BRPI0700860B1 - Forma farmacêutica na forma de uma microesfera de pss recoberta com dodab e biomolécula com carga oposta à camada de dodab, composição farmacêutica, medicamento, e uso da forma farmacêutica - Google Patents

Abstract

forma farmacêutica, processo de obtenção de forma farmacêutica, composição farmacêutica, medicamento e uso. a presente invenção refere-se a forma farmacêutica apresentando particula recoberta por camada de carga oposta á partícula, formando um sistema em que biomoléculas são imobilizadas. a invenção trata ainda de processo de preparação, composição farmacêutica, medicamento e uso de tal forma farmacêutica.

Description

[001] A presente invenção aplica-se na área farmacêutica, cosmética,veterinária, biotecnológica, química, antimicrobiana, farmacoterapêutica, imuno- diagnóstica ou preventiva.

ESTADO DA TÉCNICA

[002] O desenvolvimento de vacinas seguras e efetivas contra microrganismos infecciosos ou parasitoses é um desafio de interesse mundial. A Tabela 1 apresenta exemplos de doenças nas quais novas vacinas são ainda requeridas (adaptado de Gamvrellis, A., Leong, D., Hanley, J. C., Xiang, S. D., Mottram, P., Plebanski, M. (2004). Vaccines that facilitate antigen entry into dendritic cells. Immuno. Cell Biol. 82, 506-516; baseado em relatórios da Organização Mundial da Saúde (World Health Organization. 2001. Global tuberculosis control. W. H. O. Report 2001. W. H. O./CDS/TB/2001.287. World Health Organization, Geneva, Switzerland)).

[003] O uso de vacinas tradicionais preparadas a partir de microrganismos atenuados ou mortos tem resultado no controle e eliminação de muitas doenças devastadoras. Por outro lado, avanços em tecnologias de DNA recombinante e engenharia genética têm permitido desenvolver vacinas construídas a partir de proteínas antigênicas recombinantes ou purificadas, e vacinas de DNA, como alternativas mais seguras que as clássicas vacinas, porém a principal desvantagem destas vacinas purificadas ou de subunidade tem sido a falta de elicitação de uma resposta imune apropriada. Para resolver este problema, vacinas preparadas a partir de proteínas recombinantes ou purificadas utilizam imunoadjuvantes tanto para a apresentação e liberação do antígeno assim como para estimular o sistema imune. Adjuvantes auxiliam estes antígenos a elicitar uma resposta imune rápida, elevada e prolongada, com pequenas quantidades de proteína, diminuindo os custos de produção.

[004] A definição de adjuvante (do latim, adiuvare = auxiliar),previamente restrita para qualquer substância que aumentava a imunogenicidade de um antígeno, agora pode incluir mediadores solúveis e carriersantigênicos que interagem com moléculas de superfície presentes sobre células dendríticas (CD), antígenos particulados os quais são capturados por mecanismos disponíveis para células apresentadoras de antígeno (macrófagos, CD) e não para outro tipo de células (por exemplo, complexos imunoestimulatórios, látex, partículas de poliestireno), e vectores virais/bacterianos os quais infectam células apresentadoras de antígenos (por exemplo, vaccinia, lentivirus, adenovirus) (Gamvrellis et al., 2004).

Lípide catiônico como imunoadjuvante

[005] DODAB é um lípide sintético positivamente carregado (PM 631) com um brometo ou um cloreto como contra-ión, e duas cadeias alifáticas hidrocarbonadas C18 altamente hidrofóbicas, ligadas a um grupo amônio quaternário. Devido a estas cadeias lipofílicas, DODAB é pouco solúvel em água, porém, podem ser obtidas dispersões em água quente (> 50°C) com ocorrência de formação de bicamadas em temperaturas acima da transição de fase (~ 45 °C) (Nascimento, D. B., Rapuano, R., Lessa, M. M., Carmona-Ribeiro, A. M. (1998). Counterion Effects on Properties of Cationic Vesicles, Langmuir 14, 7387-7391). Vesículas fechadas ou fragmentos de bicamadas podem ser obtidos segundo o método de preparação (Carmona-Ribeiro, A. M., Chaimovich, H. (1983). Preparation and characterization of large dioctadecyldimethylammonium chloride liposomes and comparison with small sonicated vesicles. Biochim. Biophys. Acta 733, 172-179; Carmona-Ribeiro, A. M. (1992). Synthetic amphiphile vesicles. Chem. Soc. Rev. 21, 207-213; Carmona-Ribeiro, A. M. (2003). Bilayer-forming synthetic lipids: drugs or carriers?. Curr. Med. Chem. 10, 2425-2446; Vieira, D. B., Carmona-Ribeiro, A. M. (2001). Synthetic bilayer fragments for solubilization of amphotericin B. J Colloid Interface Sci. 244, 427-431; Pacheco, L. F., Carmona-Ribeiro, A, M. (2003). The effect of synthetic lipids on solubilization and colloid stability of hydrophobic drugs. J Colloid Interface Sci. 258, 146-154). Em dispersão aquosa, DODAB pode interagir com biomoléculas ou superfícies negativamente carregadas como células procariotas (Tápias, G. N., Sicchierolli, S. M., Mamizuka, E. M., Carmona-Ribeiro, A. M. (1994). Interactions between cationic vesicles and Escherichia coli. Langmuir 10, 3461-3465; Martins, L. M. S., Mamizuka, E. M., Carmona-Ribeiro, A. M. (1997). Cationic vesicles as bactericides. Langmuir 13, 5583-5587; Campanhã, M. T. N., Mamizuka, E. M., Carmona-Ribeiro, A. M. (1999). Interactions between cationic liposomes and bacteria: the physical-chemistry of the bactericidal action. J. Lipid Res. 40, 1495-1500). Interactions between cationic vesicles and Candida albicans. J. Phys. Chem. 105, 8230-8236.) ou eucariotas (Carmona-Ribeiro, A. M.; Ortis, F.; Schumacher, R. I.; Armelin, C. S. (1997). Interactions between cationic vesicles and cultured mammalian Cells. Langmuir 13, 2215-2218; Campanhã, M. T. N., Mamizuka, E. M., Carmona-Ribeiro, A. M. (2001)), proteínas antigênicas (Andersen, P., Askgaard, D., Ljungqvist, L., Bennedsen, J., And Heron, I. (1991). Proteins released from Mycobacterium tuberculosis during growth. Infect. Immun. 59, 1905-1910;Tsuruta, L. R., Quintilo, W., Costa, M. H. B., Carmona-Ribeiro, A. M. (1997). Interactions between cationic liposomes and an antigenic protein: the physical chemistry of the immunoadjuvant action. J. Lipid Res. 38, 2003-2011), proteínas séricas (Carvalho, L. A., Carmona-Ribeiro, A. M. (1998). Interactions between cationic vesicles and serum proteins. Langmuir 14, 6077-6081), ácidos nucléicos ou nucleotídeos (Kikuchi, I. S., Viviani, W., Carmona-Ribeiro, A. M. (1999). Nucleotide insertion in cationic bilayers. J. Phys. Chem. A 103, 8050-8055; Kikuchi, I. S., Carmona-Ribeiro, A. M. (2000). Interactions between cationic vesicles and DNA. J. Phys. Chem. B 104, 2829-2835; Nantes, I. L., Correia F. M., Faljoni-Alario, A., Kawanami, A. E., Ishiki, H. M., Amaral, A. T., Carmona-Ribeiro, A.M. (2003). Nucleotide conformational change induced by cationic bilayers. Arch Biochem Biophys. 416, 25-30; Cai, H., Tian, X., Hu, X. D., Li, S. X., Yu, D. H., Zhu, Y. H. (2005). Combined DNA vaccines formulated either in DODAB or in saline protect cattle from Mycobacterium bovis infection Vaccine 23, 3887-3895), partículas poliméricas(Carmona-Ribeiro, A. M.; Midmore, B. R. (1992). Synthetic bilayer adsorption onto polystyrene microspheres. Langmuir 8, 801-806; Vieira, D. B., Lincopan, N.,Mamizuka, E. M., Petri, D. F. S., Carmona-Ribeiro, A. M. (2003). Competitive adsorption of chitosan and cationic bilayers on polymeric microspheres: optimization of the biocidal action. Langmuir 19, 924-932), ou minerais (Rapuano, R., Carmona- Ribeiro, A. M. (1997). Physical adsorption of bilayer membranes on silica. J. Colloid Interface Sci. 193, 104-111; Rapuano, R., Carmona-Ribeiro, A. M. (2000). Supported bilayers on silica. J. Colloid Interface Sci. 226, 299-307; Moura, S. P., Carmona- Ribeiro, A. M. (2003). Cationic bilayer fragments on silica at low ionic strength: competitive adsorption and colloid stability. Langmuir 19, 6664-6667).

[006] DODAB tem sido descrito como um potencial agente imunoadjuvante por mais de 45 anos. Em 1966 Gall descreveu pela primeira vez esta propriedade imunológica (Gall, D. (1966). The adjuvant activity of aliphatic nitrogenous bases. Immunology 11, 369-386) e, a partir de então, tem sido testado em uma variedade de modelos animais em combinação com diferentes antígenos como: hemácias (Snippe, H., Belder, M., Willers, J. M. N. (1977). Dimethyl diotadecyl ammonium bromide as adjuvant for delayed hypersensitivity in mice. Immunology. 33, 931-936; Hilgers, L. A. T.;, Snippe, H., Jansze, M., Willer, J. M. N. (1986). Synergistic effects of synthetic adjuvants on the humoral immune response. Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 1986, 79, 392-396), células tumorais (Prager, M. D., Kanar, M. C., Farmer, J. L., Vanderzee, J. (1985). Effect of dimethyldioctadecylammonium bromide induced macrophages on malignant cell proliferation. Cancer Lett. 27, 225-232), proteínas (Gall, 1966), haptenos (Snippe, H., Johannesen, L., Inman, J. K., Merchant, B. (1978). Specificity of murine delayed-type hypersensitivity to conjugates of large or small haptens on protein carriers bearing lipid groups. Immunol. 34, 947-954), vírus (Kraaijeveld, C. A., Snippe, H., Harmsen, M., Khader Boutahar-Trouw, B. (1980). Dimethyl dioctadecyl ammoniumbromide as an adjuvant for delayed type hypersensitivity and cellular immunity against Semliki Forest virus in mice. Arch. Virol. 65, 211-217; Kraaijeveld, C. A., La Rivière, G., Benaissa-Trouw, B. J., Jansen J., Harmsen, T., Snippe, H. (1983). Effect of the adjuvant dimethyl dioctadecyl ammonium bromide on the humoral and cellular immune responses to encephalomyocarditis virus. Antiviral Res. 3, 137-149; Katz, D., Lehrer, S., Galan, O., Lachmi, B. E., Cohen, S. (1991). Adjuvant effects of dimethyl dioctadecyl ammonium bromide, complete Freund's adjuvant and aluminium hydroxide on neutralizing antibody, antibody-isotype and delayed-type hypersensitivity responses to Semliki Forest virus in mice. FEMS Microbiol. Immunol. 3, 305-320; Klinguer-Hamour, C., Christine, L., Plotnicky-Gilquin, H., Bussat, M-C., Revy, L., Nguyen, T., Bonnefoy, J. Y., Corvaia, N., Beck, A. (2002). DODAB adjuvant induces a mixed Th1/Th2 immune response when associated with BBG2Na, a respiratory syncytial virus potential vaccine. Vaccine 20, 2743-2751), protozoários (Kim, C. T., Chung, P. R., Im, K. I. (1991). Effect of in vivo administration of Tetrahymena pyriformis on the in vitro toxoplasmacidal activity of mouse peritoneal macrophages. Korean J. Parasitol. 29, 129-137), e antígenos bacterianos (Tsuruta el al., 1997; Lindbland, E. B., Elhay, M. J., Silva, R., Appelberg, R., Andersen, P. (1997). Adjuvant modulation of immune responses to tuberculosis subunit vaccines. Infect. Immunol. 65, 623-629; Brandt, L., Elhay, M., Rosenkrands, I., Lindblad, E. B., Andersen. P. (2000). ESAT-6 Subunit vaccination against Mycobacterium tuberculosis. Infect. Immunol. 68:791-795; Olsen, A. W., van Pinxteren, L. A. H., Okkels, L. M., Rasmussen, P. B., Andersen, P. (2001). Protection of mice with a tuberculosis subunit vaccine based on a fusion protein of antigen 85B and ESAT-6. Infect. Immunol. 69, 2773-2778; Dascher, C. C., Hiromatsu, K., Xiong, X., Morehouse, C., Watts, G., Liu, G., Mcmurray, D. N., Leclair, K. P., Porcelli, S. A., Brenner, M. B. (2003). Immunization with a mycobacterial lipid vaccine improves pulmonary pathology in the guinea pig model of tuberculosis. Int. Immunol. 15, 915-925; Holten-Andersen, L., Doherty, T. M., Korsholm, K. S., Andersen, P. (2004). Combination of the cationic surfactant dimethyl dioctadecyl ammonium bromide and synthetic mycobacterial cord factor as an efficient adjuvant for tuberculosis subunit vaccines. Infect. Immunol. 72, 1608-1617; Langermans, J. A. M., Doherty, T. M., Vervenne, R. A. W., van der Laan, T., Lyashchenko, K., Greenwald, R., Agger, E. M., Aagaard, C., Weiler, H., Van Soolingen, D., Dalemans, W., Thomas, A. W., Andersen, P. (2005). Protection of macaques against Mycobacterium tuberculosis infection by a subunit vaccine based on a fusion protein of antigen 85B and ESAT-6. Vaccine, 23, 2740-2750). Em contraste com outros immunoadjuvantes, em baixas concentrações, a toxicidade de DODAB, in vivo, parece ser baixa para humanos (Veronesi, R., Correa, A., Alterio, D. (1970). Single dose immunization against tetanus. Promising results in human trials. Rev. Inst. Trop. Med. São Paulo 12, 46-54; Stanfield, I. P., Gall, D., Bracken, P. M. (1973). Single-dose antenatal tetanus immunisation. Lancet 1, 215-219). Todavia, essa toxicidade passa a ser relevante em concentrações altas da ordem de milimolar (> 1mM).

[007] Independente da via de administração, DODAB tem mostrado efetividade após uma imunização por via subcutânea (Tsuruta et al., 1997; Lindbland et al., 1997; Holten-Andersen et al., 2004), intramuscular (Klinguer-Hamour et al., 2002; Dascher et al., 2003), e intranasal (Klinguer, C., Beck, A., De-Lys, M. C., Bussat, M. C., Blaecke, A., Derouet, F., Bonnefoy, J. Y., Nguyen, T. N., Corvaia, N., Velin, D. (2001). Lipophilic quaternary ammonium salt acts as a mucosal adjuvant when co-administered by the nasal route with vaccine antigens. Vaccine 19, 42364244).

[008] O mecanismo de ação responsável por esta intrínseca atividade imunoadjuvante não tem sido esclarecido. Algumas hipóteses sugerem o aumento da hidrofobicidade do antígeno; e a neutralização de cargas negativas no antígeno (Katz et al., 1991; Hilgers, L. A., Snippe, H. (1992). DDA as an immunological adjuvant. Res. Immunol. 143, 494-503; Muckerheide, A., Apple, R. J., Pesce, A. J., Michael, J. G. (1987). Cationization of protein antigens. I. Alteration of immunogenic properties. J. Immunol. 138, 833-837). Estudos têm demonstrado que DODAB, assim como outros lipídeos, é ativo na apresentação de antígenos em áreas timus- dependentes nos linfonodos, facilitando a indução da resposta imune celular (Coon, J., Hunter, R. (1973). Selective induction of delayed hypersensitivity by a lipid conjugated protein antigen which is localized in thymus dependent lymphoid tissue. J. Immunol. 110, 183-190).

Lípide catiônico e imobilização de DNA

[009] O desenvolvimento de sistemas artificiais capazes de carrear genes para células é um campo de considerável interesse em biologia molecular e engenharia genética. Atualmente, métodos utilizados para terapia gênica baseiam- se principalmente em vetores biológicos. O uso repetitivo desses carreadores biológicos irá eventualmente gerar diversos problemas que poderiam ser evitados com o uso de vetores inertes. Diversos tipos de moléculas ou partículas catiônicas capazes de ligar DNA e transportá-lo às células têm sido estudadas. Dentre elas estão os lipídeos sintéticos em forma de lipossomos ou as partículas poliméricas carregadas positivamente que servem como veículo para a entrega de genes (Carmona-Ribeiro, A. M. (2001) Interactions Between Bilayer Vesicles, Biomolecules, and Interfaces, In Handbook of Surfaces and Interfaces of Materials. Vol. 5, H. S. Nalwa (Ed.), American Scientific Publishers, ISBN: 0-12-513915-2, pp. 129-165). Na presente invenção ambos os tipos de carreadores foram obtidos através de preparação de lipossomos de brometo de dioctadecildimetilamônio (DODAB) ou de partículas poliméricas revestidas por bicamadas desse mesmo lípide catiônico (Carmona-Ribeiro & Midmore, 1992).

[0010] Lipossomos são estruturas esféricas compostas por bicamadas concêntricas simples ou múltiplas, resultantes da auto-associação de moléculas anfifílicas, em um meio aquoso. Os grupos da cabeça polar localizam-se na superfície das membranas, em contato com o meio externo, enquanto as cadeias de ácido graxo formam o centro hidrofóbico das membranas, que está protegido da água. Os lipossomos podem ser preparados com muitos tamanhos diferentes, variando de vesículas unilamelares pequenas a vesículas unilamelares grandes, podendo chegar a centenas de nanômetros de diâmetro (New, R.R.C. (1989) Characterization of Liposomes. pp.105-163 In Liposomes a practical approach. R.R.C. New (Ed.) , Oxford University Press, Oxford, UK).

Fragmentos de Bicamada obtidos por sonicação com tip

[0011] Em relação à preparação da dispersão lipídica, a sonicação por tip é o método utilizado para produzir pequenos fragmentos abertos de bicamadas de DODAB ou DHP em água, ao invés de vesículas esféricas fechadas. Estes fragmentos, assim como as vesículas que os originaram, estão estabilizados em solução aquosa de baixa concentração salina (até 1 mM de NaCl) pela repulsão eletrostática (Mortara, R.A., Quina, F.H., Chaimovich, H. (1978). Formation of closed vesicles from a simple phosphate diester - Preparation and some properties of vesicles of dihexadecylphosphate. Biochem. Biophys. Res. Commun. 81, 1080-1086; Kano, K., Romero, A., Djermouni, B., Ache, H., Fendler, J.H. (1979). Characterization of surfactant vesicle as a membrane mimetic agent. 2. temperature-dependant changes of turbidity, viscosity, fluorescence polarization of 2 methylantracene, and positron annihilation in sonicated dioctadecyldimethylammonium chloride. J. Am. Chem. Soc. 101, 4030-4037; Pansu, R.M., Arrio, B., Roncin, J., Faure, J. (1990). Vesicles versus membrane fragments in DODAC suspensions. J. Phys. Chem. 94, 796-801; Carmona-Ribeiro, A. M., Castuma, C.E., Sesso, A., Schreier, S. (1991) Bilayer structure and stability in dihexadecylphosphate dispersions. J. Phys. Chem. 95, 5361-5366; Carmona-Ribeiro, A. M. (2001). Bilayer vesicles and liposomes as interface agents. Chem. Soc. Rev. 30, 241-247). As principais evidências para a existência dos fragmentos foram:(i) a ausência de respostas osmótica da dispersão, indicando ausência de compartimento aquoso interno (Carmona-Ribeiro, A. M., Chaimovich, H., 1983; Carmona-Ribeiro, A.M., Yoshida, L.S., Sesso, A., Chaimovich, H. (1984). Permeabilities and stabilities of large dihexadecylphosphate and dioctadecyldimethylammonium chloride vesicles. J. Colloid Interface Sci. 100, 433-443);(ii) imagem da dispersão obtida através de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) (Carmona-Ribeiro, A.M., Castuma, C.E., Sesso, A., Schreier, S. (1991));(iii) microscopia eletrônica de crio-TEM (Hammarstrom, L., Velikian, I., Karlsson, G., Edwards, K. (1995). Cryo-TEM evidence - sonication of dihexadecyl phosphate does not produce closed bilayers with smooth curvature. Langmuir 11, 408-410; Andersson, M., Hammarstrom, L., Edwards, K. (1995). Effect of bilayer phase-transitions on vesicle structure and its influence on the kinetics of viologen reduction. J. Phys. Chem. 99, 14531-14538); a Figura 1 apresenta a crio-TEM (microscopia eletrônica de transmissão) de fragmentos de DODAB obtidos por sonicação, em que somente fragmentos de bicamada de DODAB são encontrados em solução (a barra no lado direito superior da imagem representa 100 nm de tamanho);(iv) espalhamento de luz quase-elástico e espectroscopia de ressonância paramagnética eletrônica (Pansu et al., 1990; Feitosa, E., Brown, W. (1997). Fragment and vesicle structures in sonicated dispersions of dioctadecyldimethylammonium bromide. Langmuir 13, 4810-4816);(v) solubilização de drogas hidrofóbicas como anfotericina B e miconazol (MCZ) em fragmentos de membrana de DODAB, o que não ocorreu para vesículas íntegras do mesmo anfifílico (Vieira e Carmona-Ribeiro, 2001; Pacheco e Carmona-Ribeiro, 2003) e(vi) coexistência de fases fluída e sólida na bicamada, para dispersões sonicadas de DODAB (Cocquyt, J., Olsson, U., Olofsson, G., Van der Meeren, P. (2004). Temperature quenched DODAB dispersions: fluid and solid state coexistence and complex formation with oppositely charged surfactant. Langmuir 20, 3906-3912).

Partículas para apresentação de antígenos.

[0012] Partículas de látex, ouro, sílica ou poliestireno têm sido usadas como eficientes carreadores de antígenos e em alguns casos têm mostrado alguns efeitos adjuvantes. Alguns exemplos incluem antígenos suportados sobre microesferas de látex inertes (0,5 - 2,0 μm) que podem induzir a apresentação de antígenos pelo sistema MHC classe I e subsequente ativação de células T citotóxicas CD8+, importante sistema de defesa contra antígenos virais intracelulares (Raychaudhuri, S., Rock, K. L. (1998). Fully mobilizing host defense: building better vaccines. Nat. Biotechnol. 16, 1025-1031). Antígenos acoplados a partículas de poliestireno avidamente fagocitadas (1000-2000 nm ou maiores) mostraram ser mais imunogênicos que os mesmos antígenos atuando isoladamente (Falo, L. D. Jr., Kovacsovics-Bankowski, M., Thompson, K., Rock, K. L. (1995). Targeting antigen into the phagocytic pathway in vivo induces protective tumour immunity. Nat. Med. 1, 649- 653). O tamanho ótimo parece ser restritamente definido dentro de um tamanho de espectro viral em comparação a partículas que variam para tamanhos maiores que 2000 nm (Gamvrellis et al., 2004). Partículas pequenas, in vivo,são preferencialmente captadas pelas células dendríticas (CD), em contraste às partículas maiores, as quais se localizam preferencialmente em macrófagos (Gamvrellis et al., 2004; Fifis, T., Gamvrellis, A., Crimeen-Irwin, B., Pietersz, G. A., Li, J., Mottram, P. L., McKenzie, I. F. C., Plebanski, M. (2004). Size-dependent immunogenicity: therapeutic and protective properties of nano-vaccines against tumors. J. Immunol. 173, 3148-3154). A Figura 2 representa a captura de partículas pelas células apresentadoras de antígenos. Células dendríticas (CD) e macrófagos (MC) são células fagocíticas que capturam partículas, porém, a afinidade da captura vai depender do tamanho da partícula. CD fagocitam partículas pequenas com dimensões de vírus, enquanto MC capturam partículas maiores, com dimensões de bactérias (adaptado desde Gamvrellis et al., 2004).

[0013] As principais vantagens de utilizar partículas conjugadas com antígenos são:i) rápida formulação da vacina;ii) ampla aplicação para diversos antígenos ou combinações de antígenos;iii) provável efeito sinérgico do carreador antigênico e a proteína a ser apresentada na ativação da CD.iv) minimização da quantidade de antígeno requerida com optimização da apresentação ao sistema imunológico.

Toxina da cólera, IgA, e resposta imune secretora

[0014] A cólera e as doenças toxigênicas relacionadas são um problema sério em países de Terceiro Mundo e em qualquer lugar onde as reservas de água podem ser contaminadas. Os sintomas da cólera são causados pela ação da toxina da cólera (CT), uma proteína que faz parte da família AB5 de toxinas bacterianas produzidas por um grande número de patógenos, que se aproveitam de carboidratos de superfície celular, como o GM1, para se ligarem e invadirem as células alvo (Karlsson, K. A. (1989). Animal glycosphingolipids as membrane attachment sites for bacteria. Annu. Rev. Biochem. 58, 309-350; Merritt, E.A., Hol, W.G. AB5 toxins (1995). AB5 toxins. Curr. Opin. Struct. Biol. 5, 165-171). Tais toxinas são caracterizadas por uma unidade dimérica A, composta de duas subunidades A1 e A2 ligadas entre si por pontes disulfeto, e uma unidade homopentamérica B5 envolvendo um poro central formado pelas longas a-hélices em cada um dos monômeros B (Cuatrecasas, P. (1973). Interaction of Vibrio cholerae enterotoxin with cell membranes. Biochemistry 12, 3547-3558; Holmgren, J., Lycke, N., Czerkinsky, C. (1993). Cholera toxin and cholera B subunit as oral-mucosal adjuvant and antigen vector systems. Vaccine 11, 1179-1184; Lencer, W. I., Hirst, T. R., Holmes, R. K. (1999). Membrane traffic and the cellular uptake of cholera toxin. Biochim. Biophys. Acta 1450, 177-190). Atualmente se sabe que cada subunidade B do oligômero da toxina da cólera (CTB5) participa de ligações específicas com cinco moléculas de GM1 presentes na face exterior de paredes celulares (Merritt, E. A., Sarfaty, S., Van Den Akker, F., L’hoir, C. L., Martial, J. A., Hol, W. G. (1994). Crystal structure of cholera toxin B-pentamer bound to receptor GM1 pentasaccharide. J. Protein Sci. 3, 166-175; Merritt, E. A., Kuhn, P., Sarfaty, S., Erbe, J. L., Holmes, R. K., Hol, W. G. (1998). The 1.25 Â resolution refinement of the cholera toxin B-pentamer: evidence of peptide backbone strain at the receptor-binding site. J. Mol. Biol. 282, 1043-1059), formando uma das interações proteína-carboidrato de maior afinidade de que se tem conhecimento (Turnbull, W. B., Precious, B. L., Homans, S. W. (2004). Dissecting the cholera toxin-ganglioside GM1 interaction by isothermal titration calorimetry. J. Am. Chem. Soc. 126, 1047-1054).

[0015] Acredita-se que imunoglubulina A secretora represente o principal mecanismo de defesa contra patógenos em nível de mucosas, porta de entrada de microrganismos patogênicos. A produção de IgA secretora depende da natureza do antígeno e do uso de adjuvantes especiais (Freytag, L. C., Clements, J. D. (1999). Bacterial toxins as mucosal adjuvants. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 236, 215-36; Williams, N. A., Hirst, T. R., Nashar, T. O. (1999). Immune modulation by the cholera-like enterotoxins: from adjuvant to therapeutic. Immunol. Today 20, 95-101), assim como da via de imunização.

[0016] Por ser praticamente o primeiro anticorpo a entrar em contato com antígenos invasores, para o desenho de imunoadjuvantes, a inclusão de um modulador estimulante da produção de IgA e IgG, produziria um elemento essencial no design de vacinas.

[0017] Atualmente, estudos de imunogenicidade utilizando toxina decólera, com ênfase na subunidade B, têm revelado um aumento de títulos de anticorpos sistêmicos e em nível de mucosas (Park, S-J., Chun, S-K., Kim, P. H. (2003). Intraperitoneal delivery of cholera toxin B subunit enhances systemic and mucosal antibody responses. Mol. Cells. 16, 106-112; Jani, D., Singh, N. K.,Bhattacharya, Meena, L. S., Singh, Y., Upadhyay, S. N., Sharma, A. K., Tyagi, A. K. (2004). Studies on the immunogenic potential of plant-expressed cholera toxin B subunit. Plant. Cell. Rep. 22: 471-477). O uso de mínimas quantidades da toxina associadas às proteínas não imunogênicas tem aumentado a resposta imune celular especificamente para estas últimas (Kay, R. A., Ferguson, A. (1989). Systemic delayed-type hypersensitivity to cholera toxin and a detoxied derivative. Clin. Exp. Immunol. 76, 111-116). Assim, tem-se em perspectiva, a incorporação de quantidades mínimas de CT associadas a um sistema adjuvante, para se elicitar uma ampla gama de resposta imune frente a determinado antígeno recombinante ou purificado associado ao sistema.

18/14- Tcra e cisticercose.

[0018] A cisticercose é uma infecção que pode acometer tanto suíno como o homem, e é causada pela forma larvária de Taenia soliumapós a ingestão de ovos viáveis. A neurocisticercose (NC) humana é a forma mais grave da doença, pela localização da larva no sistema nervoso central (SNC), sendo considerada um grave problema de Saúde Pública (Spina-França, A. (1984). Imunobiologia da cisticercose: avaliação dos conceitos atuais. Arch. Intern. Med. 27, 126-140). O homem é o hospedeiro definitivo do verme adulto, e elimina ovos embrionados pelas fezes, que são infectantes no meio ambiente. O suíno, após ingestão dos ovos, pode desenvolver cisticercose, a forma larvária do parasita. O homem ingerindo a carne suína com parasitas viáveis desenvolve o verme adulto (teníase). O homem também pode adquirir cisticercose após ingerir acidentalmente água e alimentos contaminados com ovos embrionados, ou ainda, por auto-infecção, quando portador do verme adulto. No Brasil, os estudos da cisticercose humana estão restritos a Centros de Especialização Neurológica, e apontam para a freqüência da NC, que varia de 1,6 - 7,5% dos pacientes internados com distúrbios neurológicos, tendo como causa a presença de cisticercos no SNC (Takayanagui, O. M., Jardim, E. (1983). Clinical aspects of neurocysticercosis: analysis of 500 cases. Arq. Neuropsiquiatr. 41, 50-63; Spina-França, A., Livramento, J. A., Machado, L. R. (1993). Cysticercosis of the central nervous system and cerebrospinal fluid. Immunodiagnosis of 1573 patients in 63 years (1929-1992). Arq. Neuropsiquiatr. 51, 16-20). A principal dificuldade associada à infecção tem sido estabelecer o diagnóstico apropriado pela falta de sistemas diagnósticos específicos. Por outro lado, o prognóstico da NC não é promissor na grande maioria dos casos. Até o presente não existe um tratamento para a doença, de modo que a única alternativa é auxiliar os pacientes, fazendo assistência com medicação paliativa para eliminar os sintomas. Frente a este quadro negativo, no futuro a única alternativa seria a vacinação, assim como estabelecer um sistema diagnóstico precoce apropriado que permita um controle precoce de formas avançadas da doença, assim como para estabelecer a real incidência da infecção.

[0019] Atualmente, têm sido caracterizados antígenos vesiculares diretamente de cisticercos de T. crassiceps e T. solium. Destes, a fusão de duas proteínas purificadas obtidas a partir de T. crassiceps (Ag 18 kDa e Ag 14 kDa) têm mostrado reatividade cruzada contra T. solium o que tem permitido produzir grandes quantidades de antígenos altamente específicos para diagnóstico de cisticercose, e potencialmente de utilidade para uma futura vacina (Espíndola, N. M., Vaz, A. J., Pardini, A. X., Fernandes, I. (2002). Excretory/secretory antigens (ES) from in-vitro cultures of Taenia crassiceps cysticerci, and use of an anti-ES monoclonal antibody for antigen detection in samples of cerebrospinal fluid from patients with neurocysticercosis. Ann. Trop. Med. Parasitol. 96, 361-368). Estudos para imunodiagnóstico de cisticercose por sorologia têm sido bem sucedidos (Espíndola, N. M., Iha, A. H., Fernandes, I., Takayanagui, O. M., Machado, L dos R., Livramento, J. A., Maia, A. A. M., Peralta, J. M., Vaz, A. J. (2005). Cysticercosis immunodiagnosis using 18- and 14-kilodalton proteins from Taenia crassiceps cysticercus antigens obtained by immunoaffinity chromatography. J. Clin. Microbiol. 43, 3178-3184), porém no futuro seria de interesse a produção de um sistema rápido, barato e de alta especificidade, como seria um sistema de aglutinação direta em látex.

[0020] Para o desenvolvimento de uma vacina contra a cisticercose, além da especificidade da proteína para ativar o sistema imune é necessária a elicitação de uma resposta celular e humoral. Embora o parasita tenha um ciclo extracelular, anticorpos dirigidos contra a grande estrutura do parasita não são suficientes para eliminar a infecção e assim células com atividade citotóxica direcionadas para eliminar o parasita seriam mais efetivas que a imunidade humoral. OBJETIVOSOs objetivos da presente invenção são:- produzir sistemas biomiméticos;- formular um particulado com distribuição de tamanho bastante estreita (alta homodispersidade);- modificar superfície de particulado proporcionando uma interface adequada para adsorção de biomoléculas;- expor haptenos nativos de antígenos; - minimizar modificações conformacionais de biomoléculas imobilizadas;- controlar diâmetro médio e polidispersidade de particulados com atividade biológica;- dirigir biomoléculas ativas até sítios alvo através de carga total positiva das formulações;- minimizar quantidades de lípide catiônico e minimizar toxicidade associada à dose alta (da ordem de milimolar) do mesmo;- minimizar quantidade de antígeno requerida para produção da resposta imunológica.

DESCRIÇÃO RESUMIDA

[0021] A presente invenção trata forma e composição farmacêutica, bem como medicamento apresentando sistema (a)/(b) compreendendo partícula (a) recoberta por camada (b) de carga oposta à partícula; e biomoléculas (c) imobilizadas sobre tal sistema. A invenção trata ainda de processo de obtenção de forma farmacêutica, assim como o seu uso.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0022] A presente invenção de forma farmacêutica apresentando sistema (a)/(b) compreendendo partícula (a) recoberta por camada (b) de carga oposta à partícula; e biomoléculas (c) imobilizadas sobre tal sistema, sendo que a concentração de (a), (b) e (c) varia na razão de 10:1:2 mg/mL; preferencialmente, 0,0750:0,0063:0,025 mg/mL.

[0023] De acordo com a invenção a partícula (a) pode ser escolhida entre: látex, sílica, ouro, poliestireno, polimetilmetacrilato, particulados de droga hidrofóbica, particulados de coacervados; preferencialmente, a partícula (a) pode ser polímero; mais preferencialmente poliestireno sulfato. Segundo a invenção, a partícula (a) trata-se de partícula polimérica aniônica. A concentração da partícula (a) pode variar de 1 a 10 x 109partículas/mL; preferencialmente, 5 x 109partículas/mL.

[0024] Já a camada (b) pode ser uma camada de lípide; preferencialmente lípide catiônico. Segundo a invenção, a camada (b) apresenta-se na forma de bicamada ou monocamada, preferencialmente bicamada de espessura entre 4 a 6 nm; preferencialmente, 5 nm. Em uma forma particular da invenção, a camada (b) é formada de haleto de dioctadecildimetilamônio (DODA); preferencialmente brometo de dioctadecildimetilamônio (DODAB). A concentração da camada (b) pode variar de 0,002 a 0,02 mM; preferencialmente 0,01 mM.

[0025] As biomoléculas (c) podem ser qualquer molécula que apresenta superfície com carga oposta à camada (b), preferencialmente carga negativa, e podem ser escolhidas entre proteínas antigênicas, proteínas séricas, imunoglobulinas, proteína A de Staphylococcus aureus, ácidos nucléicos ou nucleotídeos, partículas poliméricas, minerais, antibacterianos, antifúngicos, drogas hidrofóbicas, peptídeos, particulados de droga hidrofóbica. Preferencialmente, as biomoléculas podem ser: proteínas ou ácidos nucléicos e/ou nucleotídeos. Se proteínas, podem ser proteína purificada de Taenia crassiceps, toxinas, preferencialmente toxina da cólera, albumina sérica bovina (BSA). A concentração de proteína pode variar de 5 a 50 μg/mL; preferencialmente, 25 μg/mL. Se ácidos nucléicos e/ou nucleotídeos, podem ser DNA de bacteriófagos; preferencialmente de fago lambda. A concentração dos ácidos nucléicos pode variar de 1 a 20 μg/mL; preferencialmente 8 μg/mL.

[0026] De acordo com a invenção, o sistema (a)/(b) obtido apresenta diâmetro médio variando de 40 nm a 700 nm; preferencialmente, 310 nm. E o sistema (a)/(b)/(c) apresenta diâmetro médio variando de 60 nm a 740 nm; preferencialmente, 330 nm.

[0027] O processo de obtenção da forma farmacêutica aqui descrita também é objeto da presente invenção. Tal processo apresenta as seguintes etapas: i. recobrimento de partícula (a) com camada (b), de carga oposta à partícula; ii. imobilização de biomoléculas (c) sobre o sistema obtido em (i).

[0028] As etapas (i) e (ii) de tal processo ocorrem por mecanismo de atração eletrostática, sendo que a etapa (ii) ocorre pela adsorção das biomoléculas (c) sobre o sistema (a)/(b).

[0029] A presente invenção trata também de composição farmacêutica e medicamento apresentando sistema compreendendo partícula (a) recoberta por uma camada (b) de carga oposta à partícula; e biomoléculas (c) imobilizadas sobre tal sistema; em veículo farmaceuticamente aceitável e apropriado, além de aditivos conhecidos do homem da técnica.

[0030] A invenção trata ainda de uso do sistema (a)/(b)/(c) anteriormente descrito em aplicações farmacêuticas, cosméticas, veterinárias, biotecnológicas, químicas, antimicrobianas, farmacoterapêuticas, imuno- diagnósticas ou preventivas.

[0031] A seguir, exemplos para melhor ilustrar a invenção, contudo este não possui o intuito de restringir a invenção aqui descrita.

EXEMPLO 1. Materiais e Métodos: Lipídeos e microesferas de poliestireno

[0032] Brometo de dioctadecildimetilamônio (DODAB) 99,9% puro foi obtido da Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA).

[0033] Partículas aniônicas de Poliestireno Sulfato (PSS); lote 10-66 58; número de partículas por mL = 5,87 x 1012; diâmetro médio nominal de 301 ± 6; área superficial específica = 188,944 cm2g"1; densidade de carga = 1.68 μC cm-2; e potencial zeta = -62 ± 2 mV (Tabela 5) foram obtidas da Interfacial Dynamics Corporation (Portland, Or, USA). A partir da solução concentrada, uma solução estoque contendo 2 x 1010partículas/mL foi preparada em NaCl 1 mM.

[0034] NaCl assim como outros reagentes utilizados foram de grau analíticos. A água utilizada foi qualidade Milli-Q.

[0035] Outros reagentes usados foram ácido perclórico p.a; Solução de molibdato de amônio 1,25%; Solução de ácido ascórbico 5%; Solução padrão fosfato de sódio (NaH2PO4) 1%; Solução de nitrato de mercúrio 10 mM; Solução indicadora de difenilcarbazona em etanol.

Proteínas, DNA

[0036] Toxina da cólera foi obtida da Sigma-Aldrich e foi inicialmente preparada uma solução estoque numa concentração de 1 mg/mL em NaCl 1 mM.

[0037] Frações purificadas das proteínas 18- e 14-kDa de T.crassiceps (18/14-Tcra) foram preparadas em laboratório, a partir de protocolos previamente descritos (Espíndola et al., 2002; Espíndola, et al., 2005). Inicialmente as frações 18/14-Tcra foram diluídas 1:20 em NaCl 0.15 M obtendo uma concentração final de 1.4 mg/mL.

[0038] Albumina sérica bovina (BSA), foi obtida da Sigma-Aldrich e foi preparada como uma solução estoque de 1 mg/mL em NaCl 1 mM.

[0039] Todas as proteínas foram aliquotadas e armazenadas a -30 °C para pronto uso.

[0040] DNA de fago Lambda (extraído da Escherichia coli, formado por 48.502 pares de bases; peso molecular de 31,5x 106daltons) foi obtido da Sigma- Aldrich (St Louis, MO, USA).

Dosagem de proteínas

[0041] A concentração das proteínas foi determinada por um micro ensaio, segundo protocolo da Bio-Rad para dosagem de proteínas, baseado no método de Bradford (Bradford, M. M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254) (reagent cat# 500-0006, Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Para cada dosagem foi realizada em duplicata uma curva padrão de BSA (5 - 35 μg/mL), usando o seguinte protocolo:1. A partir de uma solução estoque de BSA 1 mg/mL foi preparada uma solução 10 vezes diluída (BSA 0,1 mg/mL) em NaCl 1 mM.2. Numa microplaca de ELISA de 96 poços foram adicionados, em cada poço, os volumes de BSA, água milli-Q e reagente de Bradford apresentados na Tabela 2, a seguir:

3. Após adicionar a água milli-Q, o conteúdo de cada poço foi cuidadosamente misturado com micropipeta automática, sem formar bolhas. Em seguida foi adicionado o reagente de Bradford e novamente o conteúdo de cada poço foi cuidadosamente misturado.4. A microplaca foi cuidadosamente agitada a 100 revoluções por 5 minutos 5. As leituras das absorbâncias foram medidas num leitor de ELISA equipado com um filtro de 595 nm (Ultramark, Model 550 Bio-Rad, Hercules, CA, USA).6. Logo após subtrair a medida do branco, as absorbâncias de cada ponto da curva foram plotadas utilizando o Origin software (Microcal Software Inc).7. Para determinar a concentração de cada proteína, a partir da solução estoque preparou-se uma solução de 50 μg/mL em NaCl 1 mM, e num outro poço da microplaca adicionou-se 20 μL desta solução, 140 μL de água milli-Q, e finalmente 40 μL de reagente de Bradford, da mesma forma como foi detalhada a preparação da curva de BSA. Todas as determinações foram feitas em duplicatas em dois independentes experimentos.8. Após leitura da absorbância e subtração do branco, a concentração corrigida de cada proteína foi calculada a partir da equação da curva: (Y—A)/B.

[0042] A Figura 3 apresenta curva padrão de BSA obtida. As Tabelas 3 e 4, a seguir, apresentam o coeficiente angular da reta (A), o intercepto da reta no eixo das absorbáncias (B), o coeficiente de regressão linear (R), o desvio padrão (SD), e o número de pontos da curva (N).

Preparação das dispersões lipídicas de DODAB e determinação analítica da concentração de DODAB Por Sonicação

[0043] Fragmentos de bicamada de DODAB (DODAB BF), de 81 ± 1 nm diâmetro e potencial zeta de 45 ± 2 mV foram preparados por sonicação com macrotip de titânio (Carmona-Ribeiro, A. M., 1992) em NaCl 1 mM na concentração final de 2,0 mM de DODAB, com posterior centrifugação (1 h x 14,000 rpm, 4 °C) para remoção de partículas de titânio adicionadas à solução devido ao sonicador, e remoção de eventuais vesículas multilamelares formadas (Fendler, J. H. (1980). Surfactant vesicles as membrane mimetic agents - characterization and utilization. Accounts Chem. Res. 13, 7-13; Mortara et al., 1978). As concentrações analíticas foram determinadas por microtitulação de DODAB (Schales, O.; Schales, S. S., 1941). A simple and accurate method for determination of chloride in biological fluids. J. Biol. Chem. 140, 879-884).

Construção do sistema suporte de biomoléculas constituído por PSS/DODAB

[0044] Partículas de PSS (2 x 1010/mL), e DODAB BF (2 mM) foram sempre preparadas em NaCl 1 mM (Pereira, E. M. A., Vieira, D. B., Carmona-Ribeiro, A. M. (2004). Cationic Bilayers on Polymeric Particles: Effect of Low NaCl Concentration on Surface Coverage. J. Phys. Chem. B 108, 11490-11495) e diluídas à concentração final desejada usando esta mesma solução de sal. A Figura 4 apresenta a construção do sistema PSS/DODAB desejado (onde A é PSS; B é DODAB BF e C é PSS/DODAB). A incorporação dos fragmentos de bicamada de DODAB foi acompanhada por mudanças no diâmetro médio, carga superficial e polidispersidade. Para obter dispersões de microesferas de PSS recobertas por DODAB, foram feitas misturas volume:volume para uma concentração final de 5 x 109 partículas/mL e DODAB BF com concentraçoes variando de 0,01 μM a 1 mM. Essas misturas interagiram por 1 h a 25°C. Cada mistura foi analisada quanto a distribuiçao de tamanhos e potencial-zeta em funçao da concentraçao de DODAB objetivando-se a determinaçao de condiçoes experimentais para obtençao do arranjo descrito na Figura 4. A partir deste ensaio, a concentração de DODAB necessária para ocorrer a formação de uma bicamada catiônica ao redor de cada partícula de PSS foi determinada como sendo de 0,01 mM para 5 x 109 partículas de PSS/mL, formando-se assim um sistema monodisperso (PSS/DODAB). Anteriormente, isotermas de adsorção do lípide sobre as partículas indicaram adsorção de bicamada (Carmona-Ribeiro & Midmore, 1992; Pereira, E. M. A., Vieira, D. B., Carmona-Ribeiro, A. M., 2004).

[0045] Considerando a área total do PSS no ensaio, a concentração de DODAB escolhida (0,01 mM) foi aquela suficiente para produzir microesferas cobertas por uma bicamada de lipídeo, assim, é de se esperar, encontrar mínimos traços de DODAB livre em solução.

Construção dos sistema PSS/DODAB/CT, PSS/DODAB/18/14- Tcra, PSS/DODAB/BSA e PSS/DODAB/DNA

[0046] No sistema monodisperso PSS/DODAB escolhido, construed como descrito anteriormente, foram adicionadas diretamente diferentes concentrações de CT, 18/14- Tcra, ou BSA variando desde 2,5 - 100 μg/mL, deixando interagir por 1 h/25°C prévio a determinação do diâmetro médio, potencial zeta, e polidispercidade do sitema.

[0047] Para PSS/DODAB/DNA, as concentrações finais de PSS e DODAB foram, respectivamente, 2,5 x 109part/mL e 0,02 mM. A concentração de DNA variou de 1 a 20 μg/mL. Após homogeneizar PSS e DODAB adicionou-se o DNA e a mistura foi incubada a temperatura ambiente por 30 minutos.

• Determinação do diâmetro médio (Dz), distribuição de tamanhos, polidispersidade, e potencial zeta (Z) nas partículas associadas e não-associadas.

[0048] A distribuição de tamanhos das partículas em cada dispersão, o diâmetro médio (Dz), a polidispersidade, e o potencial zeta (Z), na presença ou ausência de PSS, DODAB, ou proteínas, foram determinadas usando o ZetaPlusZeta Potential Analyzer (Brookhaven Instruments Corporation, Holtsville, NY), equipado com um laser de 677 nm e dynamic light-scattering(PCS) a 90° para a medição de tamanhos. Os diâmetros médios são obtidos pela montagem das datas para um valor expresso como log-normal das distribuições de tamanhos, os quais não discriminam entre uma, duas, ou mais populações diferentes, considerando sempre todas as partículas dispersas como uma única população Gaussiana. Por outro lado, para montar os dados de distribuição de tamanhos, o software do aparelho usa o algoritmo non-negatively constrained least squares (NNLS) algorithm, o qual é um modelo independente da técnica que permite realizar distribuições multimodais (Grabowski, E., Morrison, I. Particle size distribution from analysis of quasi-elastic light scattering data. In Measurements of Suspended Particles by Quasi-Elastic Light Scattering. Dahneke, B., Ed.; Wiley-Interscience: New York, 1983; pp 199-236).

• Isotermas de adsorção em 1 mM de NaCl das proteínas CT, 18/14-Tcra e BSA, sobre partículas de PSS/DODAB

[0049] Isotermas de adsorção, sobre partículas de PSS/DODAB,foram obtidas a partir de misturas de 0,05 mL da solução estoque de PSS (2 x 1010 partículas/mL) com 0,01 mL de DODAB BF (2,0 mM), e 0,14 mL de uma apropriada diluição das proteínas CT, 18/14-Tcra ou BSA, em NaCl 1 mM, em eppendorf de 1,5 mL. A concentração final de CT, 18/14-Tcra e BSA, no ensaio, variaram desde 0 - 54, 0 - 72, 0 - 80 μg/mL, respectivamente, numa concentração final fixa de 5x109 partículas de PSS/mL e 0,01 mM DODAB BF. Após 1 h de interação a 25° C, foi obtido um sobrenadante claro pela centrifugação dos microtubos durante 1h/15,000 rpm.

[0050] A quantificação de proteína livre no sobrenadante foi feita por um micro ensaio, segundo protocolo da Bio-Rad para dosagem de proteínas, baseado no método de Bradford (Bradford, M. M. (1976), conforme descrito anteriormente, usando uma curva padrão de BSA (5 - 35 μg/mL).

[0051] A quantidade de proteína adsorvida foi determinada pela diferença entre a concentração de proteína adicionada e a concentração da proteína recuperada no sobrenadante.

[0052] A capacidade adsortiva máxima para a adsorção de CT, 18/14- Tcra ou BSA, pelo PSS/DODAB, foi calculada a partir dos plateaux da isoterma de adsorção e expressa como mg de proteína adsorvida por mg de adjuvante.

2. Resultados e Discussão

[0053] A deposição de bicamadas de lipídeos sobre nanopartículas esféricas leva a formação de estruturas biomiméticas de interesse em nanotecnologia, como veículos de entrega de drogas, antígenos ou genes (Carmona- Ribeiro, 2001). Especificamente, a interação de lipídeos carregados com diversas partículas de carga oposta como sílica (Rapuano & Carmona-Ribeiro, 1997; 2000; Moura & Carmona-Ribeiro, 2003), poliestireno sulfato ou amidina (Carmona-Ribeiro, 1992; Carmona-Ribeiro & Midmore, 1992; Sicchierolli, S. M., Carmona-Ribeiro, A. M. (1995). Incorporation of the cholera toxin receptor in phospholipid -covered polystyrene microspheres Colloids Surf. B 5, 57-61; Araujo, F. P., Petri, D. F. S., Carmona-Ribeiro, A. M. (2005). Colloid stability of sodium dihexadecyl phosphate/poly(diallyldimethylammonium chloride) decorated latex. Langmuir 21, 9495-9501; Troutier, A.-L., Delair, T., Pichot, C., Ladavière, C. (2005). Physicochemical and interfacial investigation of lipid/polymer particle assemblies. Langmuir 21, 1305-1313; Troutier, A.-L., Véron, L., Delair, T., Pichot, C., Ladavière, C. (2005). New insights into self-organization of a model lipid mixture and quantification of its adsorption on spherical polymer particles. Langmuir 21, 99019910), quitosana (Vieira et al., 2003), e polimetilmetacrilato (PMMA) (Petri, D. F. S., Carneiro, B. J., Carmona-Ribeiro, A. M. (2001). Bilayers and Macromolecular Assemblies on Latex. Polym. Mater. Sci. Eng. 84, 884-885), tem sido investigada em termos de isotermas de adsorção, tamanhos, carga superficial, e estabilidade coloidal.

[0054] Na presente invenção otimizou-se a interação de lipídeos catiônicos com microesferas de poliestireno sulfato (PSS) de carga oposta, para posteriormente avaliar a capacidade de adsorção de proteínas, inclusive aquelas antigênicas ou não, que necessitam ser apresentadas como candidatas a vacinas de subunidade ou vacinas múltiplas contendo diversos antígenos.

[0055] A interação de fragmentos catiônicos de bicamada de DODAB com partículas de carga oposta é de interesse sob dois pontos de vista:1) ) as estruturas obtidas associam a vantagem das partículas e lipídeos catiônicos como agentes de interface que modificam propriedades superficiais, promovendo a otimização de resposta biológica através da associação de pequenos haptenos, ou peptídeos ou oligonucleotídeos ou DNA, em nível da interface catiônica.11) ) a produção de um sistema homodisperso pode ser visualizada como um sistema para ligar e imobilizar uma biomolécula na sua superfície, facilitando, por exemplo, a apresentação às células especializadas do sistema imune, elicitando seletivamente uma resposta humoral ou celular, ou ambas, o que seria o ideal para um sistema adjuvante ou mesmo, para a imobilização de um antígeno a ser apresentado para anticorpos circulantes, de interesse na construção de um sistema imuno-diagnóstico, para a detecção de anticorpos produzidos por hospedeiros atingidos por moléstias infecciosas, podendo-se ainda mencionar a apresentação de DNA para diversos usos (Hayashida, N., Sumi, Y., Wada, T., Handa, H., Shinozaki, K. (1995). Construction of a cDNA library for a specific region of a chromosome using a novel cDNA selection method utilizing latex particles. Gene 165, 155-61; Kneuer, C., Sameti, M., Bakowsky, U., Schiestel, T., Schirra, H., Schmidt, H., Lehr, C. M. (2000). A nonviral DNA delivery system based on surface modified silica-nanoparticles can efficiently transfect cells in vitro. Bioconjugate chemistry 11, 926-32; Elmas B; Camli S T; Tuncel M; Senel S; Tunce A. (2001). DNA -responsive uniform latex particles based on p-chloromethylstyrene. Journal of biomaterials Science 12, 283-96; Lee Gow-Yuan; Chen Chi-Hao; Wang Tzu-Hsien; Lee Wen- Chien. (2003). Affinity chromatography of DNA on nonporous copolymerized particles of styrene and glycidyl methacrylate with immobilized polynucleotide. Analytical biochemistry 312, 235-41; Ravi, K. M. N. V., Sameti, M., Mohapatra, S. S., Kong, X., Lockey, R. F., Bakowsky, U., Lindenblatt, G., Schmidt, H., Lehr, C. M. (2004). Cationic silica nanoparticles as gene carriers: synthesis, characterization and transfection efficiency in vitro and in vivo. Journal of Nanoscience and Nanotechnology 4, 876-81; Fuentes, M., Mateo, C., Rodriguez, Ana., Casqueiro, M., Tercero, J. C., Riese, H. H., Fernandez-Lafuente, R., Guisan, J. M. (2006), Detecting minimal traces of DNA using DNA covalently attached to superparamagnetic nanoparticles and direct PCR-ELISA. Biosensors & bioelectronics 21, 1574-80; Kawaguchi, H., Asai, A., Ohtsuka, Y., Watanabe, H., Wada, T., Handa, H. (1989). Purification of DNA -binding transcription factors by their selective adsorption on the affinity latex particles. Nucleic Acids Research 17, 6229-40).

Recobrimento de partículas de PSS com DODAB BF

[0056] As Figuras 5, 6, 7, 8 e 9 apresentam os sistemas estudados. Os sistemas são, respectivamente: brometo de dioctadecildimetilamônio (DODAB), fragmentos de bicamada de DODAB (DODAB BF) obtidos por sonicação com tip, partículas de poliestireno sulfato (PSS), partículas de PSS cobertas por uma bicamada de DODAB (PSS/DODAB), (Figura 8, Petri, D.F.S. and Carmona-Ribeiro, A.M., 2007. Biomimetic particles. In: Nalwa, H.S. (Ed.), Polymeric Nanostructures and Their Applications. American Scientific Publishers, Stevenson Ranch, pp. 485-530), PSS/DODAB/biomolécula. Na Tabela 5, a seguir, podem ser observadas algumas propriedades físicas das dispersões separadamente, ou em combinação.

[0057] Partículas de PSS carregadas negativamente foram cobertas por uma bicamada de DODAB:12) produzindo o aumento do diâmetro da partícula, em torno de 10 nm, equivalente a deposição de uma bicamada de 5 nm sobre cada partícula; e13) mudando a carga superficial de -60 para 48 mV, valor igual ao potencial- zeta de fragmentos de bicamada. Nesta condição, o sistema manteve- se homodisperso.

[0058] Como mostrado na Figura 10, para uma concentração fixa de 5 x 109partículas de PSS/mL, 0,01 mM de DODAB (log10 = -2) foi suficiente para formar uma simples bicamada ao redor.

[0059] No ensaio, foram usadas concentrações de DODAB variando desde 0,1 μM a 1,0 mM. Dependendo da concentração de DODAB utilizada, foram caracterizadas 3 regiões nas curvas que caracterizaram a dependência de diâmetro médio de partículas com a concentração de DODAB (Figura 10A). Na região I, concentrações < 0,3 μM (log10 = -3,5) foram insuficientes para cobrir e mudar a carga negativa da partícula. Já na região II, entre 0,3 - 3,0 μM de DODAB, a neutralização de cargas levou à agregação entre partículas com aumento de tamanho médio e floculação macroscopicamente visível. Uma concentração de DODAB > 3.2 μM levou a cargas superficiais positivas, estabilizando a dispersão, e restabelecendo a homodispersidade do sistema em valores positivos de potencial-zeta compatíveis com aqueles esperados para recobrimento de cada uma das partículas com uma bicamada de DODAB.

[0060] A Figura 11 apresenta a distribuição de tamanhos, diâmetro médio (Dz), e potencial zeta (Z) para dispersões de: (A), DODAB 2 mM; (B) PSS 5 x 109partículas/mL; (C) PSS 5 x 109partículas/mL/ 0,01 mM DODAB. Os valores representam o diâmetro médio ± erro padrão. Os valores foram obtidos após 1 h de interação a 25 °C. Os ensaios foram realizados em NaCl 1 mM.

Adsorção das proteínas CT, 18/14- Tcra ou BSA sobre partículas de PSS/DODAB.

[0061] A Tabela 6 apresenta um resumo das propriedades físicas das proteínas utilizadas no presente estudo, separadamente, ou em combinação com o sistema PSS/DODAB.

[0062] Por um mecanismo eletrostático, proteínas carregadas negativamente são adsorvidas sobre a superfície catiônica das partículas de PSS/DODAB, produzindo um aumento no tamanho das partículas assim como a redução da carga positiva, com o aumento da quantidade de proteína adsorvida.

[0063] Embora CT seja uma proteína imunogênica, a sua incorporação sobre partículas de PSS/DODAB é de interesse pelo fato de que pequenas quantidades de CT podem potencializar a resposta imune contra antígenos co-administrados, de baixa imunogenicidade, favorecendo a elicitação de uma resposta imune local e sistêmica (Kay & Ferguson, 1989; Williams et al., 1999; Park et al., 2003; Jani et al., 2004; Kaneko, T., Shimomai, S., Miyazaki, M., Baba, M., Akashi, M. (2004). IgG responses to intranasal immunization with cholera-toxin- immobilized polymeric nanospheres in mice. J Biomater. Sci. Polym. Ed. 15, 661669).

[0064] Algumas vacinas aplicadas intranasalmente em modelos animais têm incorporado com sucesso CT, porém, o uso humano tem sido questionado pela inerente toxicidade da molécula. Estudos têm demonstrado que o uso independente da subunidade B parece manter as propriedades imunoadjuvante oferecendo segurança quanto à toxicidade.

[0065] Para fins imunoterápicos, Kaneko e col., imobilizaram covalentemente CT sobre microesferas compostas de um core de poliestireno recoberto por um ácido polimetacrílico. Em condições favoráveis houve condensação do grupo amino da CT com o grupo carboxila da microesfera polimérica, produzindo- se a imobilização da proteína (Kaneko et al., 2004).

[0066] Kurohane e col., melhoraram a imunogenicidade da subunidade B da “Shiga-like toxin” (Stx1B), fator de virulência de E. coli enterohemorragica, pela adsorção do antígeno Stx1 B recombinante em microesferas de poliestireno de 6 μm. Posteriormente, usando 1 μg de CT como adjuvante houve um aumento nos níveis séricos de IgG assim como o nível de IgA secretora, após de uma imunização intranasal.

[0067] No presente estudo, CT foi incorporada sobre partículas de PSS/DODAB por um mecanismo eletrostático. A Figura 12 apresenta a distribuição de tamanhos, diâmetro médio (Dz), epotencial zeta (Z) para dispersões de: DODAB 0,01 mM + CT 25 μg/mL (A); PSS 5 x 109 partículas/mL/DODAB 0,01 mM (B); e incorporação de 5 - 50 μg/mL de CT sobre PSS/DODAB (C-E). Os valores representam o diâmetro médio ± erro padrão. Valores obtidos após 1 h de interação a 25 °C. Os ensaios foram realizados em NaCl 1 mM. É possível observar que a adição de concentrações ascendentes de proteína (5 - 50 μg/mL) aumentaram proporcionalmente o tamanho das partículas produzindo uma queda da carga positiva superficial. O sistema foi saturado após da adição de uma concentração > 25 μg/mL. Na Figura 12E, se observa a perda da homodispersidade do sistema após a adição de 50 μg/mL de CT.

[0068] CT é uma proteína hexamérica (87 kDa AB5) menos negativa. O diâmetro médio da proteína em solução (25 μg/mL, NaCl 1mM), apresentado na Tabela 6 superou as 4 micras. Assim, no sistema PSS/DODAB esta macroestrutura organizou-se uniformemente nas bicamadas catiônicas.

[0069] A Figura 13 apresenta a isoterma de adsorção de CT sobre PSS/DODAB. A partir dessa isoterma foi calculado o coeficiente de adsorção máxima igual a 0,24 mg de CT adsorvido por mg de PSS. A linearidade da isoterma se manteve até a adição de 18 μg/mL de CT. A massa do PSS correspondente a 5 x109 partículas/mL é 0,075 mg. A quantidade de proteína adsorvida foi determinada pela diferença entre o total de proteína adicionada e a quantidade de proteína recuperada no sobrenadante, após 1 h interação a 25 °C. Os ensaios foram realizados em NaCl 1 mM. PSS, e DODAB foram mantidos fixos numa concentração final de 5 x109 partículas/mL, e 0,01 mM, respectivamente.

[0070] A Figura 14 apresenta a distribuição de tamanhos, diâmetro médio (Dz), e potencial zeta (Z) para dispersões em NaCl 1 mM de: frações 18/14-Tcra 25 μg/mL (A); DODAB 0,01 mM + 18/14-Tcra 25 μg/mL (B); e CT, de 5, 25 e 50 μg/mL, sobre PSS/DODAB (C, D, E). Os valores representam o diâmetro médio ± erro padrão. Valores obtidos após 1 h de interação a 25 °C. PSS, e DODAB foram mantidos fixos numa concentração final de 5 x109partículas/mL, e 0,01 mM, respectivamente. A adsorção das frações 18/14-Tcra sobre PSS/DODAB teve o mesmo princípio de interação eletrostática entre a proteína de carga negativa e a superfície catiônica da partícula de PSS/DODAB, porém, ao contrário da CT, o Dz de 18/14-Tcra foi significantemente menor, apresentando uma carga superficial mais negativa que o resto das proteínas estudadas (Tabela 6, Figura 14A). A homodispersidade da dispersão se manteve até a adição de 25 μg/mL de proteína (Figura 14D).

[0071] A Figura 15 mostra a isoterma de adsorção das frações 18/14-Tcra sobre PSS/DODAB. A massa do PSS correspondente a 5 x109partículas/mL é 0,075 mg. A quantidade de proteína adsorvida foi determinada pela diferença entre o total de proteína adicionada e a quantidade de proteína recuperada no sobrenadante, após 1 h interação a 25 °C. Os ensaios foram realizados em NaCl 1 mM. PSS, e DODAB foram mantidos fixos numa concentração final de 5 x109partículas/mL, e 0,01 mM, respectivamente. O coeficiente de adsorção máxima, determinado a partir da isoterma de adsorção das frações 18/14-Tcra sobre PSS/DODAB foi 0,36 mg de antígeno adsorvido/mg de PSS. A linearidade da isoterma se manteve até a adição de aproximadamente 25 μg de proteína.

[0072] A neurocisticercose (NC) devida a Taenia solium é uma importante causa de morbidade e mortalidade humana prevalente em muitas partes do mundo. Um dos maiores problemas da NC é o diagnóstico clínico, considerado difícil pela grande variedade de sinais e sintomas comuns a outras patologias. Dentro dos sistemas diagnósticos disponíveis, os exames de imagem são inacessíveis pelo alto custo. Finalmente como controle preventivo não existe uma vacina efetiva para prevenir a infecção em porcos, o hospedeiro intermediário natural do parasita e transmissor da doença em humanos (Lightowlers, M. W. (2003). Vaccines for prevention of cysticercosis. Acta Trop. 87, 129-135).

[0073] Recentemente a purificação das frações protéicas 18/14-Tcra obtidas de Taenia crasicceps permitiu a construção de um sistema diagnóstico de ELISA para NC por T. solium (Espíndola, N. M., Vaz, A. J., Pardini, A. X., Fernandes, I. (2002). Excretory/secretory antigens (ES) from in-vitro cultures of Taenia crassiceps cysticerci, and use of an anti-ES monoclonal antibody for antigen detection in samples of cerebrospinal fluid from patients with neurocysticercosis. Ann. Trop. Med. Parasitol. 96, 361-368; Espíndola et al, 2005). No presente estudo, a efetividade da utilização de pequenas quantidades do antígeno 18/14-Tcra imobilizado nas microesferas de PSS/DODAB será de valor para o desenho de uma possível vacina para suínos.

[0074] Adicionalmente, a imobilização do antígeno no sistema PSS/DODAB poderia apresentar outras vantagens a serem exploradas, como a construção de um sistema diagnóstico ainda mais rápido e mais econômico que o método de ELISA, como seria um sistema de aglutinação em látex.

[0075] Para BSA foram encontrados resultados idênticos aos anteriores os quais são apresentados nas Figuras 16 e 17. O BSA é um modelo universal de proteína. A Figura 16 apresenta a distribuição de tamanhos, diâmetro médio (Dz), e potencial zeta (Z) para dispersões de: BSA 25 μg/mL em NaCl 1 mM (A); PSS 5x109 partículas/mL /DODAB 0,01 mM (B); e incorporação de 5, 25 e 50 μg/mL de BSA sobre PSS/DODAB (C, D, E). Os valores representam o diâmetro médio ± erro padrão. Valores foram obtidos após 1 h de interação a 25 °C. PSS, e DODAB foram mantidos fixos numa concentração final de 5 x109partículas/mL, e 0,01 mM, respectivamente. Já a Figura 17 mostra a isoterma de adsorção de BSA sobre PSS/DODAB. A massa do PSS correspondente a 5 x109partículas/mL é 0,075 mg. A quantidade de proteína adsorvida foi determinada pela diferença entre o total de proteína adicionada e a quantidade de proteína recuperada no sobrenadante, após 1 h interação a 25 °C. Os ensaios foram realizados em NaCl 1 mM. PSS, e DODAB foram mantidos fixos numa concentração final de 5 x109partículas/mL, e 0,01 mM, respectivamente.

[0076] Como citado anteriormente, a partir de cada isoterma foi determinada a capacidade de adsorção máxima (Tabela 7), definida como a quantidade máxima de proteína adsorvida na cobertura da bicamada de DODAB, sobre a microesfera de PSS.

[0077] Considerando que a massa de 5 x109partículas de PSS/mL corresponde a 0,075 mg, então o coeficiente da capacidade adsortiva máxima para PSS/DODAB teve um valor de 0,24 mg de CT adsorvido/mg de PSS. Já para 18/14- Tcra e BSA, a capacidade adsortiva máxima foi de 0,36 e 0.27 mg de proteína adsorvida/mg de PSS, respectivamente.

Efeito da concentração de DNA sobre tamanho e potencial zeta de partículas de PSS recobertas por fragmentos de bicamada de DODAB

[0078] A Figura 18 refere-se à distribuição de tamanho das partículas de PSS (A); a interação entre PSS/DODAB (B), a interação entre PSS/DODAB/(DNA 1 μg/mL) (C) e a interação entre PSS/DODAB/(DNA 5 μg/mL) (D) em concentrações finais de 2,5 x 109part/mL para o PSS; 0,02 mM para o DODAB. Através destes resultados é possível avaliar a homodispersidade do sistema ou melhor dizendo sua baixíssima polidispersidade.

[0079] A Figura 19 apresenta o feito da concentração de DNA no diâmetro médio (A) e no potencial zeta (B) para partículas de PSS recobertas por DODAB BF. Neste experimento as concentrações finais de PSS e DODAB são, respectivamente, 2,5 x 109part/mL e 0,02 mM. A concentração de DNA variou de 1 a 20 μg/mL. Após homogeneizar PSS e DODAB adicionou-se o DNA e a mistura foi incubada a temperatura ambiente por 30 minutos. É possível observar que em torno de 5 μg/mL de DNA ocorre um aumento significativo no diâmetro médio da dispersão (A); nessa concentração, o potencial zeta (B) tende a zero. Aumentando a concentração de DNA, a partir desse ponto de neutralização, nota-se uma diminuição no diâmetro médio de partícula nas dispersões e uma diminuição no potencial zeta que se torna mais negativo até a estabilização coloidal do sistema para valores negativos e constantes de potencial zeta. Dessa forma, o DNA foi imobilizado com sucesso sobre o particulado recoberto pelo lípide catiônico.

[0080] Cardenas et al. (Cardenas, M., Nylander, T., Jonsson, B., Lindman, B. (2005). The interaction between DNA and cationic lipid films at the airwater interface. J. Colloid Interface Sci. 286, 166-175), utilizaram um DNA de fita simples com 100 bases para interagir com CTAB (um tensoativo sintético de apenas uma cadeia hidrocarbônica) e demonstraram que a estabilidade do colóide resultante por interação com DNA depende, também, em grande parte da força de interação eletrostática entre os componentes.

[0081] A Figura 20 mostra a distribuição de tamanho das interações entre PSS/DODAB/DNA, avaliando a dispersão das amostras em relação ao aumento da concentração de DNA. Em (A) temos uma concentração de DNA igual a 9 μg/mL; em (B) 10 μg/mL; em (C) 15 μg/mL e em (D) 20 μg/mL.

[0082] Através desses resultados podemos demonstrar que o excess de DNA observado a partir da concentração de 9,0 μg/mL (A) pode ser a causa da formação de dois picos na distribuição de tamanhos, uma vez que DNA se complexa tanto com o DODAB livre na solução, quanto com as microesferas recobertas por DODAB. Ademais, a concentração de DODAB também está acima daquela necessária para recobrir todas as microesferas com uma bicamada catiônica. Assim, na concentração utilizada deve-se esperar também a ocorrência de mais um pico de distribuição de tamanhos correspondente à complexação de DODAB e DNA que não ocorreu sobre o particulado. Para eliminar esse pico basta adicionar DODAB ao PSS na proporção exata necessária para recobrir todas as microesferas com uma bicamada catiônica. O mesmo procedimento vale para as outras biomoléculas.

[0083] Os valores referentes ao diâmetro médio e potencial zeta de cada dispersão testada encontram-se na Tabela 8 anexa.

Claims (14)

1. Forma farmacêutica na forma de uma microesfera de poliestireno sulfato (PSS) caracterizada por compreender (a) a partícula polimérica aniônica de poliestireno sulfato com concentração entre 1 e 10 x 109 partículas/mL, (b) camada lípide catiônica sendo a bicamada de brometo de dioctadecildimetilamônio (DODAB) que recobre a microesfera de PSS, e, concentração entre 0,002 e 0,02 mM com espessura de 4 nm a 60 nm, onde (a) + (b) têm diâmetro médio variando de 40 nm a 700 nm e (c) biomoléculas de carga negativa, oposta ao DODAB imobilizadas sobre o sistema composto por (a) + (b), sendo a variação da concentração de (a), (b) e (c) na razão de 10:1:2 mg/mL e diâmetro médio variando de 60 nm a 740 nm.

2. Forma farmacêutica segundo a reivindicação 1 caracterizada pelo fato de a concentração da (a) partícula de poliestireno sulfato ser 5 x 109 partículas/mL.

3. Forma farmacêutica segundo a reivindicação 1 caracterizada pelo fato de a (b) bicamada de brometo de dioctadecildimetilamônio (DODAB) ser na concentração de 0,01 mM e a espessura ser de 5 nm.

4. Forma farmacêutica segundo a reivindicação 1 caracterizada pelo fato de o sistema composto por (a) + (b) ter diâmetro de 310 nm.

5. Forma farmacêutica segundo a reivindicação 1 caracterizada pelo fato de a concentração de (a), (b) e (c) ser na razão de 0,0750:0, 0063:0,025 mg/mL e diâmetro médio ser 330 nm.

6. Forma farmacêutica segundo reivindicação 1 caracterizada pelo fato de a biomolécula (c) poder ser escolhida entre: proteína purificada de Taenia crassiceps, toxina da cólera, albumina sérica bovina (BSA) ou DNA extraído de bacteriófago lambda.

7. Forma farmacêutica segundo reivindicação 6 caracterizada pelo fato de a concentração de proteína purificada de Taenia crassiceps, toxina da cólera ou albumina sérica bovina (BSA) variar de 5 a 50 μg/mL; preferencialmente, 25 μg/mL.

8. Forma farmacêutica segundo reivindicação 7 caracterizada pelo fato de a concentração de proteína purificada de Taenia crassiceps, toxina da cólera ou albumina sérica bovina (BSA) ser de 25 μg/mL.

9. Forma farmacêutica segundo reivindicação 6 caracterizada pelo fato de a concentração do DNA extraído de bacteriófago lambda variar de 1 a 20 μg/mL.

10. Forma farmacêutica segundo reivindicação 9 caracterizada pelo fato de a concentração do DNA extraído de bacteriófago lambda ser de 8 μg/mL.

11. Processo de preparação de forma farmacêutica definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 10 caracterizado pelo fato de ocorrer por mecanismo de atração eletrostática e apresentar as seguintes etapas: i. recobrimento de (a) partícula de poliestireno sulfato com (b)bicamada de brometo de dioctadecildimetilamônio (DODAB), de carga oposta à partícula; e ii. imobilização por adsorção das (c) biomoléculas sobre o sistema (a) + (b) obtido em (i).

12. Composição farmacêutica contendo a forma farmacêutica definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de apresentar sistema consistido por (a) partícula de poliestireno sulfato recoberta por uma (b) bicamada de brometo de dioctadecildimetilamônio (DODAB) de carga oposta à partícula; e (c) biomoléculas imobilizadas sobre tal sistema; em veículo farmaceuticamente aceitável e apropriado, além de aditivos conhecidos do homem da técnica.

13. Medicamento, contendo a forma farmacêutica definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de apresentar sistema consistido por (a) partícula de poliestireno sulfato recoberta por uma (b) bicamada de brometo de dioctadecildimetilamônio (DODAB) de carga oposta à partícula; e (c) biomoléculas imobilizadas sobre tal sistema; em veículo farmaceuticamente aceitável e apropriado, além de aditivos conhecidos do homem da técnica.

14. Uso da forma farmacêutica definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado por ser em aplicações farmacêuticas, cosméticas, veterinárias, biotecnológicas, químicas, antimicrobianas, farmacoterapêuticas, imunodiagnósticas ou preventivas.

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