CN116807976B - 一种包载药物脂质体及其制备方法和提高外泌体分泌量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于细胞培养技术领域，涉及一种包载药物脂质体及其制备方法和提高外泌体分泌量的方法。一种包载药物脂质体，由氯喹、磷脂和胆固醇组成；其中，所述氯喹与磷脂的质量比为1:20‑120，所述磷脂和胆固醇的质量比为2.5‑7.5:1。可以既减少药物用量、又有效提高细胞外泌体分泌量，实现同时减少细胞毒性和提高细胞外泌体分泌量，且可以减少药物用量，减少生产成本。
Description
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，尤其是涉及一种包载药物脂质体及其制备方法和提高外泌体分泌量的方法。
背景技术
外泌体( exosomes) 是由脂质双分子层包裹，与细胞膜融合后释放到细胞外基质中的多囊体小腔内，直径为30-100 nm、密度为1.13-1.21g/mL的囊泡。不同细胞来源的外泌体临床应用广泛，如干细胞来源的外泌体具有组织修复、抗炎、延缓皮肤衰老等功能。目前外泌体领域发展迅速，但产量低下极大地限制了外泌体的临床应用。若想要增加外泌体的医学应用，提高产量是至关重要的一步，产量的高效增加将会支持外泌体相关分析及其作为药物载体应用的基础研究的扩展。从外泌体分泌的三个阶段可知，第一阶段形成早期内吞体，早期内吞体发育成熟为晚期内吞体，在第二阶段中晚期内吞体向内凹陷形成管腔囊泡（ILVs），ILVs形成多囊泡体，也称为MVBs，最后在第三阶段中，只有少数MVBs与质膜融合，以胞吐的形式将外泌体释放到细胞外，而绝大多数MVBs被转运到溶酶体进行降解，因此减少溶酶体对外泌体的降解是提高产量的重要解决方案。
氯喹（CQ）一种广泛用于治疗疟疾和类风湿性关节炎的抗疟疾和抗炎剂，也是一种溶酶体抑制剂。Chloroquine treatment induces secretion of autophagy-relatedproteins and inclusion of Atg8-family proteins in distinct extracellularvesicle populations(XU J, YANG K C, GO N E, et al.Autophagy,2022:1-14.PMID:35220892)中将氯喹与细胞共孵育后，发现氯喹具有刺激外泌体分泌的作用，但由于氯喹极强的细胞毒性，该研究中氯喹用量仅为10 μM，因而促进外泌体分泌作用有限。
因此，需要研究既减少细胞毒性、又提高细胞外泌体分泌量的解决方案。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供了一种包载药物脂质体及其制备方法和提高外泌体分泌量的方法。可以既减少药物用量、又有效提高细胞外泌体分泌量，实现同时减少细胞毒性和提高细胞外泌体分泌量，且可以减少药物用量，减少生产成本。
为此，本发明第一方面提供了一种包载药物脂质体，所述包载药物脂质体由氯喹（CQ）、磷脂和胆固醇（CHOL）组成；其中，所述氯喹与磷脂的质量比为1:20-120，所述磷脂和胆固醇的质量比为2.5-7.5:1。
本发明根据CQ作为弱碱这一理化性质，当包载氯喹的脂质体快速扩散穿过细胞器膜时，氯喹会优先在溶酶体中积累，提高溶酶体腔内pH值，阻止溶酶体对外泌体的降解，提高外泌体与质膜的融合率。尽管CQ的自噬抑制作用强大，它单独使用在体外和体内的过程中仍会产生多种副作用，其中包括溶酶体体系的紊乱，本发明采用脂质体包载氯喹，不仅可以克服该缺点，还能促进氯喹的胞内转运，因而有极大的促进细胞外泌体分泌的能力。
同时本发明以外泌体分泌机制为出发点，在外泌体分泌的第三阶段中，通过减少溶酶体对外泌体的降解以及增加囊泡与细胞膜的融合，利用CQ促进外泌体分泌的同时，尽可能减少药物对细胞的损伤。
在本发明的一些实施方式中，所述氯喹与磷脂的质量比为1:20-80，优选为1:50-80，更优选为1:80；所述磷脂和胆固醇的质量比为3.75-7.5:1，优选为3.75-6.5:1，更优选为3.75:1。在一些例子中，所述氯喹与磷脂的质量比可以但不限于为1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70或1:80；所述磷脂和胆固醇的质量比可以但不限于为3.75:1、3.95:1、4.15:1、4.35:1、4.55:1、5.55:1、5.75:1、6.25:1或6.5:1。
根据本发明，所述磷脂包括大豆卵磷脂（SPC）蛋黄卵磷脂（EPC）、氢化大豆卵磷脂（HSPC）、二硬脂酰磷脂酰胆碱（DSPC）、二棕榈酰胆碱（DPPC）、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE）或二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺（DPPE）。
根据本发明，所述包载药物脂质体为包载氯喹脂质体，即为氯喹脂质体或CQ脂质体。
本发明第二方面提供了一种如本发明第一方面所述的包载药物脂质体的制备方法，所述制备方法包括：将磷脂和胆固醇按质量比混合，经薄膜分散法制备脂质体，再将脂质体与氯喹按质量比融合后并冻融处理。
在本发明的一些实施方式中，所述脂质体的浓度为20%-100%；优选为40%-80%。在一些例子中，所述脂质体的浓度可以但不限于为20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。
在本发明的一些实施方式中，所述氯喹的浓度为5-100μM；优选为5-40μM或20-100μM，更优选为5-20μM，再优选为5-10μM。在一些例子中，所述氯喹的浓度可以但不限于为5μM、10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM、90μM或100μM。
在本发明的一些实施方式中，所述制备方法包括以下具体步骤：
S1：按质量比称取胆固醇和磷脂，并分散于18-22mL无水乙醇中，于50-60℃充分溶解；再在30-40℃下减压旋转蒸发除去乙醇，直至成膜，即得到脂质膜；
S2：按比例加入0-30mL的pH 7.0的PBS缓冲液于步骤S1制得的脂质膜中，于50-60℃下进行旋转水化40-50min，即得到脂质体初品；
S3：将超声探头放入步骤S2制得的脂质体初品中进行间歇性超声处理，超声处理后于50-60℃下放置1-2h，获得脂质体混悬液；
S4：按质量比称取氯喹与步骤S3制得的的脂质体混悬液进行融合，在-40℃快速冷冻50-60min后室温环境下缓慢融化，反复冻融0-4次；优选冻融1-3次。
在本发明的一些实施方式中，所述步骤S1中减压旋转蒸发的转速为40-50r/min。
在本发明的一些实施方式中，所述步骤S3中间歇性超声处理为超声20-30s、暂停20-30s，超声频率为40-50%。
根据本发明，所述步骤S3中间歇性超声处理为超声30s、暂停30s。
在本发明的一些实施方式中，所述步骤S3中间歇性超声处理的总时间为2-3min。
根据本发明，所述步骤S3中间歇性超声处理的总时间为2min。
根据本发明，定义所述步骤S3中制得的脂质体混悬液浓度为100%，分别另取相应体积的PBS缓冲液稀释脂质体混悬液，使得脂质体的浓度为20%-100%。
本发明第三方面提供了一种提高细胞外泌体分泌量的方法，所述方法包括：将本发明第一方面所述的包载药物脂质体或本发明第二方面所述的制备方法制备的包载药物脂质体与细胞共同孵育。
在本发明的一些实施方式中，所述包载药物脂质体与细胞共同孵育时，药物的浓度为5-100μM。优选为5-40μM或20-100μM。在一些例子中，包载药物脂质体与细胞共同孵育时，药物的浓度可以但不限于为5μM、10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM、90μM或100μM。
在本发明的一些实施方式中，所述包载药物脂质体与细胞于37℃共同孵育24-72h。在一些例子中，所述包载药物脂质体与细胞于37℃可以但不限于共同孵育24 h、36 h、48h或72 h。
在本发明的一些实施方式中，所述包载药物脂质体与细胞共同孵育的方法包括以下具体步骤：
S1：将包载药物脂质体加入提前细胞铺板过夜的96孔板中，孵育24h后在酶标仪450nm波长处检测细胞活力；
S2：根据步骤S1中得到的细胞活力实验结果，选取合适药物浓度的包载药物脂质体，加入提前细胞铺板过夜的6孔板中，孵育24-72h，收取细胞上清液。
S3：将步骤S2中收取的细胞上清液置于4℃预冷1 h后，先300 g离心10 min，再2000 g离心20 min，最后10000 g离心两次30 min，每一次离心后均取上清液，弃底部沉淀；最后用0.22μm滤膜过滤离心后得到的细胞上清液；
S4：步骤S3处理得到的细胞上清液中蛋白定量后，通过Western blotting实验，分别采用CD9和TSG101两个外泌体标志蛋白进行外泌体含量检测。
在本发明的一些实施方式中，所述步骤S1和步骤S2中将细胞按照6.11×105密度种板，等到板内细胞密度长到50%时加入包载药物脂质体。
本发明的有益效果：
（1）本发明提供的一种包载药物脂质体，其通过脂质体包载氯喹，可以使用更低浓度的氯喹，不仅减少细胞毒性、增强安全性，且降低生产成本；同时可以更有效提高细胞外泌体的分泌量。
（2）本发明提供的CQ脂质体的脂质体原料和制备工艺简单且高效，可重复性好，利于工业化生产；仅采用胆固醇、磷脂和药物即可得到包封率达70%以上的CQ脂质体，操作过程中不接触有毒有机试剂，安全性高。
（3）本发明利用最佳处方制备的CQ脂质体与细胞共孵育后，在现有的提取外泌体的技术上，并未添加复杂操作步骤，流程更加可控，将药物制剂与细胞共孵育，从源头上提高细胞分泌的外泌体产量。
附图说明
图1为本发明实验例1中细胞活力结果图；
图2为本发明实验例1中外泌体含量结果图；其中，a-CD9蛋白表达图，b-TSG101蛋白表达图，c-CD9蛋白表达量，d-TSG101蛋白表达量；
图3为本发明实验例2中实施例7-10制备的包载药物脂质体与细胞共同孵育后的细胞活力结果图；
图4为本发明实验例2中外泌体含量结果图；其中，a-CD9蛋白表达图，b-TSG101蛋白表达图，c-CD9蛋白表达量，d-TSG101蛋白表达量；
图5为本发明实验例3中不同浓度不包载药物的空白脂质体与细胞共同孵育后的细胞活力结果图；
图6为本发明实验例3中实施例14-18制备的包载药物脂质体与细胞共同孵育后的细胞活力结果图；
图7为本发明实验例3中外泌体含量结果图；其中，a-CD9蛋白表达图，b-TSG101蛋白表达图，c-CD9蛋白表达量，d-TSG101蛋白表达量；
图8为本发明实验例4中实施例6-7制备的包载药物脂质体与细胞共同孵育不同时间后的细胞活力结果图；
图9为本发明实验例4中外泌体含量结果图；其中，a-CD9蛋白表达图，b-TSG101蛋白表达图，c-CD9蛋白表达量，d-TSG101蛋白表达量；
图10为本发明实验例5中实施例6-7制备的包载药物脂质体与细胞共同孵育不同时间后的细胞活力结果图；
图11为本发明实验例5中外泌体含量结果图；其中，a-CD9蛋白表达图，b-TSG101蛋白表达图，c-CD9蛋白表达量，d-TSG101蛋白表达量。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。
在本发明中，所有的设备或原料等都可从市场获得或者是本行业常用的。其中，大豆卵磷脂购买自北京美亚斯磷脂技术公司；胆固醇购买自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；CCK-8试剂盒购于索莱宝公司；CD9、TSG101、二抗鼠、二抗兔均购买自Proteintech公司、CQ购买自麦克林公司。
实施例1-5
实施例1-5分别提供一种包载药物脂质体，其组分及质量如下表1所示：
表1包载药物脂质体组分表
实施例1-5分别还提供一种包载药物脂质体的制备方法，包括以下具体步骤：
S1：按表1中质量称取胆固醇和磷脂，并分散于18-22mL无水乙醇中，于50-60℃充分溶解；再在30-40℃下减压旋转蒸发除去乙醇，转速为40-50r/min，直至成膜，即得到脂质膜；
S2：按表1所示体积加入pH 7.0的PBS缓冲液于步骤S1制得的脂质膜中，于50-60℃下进行旋转水化40-50min，即得到脂质体初品；
S3：将超声探头放入步骤S2制得的脂质体初品中进行间歇性超声处理，超声30s、暂停30s，超声频率为40-50%，超声处理的总时间为2min，超声处理后于50-60℃水浴锅中放置1-2h，获得脂质体混悬液；
S4：按质量比称取氯喹与步骤S3制得的的脂质体混悬液进行融合，在-40℃快速冷冻60min后室温环境下缓慢融化，冻融1次。
实施例6-13
实施例6-13分别提供一种包载药物脂质体，并采用与实施例1-5相同的制备方法进行制备，其组分及质量如下表2所示：
表2包载药物脂质体组分表
实施例14-18
实施例14-18分别提供一种包载药物脂质体，其组分及质量如下表3所示：
表3包载药物脂质体组分表
实施例14-18采用与实施例1-5相同的制备方法制备包载药物脂质体，唯一的区别是定义制得的脂质体混悬液浓度为100%，分别另取相应体积的PBS缓冲液稀释脂质体混悬液，使得脂质体的浓度分别为80%、60%、40%、20%；包载氯喹的浓度为20μM。
实验例1
本实验例设置实施例8和实施例10-13制备的包载药物脂质体为实验组， 20μM氯喹为对照组1，不包载药物的空白脂质体为对照组2，PBS缓冲液为空白组；采用MDA-MB-231细胞分别与实验组、对照组1、对照组2和空白组共同孵育24 h后采用CCK-8法检测MDA-MB-231细胞活力，结果如图1所示；并收取细胞上清液处理后，蛋白定量后，通过Westernblotting实验，分别用CD9和TSG101两个外泌体标志蛋白进行外泌体含量检测，结果如图2所示。
由图1结果可知，实施例8制备的氯喹浓度为20μM的CQ脂质体与细胞共同孵育后，其细胞存活率最高。
由图2结果可知，实施例8制备的氯喹浓度为20μM的CQ脂质体与细胞共同孵育后，其细胞外泌体分泌量最高；与对照组1浓度为20μM的氯喹与细胞共同孵育后的细胞外泌体分泌量相比，在相同药物浓度下，本发明制备的包载药物脂质体能够有效提高细胞外泌体的分泌量。
实验例2
本实验例设置实施例6-10制备的包载药物脂质体为实验组，5μM氯喹为对照组1，10μM氯喹为对照组2，20μM氯喹为对照组3，不包载药物的空白脂质体为对照组4，PBS缓冲液为空白组；采用MDA-MB-231细胞分别与实验组、对照组1、对照组2、对照组3、对照组4和空白组共同孵育24 h后采用CCK-8法检测MDA-MB-231细胞活力，结果如图3所示；并收取细胞上清液处理后，蛋白定量后，通过Western blotting实验，分别用CD9和TSG101两个外泌体标志蛋白进行外泌体含量检测，结果如图4所示。
由图3结果可知，实施例7制备的氯喹浓度为10μM的CQ脂质体与细胞共同孵育后，其细胞存活率最高。
由图4结果可知，实施例6制备的氯喹浓度为5μM的CQ脂质体与细胞共同孵育后，其细胞外泌体分泌量最高；与对照组2浓度为10μM的氯喹、对照组3浓度为20μM的氯喹与细胞共同孵育后的细胞外泌体分泌量相比，本发明制备的包载药物脂质体能够在使用更低浓度氯喹的基础上，进一步提高细胞外泌体的分泌量。
实验例3
本实验例设置实施例14-18制备的包载药物脂质体为实验组，20μM氯喹为对照组1，不包载药物的空白脂质体为对照组2，PBS缓冲液为空白组；采用MDA-MB-231细胞分别与实验组、对照组1、对照组2和空白组共同孵育24 h后采用CCK-8法检测MDA-MB-231细胞活力，结果如图5和图6所示；并收取细胞上清液处理后，蛋白定量后，通过Western blotting实验，分别用CD9和TSG101两个外泌体标志蛋白进行外泌体含量检测，结果如图7所示。
由图5和图6结果可知，在相同药物浓度条件下，中性脂质体浓度越大，对细胞的杀伤作用越大。且本发明制备的不同脂质体浓度的CQ脂质体与不同浓度的不包载药物的空白脂质体相比，对细胞的损伤均有一定程度的减少，均提高了细胞存活率。
由图7结果可知，实施例17制备的脂质体浓度为80%的CQ脂质体与细胞共同孵育后，其细胞外泌体分泌量最高。且本发明制备的脂质体浓度为20%-100%包载20μM氯喹的CQ脂质体与20μM氯喹相比，均能够有效提高细胞外泌体的分泌量。进一步说明在相同药物浓度下，本发明制备的包载药物脂质体能够有效提高细胞外泌体的分泌量。
实验例4
本实验例采用MDA-MB-231细胞分别与6-7制备的包载药物脂质体共同孵育24 h、48 h、72 h后采用CCK-8法检测MDA-MB-231细胞活力，结果如图8所示；并收取细胞上清液处理后，蛋白定量后，通过Western blotting实验，分别用CD9和TSG101两个外泌体标志蛋白进行外泌体含量检测，结果如图9所示。
由图8结果可知，实施例6-7制备的氯喹浓度为5μM和10μM的CQ脂质体与细胞共同孵育24 h、48 h、72 h后，其细胞存活率随培养时间呈依赖性降低。
由图9结果可知，实施例6-7制备的氯喹浓度为5μM和10μM的CQ脂质体与细胞共同孵育48 h后，其细胞外泌体分泌量最高；说明CQ脂质体与细胞共同孵育的最佳时间为48 h，在此时间点，细胞外泌体的分泌速度大于降解速度，细胞外泌体分泌量最高。
实验例5
本实验例采用MDA-MB-231细胞分别与6-7制备的包载药物脂质体共同孵育12 h、24h、48 h后采用CCK-8法检测MDA-MB-231细胞活力，结果如图10所示；并收取细胞上清液处理后，蛋白定量后，通过Western blotting实验，分别用CD9和TSG101两个外泌体标志蛋白进行外泌体含量检测，结果如图11所示。
由图10结果可知，实施例6-7制备的氯喹浓度为5μM和10μM的CQ脂质体与细胞共同孵育12 h比孵育24h，其细胞存活率有所提高。
由图11结果可知，虽然缩短CQ脂质体与细胞共同孵育时间至12 h可以减少药物对细胞的损伤，提高了细胞存活率，但细胞外泌体的分泌量大幅度减少，进一步说明CQ脂质体与细胞共同孵育的最佳时间为48 h，在此时间点，细胞外泌体分泌量最高。
应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。
Claims (2)
1.一种包载药物脂质体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：将磷脂和胆固醇按质量比混合，经薄膜分散法制备脂质体，再将脂质体与氯喹按质量比融合后并冻融处理；
其中包载药物脂质体中所述氯喹与磷脂的质量比为1:80-120；所述磷脂和胆固醇的质量比为2.5-4.35：1；
所述脂质体的浓度为60％-80％；
所述氯喹的浓度为5-20μM；
所述制备方法包括以下具体步骤：
S1：按质量比称取胆固醇和磷脂，并分散于18-22mL无水乙醇中，于50-60℃充分溶解；再在30-40℃下减压旋转蒸发除去乙醇，直至成膜，即得到脂质膜；
S2：按比例加入0-30mL的pH 7.0的PBS缓冲液于步骤S1制得的脂质膜中，于50-60℃下进行旋转水化40-50min，即得到脂质体初品；
S3：将超声探头放入步骤S2制得的脂质体初品中进行间歇性超声处理，超声处理后于50-60℃下放置1-2h，获得脂质体混悬液；
S4：按质量比称取氯喹与步骤S3制得的的脂质体混悬液进行融合，在-40℃快速冷冻50-60min后室温环境下缓慢融化，反复冻融0-4次；
所述步骤S1中减压旋转蒸发的转速为40-50r/min；
和/或，所述步骤S3中间歇性超声处理为超声20-30s、暂停20-30s，超声频率为40-50％；
和/或，所述步骤S3中间歇性超声处理的总时间为2-3min。
2.一种提高细胞外泌体分泌量的方法，其特征在于，所述方法包括：将权利要求1所述的制备方法制备的包载药物脂质体与细胞共同孵育；
所述包载药物脂质体与细胞于37℃共同孵育24-72h。
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Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101283987A (zh) * | 2008-05-19 | 2008-10-15 | 浙江大学 | 氯喹脂质体冻干粉针及制备方法 |
| CN102188377A (zh) * | 2010-03-18 | 2011-09-21 | 鲁翠涛 | 包载药物脂质体的制备方法 |
| WO2012100590A1 (zh) * | 2011-01-27 | 2012-08-02 | 浙江大学 | 氯喹和阿霉素共载脂质体及其制备方法 |
| CN104706596A (zh) * | 2015-03-21 | 2015-06-17 | 云南沃森生物技术股份有限公司 | 一种制备流感疫苗脂质体的方法 |
| CN113930392A (zh) * | 2020-08-20 | 2022-01-14 | 北京沃森百欧生物科技研究院有限公司 | 一种间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用 |
| CN114191539A (zh) * | 2021-11-19 | 2022-03-18 | 广东工业大学 | 一种复合共载送小分子核酸和活性蛋白的外泌体纳米粒子及其制备方法和应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20150125950A1 (en) * | 2012-05-18 | 2015-05-07 | Agency For Science, Technology And Research (A*Sta (A*Star) | Umbilical cord mesenchymal stem cell exosomes |
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Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101283987A (zh) * | 2008-05-19 | 2008-10-15 | 浙江大学 | 氯喹脂质体冻干粉针及制备方法 |
| CN102188377A (zh) * | 2010-03-18 | 2011-09-21 | 鲁翠涛 | 包载药物脂质体的制备方法 |
| WO2012100590A1 (zh) * | 2011-01-27 | 2012-08-02 | 浙江大学 | 氯喹和阿霉素共载脂质体及其制备方法 |
| CN104706596A (zh) * | 2015-03-21 | 2015-06-17 | 云南沃森生物技术股份有限公司 | 一种制备流感疫苗脂质体的方法 |
| CN113930392A (zh) * | 2020-08-20 | 2022-01-14 | 北京沃森百欧生物科技研究院有限公司 | 一种间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用 |
| CN114191539A (zh) * | 2021-11-19 | 2022-03-18 | 广东工业大学 | 一种复合共载送小分子核酸和活性蛋白的外泌体纳米粒子及其制备方法和应用 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| A Novel Strategy to Increase the Yield of Exosomes (Extracellular Vesicles) for an Expansion of Basic Research;Sherif E. Emam等;Biol. Pharm. Bull;733-742 * |
| Interfering with endolysosomal trafficking enhances release of bioactive exosomes;Francisco G. Ortega;Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine;102014 * |
| 改善外泌体应用局限性的研究进展;张茜，鲁卫东;中南药学;第21卷(第7期);1877-1882 * |
| 氯喹脂质体的制备及评价;荆娜;万方;1-4 * |
| 荆娜.氯喹脂质体的制备及评价.万方.2009,1-4. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| CN116807976A (zh) | 2023-09-29 |
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