JP2010105968A - カチオン性ナノゲルを用いる粘膜ワクチン - Google Patents
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Abstract
【解決手段】カチオン性の官能基を有する親水性の多糖に側鎖として疎水性のコレステロールを付加したナノゲルとワクチン抗原との複合体を含み、粘膜を介して投与される、微生物感染症の予防又は治療用粘膜ワクチン製剤。
【選択図】なし
Description
[1] カチオン性の官能基を有する親水性の多糖に側鎖として疎水性のコレステロールを付加したナノゲルとワクチン抗原との複合体を含み、粘膜を介して投与される、微生物感染症の予防又は治療用粘膜ワクチン製剤。
[2] カチオン性の官能基がアミノ基である、[1]の粘膜ワクチン製剤。
[3] ナノゲルがコレステロール置換プルランである、[1]又は[2]の粘膜ワクチン製剤。
[5] 微生物がウイルス、細菌、原虫及び真菌からなる群から選択される、[4]の粘膜ワクチン製剤。
[6] ワクチン抗原がボツリヌス毒素の重鎖C末端無毒領域、破傷風トキソイド及びエイズウイルスの膜抗原分子gag p24からなる群から選択される、[5]の粘膜ワクチン製剤。
[7] ワクチン抗原とナノゲルが1:1〜1:10のモル比で複合化される、[1]〜[6]のいずれかの粘膜ワクチン製剤。
[8] 経鼻投与製剤である、[1]〜[7]のいずれかの粘膜ワクチン製剤。
[9] 経口投与製剤である、[1]〜[7]のいずれかの粘膜ワクチン製剤。
[11] カチオン性の官能基がアミノ基である、[10]の粘膜ワクチン製剤の製造方法。
[12] ナノゲルがコレステロール置換プルランである、[10]又は[11]の粘膜ワクチン製剤の製造方法。
[13] ワクチン抗原が微生物由来抗原である、[10]〜[13]のいずれかの粘膜ワクチン製剤の製造方法。
[14] 微生物がウイルス、細菌、原虫及び真菌からなる群から選択される、[13]の粘膜ワクチン製剤の製造方法。
本発明において「ナノゲル」とは親水性の多糖に、側鎖として疎水性のコレステロールを付加した構造を有する疎水化高分子ゲルナノ粒子をいう。用いるナノゲルは、例えば国際公開第WO00/12564号パンフレット(高純度疎水性基含有多糖類及びその製造方法)に記載の方法で製造することができる。
カチオン性ナノゲル(カチオン性CHP)は100単糖あたりコレステロールが1.4及びエチレンジアミンが18置換されているものを使用した(CHPNH2ナノゲル)。CHP誘導体又はカチオン性プルランを1mg/mlのリン酸緩衝溶液(PBS)に溶かした。CHPNH2ナノゲルに15分間のソニケーションを行った後、フィルター(0.22 mm)に通した。
実施例1で作製したカチオン性ナノゲル粘膜ワクチン又は抗原単独を、6〜8週齢のBalb/cマウス(雌)に1匹あたりHc 10μg(ナノゲル88.9μg)、TT 30μg(ナノゲル80.0μg)、又はgag p24 10μg(ナノゲル 166.7μg)を、週1回(計3回)鼻腔内に投与することで、経鼻免疫を行った。投与抗原量(液量)はすべての実験区において15μlになるように調整し、片鼻当たり7.5μlを投与した。この際、コントロールとしてPBSを投与した。
実施例1で作製したボツリヌス毒素の重鎖C末端無毒領域(Hc、分子量45000)を抗原とするカチオン性ナノゲルワクチン又はHc単独を実施例2と同様の方法でそれぞれマウス5匹に経鼻免疫した。陰性コントロールとしてPBSを投与した。3回の免疫後、腹腔投与致死量の25000倍(500ng)のボツリヌス毒素(大阪府立大学生命環境科学研究科獣医学専攻、小崎俊司教授により入手した)を腹腔内投与することで、その生存効果を解析した。また、鼻腔組織中に誘導されたHc特異的IgAの中和効果を解析する目的で、10μgのボツリヌスプロジェニター毒素(和光純薬より入手した)を経鼻投与し、その後の生存効果も解析した。
実施例1で作製したボツリヌス毒素の重鎖C末端無毒領域(Hc、分子量45000)を抗原とするカチオン性ナノゲルワクチン又は、同一抗原を同量複合化させたカチオン性リポソーム(Pro-ject)を実施例2と同様の方法でそれぞれマウス5匹に経鼻免疫した。なお、Pro-jectはPIERCEより入手した。
図11に示すように、Hcをカチオン性ナノゲルとの複合体として投与した場合に、Hcをカチオン性リポソームとの複合体で投与した場合に比べ、ボツリヌス毒素に対するトータルIgG抗体価が著しく高かった。
図12に示すように、Hcをカチオン性ナノゲルとの複合体として投与した場合に、Hcをカチオン性リポソームとの複合体で投与した場合に比べ、ボツリヌス毒素に対するトータルIgA抗体価が著しく高かった。
ボツリヌス毒素の重鎖C末端無毒領域(Hc、分子量45000)にDTPA anhydrideを用いて111In(インジウム)を公知の方法で標識した。標識効率は、728.3233±115.3543 CPM/ngであった。その後、標識Hcをナノゲルに複合化させた。1,000,000 CPM量の標識Hcを複合化させたナノゲル粘膜ワクチン又は標識Hc単独をマウスに経鼻投与した。その後の体内動態(脳、嗅球、鼻腔、鼻腔関連リンパ組織(NALT)、頸部リンパ節及び脾臓)をガンマカウンターで追跡評価した。具体的には、経鼻投与の0.17、1、6、12、24及び48時間後に、マウスから脳、嗅球、鼻腔、鼻腔関連リンパ組織(NALT)、頸部リンパ節及び脾臓を採取し、試料重量を測定後、試料からのガンマ線をガンマカウンターで測定した。
Claims (14)
- カチオン性の官能基を有する親水性の多糖に側鎖として疎水性のコレステロールを付加したナノゲルとワクチン抗原との複合体を含み、粘膜を介して投与される、微生物感染症の予防又は治療用粘膜ワクチン製剤。
- カチオン性の官能基がアミノ基である、請求項1記載の粘膜ワクチン製剤。
- ナノゲルがコレステロール置換プルランである、請求項1又は2に記載の粘膜ワクチン製剤。
- ワクチン抗原が微生物由来抗原である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の粘膜ワクチン製剤。
- 微生物がウイルス、細菌、原虫及び真菌からなる群から選択される、請求項4記載の粘膜ワクチン製剤。
- ワクチン抗原がボツリヌス毒素の重鎖C末端無毒領域、破傷風トキソイド及びエイズウイルス膜抗原分子gag p24からなる群から選択される、請求項5記載の粘膜ワクチン製剤。
- ワクチン抗原とナノゲルが1:1〜1:10のモル比で複合化される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の粘膜ワクチン製剤。
- 経鼻投与製剤である、請求項1〜7のいずれか1項に記載の粘膜ワクチン製剤。
- 経口投与製剤である、請求項1〜7のいずれか1項に記載の粘膜ワクチン製剤。
- カチオン性の官能基を有する親水性の多糖に側鎖として疎水性のコレステロールを付加したナノゲルとワクチン抗原を4〜37℃で2〜48時間混合することを含む、ワクチン抗原と前記ナノゲルの複合体を含む粘膜ワクチン製剤の製造方法。
- カチオン性の官能基がアミノ基である、請求項10記載の粘膜ワクチン製剤の製造方法。
- ナノゲルがコレステロール置換プルランである、請求項10又は11に記載の粘膜ワクチン製剤の製造方法。
- ワクチン抗原が微生物由来抗原である、請求項10〜13のいずれか1項に記載の粘膜ワクチン製剤の製造方法。
- 微生物がウイルス、細菌、原虫及び真菌からなる群から選択される、請求項13記載の粘膜ワクチン製剤の製造方法。
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