имеет n остатков K (Lys) на N-концевой части и m остатков L на С-концевой части. Такой синтетический пептид может быть любым из следующих пептидов. В скобках указана аббревиатура пептида. Аминокислотный остаток обозначается однобуквенным кодом.
SEQ ID №1 (K6L16) состоит из 6 остатков K(Lys) на N-концевой стороне и 16 остатков L на С-концевой стороне, a SEQ ID №2 (K6L11) состоит из 6 остатков K(Lys) на N-концевой стороне и 11 остатков L на С-концевой стороне. Эти синтетические пептиды, полученные в соответствии с известными способами химического синтеза, имеют чистоту 95% или выше.
Липид
Предпочтительно используется фосфолипид, содержащийся в легочном сурфактанте, такой как фосфатидилхолин, дипальмитоилфосфатидилхолин, фосфатидилсерин и фосфатидилглицерин. В противном случае также может быть использован фосфатидилинозит, фосфатидилэтаноламин, фосфатидная кислота, сфингомиелин и т.п. В качестве жирных кислот могут быть использованы лауриновая кислота, миристиновая кислота, пальмитиновая кислота, стеариновая кислота, пальмитоолеиновая кислота, олеиновая кислота и т.п. Кроме того, можно использовать липиды, полученные из водных животных, таких как киты и дельфины, у которых легкие раздуваются динамично.
Карбоксивиниловый полимер (СУР)
CVP представляет собой гидрофильный полимер, полученный путем полимеризации акриловой кислоты в качестве основного компонента, и коммерчески доступен; например, могут быть использованы Hivis Вако 103, Hivis Вако 104, Hivis Вако 105, продукты компании Sigma рАА130 (Sigma, Сент-Луис, Миссури, каталоговый №181293), рАА450 (Sigma, каталоговый №181285) и рАА1250 (Sigma, каталоговый №306215). Среди них предпочтительными являются Hivis Вако 104 и продукты компании Sigma рАА130 и рАА1250, которые широко используются в производстве косметических и фармацевтических гелей. После получения раствора CVP с 0,2 до 2,0% по весу в чистой воде или физиологическом растворе при ультразвуковой обработке для подведения pH до 5,0-10,5 может быть использован нейтрализующий раствор NaOH, так как предпочтительно использовать pH, который не влияет отрицательно на стабильность антигена вакцины. Например, антиген вакцины против вируса гриппа доводят до pH 6,8-8,0, предпочтительно до pH 7,0-7,2.
Антиген
Антиген включает молекулы антигена, например, бактериального антигена высокой степени чистоты для вакцинации, чистота которого составляет примерно 90% или более, вирусного антигена, белка, такого как анатоксин, гликопротеина, аллергена, полимерного сахарида и нуклеиновой кислоты. Например, предусмотрен антиген для вакцины против вируса ветряной оспы, вируса кори, вируса эпидемического паротита, полиомиелита, ротавируса, вируса гриппа, аденовируса, вируса герпеса, вируса атипичного острого респираторного синдрома (SARS), вируса Западного Нила, вируса Хантаан, вируса лихорадки денге, вируса японского энцефалита, вируса желтой лихорадки, вируса клещевого энцефалита, ВИЧ, вируса гепатита С, Bordetella pertussis, менингококка, вируса гриппа В, пневмовируса, холерного вибриона, плазмодия, возбудителя сонной болезни и т.п.
[0026] При использовании в одиночку или, особенно, в сочетании с AD-носителем (а) или в сочетании с карбоксивиниловым полимером (CVP) антиген применяют в количестве, которое подводят таким образом, что антиген - специфический IgA слизистой и IgG крови не производится в количестве, производящем эффективную иммунную индукцию.
[0027] Антигенный белок гриппа содержит белок М, нейраминазу, нуклеопротеид и т.п. в дополнение к антигенной молекуле НА. В последующем описании количество антигенного белка означает общее количество белка, в том числе антигенных молекул, перечисленных выше. Количество молекул антигена НА составляет примерно 50% от общего антигенного белка в случае часто используемой вакцины гриппа.
[0028] Ниже приведено описание способа получения AD-носителя и мукозальной вакцины с добавлением CVP из материалов, описанных выше.
Изготовление AD-носителя
Несколько липидов из перечисленных выше смешивают в подходящем соотношении и суспендируют в смеси хлороформ.метанол (2:1 (объем/объем)), например, с концентрацией липида 10 мг/мл, и используют в качестве липидного компонента. Синтетический пептид растворяют в этаноле, например, в концентрации 5,0 мг/мл. Затем эти липидный компонент и синтетический пептид смешивают. Соотношение смешивания включает от примерно 0,2 до примерно 12,0% сухой массы для синтетического пептида, и от примерно 88 до примерно 99,8% сухой массы для липида. Эту смесь выпаривают до сухости при температуре примерно 40°C с помощью роторного испарителя и повторно суспендируют в 10% этаноле до соответствующей концентрации, встряхивают и перемешивают в течение 15 минут на водяной бане при температуре примерно 45°C до получения однородной дисперсии, которую затем замораживают и высушивают. Это сухое вещество хранится при температуре примерно -30°C, и каждый раз в момент применения его суспендируют в чистой воде или физиологическом растворе, а затем подвергают воздействию ультразвуковой волны, гомогенизатора, мешалки, встряхивателя и т.п., чтобы сформировать однородную дисперсию.
Мукозальный вакцинный перпарат с добавлением CVP
Вышеупомянутый AD-носитель, CVP и антиген смешивают в подходящем соотношении. Таким образом, в случае вакцины против гриппа раствор AD-носителя смешивают со стоковым раствором вакцины, так что отношение количества AD-носителя (V) к антигенному белку (А) на основе сухого веса, т.е. V/A, приобретает необходимое значение. Сухой вес антигенного белка (А) для введения одной мыши составляет от примерно 0,01 до примерно 10 мкг/кг массы тела, предпочтительно составляет от примерно 0,03 до примерно 5,0 мкг/кг массы тела. Это количество антигенного белка составляет 1/5 или меньше от количества антигена (от примерно 0,1 до примерно 50 мкг/кг массы тела, предпочтительно от примерно 0,3 до примерно 30 мкг/кг массы тела) в мукозальной вакцине патентного документа 3 (антиген+AD-носитель).
[0029] В таком количестве антигена для индукции преимущественно и селективно продукции антитела IgA V/A предпочтительно составляет от примерно 0,1 до примерно 1,0. С другой стороны, V/A для индукции продукции обоих антител IgA и IgG составляет от примерно 1,0 до примерно 100, предпочтительно от примерно 5 до примерно 20. При описанном выше V/A примерно 60% или более антигена связано с AD-носителем, и полученная мукозальная иммунная вакцина способна эффективно индуцировать продукцию антитела IgA и/или продукцию антитела IgG.
[0030] Концентрация CVP в конечном растворе назальной вакцины, в который был добавлен CVP, составляет примерно от 0,1% до 1,0%, предпочтительно от 0,3% до 0,8%. AD-носитель, антиген и CVP можно смешать равномерно с помощью гомогенизатора, смесителя, мешалки, встряхивателя и т.п.
[0031] Как правило, как показано в Примере 1, описанном ниже, антигенный белок и AD-носитель смешивают, затем подвергают ультразвуковой обработке в течение 3 минут, затем встряхивают в течение 2 часов при комнатной температуре и, наконец, соединяют с равным объемом 1% раствора CVP в физиологическом растворе, таким образом получая мукозальную вакцину с добавлением CVP. Этот способ идентичен способу, описанному в патенте 3, за исключением добавления CVP. Тем не менее, этот способ является невыгодным, так как он может позволить вирусному антигену инактивироваться за счет тепла, выделяемого при ультразвуковой обработке, и процесс ультразвуковой обработки имеет затруднение в поддержании постоянных условий с учетом типа используемого прибора, размера осциллятора, состояния осциллятора и т.п.
[0032] Таким образом, предпочтительным является способ продукции, который приведен в Примере 7 и включает следующие этапы:
(1) суспендирование AD-носителя и антигенного белка в воде (чистой воде);
(2) повторное нагревание и перемешивание один или более чем один раз;
(3) замораживание и лиофилизацию;
(4) суспендирование лиофилизированных образцов в физиологическом растворе для доведения до заранее определенной концентрации; и
(5) добавление раствора CVP в физиологический раствор.
Он является прекрасным способом, который служит не только для решения вышеупомянутых проблем, связанных с ультразвуковой обработкой, но также позволяет далее увеличивать продукцию антиген-специфических IgA и IgG.
[0033] Мукозальная вакцина с добавлением CVP, изготовленная таким образом, может быть использована в однократной дозировке, но предпочтительно она используется в двух дозировках (начальная иммунизация и вторичная иммунизация) или трех дозировках (начальная иммунизация, вторичная иммунизация и третичная иммунизация). Такая повторная иммунизация позволяет заметно поднять титры антиген-специфических антител IgA и IgG. Две или три вакцинные дозировки вводят с интервалом от 1 недели до 3 недель, предпочтительно примерно 2 недели. Введение мукозальной вакцины с добавлением CVP изобретения может быть проведено в носовую полость, а также в ротовую полость или полость влагалища (см., например, Lubrizol Pharmaceutical Bulletin, Polymers for Pharmaceutical Applications, Lubrizol Advanced Materials, Inc. 2008).
[0034] Далее данное изобретение подробно описано в следующих примерах, но оно не ограничивается следующими примерами.
Пример 1
[0035] [Этапы производства, включающего ультразвуковую обработку]
AD-носитель получают, как описано ниже. Дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC), фосфатидилглицерин (PG) и пальмитиновую кислоту (РА) смешивают в соотношении 75:25:10 (вес/вес/вес) и суспендируют в смеси хлороформ:метанол (2:1 (объем/объем)) до концентрации фосфолипида 10 мг/мл, получая липидный компонент.Синтетический пептид K6L16 (KKKKKKLLLLLLLLLLLLLLLL) (продукт GenScript Inc.) с чистотой 95% или выше растворяют в метаноле в концентрации до 5,0 мг/мл. Раствор липидного компонента (DPPC:PG:PA=75:25:10, вес/вес/вес) и раствор пептида K6L16 смешивают в массовом соотношении фосфолипидный компонент: K6L16=100:2 и выпаривают до сухости при 40°C с помощью роторного испарителя. Их ресуспендируют в 10% этаноле до концентрации фосфолипида 4 мг/мл, встряхивают и перемешивают в течение 15 минут на водяной бане при температуре примерно 45°C до получения однородной дисперсии. Их замораживают и высушивают, а затем сохраняют в качестве AD-носителя при -30°C.
[0036] Затем вышеупомянутый AD-носитель используют для приготовления мукозальной вакцины с добавлением CVP, как описано ниже.
[0037] Лиофилизированный AD-носитель используют, суспендируя его в физиологическом растворе непосредственно перед применением. Используемым антигеном вакцины против вируса гриппа (НА) был A/NewCaledonia/20/99 (H1N1), предоставленный Фондом исследований микробных заболеваний Университета Осаки, с концентрацией 1,94 мг белка/мл (натрий-фосфатный буферный раствор, хлорид натрия, раствор тимеросала: содержащий на 1 мл 3,53 мг натрия фосфорнокислого двузамещенного одноводного, 0,54 мг дигидрофосфата натрия, 8,50 мг хлорида натрия и 0,008 мг тимеросала). Вакцину и AD-носитель смешивают в таком соотношении, что отношение количества белка в растворе антигена (А) к количеству фосфолипида в растворе AD-носителя (V), т.е. VA, составляет 10, подвергают ультразвуковой обработке с трехкратным включением и выключением с интервалом в 30 секунд, выполняя ультразвуковую обработку в течение 3 минут в общей сложности, в том числе с включением на 90 секунд и выключением на 90 секунд в общей сложности (модель S-250D, Branson Ultrasonics Danbury), затем встряхивают в течение 2 часов при комнатной температуре и растворяют в физиологическом растворе, а затем соединяют с нейтрализовованным 1% CVP (Hivis Вако 104) до конечной концентрации 0,5%. Таким образом, композиция, которая содержится в общей сложности в 4 мкл и которую вводят в обе носовые полости одной мыши, по 2 мкл в каждую ноздрю, содержит количество антигенного белка вакцины против гриппа (НА)/количество фосфолипида в растворе AD-носителя/масса CVP=0,2 мкг/2,0 мкг/20 мкг. pH этой мукозальной вакцины с добавлением CVP находится в пределах, которые позволяют поддерживать антигенность антигенного белка НА (от 7,0 до 7,2).
[0038] Здесь и далее мукозальная вакцина с добавлением CVP обозначается как «HA+SF-10». В то время как количество SF-10 представляет собой AD-носитель (2,0 мкг)+С\/Р (20 мкг)=22 мкг, как описано выше, следующее описание использует обозначение SF-10 (2,0 мкг) для представления количества фосфолипидов AD-носителя, который служит в качестве основы для влияния носителя адъюванта. Количества SF-10 в других примерах указаны как значения без учета количеств С VP.
Пример 2
[0039] В соответствии со способом в примере 1 была изготовлена мукозальная вакцина с добавлением CVP, в которой количество антигенного белка НА составило 0,1 мкг. Соотношение антигенного белка НА, AD-носителя и CVP было идентично таковому в примере 1 (т.е. содержание AD-носителя в количестве, в 10 раз превышающем количество антигенного белка, и CVP в конечной концентрации 0,5%).
Пример 3
[0040] В соответствии со способом в примере 1 была изготовлена мукозальная вакцина с добавлением CVP, в которой количество антигенного белка НА составило 0,03 мкг. Соотношение антигенного белка НА, AD-носителя и CVP было идентично таковому в примере 1 (т.е. содержание AD-носителя в количестве, в 10 раз превышающем количество антигенного белка, и CVP в конечной концентрации 0,5%).
Сравнительный Пример 1
[0041] Была изготовлена мукозальная вакцина патентного документа 3 (HA+AD-носитель). Антигенный белок НА и AD-носитель были идентичны таковым в Примере 1, и изготовление вакцины было проведено так же, как в примере 1. Количество антигенного белка НА составило 0,2 мкг, а количество AD-носителя составило 2,0 мкг.
Сравнительный пример 2
[0042] Была изготовлена мукозальная вакцина, описанная в патентных документах 5 и 6 (HA+CVP). Антигенный белок НА и CVP были идентичны таковым в Примере 1, и изготовление вакцины было проведено так же, как в примере 1. Количество антигенного белка НА составило 0,2 мкг, а конечная концентрация CVP составила 0,5%
Сравнительный пример 3
[0043] Была изготовлена мукозальная вакцина, описанная в патентном документе 4 (НА+НРС). Антигенный белок НА был идентичен таковому в Примере 1, а НРС был коммерчески полученным НРС 6.0-10.0 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd). Изготовление вакцины было проведено так же, как в примере 1. Количество антигенного белка НА составило 0,2 мкг, а количество НРС составило 20 мкг.
Сравнительный пример 4
[0044] Была изготовлена мукозальная вакцина (HA+AD-носитель+НРС) путем объединения HA+AD-носитель патентных документов 3 с НРС. HA+AD-носитель был идентичен таковому в сравнительном примере 1, а НРС был идентичен таковому в сравнительном примере 3, в то время как изготовление вакцины было проведено так же, как в примере 1. Количество антигенного белка НА составило 0,2 мкг, количество AD-носителя составило 2,0 мкг, а количество НРС составило 20 мкг.
Сравнительный пример 5
[0045] В соответствии со способом, описанным в публикации (Asahi-Ozaki Y et al., Microbes Infect 2006; 8:2706-2714, Ichinohe T, et al., J Virol 2005; 79(5): 2910-2919), была изготовлена мукозальная вакцина (НА+поли(I:С)), содержащая поли(I:С) (Alexis Corp.), который является лигандом Toll-подобных рецепторов (TLR) дендритных клеток и интенсивно стимулирует антигенпредставляющие клетки, усиливая продукцию антитела. Количество антигенного белка НА составило 0,2 мкг, количество поли(I:С) составило 2 мкг.
Сравнительный пример 6
[0046] Антиген НА разводили физиологическим раствором и использовали в качестве вакцины. Доза антигенного белка НА на одно животное составляла 0,2 мкг.
Эксперимент 1
[0047] Используя мышей, тестировали эффекты повышения продукции антитела, вызываемые назальными мукозальными вакцинами.
1. Мукозальная вакцина
- HA+SF-10 (пример 1)
- HA+AD-носитель (сравнительный пример 1)
- HA+CVP (сравнительный пример 2)
- НА+НРС (сравнительный пример 3)
- HA+AD-носитель+НРС (сравнительный пример 4)
- НА+поли (I:C) (сравнительный пример 5)
- НА в одиночку (сравнительный пример 6)
2. Животные
Использовали самок мышей BALB/c (6-8 недель), приобретенных у Japan SLC, Inc. (Сидзуока, Япония). Все эксперименты на животных проводили в здании для инфицированных животных (уровень Р2) в Институте экспериментов на животных, Университет Токушима, Школа медицины, в соответствии с руководящими принципами Комитета по экспериментам на животных Университета Токушима, Школа медицины.
3. Способ иммунизации
При введении вакцины через нос 2 мкл 5 мукозальных вакцин, описанных выше в разделе 1, соответственно вводили в каждую ноздрю, таким образом закапывая в общей сложности 4 мкл в обе носовые полости каждой мыши под анестезией с помощью препаратов Ketalar (62,6 мг/кг) и Selactar (12,4 мг/кг). В качестве контроля использовали группу, получившую физиологический раствор, и сравнительный пример 6 (антигенный белок НА в одиночку) в количестве, идентичном таковому в растворе вакцины. Каждая группа включала от 9 до 10 мышей.
[0048] Вторичную (бустирующую) иммунизацию проводили путем назального введения одинаковых доз вакцины через две недели после первой иммунизации. Через две недели после вторичной иммунизации аналогичным способом проводили третичную иммунизацию, и через две недели после последней иммунизации брали образцы. Хотя вакцину вводили в общей сложности три раза, вторичная иммунизация в качестве окончательной иммунизации может дать почти аналогичные результаты.
4. Получение от мышей смывов носовой полости и альвеолярных смывов Через две недели после третичной иммунизации получали смывы полости носа/альвеолярные смывы и сыворотки для измерения антиген-специфических IgA и IgG к вирусному НА. Процедуры были такими же, как описано в публикации (Mizuno D, Ide-Kurihara М, Ichinomiya Т, Kubo I, Kido H. Modified pulmonary surfactant is a potent adjuvant that stimulates the mucosal IgA production in response to the influenza virus antigen. J Immunol. 2006; 176:1122-30).
[0049] Мышей, которым вводили вакцину, анестезировали фенобарбиталом, чтобы провести тораколапаротомию, и надрезали трахею, чтобы вставить венозный катетер Atom 3 Fr с узлами (Atom Medical Corporation, Токио, Япония) в легкое, и через него затем вводили 1 мл физиологического раствора и забирали обратно. Эту процедуру повторяли три раза и полученные в общей сложности 3 мл использовали в качестве альвеолярного смыва. После сбора альвеолярного смыва венозный катетер Atom вставляли через надрезанную трахею в направлении носовой полости, вводили через него 1 мл физиологического раствора и собирали жидкость, выходящую из носа. Жидкость использовали в качестве смыва носовой полости. Кроме того, собирали кровь из сердца и центрифугировали ее в течение 10 минут со скоростью 5000 оборотов в минуту для получения сыворотки.
5. Количественная оценка противогриппозного антитела
Уровни специфических противогриппозных IgA и IgG в смывах носовой полости/альвеолярного смыва и сыворотке количественно оценивали с помощью анализа ELISA в соответствии с описанием в приведенной выше публикации (Mizuno D, et al. J Immunol. 2006;176:1122-30).
[0050] Анализ ELISA проводили в соответствии со способом, приведенным для набора для количественной оценки Mouse ELISA quantitation kit от BETHYL LABORATORIES, INC. (Техас, США). В каждую лунку 96-луночного иммунопланшета Nunc Immunoplate (Nalgen Nunc International, Нью-Йорк, США) вносили 1 мкг вакцины и 100 мкл 1 мг/мл раствора бычьего сывороточного альбумина (BSA, SIGMA, Миссури, США) в PBS и оставляли в течение ночи при 4°C для твердофазной реакции иммобилизации. После этого вакцинную жидкость удаляли путем трехкратного промывания промывочной жидкостью (50 мМ Tris, 0,14 М NaCl, 0,05% Твин-20, pH 8,0). В каждую лунку вносили 200 мкл 50 мМ буферного раствора Tris-HCl (pH 8,0), содержащего 0,15 М NaCl и 1% BSA, и проводили реакцию блокировки в течение 1 часа при комнатной температуре. После трехкратного промывания каждой лунки промывочной жидкостью вносили 100 мкл смывов носовой полости, легочных смывов или сывороток, которые были соответственно разведены буферным раствором, связывающим образец (50 мМ Tris, 0,15 М NaCl, 1% BSA, 0,05% Твин-20, pH 8,0), и проводили реакцию в течение 2 часов при комнатной температуре. Козлиные противомышиные IgA или IgG, меченые пероксидазой хрена (HRP) (Bethyl Laboratories, Inc), использовали в качестве вторичного антитела, и ТМВ Microwell Peroxidase Substrate System (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc., Мэриленд, США) использовали для проведения хромогенной реакции. Реакцию останавливали добавлением 100 мкл 2 М H2SO4 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) в каждую лунку и измеряли абсорбцию при 450 нм с помощью SPECTRAmax PLUS 384. В качестве стандарта для количественной оценки использовали абсорбцию, полученную аналогично с использованием 10 нг противогриппозного IgA и IgG, очищенного из вышеупомянутых легочных смывов.
6. Результаты
Результаты индукции антитела против НА вируса гриппа показаны для IgA в смывах носовой полости (фиг. 1, слева) и IgG в крови (фиг. 1, справа). Соответствующие измеренные значения приведены в таблице 1. Фиг. 2 и Таблица 2 показывают титры HI соответствующих анализируемых групп.
(1) Группа, получавшая только антиген НА (сравнительный пример 6), демонстрировала уровень антиген-специфического IgA 24,77 нг/мл и уровень IgG 0,54 мкг/мл, в то время как группа, получавшая HA+SF-10 (пример 1), демонстрировала уровень антиген-специфического IgA 3307,60 нг/мл и уровень IgG 568,75 мкг/мл, показывая 132-кратное повышение для IgA в смывах носовой полости и 1137-кратное повышение для IgG в сыворотках крови. Было подтверждено, что мукозальная вакцина с добавлением CVP (HA+SF-10) данного изобретения имеет чрезвычайно мощный эффект индукции антитела (фиг.1, таблица 1).
(2) Продукция антитела в группе, получавшей HA+SF-10 (пример 1), была выше в 15,6 раз для антиген-специфического IgA и в 150 раз для IgG по сравнению с HA+AD-носитель (сравнительный пример 1) и выше в 10,7 раз для антиген-специфического IgA и в 115,4 раз для IgG по сравнению с HA+CVP (сравнительный пример 2) (фиг. 1, таблица 1). Такие необыкновенно хорошие эффекты индукции антитела, вызванные HA+SF-10, выходят далеко за рамки, предсказанные исходя из простой комбинации известной мукозальной вакцины (HA+AD-носитель) патентного документа и известного CVP патентных документов 5 и 6.
(3) Продукция антитела в группе, получавшей НА+НРС (сравнительный пример 3), была аналогична или меньше, чем в группе, получавшей только НА (сравнительный пример 6). Продукция антитела в группе, получавшей HA+AD-носитель+НРС (сравнительный пример 4), была ниже, чем в группе, получавшей HA+AD-носитель (сравнительный пример 1) (фиг. 1, таблица 1). Основываясь на этих результатах, было подтверждено, что НРС, который широко известен как гелеобразующий агент в составе носовых капель или как добавка в мукозальной вакцине, аналогичная CVP, не обладает эффектом повышения иммунной индукции при использовании в сочетании с антигеном и AD-носителем. Соответственно, считается, что усиление адъювантного эффекта AD-носителя с помощью добавления CVP связано с природой AD-носителя, а не просто с эффектом увеличения вязкости вакцины.
(4) Продукция антител в группе, получавшей HA+SF-10 (пример 1), была выше в 11,4 раз для IgA в смывах носовой полости и в 2,3 раза для IgG в сыворотках крови по сравнению с НА+поли(I:С) (сравнительный пример 5) (фиг. 1, таблица 1). На основании этих результатов было подтверждено, что мукозальная вакцина с добавлением CVP (HA+SF-10) изобретения имеет более мощный иммунный эффект индукции, чем поли(I:С), мощно стимулируя антигенпредставляющие клетки и усиливая продукцию антигена.
[0051] [Таблица 1]
Титр антител
[0052]
(5) В то время как в соответствии с международными критериями оценки вакцин против гриппа для защитного иммунитета, по которым вакцина, титр торможения гемагглютинации (HI) которой превышает 40, оценивается как эффективная, только у 50% образцов с HA+AD-носитель (сравнительный пример 1) HI превысил 40 со средним значением HI=39. Напротив, HA+SF-10 (пример 1) показал HI>40 во всех образцах, а среднее значение было таким высоким как HI=213,3, и демонстрировал мощный противовирусный защитный эффект, который составлял 1,56 от такового с НА+поли(I:С) (сравнительный пример 5), который продемонстрировал HI=137,0 (фиг. 2, таблица 2).
[0053] [Таблица 2]
Титр HI
Эксперимент 2
[0054] Антигенпредставляющие дендритные клетки, полученные способом из публикации (Mizuno D et al., J Immunol 2006; 176:1122-1130), стимулировали эндотоксином (ЛПС: 100 нг/1×105 клеток) (Grauer О, et al., Histochem Cell Biol 2002; 117:351-362), поли(I:С) (10 мкг/1×105 клеток) и SF-10 (AD-носитель с добавлением CVP 10 мкг/1×105 клеток) и измеряли уровни экспрессии маркерных молекул активации на клеточных мембранах (МНС II, CD40, CD80 (В7-1) и CD86 (В7-2)).
[0055] Результаты показаны на фиг. 3. ЛПС и поли(1:С) заметно повышали экспрессию CD40 и CD86 и число активированных антигенпредставляющих дендритных клеток, в то время как SF-10 сам по себе не увеличивал экспрессию МНС II, CD40, CD80 и CD86 на антигенпредставляющих дендритных клетках, показывая уровень экспрессии, почти равный уровню в контроле (необработанных клетках).
[0056] На основании этих результатов было принято, что SF-10 прямо не стимулирует антигенпредставляющие дендритные клетки без антигена, т.е. SF-10 эффективно стимулирует доставку антигена к антигенпредставляющим дендритным клеткам, тем самым вызывая продукцию антитела.
Эксперимент 3
[0057] Каждую мукозальную вакцину с добавлением CVP из примера 1 (количество антигенного белка НА: 0,2 мкг), примера 2 (количество антигенного белка НА: 0,1 мкг) и примера 3 (количество антигенного белка НА: 0,03 мкг) вводили мышам (10 животных в каждой группе) аналогично эксперименту 1 и измеряли антиген-специфические IgA в смывах носовой полости и IgG в крови аналогично эксперименту 1.
[0058] Результаты представлены в таблице 3. Пример 1 (количество антигенного белка НА: 0,2 мкг) и пример 2 (количество антигенного белка НА: 0,1 мкг) демонстрировали почти равный эффект индукции антител. Кроме того, пример 3 (количество антигенного белка НА: 0,03 мкг), где количество антигенного белка составляло 1/6 или менее от такового в примере 1, также демонстрировал намного более мощный эффект индукции антитела по сравнению со сравнительным примером 2: HA+AD-носитель (количество антигенного белка НА: 0,2 мкг) и сравнительным примером 3: HA+CVP (количество антигенного белка НА: 0,2 мкг) в эксперименте 1 (таб. 1). Таким образом, экспериментальная группа из примера 3 демонстрировала уровень антиген-специфического IgA в 11,7 раза выше, чем в сравнительном примере 2, и в 8,0 раз выше, чем в сравнительном примере 3, и количество IgG в 77,2 раза выше, чем в сравнительном примере 2, и в 60,1 выше, чем в сравнительном примере 3.
[0059] На основании этих результатов было подтверждено, что мукозальная вакцина с добавлением CVP изобретения способна продуцировать достаточное количество антитела с гораздо меньшим количеством антигена, чем в мукозальных вакцинах патентного документа 3 (HA+AD-носитель) и патентных документов 5 и 6 (HA+CVP). Кроме того, в отношении эффекта торможения гемагглютинации (HI-эффекта) мукозальная вакцина с добавлением CVP демонстрировала достаточный защитный эффект, реализуемый HI=198,0, даже с количеством антигенного белка НА 0,03 мкг.
[0060] [Таблица 3]
Пример 4
[0061] В соответствии со способом в примере 1 получали мукозальную вакцину с добавлением CVP с количеством AD-носителя 0,3 мкг и количеством антигенного белка НА 0,03 мкг. Соотношение антигенного белка НА, AD-носителя и CVP было идентично таковому в примере 1 (т.е. содержание AD-носителя в количестве, в 10 раз превышающем количество антигенного белка, и CVP в конечной концентрации 0,5%).
Эксперимент 4
[0062] Каждую мукозальную вакцину с добавлением CVP из примера 1 (AD-носитель: 2,0 мкг, количество антигенного белка НА: 0,2 мкг) и примера 4 (AD-носитель: 0,3 мкг, количество антигенного белка НА: 0,03 мкг) аналогично эксперименту 1 вводили мышам (10 животных в каждой группе), которых затем инфицировали на 14 день после второй вакцинации (в общей сложности трехкратная иммунизация) 50 PFU и 800 PFU вируса гриппа (A/PR8 (N1H1)/мкл).
[0063] Как показано на фиг. 4, инфицирующее количество вируса, способное обеспечить 50% летальную дозу (LD50), составляло PFU<5, а без введения вакцины все мыши умирали в течение 9 дней при 50 PFU и в течение 8 дней при 100 PFU или более после заражения.
[0064] Влияние вакцинации на выживаемость показано на фиг. 5 и фиг. 6. И в контроле (с физиологическим раствором), и в сравнительном примере 6 (только антигенный белок НА) все животные погибли через 7-9 дней после инфицирования 50 PFU вируса и через 7 дней после инфицирования 800 PFU вируса. В сравнительном примере 5 (НА+поли(I:С)) 9 из 10 животных погибли в течение 9 дней после инфицирования 800 PFU вируса.
[0065] С другой стороны, все мыши, получавшие мукозальные вакцины с добавлением CVP из примера 1 и примера 4, выживали в течение 15 дней после инфицирования 50 PFU вируса. Инфицирование 800 PFU вируса убило 1 из 10 животных, получавших вакцину из примера 1 (через 8 дней или позднее), и 5 из 10 животных, получавших вакцину из примера 4 (через 10 дней или позднее).
[0066] На основании этих результатов было подтверждено, что мукозальная вакцина с добавлением CVP изобретения обладает отличным эффектом предотвращения инфекции.
Пример 5
[0067] [Производственный процесс В без ультразвуковой обработки]
Порошок лиофилизированного AD-носителя растворяли в чистой воде и добавляли к жидкости с антигенным белком НА, как в Примере 1, а затем этот раствор объединяли с равным количеством 1,0% CVP, растворенного в чистой воде, получая суспензию. Эту суспензию нагревали без ультразвуковой обработки при 42°C в течение 10 минут, используя водяную баню, и на третьей и седьмой минутах нагревания раствор перемешивали с помощью миксера в течение 10 секунд для достижения однородности. После нагревания суспензию замораживали на ночь при температуре от -30°C до -75°C и лиофилизировали, получая сухой порошок. Лиофилизированный порошок хранили при температуре -30°C.
Непосредственно перед применением лиофилизированный порошок суспендировали в физиологическом растворе, получая мукозальную вакцину с добавлением CVP. Раствор вакцины так разводили, чтобы вводить в общей сложности 4 мкл в обе носовые полости мышей, в каждую ноздрю по 2 мкл раствора, содержащего 0,5% CVP, 0,2 мкг антигенного белка НА и 2,0 мкг фосфолипидов AD-носителя. Далее эта мукозальная вакцина с добавлением CVP обозначается как HA+SF-10-B.
Пример 6
[0068] [Производственный процесс С без ультразвуковой обработки] Порошок лиофилизированного AD-носителя, растворенный в чистой воде, смешивали с жидкостью с антигенным белком НА, как в Примере 1. Эту суспензию нагревали при 42°C в течение 10 минут, используя водяную баню, и на третьей и седьмой минутах нагревания раствор перемешивали с помощью миксера в течение 10 секунд для достижения однородности. После нагревания суспензию замораживали на ночь при температуре от -30°C до -75°C и лиофилизировали, получая сухой порошок. Лиофилизированный порошок хранили при температуре -30°C. Непосредственно перед применением лиофилизированный порошок осторожно перемешивали с 0,5% раствором CVP, предварительно растворенного в физиологическом растворе, избегая любого вспенивания, и таким образом получали мукозальную вакцину с добавлением CVP. В общей сложности вводили 4 мкл в обе носовые полости мышей, в каждую ноздрю по 2 мкл раствора, содержащего 0,2 мкг антигенного белка НА и 2,0 мкг фосфолипидов AD-носителя. Далее эта мукозальная вакцина с добавлением CVP обозначается как HA+SF-10-C.
Эксперимент 5
[0069] Каждую из мукозальных вакцин с добавлением CVP из примера 1 (далее именуемую «HA+SF-10-А»), примера 5 (HA+SF-10-B) и примера 6 (HA+SF-10-С) инокулировали мышам (10 животным в каждой группе) аналогично эксперименту 1 (три раза с интервалом в 2 недели) и измеряли противогриппозные антитела IgA и IgG аналогично эксперименту 1.
[0070] Результаты представлены в таблице 4. Пример 6 (HA+SF-10-C) демонстрировал эффект индукции антитела примерно в 2-4 раза выше для уровня IgA и примерно в 2 раза выше для уровня IgG по сравнению с примером 1 (HA+SF-10-А) и примером 5 (HA+SF-10-B). Таким образом, предполагалось, что способ примера 6 (производственный процесс С) приводит к отличному эффекту индукции антитела из-за того, что отсутствовал этап ультразвуковой обработки и раствор CVP добавляли в заключительном этапе.
[0071] [Таблица 4]
Сравнение эффектов индукции антитела при различии процесса производства вакцины
Эксперимент 6
[0072] Форму каждого компонента мукозальной вакцины с добавлением CVP изобретения (антигенного белка НА, AD-носителя и CVP) анализировали с помощью электронного микроскопа. Как показано на фиг. 7, CVP играл роль в существенном повышении связывания антигена и AD-носителя.
[0073] CVP использовали в качестве загустителя (патентные документы 5 и 6), который является одним из загустителей-полимеров для улучшения нахождения активного ингридиента в полости носа, так же, как и гидроксипропилцеллюлоза (патентный документ 4), альгинат натрия (патентный документ 7) и другие эксципиенты. Тем не менее, как показали результаты эксперимента 6, в данном изобретении было обнаружено, что CVP в сочетании с AD-носителем повышает связывание антигена и AD-носителя, а также увеличивает количество антигена, включенного в антигенпредставляющие клетки, тем самым усиливая эффект AD-носителя.
Эксперимент 7
[0074] SF-10 (AD-носитель+CVP) (20 мкг) примера 1 и антигенный белок НА (2 мкг) примера 1, которые были помечены флуоресцентным красителем АТТО 488, смешивали и затем добавляли к мышиным дендритным клеткам костного мозга (2×105 клеток), и через 1 час инкубации измеряли с помощью проточной цитометрии интенсивность флуоресценции дендритных клеток, помеченных антигенным белком НА, меченым флуоресцентным красителем. Также смешивали поли(I:С) (10 мкг) сравнительного примера 5 и флуоресцентно-меченый антигенный белок НА (2 мкг) и аналогично измеряли интенсивность флуоресценции дендритных клеток. Флуоресценция, демонстрируемая дендритными клетками, отражала связывание и включение меченого флуоресцентной краской антигенного белка НА в клетки.
[0075] Результаты показаны на фиг. 8. В то время как поли(I:С) не способствовал связыванию и включению меченого флуоресцентной краской антигенного белка НА в дендритные клетки, SF-10 демонстрировал значительный стимулирующий эффект.
[0076] На основании этих результатов было подтверждено, что мукозальная вакцина изобретения SF-10 способствует связыванию и включению антигенного белка в антигенпредставляющие клетки, таким образом увеличивая продукцию антитела и давая отличную возможность предотвратить инфекцию.
Эксперимент 8
[0077] Следующие компоненты добавляли к культивируемым мышиным дендритным клеткам костного мозга (2×105 клеток) в 1 мл среды cRPMI, и через 1 час измеряли с помощью проточной цитометрии активацию дендритных клеток, используя в качестве индекса увеличение экспрессии CD86, который является одним из маркеров активации дендритных клеток. Для измерения использовали цитометр FACSCalibur (BD Biosciences, Массачусетс, США), а для обработки данных использовали программное обеспечение CellQuest (BD Biosciences, Массачусетс, США), чтобы определить экспрессию CD86.
- Физиологический раствор
- Физиологический раствор+антигенный белок НА
- SF-10
- SF-10+антигенный белок НА
- поли(I:С)
- поли(I:С)+антигенный белок НА
Антигенный белок НА (2 мкг) и SF-10 (20 мкг) были такими, как описано в примере 1, в то время как поли(I:С) (10 мкг) был идентичен таковому в сравнительном примере 5.
[0078] Результаты показаны на фиг. 9. В то время как поли(I:С) сам по себе увеличивал экспрессию CD86 (маркер активации дендритных клеток) аналогично эксперименту 2, экспрессия CD86 не увеличивалась далее при добавлении антигена. Напротив, SF-10 сам по себе не активировал дендритные клетки, но экспрессия CD86 в присутствии антигена увеличивалась примерно в 2 раза.
[0079] На основании этих результатов предполагается, что мукозальный адъювант с добавлением CVP изобретения, т.е. SF-10, эффективно доставлял антиген антигенпредставляющим дендритным клеткам, активируя их и, тем самым, вызывая продукцию антитела.
[0080] Аналогичные результаты были получены при использовании CD40, который также является одним из маркеров активации дендритных клеток.
Эксперимент 9
[0081] Для того, чтобы изучить активацию дендритных клеток при повышенной доставке антигена с помощью SF-10, которая была подтверждена in vitro в эксперименте 8, отдельным мышам {in vivo) вводили в носовую полость следующие компоненты, идентичные таковым в эксперименте 8.
- Физиологический раствор
- Физиологический раствор+антигенный белок НА
- SF-10
- SF-10+антигенный белок НА
Эксперимент на животных проводили по пути эксперимента 1. Антигенный белок НА (0,2 мкг) и SF-10 (2 мкг) были такими же, как в примере 1, в то время как поли(I:С) (2 мкг) был идентичен таковому в сравнительном примере 5.
[0082] Мышей декапитировали через 48 часов после назальной инокуляции, собирали ткани полости носа и обрабатывали коллагеназой (1 мг/мл, встряхивая при 37°C в течение 30 минут). После фильтрации через сетку с последующим центрифугированием (4°C, 10 минут, 200×g) из извлеченных клеток получали дендритные клетки с помощью VarioMACS (Miltenyl Biotech, Бергиш-Гладбах, Германия) с использованием анти-CD11c (N-418)-конъюгированных магнитных шариков (Miltenyl Biotech, Бергиш-Гладбах, Германия) и LS-колонки в соответствии с инструкцией изготовителя. Затем измеряли повышение экспрессии CD86 способом, аналогичным таковому в эксперименте 8.
[0083] Результаты показаны на фиг. 10. Активация дендритных клеток в связи с повышением доставки антигена с помощью SF-10 была подтверждена также в носовой полости мыши.
Эксперимент 10
[0084] Исследовали CVP на предмет его предпочтительной концентрации. За исключением применения рАА130, производимого Sigma Corporation, в качестве CVP с концентрацией 0,1%, 0,25%, 0,5%, 0,75%, или на 1,0%, мукозальную вакцину с добавлением CVP получали способом из примера 6, и способом из эксперимента 1 измеряли количество антиген-специфического IgA в смыве носовой полости и IgG в сыворотке крови мыши.
[0085] Результаты представлены в таблице 5, которая указывает, что уровни и IgA, и IgG были повышены в ответ на увеличение количества CVP до концентрации рАА130 CVP 0,5%. После достижения пика CVP на уровне 0,5% более высокая концентрация CVP, как правило, имела тенденцию уменьшать эффект индукции антитела.
[0086] [Таблица 5]
Эксперимент 11
Исследовали влияние комбинации AD-носителя и CVP на иммуногенный эффект антигена респираторно-синцитиального вируса (RSV). Способом из эксперимента 1 измеряли количество антиген-специфического IgA в смыве носовой полости и IgG в сыворотке крови мыши. Результаты представлены на Фиг. 11, где комбинация AD-носителя и CVP обозначена как "SF-10F" при получении вакцины с использованием лиофилизированного AD-носителя и антигена, смешиваемых с CVP, либо как "SF-10" при получении вакцины с использованием нелиофилизированной смеси. Первая диаграмма на Фиг. 11 отражает результаты эксперимента с IgG, а вторая - с IgA.
Результаты свидетельствуют, что как SF-10F, так и SF-10 в комбинации с антигеном RSV вызывают усиленную продукцию IgG и IgA по сравнению с одним RSV, с комбинацией RSV+CVP и с комбинацией RSV+AD-носитель.
Эксперимент 12
Исследовали эффективность комбинации SF-10 (AD-носитель и CVP) с овальбумином (OVA), типичным антигеном пищевой аллергии, в сравнении с одним OVA и комбинацией OVA+поли(I:С).
Эксперимент проводили на самках мышей BL/6 7-недельного возраста.
Экспериментальные группы: физиологический раствор, OVA, OVA+поли(I:С), OVA+SF-10.
Дозы интраназального введения: 10 мкг OVA/10 мкг поли(I:С) или 100 мкг SF-10/мышь.
График введения: три раза каждые две недели.
На 7-й день после последней вакцинации выделяли лимфоциты из слизистой оболочки носа.
FACS-анализ: лимфоциты окрашивали антителом к T-Select МНС тетрамеру (H-2Kb OVA Tetramer-SINFEKL, РЕ) (MBL) и меченым FITC антимышиным CD8a (BD) и затем проводили FACS-анализ.
Результаты представлены на Фиг. 12.
При интраназальном введении OVA+SF-10 наблюдается значительно более выраженный иммунный ответ по сравнению с введением одного OVA, который сопоставим с ответом, наблюдаемым с поли(I:С), известным мощным мукозальным адъювантом.
Claims (5)
1. Мукозальная вакцина, продуцирующая антиген-специфический IgA слизистой оболочки и IgG крови на уровнях, способных вызывать эффективную иммунную индукцию и эффект предотвращения инфекции, которая включает:
(а) AD-носитель, состоящий из синтетического пептида и смеси дипальмитоилфосфатидилхолина, фосфатидилглицерина и пальмитиновой кислоты, где синтетический пептид состоит из аминокислотной последовательности KnLm (где n составляет от 4 до 8, a m составляет от 11 до 20);
(б) карбоксивиниловый полимер; и
(в) антигенный белок в количестве, не способном продуцировать достаточно IgA слизистой оболочки и IgG крови для оказания эффективной иммунной индукции и эффекта предотвращения инфекции, если использовать его в одиночку.
(а) AD-носитель, состоящий из синтетического пептида и смеси дипальмитоилфосфатидилхолина, фосфатидилглицерина и пальмитиновой кислоты, где синтетический пептид состоит из аминокислотной последовательности KnLm (где n составляет от 4 до 8, a m составляет от 11 до 20);
(б) карбоксивиниловый полимер; и
(в) антигенный белок в количестве, не способном продуцировать достаточно IgA слизистой оболочки и IgG крови для оказания эффективной иммунной индукции и эффекта предотвращения инфекции, если использовать его в одиночку.
2. Мукозальная вакцина по п. 1, в которой белковый антиген (в) присутствует в количестве, которое даже в сочетании с AD-носителем (а) или в сочетании с карбоксивиниловым полимером (б) не способно продуцировать антиген-специфические IgA слизистой оболочки и IgG крови в количествах, способных оказывать эффективную иммунную индукцию и эффект предотвращения инфекции.
3. Мукозальная вакцина по п. 1, где указанный синтетический пептид состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID №1 или 2.
4. Мукозальная вакцина по п. 1, где указанный антигенный белок представляет собой полученный из патогена инактивированный антиген, очищенный антиген, частично очищенный антиген, рекомбинантный антиген, обезвреженный токсин или аллерген, вызывающий аллергию.
5. Способ получения мукозальной вакцины, производящей уровни антиген-специфических IgA слизистой оболочки и IgG крови, способные оказывать эффективную иммунную индукцию и эффект предотвращения инфекции, которая включает:
(а) AD-носитель, состоящий из синтетического пептида и смеси дипальмитоилфосфатидилхолина, фосфатидилглицерина и пальмитиновой кислоты, где синтетический пептид состоит из аминокислотной последовательности KnLm (где n составляет от 4 до 8, a m составляет от 11 до 20);
(б) карбоксивиниловый полимер; и
(в) антигенный белок в количестве, не способном продуцировать достаточно IgA слизистой оболочки и IgG крови для оказания эффективной иммунной индукции и эффекта предотвращения инфекции, если использовать его в одиночку, где указанный способ включает:
(1) суспендирование указанного (а) и (в) в воде;
(2) повторное нагревание и перемешивание один или более чем один раз;
(3) замораживание и лиофилизацию;
(4) суспендирование лиофилизированной формы в физиологическом растворе для доведения до заранее определенной концентрации; и
(5) добавление раствора указанного (б).
(а) AD-носитель, состоящий из синтетического пептида и смеси дипальмитоилфосфатидилхолина, фосфатидилглицерина и пальмитиновой кислоты, где синтетический пептид состоит из аминокислотной последовательности KnLm (где n составляет от 4 до 8, a m составляет от 11 до 20);
(б) карбоксивиниловый полимер; и
(в) антигенный белок в количестве, не способном продуцировать достаточно IgA слизистой оболочки и IgG крови для оказания эффективной иммунной индукции и эффекта предотвращения инфекции, если использовать его в одиночку, где указанный способ включает:
(1) суспендирование указанного (а) и (в) в воде;
(2) повторное нагревание и перемешивание один или более чем один раз;
(3) замораживание и лиофилизацию;
(4) суспендирование лиофилизированной формы в физиологическом растворе для доведения до заранее определенной концентрации; и
(5) добавление раствора указанного (б).
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2010045205 | 2010-03-02 | ||
| JP2010-045205 | 2010-03-02 | ||
| PCT/JP2011/054586 WO2011108521A1 (ja) | 2010-03-02 | 2011-03-01 | 粘膜ワクチン |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2012140064A RU2012140064A (ru) | 2014-04-10 |
| RU2570394C2 true RU2570394C2 (ru) | 2015-12-10 |
Family
ID=44542172
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2012140064/15A RU2570394C2 (ru) | 2010-03-02 | 2011-03-01 | Мукозальная вакцина |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US9540420B2 (ru) |
| EP (1) | EP2543387B1 (ru) |
| JP (1) | JP5804278B2 (ru) |
| KR (1) | KR101751376B1 (ru) |
| CN (1) | CN103002908B (ru) |
| BR (1) | BR112012022059B1 (ru) |
| CA (1) | CA2791661C (ru) |
| RU (1) | RU2570394C2 (ru) |
| WO (1) | WO2011108521A1 (ru) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP6085886B2 (ja) * | 2011-08-29 | 2017-03-01 | 国立大学法人徳島大学 | Ｒｓｖ粘膜ワクチン |
| JP6629877B2 (ja) * | 2015-10-30 | 2020-01-15 | 帝人ファーマ株式会社 | 鼻粘膜投与用医薬組成物 |
| CN110548136A (zh) * | 2018-05-30 | 2019-12-10 | 王美亮 | 汉坦病毒长肽疫苗 |
| KR20200015323A (ko) | 2018-08-03 | 2020-02-12 | 에릭스바이오(주) | 바이러스 치료 장치 또는 백신 제조 장치 |
| WO2020045155A1 (ja) | 2018-08-30 | 2020-03-05 | 国立大学法人徳島大学 | 免疫寛容誘導剤及びアレルギー性疾患の治療又は予防剤 |
| WO2021206103A1 (ja) * | 2020-04-06 | 2021-10-14 | 応用酵素医学研究所株式会社 | 皮下投与型ワクチン |
| CN114681586A (zh) * | 2020-12-25 | 2022-07-01 | 黑龙江省儒中医疗科技有限公司 | 一种流感外用疫苗及其制备方法 |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0678245B2 (ja) * | 1989-07-04 | 1994-10-05 | 東興薬品工業株式会社 | 鼻腔内噴霧投与用インフルエンザワクチンゲル製剤 |
| US5158761A (en) * | 1989-04-05 | 1992-10-27 | Toko Yakuhin Kogyo Kabushiki Kaisha | Spray gel base and spray gel preparation using thereof |
| US5215739A (en) * | 1989-04-05 | 1993-06-01 | Toko Yakuhin Kogyo Kabushiki Kaisha | Spray gel base and spray gel preparation using thereof |
| AT407958B (de) * | 1999-02-11 | 2001-07-25 | Immuno Ag | Inaktivierte influenza-virus-vakzine zur nasalen oder oralen applikation |
| WO2001017556A1 (fr) * | 1999-09-07 | 2001-03-15 | Shionogi & Co., Ltd. | Préparations vaccinales administrables par les muqueuses |
| ES2401425T3 (es) * | 2001-10-25 | 2013-04-19 | Medical Research Council | Moléculas |
| US8211442B2 (en) * | 2005-08-05 | 2012-07-03 | The University Of Tokushima | Mucosal vaccine enabling switching from production of IgA antibody to production of both of IgA and IgG antibodies |
| JP2009209086A (ja) * | 2008-03-04 | 2009-09-17 | Masami Moriyama | 粘膜投与型ワクチン |
| EP2281574B1 (en) * | 2008-04-02 | 2014-07-09 | The University of Tokushima | Antigen-and-drug vehicle comprising synthetic peptide, and mucosal vaccine using the same |
-
2011
- 2011-03-01 KR KR1020127022894A patent/KR101751376B1/ko active IP Right Grant
- 2011-03-01 WO PCT/JP2011/054586 patent/WO2011108521A1/ja active Application Filing
- 2011-03-01 CN CN201180011812.0A patent/CN103002908B/zh active Active
- 2011-03-01 CA CA2791661A patent/CA2791661C/en active Active
- 2011-03-01 RU RU2012140064/15A patent/RU2570394C2/ru active
- 2011-03-01 JP JP2012503178A patent/JP5804278B2/ja active Active
- 2011-03-01 EP EP11750631.1A patent/EP2543387B1/en active Active
- 2011-03-01 BR BR112012022059-4A patent/BR112012022059B1/pt active IP Right Grant
- 2011-03-01 US US13/582,160 patent/US9540420B2/en active Active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| OLIVE C., et al., Intranasal administration is an effective mucosal vaccine delivery route for self-adjuvanting lipid core peptides targeting the group A streptococcal M protein.J Infect Dis. 2006 Aug 1;194(3):316-24. Epub 2006 Jun 30. HAAQ KL., et al., The EG95 antigen of Echinococcus spp. contains positively selected amino acids, which may influence host specificity and vaccine efficacy. PLoS One. 2009;4(4):e5362. doi: 10.1371/journal.pone.0005362. Epub 2009 Apr 29. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20130045232A1 (en) | 2013-02-21 |
| EP2543387A4 (en) | 2013-06-19 |
| JPWO2011108521A1 (ja) | 2013-06-27 |
| CN103002908A (zh) | 2013-03-27 |
| EP2543387A1 (en) | 2013-01-09 |
| KR101751376B1 (ko) | 2017-07-11 |
| BR112012022059A2 (pt) | 2016-11-01 |
| CA2791661A1 (en) | 2011-09-09 |
| CA2791661C (en) | 2019-05-07 |
| JP5804278B2 (ja) | 2015-11-04 |
| CN103002908B (zh) | 2015-09-02 |
| US9540420B2 (en) | 2017-01-10 |
| BR112012022059A8 (pt) | 2018-01-02 |
| WO2011108521A1 (ja) | 2011-09-09 |
| EP2543387B1 (en) | 2016-10-26 |
| BR112012022059B1 (pt) | 2021-07-27 |
| RU2012140064A (ru) | 2014-04-10 |
| KR20130044204A (ko) | 2013-05-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2570394C2 (ru) | Мукозальная вакцина | |
| JP4137640B2 (ja) | 新規プロテオソーム−リポサッカリドワクチンアジュバント | |
| Dmour et al. | Recent advances on chitosan as an adjuvant for vaccine delivery | |
| CN111375055B (zh) | 一种2019-nCoV亚单位疫苗组合物及其免疫方法 | |
| JP6792452B2 (ja) | 免疫原性化合物 | |
| JP5190628B2 (ja) | 混合免疫賦活剤を含む新規ワクチン | |
| JP2011190278A (ja) | 粘膜体表面に接触させてワクチン抗原を包含する物質の効果を調節する新規非抗原性粘膜アジュバント処方 | |
| JP2010105968A (ja) | カチオン性ナノゲルを用いる粘膜ワクチン | |
| WO2016199904A1 (ja) | ワクチン用アジュバント、ワクチン、及び免疫誘導方法 | |
| CN109701010A (zh) | 疫苗复合佐剂系统及其在抗原中的应用 | |
| JP2008526985A (ja) | 粘膜ワクチンの送達のためのペプチド | |
| JP2023522592A (ja) | 抗原性部位とリポソーム調製物とを含む免疫原性組成物、当該組成物を作製する方法、薬物として使用するための、特にワクチンとして使用するための、当該組成物 | |
| CA2720277C (en) | Antigen-and-drug vehicle comprising synthetic peptide, and mucosal vaccine using the same | |
| Kimoto | Development of a safe and effective novel synthetic mucosal adjuvant SF-10 derived from physiological metabolic pathways and function of human pulmonary surfactant | |
| JP2003528818A (ja) | 皮膚経路を介したワクチン接種による粘膜免疫の誘導 | |
| WO2021206103A1 (ja) | 皮下投与型ワクチン | |
| JP2005082581A (ja) | 分泌型ＩｇＡ抗体誘導剤 | |
| Martinez-Gil et al. | The Role of Self-Assembling Lipid Molecules in Vaccination | |
| EP2752199A1 (en) | Rsv mucosal vaccine | |
| Hendy | Improved Delivery of a Broadly Active Influenza Subunit Vaccine |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HZ9A | Changing address for correspondence with an applicant |