CN104706596A - 一种制备流感疫苗脂质体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种制备流感疫苗脂质体的方法。该方法包括磷脂膜、空白脂质体、单层脂质体的制备、脂质体包封流感疫苗蛋白、流感疫苗脂质体冻干粉制备。该方法在磷脂膜中加入25ml～35ml、pH7.0的磷酸盐缓冲液；制备单层脂质体在50℃以上超声4-8次；单层脂质体与1500μg～2500μg流感抗原液混合；低温速冻、室温融化，反复冻融2-4次；之后低温预冻、冻干得流感疫苗脂质体，置4℃贮存。本发明克服了常规制备疫苗脂质体中温度过高引起蛋白质类疫苗变性，影响免疫原性的弊端。各参数的控制，使得脂质体粒径均匀，有较低的渗透性，在溶液中稳定，既提高了疫苗的包封率，又能保障对温度敏感的蛋白类疫苗的有效性。

Description

一种制备流感疫苗脂质体的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体涉及一种制备流感疫苗脂质体的方法。

背景技术

佐剂是先于抗原或与抗原同时应用，能非特异性地改变或增强机体对抗原的特异性免疫应答，而本身并不引起机体产生免疫应答的物质。理想的佐剂应具备以下特征：既能促进体液和细胞介导的免疫，也能作用于弱免疫性抗原，且不引起有害副作用，能用于不同的抗原，能以不同途径免疫，能有效影响免疫反应质量，能在免疫抑制个体中发挥作用，稳定、廉价和易生产。

脂质体具有良好的免疫佐剂功能，可增强机体的体液免疫和细胞免疫。脂质体作为疫苗佐剂具有以下优点：安全性好、副作用小、天然靶向性、可作为半抗原的载体诱发半抗原特异性免疫应答，减少抗原的剂量及接种次数，能降低被包裹抗原的毒性，增强动物耐受高剂量病原微生物或其毒素攻击的能力，提高抗原稳定性，延长疫苗使用期，降低储存条件，比单用游离抗原或其他佐剂能显著地诱生抗体形成细胞，增加循环抗体滴度，并能强烈地诱导免疫记忆细胞的形成，增强免疫记忆力。

制备脂质体最基本和应用最广泛的方法是薄膜分散法，该法工艺简单，是制备蛋白质药物脂质体的首选，利于规模化生产。鲁卫东等曾系统研究了薄膜分散法制备流感疫苗脂质体体液免疫、粘膜免疫和细胞免疫的效果，结果显示免疫原性均有明显提高。但薄膜分散法在制备过程中温度较高，不适用于减毒活疫苗脂质体的制备。薄膜分散法在37℃下制备，适用于大多数疫苗的制备，但对某些对温度非常敏感的需要低温制备的疫苗，如减毒活疫苗，则需要在更低的温度下制备。

冻融法(freeze-thawing method)制备脂质体是先采用薄膜分散法和超声法制备未载药的单层脂质体，冷冻前将待包封的药物加入，在快速冷冻过程中，由于冰晶的形成，使脂质体膜破裂，形成冰晶片层与破裂的脂膜共存状态，脂质和药物紧密接触，在缓慢融化时，暴露出的脂膜互相融合重新形成脂质体，并在此时实现对药物的包封。通过反复多次的冻融，最终实现对药物的有效包封。

冻融-冻干法是在薄膜分散法基础上进行的，分为：1)薄膜分散法成膜、2)水化形成大多室脂质体、3)超声破碎形成大小均一的小单室脂质体，以及4)冻融法包封药物四个过程。制备过程中药物性质、制备方法、大豆卵磷脂与胆固醇的比例、水和介质(PBS)溶液的pH值、投药量、水合介质(PBS)的用量、所用有机试剂的种类及用量、薄膜分散法中水化温度、旋转蒸发仪的旋转速度、水化时间长短、超声功率及频率、冻融次数等对脂质体的形成和包封率均有影响。由于前期的试验已形成一套成熟的薄膜分散法成膜及水化形成大多室脂质体的技术，因此本发明着重对超声破碎形成大小均一的小单室脂质体以及冻融法包封药物过程中影响药物质量的因素进行限定，主要包括投药量、水合介质(PBS)的用量、超声功率及频率、冻融次数四个因素。其余因素结合以前研究确定为(l)水化转速:65r/min、(2)水化时间:45min、(3)有机溶剂:无水乙醇、(4)磷脂种类:大豆卵磷脂、(5)PBS缓冲液pH值:7.0、(6)磷脂胆固醇比:300:100(mg)。

运用冻融-冻干法制备脂质体，得到具有一定外形的粉状或饼状物，以固体形式存在，能够在保证安全性的基础上提高流感疫苗的稳定性，便于疫苗的运输与保存，避免了磷脂和药物的水解、药物泄露等问题的出现，能够满足更多生物制品脂质体低温制备的特殊要求。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服原有的脂质体制备方法制备过程中温度较高，无法用于某些对温度非常敏感的需要低温制备的疫苗，其目的是提供一种可在低温条件下制备流感疫苗脂质体的方法：冻融-冻干法。

为解决上述技术问题和达到本发明目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

一种制备流感疫苗脂质体的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)磷脂膜的制备

将大豆卵磷脂300mg和胆固醇100mg混合溶于15ml无水乙醇后，于37℃减压旋转蒸发，除去无水乙醇溶剂，得磷脂膜；

(2)空白脂质体的制备

①在磷脂膜中加入25ml～35ml pH为7.0的磷酸盐缓冲液，在磷脂的液晶相转变温度(Tc)50℃以上进行水浴旋转水化1h，得混悬液；

②所得混悬液在50℃以上放置1～2h，得空白脂质体；

(3)制备单层脂质体

①将超声探头浸入空白脂质体中，50℃以上进行频繁间歇超声，所述频繁间歇超声是每次超声功率80％，每次超声30s，间歇30s，超声4-8次；

②超声后，空白脂质体以1700g转速离心2min，除去金属钛碎末，并在50℃以上放置1h～2h得单层脂质体；

(4)脂质体包封流感疫苗蛋白

①将单层脂质体中与1500μg～2500μg流感抗原液混合；

②反复冻融：-40℃低温冰箱快速冷冻1h，25℃缓慢融化，反复冻融2-4次；

(5)流感疫苗脂质体冻干粉的制备

①反复冻融后，以-40℃低温预冻4h～8h；

②于冷冻干燥机上-52℃、0.06mbar冻干28h以上，得到白色疏松状冻干粉体即为流感疫苗脂质体，置4℃贮存。

进一步，在步骤(1)所述于37℃减压旋转蒸发时，充入氮气60s，除去无水乙醇溶剂；在步骤(3)①将超声探头浸入空白脂质体中，充入氮气，再50℃以上进行频繁间歇超声。

进一步，步骤(2)①在磷脂膜中加入pH为7.0的磷酸盐缓冲液为30ml；步骤(3)①中超声6次；步骤(4)①将单层脂质体与2500μg流感抗原液混合，步骤(4)②反复冻融4次。

本发明的有益效果是：

本发明方法采用冻融-干燥法制备流感疫苗脂质体，克服了常用方法制备疫苗脂质体中温度过高引起蛋白质类疫苗变性，影响其免疫原性的弊端。该方法操作简便、快捷，各参数的控制，使制得的脂质体粒径均匀，有较低的渗透性，在溶液中稳定，既提高了疫苗的包封率，又能保障对温度敏感的蛋白类疫苗的有效性。本发明方法建立了一套适用于大多数疫苗脂质体制备的方法，具有很强的应用性。

具体实施方式

实施例1-实施例4分别对影响冻融-冻干法制备流感疫苗脂质体工艺的影响因素：投药量、水合介质用量、超声次数和冻融次数在技术方案中提到的相关技术参数范围内进行验证，每个验证指标进行3次重复实验。通过对验证结果统计分析，在其它因素固定不变的情况下，包封率随投药量的增加而增加，但均在70％-80％以内，综合考虑包封率与不被包封的药物的量，为避免过多药物的损失(不被包封的药物在500μg左右)，将投药量考察范围确定为1500μg到2500μg。

水合介质的用量过小，水化后脂质体粒度不规则，碎片多；用量太大，粒度不太均匀，且数量减少，稳定性偏差。结合包封率确定水合介质的用量最佳范围为25ml到35ml；超声4次以上粒径范围变为1-10μm，以1-4μm为主，超声10次后粒径范围变为0.5-1μm。超声4次以上包封率均大于75％。

由于疫苗肺部给药，脂质体粒径越小吸收越快，肺部沉积率越高，但不应小0.5μm，否则粒子会随呼气排除体外，且粒径过小，脂质体冻融过程中有效包封体积减少，也影响包封率。故超声次数最佳范围为4-8次；包封率随冻融次数的增加而增加，但是3次以上之后均为75％以上，且变化不明显。且由于冻融过程中存在脂质体膜的破裂与融合过程，小粒径脂质体融合成粒径稍大的脂质体，随着冻融次数的增加脂质体粒径会变大，故冻融最佳次数确定为2-4次。

实施实例5在投药量、水合介质(PBS)的用量、超声频率和冻融次数的最佳取值范围内，各因素设3个水平，以药物包封率为主要评价指标，脂质径分布为辅助，按L₉(3⁴)正交设计表安排正交试验，确定脂质体的最优处方及工艺为：投药量2500μg，冻融4次，加入PBS体积为30ml，超声6次。最佳组合的包封率为(82.74±1.67)％(n＝3)，平均粒径约为2μm，1.0～4.0μm粒径约占95％。

实施实例6对脂质体体外稳定性考察，脂质体的理化稳定性直接影响其作为药物载体的载药性能，在不同的体外储存条件下，会发生不同程度的磷脂氧化和脂质体渗漏，从而影响其包封率，使脂质体载药性能发生变化。本实例将脂质体混悬液和冻干粉放置在不同的温度(4℃、25±2℃、40±2℃)条件下进行温度加速实验，在设定的时间点(0、1、3、5、10、15、30、60、120、180天)取样，冻干粉以PBS缓冲液复溶，分别于4℃、50000r/min离心1h，测定脂质体包封率，考察脂质体混悬液和冻干粉的外观、微观形态和包封率在不同时间(0～180天)内的变化情况。结果发现在低温下(4℃)保存的脂质体，第180天仍保持在70％以上的包封率，渗漏率10％以下，粉体无收缩，颜色无变化。

以下各实施例无特殊说明均为常规方法，所用材料和试剂均为市售：流行型感冒病毒裂解单价液(20121026，H1N1)、血凝素(HA)含量为550μg/ml(云南沃森生物技术股份有限公司)、标准小牛血清蛋白BSA(美国Sigma)、大豆卵磷脂PC-50(北京美亚斯磷脂技术有限公司)、胆固醇(上海新兴化工试剂研究所)、Folin酚蛋白定量试剂盒(北京鼎国生物技术有限公司)；无水乙醇、无水碳酸钠、碳酸氢钠、氯化钠、柠檬酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、酒石酸钾、硫酸铜等其余试剂均为分析纯。所用仪器设备：

①Labconco^R 4.5L冷冻干燥机(美国Labconco)

②RE-52AA型旋转蒸发仪(上海亚荣生物仪器厂)

③SHB-ⅢS型循环水式多用真空泵(郑州长城)

④EL204型电子天平(上海梅特勒-托利多)

⑤超低温冰箱(日本三洋)

⑥紫外可见分光光度计(UV7501)

⑦DHG电热鼓风干燥箱(上海一恒)

⑧PB-10型pH酸度计(德国Sartorius公司)

⑨Z300K型台式高速低温离心机(德国Hemle)

⑩Motic B5型数码电子显微镜(厦门麦克奥迪)

VCX-130型探头式超声波破碎仪(功率130W，20KHZ，美国Sonic公司)

实施例1

在投药量参数范围1000～3000μg内进行验证，固定其它因素为：冻融次数3次、PBS量30ml、超声功率80％，频率6次，验证投药量为1000、2000和3000μg时脂质体的包封率。每个投药量做三次重复，各个重复均按以下步骤进行：

(1)磷脂膜(Phospholipid membrame)的制备

大豆卵磷脂(磷脂酰胆碱)300mg和胆固醇100mg(质量比3:1)混合溶于15ml无水乙醇后，于37℃减压旋转蒸发，充入无氧氮气60s(如有条件的充入无氧氮气，以确保除尽溶剂，并置换出空气，减少氧化因素)，除去无水乙醇溶剂，成膜即得磷脂膜；

(2)空白脂质体的制备

①在磷脂膜中加入30mlpH为7.0的磷酸盐缓冲液，在磷脂的液晶相转变温度(Tc)50℃以上进行水浴旋转水化1h；

②所得混悬液在50℃以上放置1或2h，得空白脂质体；

(3)制备单层脂质体，控制合适粒径

①将超声探头浸入空白脂质体乳状混悬液中，充入氮气(条件允许时)，50℃(Tc)以上进行频繁间歇超声；所述频繁间歇超声是每次超声功率80％，每次超声30s，间歇30s，超声6次；调整超声仪，混悬液被剧烈震荡，超声较成功，混悬液无沉淀，有白色乳光出现；

②超声后，脂质体混悬液以1700g转速离心2min，除去金属钛碎末，并在50℃(Tc)以上放置1h～2h得单层脂质体；

(4)脂质体包封流感疫苗蛋白

①将单层脂质体与1000μg或2000μg或3000μg流感抗原液混合(根据验证投药量确定)；

②反复冻融：-40℃低温冰箱快速冷冻1h，25℃缓慢融化，反复冻融3次；冻融过程是药物进入脂质体的关键性步骤，可提高水溶性药物的包封率。

(5)流感疫苗脂质体冻干粉的制备

①反复冻融后，仍以-40℃低温预冻4～8h

②于冷冻干燥机上-52℃、0.06mbar冻干28h以上，得到白色疏松状冻干粉体即为本发明制备的流感疫苗脂质体，置4℃贮存。

③使用时加入适量PBS或注射用水复溶形成DRV(冻干再水化脂质体)混悬液，进行包封率、稳定性或有效性评价，或进行混悬液雾化给药研究，或以干粉装入吸入装置进行肺部吸入研究。

(6)结果测定

①流感疫苗脂质体形态观察和粒度分布测定

取流感疫苗脂质体冻干粉适量复溶，适当稀释，室温下用Motic B5型数码显微镜(Oil,100x)观察脂质体形态，并用Nano measurer 1.2软件对脂质体的粒径进行分析，测定其平均粒径和粒径分布。

②流感疫苗脂质体包封率测定

根据脂质体与游离药物比重不同，所受到的离心力不同，从而沉降速度不同，采用低温超速离心法测定包封率。取一定量脂质体悬液放入超速离心管中，于4℃，50000r/min离心1h，分离游离药物与脂质体，以Lowry蛋白测定法测定未离心前样品的总药物量和离心后上清液的游离药物量，计算包封率。

结果及分析：在投药量的范围为1000～3000μg，实施例1对此技术参数进行了范围两端及中间参数运用的实验，每一运用重复进行了3次实验，共计9次。结果表明，不同投药量下(1000、2000、3000μg)发现包封率随投药量的增加而增加，但均在70％-80％以内，综合考虑包封率与不被包封的药物的量，为避免过多药物的损失(不被包封的药物在500μg左右)，投药量最佳范围为1500μg到2500μg。

实施例2

在水合介质用量参数范围20～40ml内进行验证，固定其它因素为：投药量2000μg、冻融次数3次、超声功率80％，频率6次，验证水合介质体积分别为20ml、30ml、40ml时脂质体的包封率。每个体积做三次重复，各个重复除以下的操作不同外，其余操作与实施例1相同，不再赘述。

(2)空白脂质体的制备

①加入20ml或30ml或40ml(根据验证体积加入)pH7.0的磷酸盐缓冲液(PBS)，水浴旋转水化；

(4)脂质体包封流感疫苗蛋白

①超声后的脂质体混悬液与2000μg流感抗原液混合。

结果及分析：结果显示水合介质的用量过小，水化后脂质体粒度不规则，碎片多；用量太大，粒度不太均匀，且数量减少，稳定性偏差。只从粒度观察差异性不是很明显，需结合包封率确定。包封率分别为(65％、80％、70％)，故水合介质的用量最佳范围为25ml到35ml。

实施例3

在超声次数参数范围2～10次内进行验证，固定其它因素为：投药量2000μg、水合介质用量30ml，冻融次数3次、超声功率80％，超声时间与间歇时间均为30s，验证超声次数分别为2、4、6、8、10次时水化后粒径与超声后粒径的变化以及包封率的变化。每次验证做三次重复，各个重复除以下的操作不同外，其余操作与实施例1相同，不再赘述。

(3)制备单层脂质体，控制合适粒径

②超声功率80％，每次超声30s，间歇30s，超声2或4或6或8次(根据所需验证的超声次数确定)；

(4)脂质体包封流感疫苗蛋白

①超声后的脂质体混悬液与2000μg流感抗原液混合。

结果及分析：水化后脂质体为大多室脂质体，粒径范围较广(1-30μm)，以2-5μm左右为主，但存在个别体积较大脂质体，粒径分布跨度大。超声4次以上粒径范围变为1-10μm，以1-4μm为主，超声10次后粒径范围变为0.5-1μm。测得包封率4次以上均大于75％。疫苗肺部给药时，脂质体粒径越小吸收越快，肺部沉积率越高，但不应小于0.5μm，否则粒子会随呼气排除体外，且粒径过小，脂质体冻融过程中有效包封体积减少，也影响包封率。故超声次数最佳范围为4～8次。

实施例4

在冻融次数参数范围2～6次内进行验证，固定其它因素为：投药量2000μg、水合介质用量30ml、超声功率80％，次数6次，验证冻融次数分别为2、3、4、5、6次时包封率的变化。每次验证做三次重复，各个重复除以下的操作不同外，其余操作与实施例1相同，不再赘述。

(4)脂质体包封流感疫苗蛋白

①超声后的脂质体混悬液与2000μg流感抗原液混合。

②反复冻融：-40℃低温冰箱快速冷冻，室温缓慢融化，反复2或3或4或5或6次(根据所需验证的次数冻融)。

结果及分析：冻融-冻干法制备脂质体过程中，冻融次数是最关键的步骤。如果药物为对热不敏感，且超声不产生其失效的情况下，在水化时就加入药物，然后超声冻融可以显著提高脂质体的包封率。但是大部分生物制品为蛋白质类药物，超声会引起蛋白质的变性影响其药效。故冻融过程成为脂质体包封蛋白的唯一步骤。结果发现，包封率随冻融次数的增加而增加，但是3次以上之后均为75％以上，且变化不明显。且由于冻融过程中存在脂质体膜的破裂与融合过程，小粒径脂质体融合成粒径稍大的脂质体，随着冻融次数的增加脂质体粒径会变大，故冻融的最佳范围为2-4次。

实施例5

在影响脂质体稳定性及包封率的4个主要因素:投药量、水合介质(PBS)的用量、超声功率及频率、冻融次数以及各因素的最佳取值区间范围内，各因素设3个水平(如表1)。以药物包封率为主要评价指标，脂质体粒径及分布为辅助，按L₉(3⁴)正交设计表安排正交试验(如表2)，确定脂质体的最优处方及工艺。每个正交试验做三次重复，各个重复除以下的操需按验证因素相应水平调整外，其余操作与实施例1相同，不再赘述。正交试验设计及结果如表2。

表1正交设计因素水平表

(2)空白脂质体的制备

①加入25ml或30ml或35ml(根据试验确定)pH7.0的磷酸盐缓冲液(PBS)，水浴旋转水化；

(3)制备单层脂质体，控制合适粒径

②超声功率80％，每次超声30s，间歇30s，超声4或6或次(根据试验确定)；

(4)脂质体包封流感疫苗蛋白

①超声后的脂质体混悬液与1500或2000或2500μg流感抗原液混合；

②反复冻融：-40℃低温冰箱快速冷冻，室温缓慢融化，反复2或3或4次。

表2正交实验设计及实验结果

结果及分析：由正交实验结果分析可知,各因素对药物包封率影响大小的顺序为：C＞A＞D＞B。得各因素最佳组合为投药量2500μg，冻融4次，加入PBS体积为30ml，超声6次。根据该最佳组合，验证该最佳组合包封率为(82.74±1.67)％(n＝3)，平均粒径约2μm，1.0～4.0μm粒径约占95％。

实施例6脂质体的理化稳定性直接影响其作为药物载体的载药性能，在不同的体外储存条件下，会发生不同程度的磷脂氧化和脂质体渗漏，从而影响其包封率，使脂质体载药性能发生变化。本实例将脂质体混悬液和冻干粉放置在不同的温度(4℃、25±2℃、40±2℃)条件下进行温度加速实验，在设定的时间点(0、1、3、5、10、15、30、60、120、180天)取样，冻干粉以PBS缓冲液复溶，分别于4℃、50000r/min离心1h，测定脂质体包封率，考察脂质体混悬液和冻干粉的外观、微观形态和包封率在不同时间(0～180天)内的变化情况。每个温度梯度下进行三次重复平行实验。在不同的时间，脂质体悬液与冻干粉两种储存形式的包封率变化差异见表3。

表3不同温度下流感疫苗脂质体包封率(％)

结果及分析：在40±2℃条件下储存，脂质体混悬液3天后包封率急剧下降，数量减少，10天后包封率降至10％以下，外观变黄并出现大量浑浊和沉淀；而冻干脂质体包封率第15天时仍保持在60％以上，粉体收缩、微黄，显微镜下观察粒径变大，15天后包封率下降明显。

在25±2℃室温条件下储存，脂质体混悬液包封率30天时下降约一半，60天后会降至近10％左右，出现沉淀，但悬液颜色无变化；而冻干脂质体的包封率180天时仍能保持在60％以上，渗漏率低于25％，粉体轻度收缩、颜色无变化。在4℃冷藏条件下储存，脂质体混悬液包封率180天时仍保持在45％以上，悬液颜色无变化，仅少许沉淀；而冻干脂质体的包封率变化不大，180天时仍能保持在70％以上的，渗漏率低于10％，粉体无收缩、颜色无变化。证明冻融-冻干法制备的脂质体体外具有良好的稳定性，在室温下仍有较高的包封率，作为药物载体具有很好的应用前景，同时也证明本发明方法具有很强的实用性，有望进一步应用于减毒活疫苗制备。

Claims (3)

1.一种制备流感疫苗脂质体的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)磷脂膜的制备

将大豆卵磷脂300mg和胆固醇100mg混合溶于15ml无水乙醇后，于37℃减压旋转蒸发，除去无水乙醇溶剂，得磷脂膜；

(2)空白脂质体的制备

①在磷脂膜中加入25ml～35ml pH为7.0的磷酸盐缓冲液，在磷脂的液晶相转变温度50℃以上进行水浴旋转水化1h，得混悬液；

②所得混悬液在50℃以上放置1～2h，得空白脂质体；

(3)制备单层脂质体

①将超声探头浸入空白脂质体中，50℃以上进行频繁间歇超声，所述频繁间歇超声是每次超声功率80％，每次超声30s，间歇30s，超声4-8次；

②超声后，空白脂质体以1700g转速离心2min，除去金属钛碎末，并在50℃以上放置1h～2h得单层脂质体；

(4)脂质体包封流感疫苗蛋白

①将单层脂质体中与1500μg～2500μg流感抗原液混合；

②反复冻融：-40℃低温冰箱快速冷冻1h，25℃缓慢融化，反复冻融2-4次；

(5)流感疫苗脂质体冻干粉的制备

①反复冻融后，以-40℃低温预冻4h～8h；

②于冷冻干燥机上-52℃、0.06mbar冻干28h以上，得到白色疏松状冻干粉体即为流感疫苗脂质体，置4℃贮存。

2.根据权利要求1所述的制备流感疫苗脂质体的方法，其特征在于：在步骤(1)所述于37℃减压旋转蒸发时，充入氮气60s，除去无水乙醇溶剂；在步骤(3)①将超声探头浸入空白脂质体中时，充入氮气，再50℃以上进行频繁间歇超声。

3.根据权利要求1或2所述的制备流感疫苗脂质体的方法，其特征在于：步骤(2)①在磷脂膜中加入pH为7.0的磷酸盐缓冲液为30ml；步骤(3)①中超声6次；步骤(4)①将单层脂质体与2500μg流感抗原液混合，步骤(4)②反复冻融4次。