CN107583059B

CN107583059B - 一种可包载量子点的阳离子脂质体流感疫苗及其制备方法

Info

Publication number: CN107583059B
Application number: CN201711044936.4A
Authority: CN
Inventors: 杨建宏; 于蕊; 渠文静; 李娜; 左文宝; 侯延辉; 刘艳华
Original assignee: Ningxia Medical University
Current assignee: Ningxia Medical University
Priority date: 2017-10-31
Filing date: 2017-10-31
Publication date: 2021-03-30
Anticipated expiration: 2037-10-31
Also published as: CN107583059A

Abstract

本发明涉及一种可包载量子点的阳离子脂质体流感疫苗及其制备方法，该阳离子脂质体流感疫苗以阳离子复合物为疫苗佐剂和载体，采用薄膜分散法、冻融法或冷冻干燥法将量子点和流感疫苗原液包载于其中制备，得到的阳离子脂质体流感疫苗的粒径在100nm～3μm之间，zeta电位为30～90mV，包封率为45%～95%，载药量为2%～10%。本发明制备的包载量子点的阳离子脂质体流感疫苗，可作为生物探针，用于细胞摄取成像，且稳定性较好，经小鼠鼻黏膜免疫后，该新型疫苗能显著提高小鼠体液免疫及黏膜免疫应答水平。

Description

一种可包载量子点的阳离子脂质体流感疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于纳米材料技术领域中的一种新型微粒给药系统，特别是涉及一种可包载量子点的阳离子脂质体流感疫苗及其制备方法。

背景技术

疫苗（vaccine）是用于预防传染病的抗原制剂，近年来，随着免疫学技术的不断深入和基因工程技术的迅速发展，DNA重组疫苗、合成肽疫苗等新型疫苗不断涌现，与传统疫苗相比，这些新型疫苗纯度高、特异性强，但分子小，免疫原性弱，难以诱导机体产生有效的免疫应答，因此需要佐剂来增强其免疫原性或增强宿主对抗原的保护性应答。

脂质体就是一种对疫苗有很强的增效作用的佐剂。脂质体（Liposomes）由磷脂双分子层构成，结构与细胞膜相似，兼具佐剂和载体功能。自1974年Allison和Gregoriadis首次发现脂质体具有免疫佐剂效应以来，其已成为一种新型的疫苗佐剂，在各个方面被广泛地研究和应用。已有研究证明脂质体无毒、无免疫原性，能保护被包封抗原免遭降解；可将抗原呈递给合适的免疫细胞，而且能诱导树突状细胞(Dendritic cells, DCs)成熟，增强机体的体液和细胞介导的免疫应答，对疫苗有很强的增效作用，因此成为一种理想的疫苗佐剂载体。

作为疫苗佐剂载体的脂质体主要是采用带有电荷的脂质体膜，利用其电荷吸

附特性使脂质体包封抗原的包封率增大，脂质体的稳定性更好。通常来说，脂质体的表观表面电荷主要是由脂质双分子层中的脂质成分决定的，并可通过带电荷的脂质进行修饰，比如，带正电的硬脂酰胺、二甲基双十八烷基铵、溴化三甲基-2, 3-二油酰氧基丙基铵等；带负电荷的磷脂酸、磷酯酰丝氨酸等。据报道，脂质体的表面电荷会影响脂质体在体外的细胞摄取，一般来说，抗原提呈细胞对正电荷脂质体的吞噬作用要强于负电荷和中性脂质体。同时，脂质体的表面电荷对抗体应答也有显著影响。有研究显示，皮下注射OVA脂质体疫苗后，正电荷脂质体与负电荷脂质体或中性脂质体相比，有更高的巨噬细胞摄取，诱导更高的抗体水平。此外，脂质体的表面电荷也会影响其与内源性组织成分的相互作用（比如蛋白质，酶类和细胞），尤其会影响脂质体在注射部位的滞留、引流动力学和在淋巴组织中的定位。研究表明，粒径较大的阳离子脂质体主要是通过增加抗原在给药部位的滞留，促进树突细胞（DCs）成熟，从而增强T细胞免疫应答。

此外，免疫途径也是影响疫苗免疫应答效应的另一重要因素。黏膜是大量致病菌进入人体的区域，其中以流感病毒为典型代表，它主要通过感染呼吸道上皮细胞，经呼吸道黏膜进入人体。获得黏膜免疫应答的最佳方式是在黏膜区域进行抗原免疫。在所有可能的黏膜疫苗接种区域中，鼻黏膜是最具有潜力的区域，它可以改善病人免疫接种，尤其是儿童免疫接种的依从性。单独的抗原以鼻腔免疫的方式通常不能激发保护性的免疫反应，当辅以佐剂或者载体时，通常可以提高现有疫苗的抗原性能。

量子点，又可称为纳米晶体，是一种由II－VI族或III－V族元素组成的纳米颗粒。量子点的粒径一般介于1～10nm之间，由于电子和空穴被量子限域，连续的能带结构变成具有分子特性的分立能级结构，受激后可以发射荧光。基于量子效应，量子点在太阳能电池，发光器件，光学生物标记等领域具有广泛的应用前景。1997年以来，随着量子点制备技术的不断提高，量子点己越来越可能应用于生物学研究。1998年，Alivisatos和Nie两个研究小组分别在Science上发表有关量子点作为生物探针的论文，首次将量子点作为生物荧光标记，并且应用于活细胞体系，他们解决了如何将量子点溶于水溶液，以及量子点如何通过表面的活性基团与生物大分子偶联的问题，由此掀起了量子点的研究热潮。

相对于传统的有机染料，量子点（QDs）具有更好的光稳定性，且呈现连续的吸收光谱，更适合于长时间的观测并具有更宽广的激发波长范围。此外，QDs还具有窄且对称的发射光谱，高的发光强度。上述优越的荧光性质使得荧光QDs成为一种潜在的取代传统有机染料的理想荧光基团，已在生物分子、细胞及活体荧光成像，肿瘤标志物检测等研究领域有了广泛的应用。特别是应用脂质体等纳米载体对QDs进行包裹制备QDs纳米粒更有利于提高荧光稳定性，延长荧光寿命、增加生物相容性及降低毒副作用。采用QDs标记的脂质体作为生物探针，可以考察未成熟骨髓树突细胞（BMDCs）对其的体外摄取能力。

综上所述，构建一种可包载量子点的阳离子脂质体流感疫苗，对于有效改善流感疫苗体液及黏膜免疫应答效果，提高病人免疫接种的顺应性，并将其作为生物探针，通过体外的细胞摄取及刺激成熟实验和小鼠的鼻黏膜给药，探讨其免疫学机制和免疫学效应，具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的就在于提供一种可包载量子点的阳离子脂质体流感疫苗，从而克服现用流感疫苗存在的免疫原性弱、接种途径单一、病人顺应性差等缺陷，使其通过鼻黏膜免疫后能有效诱导体液及黏膜免疫应答，增强免疫应答效果，并通过体外的细胞摄取及刺激成熟实验，初步探讨其免疫学机制。

本发明的另一目的是提供上述包载量子点的阳离子脂质体流感疫苗的制备方法。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种可包载量子点的阳离子脂质体流感疫苗，其特征在于该阳离子脂质体流感疫苗是由作为佐剂的阳离子脂质体和流感疫苗原液组成，其可包载量子点。

所述阳离子脂质体流感疫苗的粒径在100nm～3μm之间，zeta电位为30～90mV，包封率为45%～95%，载药量为2%～10%。

所述阳离子脂质体是由溴化三甲基-2, 3-二油酰氧基丙基铵、氯化三甲基-2, 3-二油烯氧基丙基铵、溴化三甲基十四烷基铵、溴化三甲基十六烷基铵、二甲基双十八烷基铵、O-[(N,N-二甲基氨基乙基)-氨基甲酰基]胆固醇盐酸盐和海藻糖6, 6’-二山嵛酸酯中的一种或几种组成。

所述阳离子脂质体为二甲基双十八烷基铵和海藻糖6, 6’-二山嵛酸酯的混合物，其摩尔比为1:1～10:1。

所述流感疫苗原液为H1N1流感疫苗原液、H3N2流感疫苗原液、H5N1流感疫苗原液、H5N2流感疫苗原液、H7N3流感疫苗原液、H7N7流感疫苗原液或H7N9流感疫苗原液，其与阳离子脂质体的质量比为5:100～12.5:100。

所述量子点为脂溶性的量子点或水溶性的量子点，具体为CdSe/ZnS、CdTe/ZnS、CdSe/ZnSe或CdTe/ZnSe中的一种。

上述可包载量子点的阳离子脂质体流感疫苗的制备方法，其特征是：以阳离子脂质体为疫苗佐剂和载体，采用薄膜分散法、冻融法或冷冻干燥法将流感疫苗原液和量子点包载于其中。

本发明以粒径、Zeta电位、包封率及载药量等特性为考察指标，对薄膜分散法制备的空白脂质体的主要影响因素：有机溶剂的种类及比例、水化介质的种类及pH、抗原与脂质的比例、水化温度、水化时间、水化方式、超声时间进行筛选，并对其进行优化，最终得到薄膜分散法制备阳离子脂质体流感疫苗的步骤包括：

1）将阳离子脂质溶于适量有机溶剂，减压旋转蒸发除去有机溶剂，然后加入适量浓度为1～20mmol/L的Tris-HCl缓冲液（pH为5～9），水浴超声并孵化30min～1h，即得空白脂质体。

2）将流感疫苗原液加入到上述空白脂质体中，使其充分融合，即得阳离子

脂质体流感疫苗。

本发明将薄膜分散法改为冻融法时，具体制备步骤如下：

2）将流感疫苗原液加入到上述空白脂质体中，使其充分融合。

3）将其放入冰箱冷冻，隔段时间后取出，反复冻融数次，即得阳离子脂质

体流感疫苗。

本发明采用冷冻干燥法时，具体制备步骤如下：

2）将流感疫苗原液和冻干保护剂加入到上述空白脂质体中，使其充分融合。

3）将其放入冰箱预冻12-24小时，取出后放在真空冷冻干燥机中冷冻干燥12-24小时，即得阳离子脂质体流感疫苗。

上述三种方法中，所述水化介质为Tris-HCl缓冲液或PBS缓冲液，其浓度为1～20mmol/L，pH为5～9。

所述有机溶剂为乙醇、丙酮、四氢呋喃、二氯甲烷、氯仿或甲醇中的一种或

几种。

所述冻干保护剂为乳糖、蔗糖、葡萄糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇中的一种

或几种，其质量浓度为0.5～2%，与阳离子脂质体的质量比为0.5～1:1。

上述三种方法中，对于量子点包载，是将量子点溶液加入到成膜的阳离子脂

质中、空白脂质体中或脂质体疫苗中实现。

本发明具有以下技术优势：

1）本发明以阳离子脂质体作为疫苗佐剂和载体，尤其是以DDA和TDB阳离子复合物为优选研究对象，将流感疫苗原液包载于其中，制得阳离子脂质体流感疫苗。体外的树突状细胞刺激成熟实验结果显示：DDA-TDB脂质体流感疫苗能显著上调树突状细胞表面共刺激分子CD80、CD86及MHC-II的表达水平，表明DDA-TDB脂质体流感疫苗能够有效促进小鼠骨髓未成熟树突状细胞的分化成熟，从而表明DDA-TDB是一种优良的疫苗佐剂和载体。且其对流感疫苗有较高的包封率和载药量，包封率为45%～95%，载药量为2%～10%。

2）该阳离子脂质体可同时包载量子点，其中量子点（QDs）相对于传统的有机染料，具有更好的光稳定性，且呈现连续的吸收光谱，更适合于长时间的观测。此外，QDs还具有窄且对称的发射光谱，高的发光强度。上述优越的荧光性质使得荧光QDs成为一种潜在的取代传统有机染料的理想荧光基团，已在生物分子、细胞及活体荧光成像、肿瘤标志物检测等研究领域有了广泛的应用。特别是应用脂质体等纳米载体对QDs进行包裹制备QDs纳米粒更有利于提高荧光稳定性，延长荧光寿命、增加生物相容性及降低毒副作用。采用QDs标记的脂质体作为生物探针，可以考察未成熟骨髓树突细胞（BMDCs）对其的体外摄取能力。因此本发明将量子点包载于阳离子脂质体中，将其作为一种优良的生物探针，用于细胞摄取成像。在体外细胞摄取实验中，将培养的小鼠骨髓树突状细胞与已制备的包载量子点的DDA-TDB脂质体共培养后，采用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测未成熟BMDCs对量子点（QDs）标记的阳离子脂质体的体外摄取情况，考察其递送抗原的能力。结果表明小鼠骨髓未成熟树突状细胞对该阳离子脂质体有相对较高的摄取率，从而表明该阳离子脂质体能够有效促进BMDCs对其的摄取。

3）除此之外，本发明采用鼻黏膜途径给药，克服了现用流感疫苗不能有效诱导黏膜免疫应答、接种途径单一，病人顺应性差等问题。动物实验结果显示，该阳离子脂质体流感疫苗经小鼠鼻黏膜免疫后，小鼠黏液sIgA、血清IgG及各IgG亚型的抗体水平均较高，表明该阳离子脂质体流感疫苗可显著提高小鼠体液免疫及黏膜免疫应答水平；同时，表明鼻黏膜免疫是一种新型的、优良的疫苗免疫给药途径。

综上所述，本发明制备的可包载量子点的阳离子脂质体流感疫苗，可作为生物探针，用于细胞摄取成像，且稳定性较好，经小鼠鼻黏膜免疫后，该新型疫苗能显著提高小鼠体液免疫及黏膜免疫应答水平。

附图说明

图1为本发明包载量子点的DDA-TDB阳离子脂质体流感疫苗的模式图。

图2为本发明DDA-TDB阳离子脂质体流感疫苗的透射电镜图。

图3为本发明树突状细胞对包载量子点的阳离子脂质体摄取的激光共聚焦图（其与中性脂质体DSPC-Chol进行了对比，其中a为空白对照，b为DSPC-Chol脂质体，c为DOTAP-DC-Chol脂质体，d为DDA-TDB脂质体）。

图4为本发明树突状细胞对包载量子点的阳离子脂质体摄取的流式细胞仪测定结果图（与中性脂质体DSPC-Chol流感疫苗组进行了对比）。

图5为本发明阳离子脂质体流感疫苗对树突状细胞刺激成熟的流式细胞仪测定结果图（与中性脂质体DSPC-Chol流感疫苗组进行了对比）。

图6为本发明将DOTAP-DC-Chol流感疫苗和DDA-TDB流感疫苗经小鼠鼻黏膜免疫后小鼠鼻咽组织与气管中IgA抗体和血清中IgG抗体表达情况图（与中性脂质体DSPC-Chol流感疫苗组进行了对比）。

图7为本发明将DOTAP-DC-Chol流感疫苗和DDA-TDB流感疫苗经小鼠鼻黏膜免疫后小鼠血清中IgG1、IgG2a、IgG2b抗体表达情况图（与中性脂质体DSPC-Chol流感疫苗组进行了对比）。

具体实施方法

以下通过实例对本发明做进一步的阐述。

实施例1：薄膜分散法制备DDA-TDB脂质体流感疫苗

将DDA和TDB按摩尔比为7～10:1置于50 ml圆底烧瓶中，加入1～2 ml氯仿和甲醇溶解，并加入量子点，水浴加热下减压旋转蒸发除去有机溶剂，形成均匀的脂质薄膜，再通入3minN₂，除尽残留溶剂。然后加入2 ml浓度为10 mM的Tris-HCl缓冲液（pH为6.8～9），60℃下水浴超声并孵化45min，得到粒径约为600～700 nm空白脂质体。然后按流感疫苗：DDA-TDB质量比为10～12.5:100，将流感疫苗原液加入到上述空白脂质体中，使其充分融合，置于4℃储存备用。上述所得阳离子脂质体流感疫苗粒径为1700-1900nm，与空白脂质体相比粒径变化明显，zeta为50～57mV，包封率为77.5%，载药量为8.7%。

实施例2：薄膜分散法制备DOTAP-DC-Chol脂质体流感疫苗

将DOTAP和DC-Chol按摩尔比为1:1置于50 ml圆底烧瓶中，加入1～2 ml

氯仿和甲醇溶解，并加入量子点，水浴加热下减压旋转蒸发除去有机溶剂，形成均匀的脂质薄膜，再通入3minN₂，除尽残留溶剂。然后加入2 ml浓度为10 mM的Tris-HCl缓冲液（pH为6.8～7.4），60℃下水浴超声并孵化30min，得到粒径约为250-270nm空白脂质体。然后按流感疫苗：DOTAP-DC-Chol质量比为5～12.5:100，将流感疫苗原液加入到上述空白脂质体中，使其充分融合，置于4℃储存备用。上述所得阳离子脂质体流感疫苗粒径为330-350nm，zeta为49～54mV，包封率为46.2%，载药量为5.3%。

实施例3：薄膜分散法制备DOTAP-DC-Chol脂质体流感疫苗

将DOTAP和DC-Chol按摩尔比为1:1置于50 ml圆底烧瓶中，加入1～2 ml

氯仿和甲醇溶解，35-40℃水浴加热下减压旋转蒸发除去有机溶剂，形成均匀的脂质薄膜，再通入3minN₂，除尽残留溶剂。然后加入2 ml浓度为10 mM的Tris-HCl缓冲液（pH为6.8～7.4），55-65℃下水浴超声并孵化30min，得到粒径约为230-290nm空白脂质体。然后按流感疫苗：DOTAP-DC-Chol质量比为5～12.5:100，将流感疫苗原液加入到上述空白脂质体中，并加入量子点，使其充分融合，置于4℃储存备用。上述所得阳离子脂质体流感疫苗粒径为310-370nm，zeta为45～57mV，包封率为47.3%，载药量为5.4%。

实施例4：冻融法制备DDA-TDB脂质体流感疫苗

将DDA和TDB按摩尔比为1～10:1置于50 ml圆底烧瓶中，加入1～3 ml氯仿和甲醇溶解，水浴加热下减压旋转蒸发除去有机溶剂，形成均匀的脂质薄膜，再通入2～5 minN₂，除尽残留溶剂。然后加入2 ml浓度为10 mM的Tris-HCl缓冲液（pH为5～9），50～70℃下水浴超声并孵化30min～1h，得到粒径约为500～700 nm空白脂质体。然后按流感疫苗：DDA-TDB质量比为5～12.5:100，将流感疫苗原液加入到上述空白脂质体中，使其充分融合，最后将其放入-70℃冰箱冷冻，6～8h后取出，使其融化，反复冻融4次，并加入量子点，置于4℃储存备用。上述所得阳离子脂质体流感疫苗粒径为2083.7nm，与空白脂质体相比粒径变化明显，zeta为50～60mV，包封率为90%，载药量为8.9%。

实施例5：冷冻干燥法制备DDA-TDB脂质体流感疫苗

将DDA和TDB按摩尔比为1～10:1置于50 ml圆底烧瓶中，加入1～3 ml氯仿和甲醇溶解，水浴加热下减压旋转蒸发除去有机溶剂，形成均匀的脂质薄膜，再通入2～5 minN₂，除尽残留溶剂。然后加入2 ml浓度为10 mM的Tris-HCl缓冲液（pH为5～9），50～70℃下水浴超声并孵化30min～1h，得到粒径约为500～700 nm空白脂质体。然后按流感疫苗：DDA-TDB质量比为5～12.5:100将流感疫苗原液加入到上述空白脂质体中，并加入浓度为1%（m/V）的蔗糖作为冻干保护剂，使其充分融合，再将其放入冰箱预冻12小时，取出后放在真空冷冻干燥机中冷冻干燥12小时，得冻干制剂，置于4℃储存备用。使用前复溶并加入量子点。上述所得阳离子脂质体流感疫苗粒径约为2μm，与空白脂质体相比粒径变化明显，zeta为50～60mV，包封率为92%，载药量为9%。

Claims

1.一种可包载量子点的阳离子脂质体流感疫苗，其特征在于该可包载量子点的阳离子脂质体流感疫苗是以阳离子脂质体作为疫苗佐剂和载体，采用冻融法将流感疫苗原液和量子点包载其中制备而成，

所述冻融法包括以下步骤：1）将阳离子脂质体先溶于适量有机溶剂，减压旋转蒸发除去有机溶剂形成阳离子脂质体薄膜，然后加入适量浓度为1～20mmol/L、pH为5～9的Tris-HCl缓冲液，水浴超声并孵化30min～1h，即得空白脂质体；2）将流感疫苗原液加入到上述空白脂质体中，使其充分融合，再将其放入冰箱冷冻，隔段时间后取出，反复冻融数次，即得阳离子脂质体流感疫苗，其中量子点加入到上述成膜的阳离子脂质体、空白脂质体或阳离子脂质体流感疫苗中实现包载最终形成包载量子点的阳离子脂质体流感疫苗；所述流感疫苗原液与阳离子脂质体的质量比为5:100～12.5:100；

2.一种可包载量子点的阳离子脂质体流感疫苗，其特征在于该可包载量子点的阳离子脂质体流感疫苗是以阳离子脂质体作为疫苗佐剂和载体，采用冷冻干燥法将流感疫苗原液和量子点包载其中制备而成，

所述冷冻干燥法包括以下步骤：1）将阳离子脂质体先溶于适量有机溶剂，减压旋转蒸发除去有机溶剂形成阳离子脂质体薄膜，然后加入适量浓度为1～20mmol/L、pH为5～9的Tris-HCl缓冲液，水浴超声并孵化30min～1h，即得空白脂质体；2）将流感疫苗原液和冻干保护剂加入到上述空白脂质体中，使其充分融合，再将其放入冰箱预冻12-24小时，取出后放在真空冷冻干燥机中冷冻干燥12-24小时，即得阳离子脂质体流感疫苗；其中量子点加入到上述成膜的阳离子脂质体、空白脂质体或阳离子脂质体流感疫苗中实现包载最终形成包载量子点的阳离子脂质体流感疫苗；所述流感疫苗原液与阳离子脂质体的质量比为5:100～12.5:100；

3.按照权利要求1或2所述的可包载量子点的阳离子脂质体流感疫苗，其特征在于该包载量子点的阳离子脂质体流感疫苗的粒径在100nm～3μm之间，zeta电位为30～90mV，包封率为45%～95%，载药量为2%～10%。

4.按照权利要求1或2所述的可包载量子点的阳离子脂质体流感疫苗，其特征在于所述流感疫苗原液为H1N1流感疫苗原液、H3N2流感疫苗原液、H5N1流感疫苗原液、H5N2流感疫苗原液、H7N3流感疫苗原液、H7N7流感疫苗原液或H7N9流感疫苗原液。

5.按照权利要求1或2所述的可包载量子点的阳离子脂质体流感疫苗，其特征在于所述量子点为脂溶性的量子点或水溶性的量子点，具体为CdSe/ZnS、CdTe/ZnS、CdSe/ZnSe或CdTe/ZnSe中的一种。

6.按照权利要求1或2所述的可包载量子点的阳离子脂质体流感疫苗，其特征在于所述有机溶剂为乙醇、丙酮、四氢呋喃、二氯甲烷、氯仿或甲醇中的一种或几种。

7.按照权利要求2所述的可包载量子点的阳离子脂质体流感疫苗，其特征在于所述冻干保护剂为乳糖、蔗糖、葡萄糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇中的一种或几种，其质量浓度为0.5～2%，用量为阳离子脂质体质量的0.5～1倍。