DK176010B1 - Medikament-lipid-systemer med lav toxicitet - Google Patents

Description

DK 176010 B1

Medicament-lipid system med lav toxicitet

Den foreliggende opfindelse angår formuleringer og metoder til fremstilling af medikament-associerede lipid-komplekser med høje forhold imellem medi-5 kament og lipid (såkaldte høj-medikament/lipid-komplekser eller HDLC'er).

Sådanne formuleringer er generelt i det væsentlige ækvivalente med eller bedre end det tilsvarende medikament i fri form med hensyn til effektivitet, men samtidig udviser de en lavere toxicitet. Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til fremstilling af sådanne HDLC'er. Nærmere bestemt angår 10 opfindelsen disse kompleksers anvendelse i forbindelse med de toxiske anti-fungale polyen-antibiotika, nærmere bestemt amphotericin B og nystatin.

Høj-medikament/lipid-komplekserne (HDLC'eme) ifølge opfindelsen kan fremstilles ved teknikker, der i det væsentlige er de samme som anvendes 15 ved fremstilling af liposomer. Opfindelsen omfatter anvendelsen af disse HDLC-strukturer i tilknytning til bioaktive midler, såsom lægemidler, i særdeleshed polyen-antibiotika, såsom amphotericin B og nystatin.

Et andet aspekt ved den foreliggende opfindelse er en hidtil ukendt metode til 20 dannelse af liposomer (eller HDLC'er) uden anvendelse af organiske opløsningsmidler. Indkapslingen i eller associationen af et medikament til liposo-meme forløber via et ethanol-baseret eller et vandigt mellemprodukt.

Liposomer er fuldstændigt lukkede lipid-dobbeltmembraner, som indeholder 25 et indesluttet væskevolumen. Liposomeme kan være unilamellare vesikler (som besidder et enkelt membran-dobbeltlag) eller multilamellare vesikler (løg-lignende strukturer, som er karakteristiske ved flere membrandobbeltlag, der er separeret fra hinanden af vandige lag). Dobbeltlaget er sammensat af to lipid-monolag, som har en hydrofob "hale’-region og en hy-30 drofil "hoved"-region. Strukturene af membran-dobbeltlaget er sådan, at de hydrofobe (ikke-polære) "haler” i lipid-monolagene orienterer sig imod midten af dobbeltlaget, mens de hydrofile "hoveder” orienterer sig imod den vandige fase.

2 DK 176010 B1

Den oprindelige liposom-fremstilling beskrevet af Bangham et al. (J. Mol.

Biol., 1965, 13:238-252) involverer, at man suspenderer phospholipider i et organiske opløsningsmiddel, som derefter afdampes til tørhed, hvorved der efterlades en phospholipid-film på reaktionsbeholderens inderside. Derefter 5 tilsættes en passende mængde af en vandig fase, og blandingen får lov af "kvælde op", hvorefter de resulterende liposomer, som består af multilammel-lare vesikler (MLV’er), dispergeres ad mekanisk vej. Denne præparation danner basis for udviklingen af de små sonikerede unilamellare vesikler som er beskrevet af Papahadjopoulos et al. (Biochim. Biophys, Acta., 1967, 10 135:624-638). og store unilamellare vesikler.

De teknikker, som anvendes til at producere store unilamellare vesikler (LUV'er), såsom inddampning i omvendt fase, infusionsprocedurer og deter-gent-fortrinding, kan også anvendes til fremstilling af liposomer. Én oversigt 15 over disse og andre metoder til fremstilling af liposomer kan findes i bogen "Liposomes", Marc Ostro (red.), Marcel Dekker, Inc., New York, 1983, kapitel 1; se ogsåSzoka, Jr., et al., (1980, Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9:467). En særligt foretrukken metode til dannelse af LUV'er er beskrevet i indtemational patentansøgning nr. PCT/US 87/00238 med titlen "Extrusion Technique for 20 Producing Unilamellar Vesicles". Vesikler fremstillet ved denne teknik benævnt LUVET'er, ekstruderes under tryk igennem et membranfilter. Vesikler-ne kan også ekstrudere igennem et 200 nm filter. Sådanne vesikler kendes som VET 2oo’er. Man kan udsætte LUVET'er for mindst en frysnings- og optøningscyklus, inden man gennemfører ekstruderingen. Denne procedure er 25 beskrevet af Mayer et al. (Biochim. Biophys. Acta., 1985, 817:193-196 i en artikel benævnt "Solute Distributions and Trapping Efficiencies Observed in Freeze-Thawed Multilamellar Vesicles"

Ved den praktiske udøvelse af opfindelsen foretrækker man en klasse af li-30 posomer og en metode til deres dannelse, som udmærker sig ved at have en i det væsentlige ensartet fordeling af opløste stoffer i lamellerne. Denne klasse af liposomer benævnes som stabile plurilamellare vesikler (SPLV) som defineret i US patentskrift nr. 4.552.803, og klassen inkluderer de monofase- 3 DK 176010 B1 vesikler, som er beskrevet i US patentskrift nr. 4.588.578, samt frosne og optøede multilamellare vesikler (FATMLV) som beskrevet ovenfor.

En række forskellige steroler og disses vandopløselige derivater, såsom cho-5 lesterol-hemisuccinat, har været anvendt til fremstilling af liposomer, se især US patentskrift nr. 4 721 612. I den publicerede PCT-ansøgning nr. WO ! 85/00968 er beskrevet en fremgangsmåde, hvormed man kan reducere toxi-citeten af medikamenter ved at indkapsle disse i liposomer omfattende a-tocophenol og visse derivater deraf. Også en række forskellige tocopheroler 10 og deres vandopløselige derivater har været anvendt til dannelse af liposomer, se PCT-publikation nr. WO 87/02219 med titlen "Alpha Tocopherol-Based Vesicles" I et liposom-baseret system til afgivelse af et medikament er et bioaktivt mid-15 del, såsom et lægemiddel, indesluttet i liposomeme, som derefter indgives til patienten under behandling. I denne sammenhæng kan henvises til US pa-tentskrifteme nr. 3 993 754, nr. 4145 410, nr. 4 235 871, nr.4 224 179, nr.

4 522 803 og nr. 4 588 578. Hvis det bioaktive middel er lipofilt, kan det alternativt forbinde sig med lipid-dobbeltlaget. I forbindelse med den foreliggende 20 opfindelse skal udtrykket "indeslutning" opfattes som omfattende såvel medikamentet i liposomets væskevolumen som medikamentet forbundet med lipid-dobbeltlaget.

Mange medikamenter, som er nyttige til behandling af forskellige sygdomme, 25 viser sig at være toxiske over for patienten. Sådanne former for toxicitet kan være cardiotoxicitet, som det er tilfældet med antitumor-midlet doxorubicin, eller nephrotoxicitet, som det er tilfældet med aminoglycosid- eller polyen-antibiotika, såsom amphotericin B. Amphotericin B er et ekstremt toxisk anti-fungalt polyen-antibiotikum, som har vist sig at være det mest pålidelige mid- i 30 del til behandling af livstruende svampeinfektioner (Taylor et al., Am. Rev.

Respir. Dis., 1982,125:610-611. Eftersom amphotericin B er en hydrofobfor- i bindelse, er den uopløselig i vandige medier, og den er kommercielt tilgængelig som en kolloid dispersion i desoxycholat, som er et detergent, der be- i 4 DK 176010 B1 nyttes til at suspendere forbindelsen, og som i sig selv er toxisk. Methyleste-ren af amphotericin B og amphotericin B i sig selv har også vist sig at være aktive over for HTLV-lll/LAV-virus, som er et lipid-omsluttet retrovirus vist i ætiologien af erhvervet immundefekt-syndrom (AIDS) (Schaffner et al., Bio-5 chem, Pharmacol., 1986, 35:4110-4113). I denne undersøgelse har man sat ascorbinsyresaltet (vandopløseligt) af methylesteren af amphotericin B og amphotericin B i sig selv til separate kulturer af celler inficeret med HTLV-lll/LAV-virus, hvorefter man har undersøgt cellerne for replikation af dette virus. Resultaterne viste, at methylesteren af amphotericin B og amphotericin ! 10 B i sig selv beskyttede målcellerne imod de cytopatiske effekter af det pågældende virus, svarende til den virkning, som er eftervist for herpes-virus (Stevens et al., Arch. Virol., 1975, 48:391).

Fra litteraturen kendes rapporter, som beskriver anvendelsen af liposom-15 inkapslet amphotericin B. Juliano et al. (Annals N. Y. Acad. Sci., 1985, 446:390-402 diskuterer behandlingen af systemiske svampeinfektioner med liposomalt amphotericin B. Sådanne liposomer omfatter phospholipid, f.eks. dimyristoylphosphatidylcholin (DMPC) og dimyristoylphosphatidylglycerol (DMPG) i et molforhold på 7:1, samt cholesterol. Undersøgelser over akut 20 toxicitet (LD50) og forsøg in vitro, som har sammenlignet frit og liposom-indkapslet amphotericin B, viste lavere toxicitet ved anvendelse af de liposo-male præparater, samtidigt med, at den antifungale styrke i det væsentlige var uændret. Lopez-Berestein et al. (J. Infect. Dis., 1986, 151:704-710) har administreret liposom-indkapslet amphotericin B til patienter med systemiske 25 svampeinfektioner. Disse liposomer bestod af BMPC og DMPG i et molforhold på 7:3, og medikamentet var indkapslet med en effektivitet på over 90%.

Som et resultat af de liposomale medikamentbehandlinger med 5 moI-% amphotericin B reagerede 66% af patienterne favorabelt, idet svampeinfektionen enten helt eller delvist forsvandt. Lopez-Berestein et al. (J. Infect. Dis., 30 1983, 147:939-945). Ahrens et al., (S. Jour. Med. Vet. Mycol., 1984, 22:161- 166), Panosian et al. (Antimicrob. Agents Chemo., 1984 25:655-656) og Tremblay et al. (Antimicrob. Agents Chemo., 1984, 26:170-173) har også testet den komparative effektivitet af frit og liposomalt amphotericin B til be- 5 DK 176010 B1 handling og profylakse af systemisk candidiasis og leishmaniasis (panosian et al., supra) hos mus. Disse forskere fandt et forhøjet terapeutisk indeks med liposom-indkapslet amphotericin B ved behandling af candidiasis. I alle tilfælde fandt man, at væsentligt højere doser af amphotericin B kunne tolere-5 res, når medikamentet var indkapslet i liposomer. Amphotericin B-liposom-formuleringeme havde ringe eller slet ingen virkning ved behandling af leishmaniasis.

Proliposomer (lipid og medikament overtrukket på en opløselig bærer til dan-10 nelse af et granulært materiale) omfattende DMPC/DMPG, ergosterol og amphotericin B er også blevet fremstillet (Payne et al., J. Pharm. Sci., 1986, 75:330-333).

I andre undersøgelser har man sammenlignet en intravenøs behandling af 15 cryptococcosis i mus med liposomalt amphotericin B med en tilsvarende behandling med amphotericin B-desoxycholat (Graybill et al., J. Infect. Dis., 1982, 145:748-752). De mus, som var blevet behandlet med liposomalt amphotericin B, viste længere overlevelsestider, lavere indhold af cryptococci i vævet samt reduceret akut toxicitet. De multilamellare liposomer, som blev 20 anvendt ved disse undersøgelser, indeholdt ergosterol. Taylor et al. (Am.

Rev. Resp. Dis., 1982, 125:610-611 har behandlet histoplasmosis i mus med liposomalt amphotericin B, hvori liposomeme indeholdt ergosterol og phospholider. De liposomale præparationer var mindre toxiske og mere effektive til behandling af histoplasmosis, og de havde ændrede serum- og 25 vævsfordelinger (med lavere serum-niveauer og højere lever- og milt-koncentrationer) end de tilsvarende amphotericin B-præparationer.

I de ovenfor omtalte undersøgelser anvendte man lipid-holdige liposomer til at formindske toxiciteten af det indesluttede medikament, idet der var en ten-30 dens i retning af at forøge lipid-indholdet i formuleringerne med henblik på at opnå en stødpudevirkning over for medikamentets toxicitet. Det har overraskende vist sig, at et lavt lipid-indhold faktisk nedsætter toxiciteten mest effektivt. Ved dannelsen HDLC'er ifølge opfindelsen ved en MLV-metode kan 6 DK 176010 B1 der opstå en blandet population af HDLC'er med MLVer. Disse præparationer er sådanne, som indeholder fra omkring 5 til omkring 25 mol-% af medikamentet (amphotercin B), idet mængden af HDLC’er stiger, når mol-% af medikamentet forøges. De præparationer, som gør brug af ca. 25-50 mol-% 5 medikament, er i det væsentlige HDLC’er, som er uden indhold af liposomer.

Alternativt er de præparationer, som indeholder 5 mol-% af det hydrofobe medikament eller derunder, i det væsentlige liposomale præparationer med et vist indhold af HDLC'er. Den separation af HDLC'er fra heterogene populationer, som eventuelt er nødvendige, kan foretages ved anvendelse af en 10 hvilken som helst kendt separationsteknik, f.eks. densitetsgradientcentrifugering.

Processerne, som anvendes til dannelse af disse HDLC'er, kan være i det væsentlige de samme som anvendes til dannelse af liposomer, men i den 15 foreliggende opfindelse, hvor man anvender høje forhold imellem medikament og lipid, dannes der HDLC'er i højere mængder end liposomerne under en uventet stor reduktion af toxiciteten sammenlignet med de kendte liposomale formuleringer.

20 Opsummering af opfindelsen

Med den foreliggende opfindelse tilvejebringes HDLC-systemer (komplekser med høje forhold imellem medikament og lipid), som omfatter lipider og bioaktive forbindelser, herunder lægemidler. Sådanne HDLC'er kan omfatte 25 phospholider, såsom DMPC og DMPG, fortrinsvis i et molforhold på 7:3, eller mættede phospholipider eller fedtsyre-phospholipider. Det bioaktive middel er fortrinvis et lægemiddel, såsom et antifungalt medikament, eksempelvis nystatin eller amphotericin B. Det pågældende medikament er fortrinsvis til stede i en mængde på mellem ca. 6 og ca. 50 mol-%, fortrinsvis mellem 30 30 og 50 mol-%. Farmaceutiske midler indeholdende HDLC'er, som fortrinsvis omfatter et lægemiddel såsom amphotericin B, fremstilles ved hjælp af farmaceutisk acceptable bærestoffer eller fortyndingsmidler, og disse farmaceutiske midler kan indgives parenteralt. Sådanne midler benyttes til behandling 7 DK 176010 B1 af infektionssygdomme, såsom svampeinfektioner, ved administration til pattedyr, herunder mennesker. De HDLC-holdige midler ifølge opfindelsen omfatter sådanne sammensætninger, som i det væsentlige er uden indhold af liposomer, som indkapsler medikamentet. Generelt indeholder de højst ca.

5 10 vægt-% lipid, fortrinsvis højst ca. 5 vægt-% lipid, især højst ca. 3% lipid.

Den foreliggende opfindelse anviser også en fremgangsmåde til fremstilling af en HDLC sammensætning som angivet i krav 18-24 10 I det følgende beskrives forskellige metoder til fremstilling af de omhandlede HDLC'er. F.eks. omtales teknikker, hvor man først solubiliserer medikamentet, især amphotericin B, i et opløsningsmiddel såsom dimethylsulfoxid (DMSO) eller methanol. Lipidet (fortrinsvis DMPC/DMPG i et molforhold på 7:3) solubiliseres i et opløsningsmiddel, såsom methylencholid, hvorefter li-15 pid-og medikamentopløsningeme blandes. Opløsningsmidlerne kan afdam-pes under reduceret tryk, hvilket resulterer i en tynd lipid-medikament-film.

Denne film kan hydratiseres i en vandig opløsning, såsom saltvand, PBS eller glycin-puffer, hvorved der dannes HDLC'er. Alternativt kan man sætte den vandige opløsning til den opløsningsmiddelholdige medikament- og lipid-20 fase, inden man afdamper opløsningsmidlet. Som et andet alternativ kan man resuspendere den resulterende tørre lipid-medikament-film i et opløsningsmiddel, såsom methylenchlorid, hvorefter man atter kan inddampe under reduceret tryk, inden man hydratiserer filmen. Man kan endvidere anvende en dehydratiseringsprocedure. Ved en sådan proces dehydratiserer man 25 en tør lipid-medikament-film under dannelse af en tynd flage, som hydratiseres ved hjælp af en vandig opløsning.

Ved en alternativ metode til dannelse af de omhandlede HDLC'er dannes lipid-partikler (eller liposomer) indeholdende et bioaktivt middel (et medika-30 ment, f.eks. en antifungal polyen-forbindelse såsom amphotericin B), som er fremstillet ved MLV-processen, og som indeholder omkring 6-50 mol-% amphotericin B, hvorefter partiklerne (eller liposomeme) underkastes en opvarmningscyklus ved omkring 25-60 °C, fortrinvis ved omkring 60 °C. Ved en 8 DK 176010 B1 i sådan cyklus dannes et amphotericin B/lipid-kompleks af højere orden og med ringere toxicitet.

Ifølge et andet aspekt ved den foreliggende opfindelse anvender man en ab-5 sorbansspektrum-teknik til at bestemme toxiciteten af et medikament-lipid-kompleks (hvor medikamentet eksempelvis er en antifungal polyen-forbindelse såsom amphotericin B). Absorbansspektret for et medikament er specifikt for det pågældende medikament, idet medikamentets signatur kan være en top eller en serie af toppe i det ultraviolette eller det synlige område.

10 Signatur-toppen for amphotericin B (som er vist på fig. 12 i deoxycholat- j opløsning) er mellem 300 og 500 nm og har karakteristiske toppe, hvoraf den mest repræsentative viser sig ved 4013 nm. Man kan svække denne top ved at kompleksbinde medikamentet med lipid, hvilket kan udnyttes kvantitativt som et mål for toxiciteten af HDLC. Med andre ord kan graden af toxicitet 15 bestemmes ud fra intensiteten (højden) af absorbanstoppen.

Med opfindelsen tilvejebringes også en proces til fyldning af liposomer, hvorved medikamentet, især polyen-antibiotiket amphotericin B, dispergeres ved sonisk behandling i et opløsningsmiddel, såsom ethanol, hvortil der er sat en 20 syre, såsom saltsyre. En lipid-film, specielt omfattende DMPC og DMPG i et molforhold på omkring 7:3, hydratiseres med en vandig opløsning, især en vandig puffer, såsom PBS, hvorefter en prøve af den sure ethanolopløsning, som indeholder medikamentet, fyldes påliposomeme, hvilket gøres ved simpelthen at sætte opløsningen til liposom-præparationen. Derefter fjerner man 25 ethanolet fra den resulterende suspension og resuspenderer opløsningen i en vandig opløsning. I afhængighed af molforholdet imellem medikamentet og lipidet favoriserer processen en dannelse af HDLC'er i stedet for liposomer. Når indholdet af medikamentet eksempelvis overstiger 16 mol-%, dannes der således flere HDLC'er end liposomer. Hvis der omvendt er tale om et 30 indhold af medikament på 0-15 mol-%, favoriserer processen dannelse af liposomer. Liposomer eller HDLC’er fremstillet ved denne påfyldningsproces under anvendelse af surt ethanol kan udformes således, at de kan anvendes som farmaceutiske midler, gennem tilsætning af farmaceutisk acceptable t 9 DK 176010 B1 bærestoffer eller fortyndingsmidler. Disse farmaceutiske midler kan anvendes til behandling af svampeinfektioner ved indgivelse til pattedyr, herunder mennesker.

5 Kort beskrivelse af teoninoeme

Fig. 1 er en grafisk afbildning, der viser den akutte toxicitet målt ved LD50 som en funktion af molprocenten af amphotericin B i præparationen.

10 Fig. 2 er et spektrum (differential scanning kalorimetri) af en liposomal (MLV) præparation indeholdende 5 mol-% amphotericin B.

Fig. 3 er et spektrum (differential scanning kalorimetri) af en HDLC-præparation (MLV-processen), der indeholder 25 mol-% amphotericin B.

15

Fig. 4 er en grafisk afbildning af en isopyknisk gradient af multilamellare lipo-somer indeholdende 5 mol-% amphotericin B. Den fuldt optrukne linie er lipi-det, og den stiplede linie er amphotericin B.

20 Fig. 5 er en grafisk afbildning af en isopyknisk gradient af HDLC’er (MLV-processen) fremstillet med 50 mol-% amphotericin B. Den fuldt optrukne linie er lipidet, og den stiplede linie er amphotericin B.

Fig. 6 er grafiske afbildninger af røntgen diffraktionsdata for liposom- og 25 HDLC-præparationer (MLV-processen), som indeholder henholdsvis 5 og 50 mol-% amphotericin B.

Fig. 7 viser 31P-NMR-spektre for HDLC-præparationer (MLV-processen), som indeholder 25 og 50 mol-% amphotericin B.

30

Fig. 8 viser 31P-NMR-spektre for liposom-præparationer (MLV-processen), der indeholder 0 og 5 mol-% amphotericin B.

10 DK 176010 B1

Fig. 9 er en grafisk afbildning af en isopyknisk densitetsgradient af amphotericin B holdige liposomer dannet ved processen med sur ethanol, hvilke lipo-somer indeholder 5 mol-% amphotericin B. Den fuldt optrukne linie er lipidet, mens den stiplede linie er amphotericin B.

5

Fig. 10 er et absorbansspektrum af fri amphotericin B opløst i deoxycholat.

Fig. 11 viser absorbansspektre af 5 mol-% amphotericin B (a) 25 mol-% amphotericin B (b), 25 mol-% amphotericin B efter opvarmning (c) og 50 mol-10 % amphotericin B (d) i 7:3 DMPC/DMPG.

Fig. 12 er et absorbansspektrum af 25 mol-% amphotericin B i 7:3 DMPC/DMPG, såvel før (a) som efter (b) opvarmning til 60 0 C i 10 minutter.

15 Fig. 13 er et DSC-spektrum af 7:3 DMPC/DMPG indeholdende 25 mol-% amphotericin B, såvel før (a) som efter (b) en varmecyklus, sammenlignet med spektret af ren DMPC/DMPG (c).

Fig- 14 er et 31P-NMR-spektrum af komplekser af 7:3 DMPC/DMPG indehol· 20 dende 25 mol-% amphotericin B, såvel før (a) som efter (b) en varmecyklus ved 60 °C.

Fig. 15 er en grafisk afbildning, som viser indflydelsen af ionstyrken på optagelsen af amphotericin B i DMPC/DMPG-liposomer.

25

Fig. 16 viser indvirkningen af inkubationstemperaturen på hastigheden af amphotericin B-optagelsen i DMPC/DMPG-liposomer.

Fig. 17 viser liposom-strukturens indflydelse på optagelsen af amphotericin B 30 i MLV'er eller LUV'er af DMPC/DMPG.

Med opfindelsen tilvejebringes ikke-liposomale komplekser med et højt forhold imellem medikament og lipid (HDLC'er) med enestående egenskaber 11 DK 176010 B1 samt metoder til deres fremstilling. Disse HDLC'er indeholder et bioaktivt middel, såsom en hydrofob forbindelse, som, når de omhandlede HDLC'er indgives til en organisme, kan have en i det væsentlige lige så høj eller højere effektivitet og en lavere toxicitet i sammenligning med det tilsvarende me-5 dikament indgivet i enten fri eller liposomal form. Sådanne HDLC'er har et højt molforhold imellem medikament og lipid (over ca. 5 mol-% medikament).

Med den foreliggende opfindelse vises det overraskende, at komplekser, der indeholder mindre lipid, såsom de omhandlede HDLC-systemer, har nedsat toxicitet i sammenligning med liposomale systemer. Opfindelsen involverer 10 HDLC-formuleringer til brug som bærersystemer for medikamenter, såsom de antifungale polyen-antibiotika amphotericin B og nystatin. I modsætning til de hidtil kendte formuleringer er de omhandlede formuleringer stabile i vandige opløsninger, såsom saltvand.

15 Med opfindelsen tilvejebringes også en hidtil ukendt metode til fyldning af liposomer, hvorved liposomerne fyldes ved indkapsling af et medikament via et intermediær! opløsningsmiddel. Dette opløsningsmiddel har de egenskaber, at det solubiliserer den bioaktive forbindelse, såsom amphotericin B, at det ikke nedbryder liposomernes membran-struktur, og at det er kompatibelt 20 med vandige opløsningsmidler. Et sådant intermediært opløsningsmiddel er ethanol. Den omhandlede metode forløber uden anvendelse af organiske opløsningsmidler. I afhængighed af molprocenten af medikament, som anvendes i præparationen, vil der dannes HDLC'er i stedet for liposomer. I de tilfælde, hvor en dannelse af HDLC'er favoriseres, vil processen fylde disse 25 HDLC'er med medikamentet.

HDLC’er refererer til medikament-associeret lipid i partikelform, idet sådanne partikelformer af natur er ikke-liposomale. Når de dannes gennem en MLV-proces, er sådanne HDLC'er eksempelvis karakteriseret ved (1) fryse-fraktur 30 elektronmikrografi (Deamer et al., Biochim. Biophys. Acta, 1970, 219:47-60). som viser ikke-liposomale komplekser; (2) måling af indkapslet volumen (Deamer et al., Chem. Phys. Lipids, 1986, 40:167-188), som i det væsentlige viser indkapslingsvolumener i nærheden af nul og derfor er ikke-liposomale; 12 DK 176010 B1 (3) differential scanning kolorimetri (DSC) (Chapman, D., i "Liposome Technology", gregoriadis, G., (red.) 1984 CRC Press, Boca Raton), som viser at der ikke er nogen præ-overgangsfase eller overgang af lipid-dobbeltlaget; (4) 31P-NMR-spektre (Cullus et al., 1982 i "Membrane Fluidity in Biology", Aca-5 demic Press, INc., London & N.Y.), som antyder karakteristika af stærkt im-mobiliserede lipider (bred isotropi) og (5) røntgendiffraktionsdata (Shipley et al., i "Biomembranes", 1973, redigeret af Chapman, D. og Wallach, D., Vol.

2:1, Academic Press, Inc. London & N.Y.), som indikerer et gelfase-lipid.

Hvad der ligeledes er karakteristisk ved disse systemer, at der sker en fuld-10 stændig association af medikamentet til lipidet, hvilket lader sig eftervise ved densitetsgradient-centrifugering. Ved denne teknik centrifugeres gradienten under en forhøjet kraft (omkring 230.000 x g) i omkring 24 timer. Dette sikrer, at alle komponenterne i gradienten når de positioner, hvor deres densitet er i ligevægt. Elueringsprofilerne af disse systemer viser en overlapning imellem 15 toppene for medikament og lipid, hvilket indikerer, at hele mængden af medi kamentet er associeret med lipidet.

Et af aspekterne ved den foreliggende opfindelse er et forhold imellem medikament og lipid, som fører til HDLC'er, der resulterer i en i det væsentlige 20 ækvivalent eller højere effektivitet af medikamentet under samtidig nedbringelse af den akutte toxicitet som målt ved LD50 i mus (fig. 1). Det har vist sig, at et indhold af det hydrofobe medikament på ca. 6-50 mol-% imødekommer disse krav, idet det foretrukne forhold er mellem ca. 15 og ca. 50, fortrinsvis mellem ca. 25 og ca. 50, især mellem 25 og 35 mol-% af det hydrofobe me-25 dikament. Når koncentrationen af medikamentet overstiger omkring 6 mol-% og nærmer sig 25 mol-%, dannes der blandede populationer af liposomer og HDLC'er. Når molprocenten af medikamentet inden for dette område nærmer sig 25, er en forholdsvis større del af strukturerne HDLC'er og ikke liposomer.

Ved koncentrationer af medikamentet på omkring 5 mol-% og derunder og 30 ned til en lavere lipid-grænse, der for fagfolk er kendt som den "kritiske micel-le-koncentration”, er der blandede HDLC-liposom-populationer, men i det væsentlige liposomale strukturer, til stede. Sådanne liposomer kan dannes ved den nye "ethanol-mellemprodukt-proces" ifølge opfindelsen.

13 DK 176010 B1

Karakteristisk for de ovennævnte HDLC’er er forskellige medikament-lipid-dispersioner, som observeres efter densitetscentrifugering. Hvis man separerer medikament-lipid-komplekset (DMPC/DMPG i et molforhold på 7:3) påi-5 sopykniske saccharosedensitetskolonner, observerer man en dannelse af bånd, som afhænger af forholdet imellem medikament og lipid og af fremstillingsmetoden. I systemer, som omfatter 5 mol-% medikament fremstillet ved MLV-processen, observerer man 2 hovedbånd, af hvilke det ene skyldes li-posomeme, mens det andet skyldes medikament associeret med lipidet 10 (HDLC'er). De præparationer, som indeholder 25 og 50 mol-% af medikamentet, viser et enkelt bånd, hvori størstedelen af medikamentet er knyttet til lipidet. Det har overraskende vist sig, at disse systemer, som har et lavere indhold af lipid og et højere indhold af medikament, er mindre toxiske. Fig. 1 viser LD5o-værdier (mg/kg) i mus som funktion af den molprocent, hvormed 15 medikamentet amphotericin B indgår i præparationen. LDso-værdieme stiger ved et indhold af medikament på mellem 5 og 50 mol-%, hvorefter der sker et fald ved 60 mol-%. Afbildningen viser også LD50-værdien forden kommercielt tilgængelige form af dette medikament, som er benævnt Fungizone, ved et indhold påomkring 3,5 mg/kg. En blodcellelysering (hæmolyse) in vitro de-20 monstrerer det samme toxicitetsfænomen.

Undersøgelser af det indkapslede volumen (indkapsling af opløst stof i μΙ pr. pmol lipid) foretaget på MLV-præparationer med medikament-lipid-associationer med forskellige indhold af medikament demonstrerer den 25 usædvanlige natur af de formuleringer, som indeholder 25 mol-% medikament og derover (HDLC). Disse systemer indeslutter ikke noget opløst stof og er derfor ikke liposomale. Frysefraktur-elektronmikrografiske afbildninger af de samme systemer viser liposomer ved 0 og 5 mol-% medikament, men ikke-liposomale HDLC'er ved 25 og 50 mol-% medikament.

30

Undersøgelser foretaget på MLV-præparationer ved differential scanning ka-lorimetri med forskellige procentvise indhold af medikament efterviser de samme fænomener. Det betyder, at spektrene viser overgangstoppe, som er 14 DK 176010 B1 karakteristiske for lipidet i ikke-pertuberet dobbeltlagstilstand, ved et medikamentindhold på 5 mol-% (fig. 2), men ikke nogen overgangstop ved 25 mol-% medikament (fig. 3). Når der er tale om 25 mol-% medikament, er hele lipid-mængden fuldstændigt associeret med medikamentet, hvilket vil sige, at 5 lipidets acyl-kæder ikke er frie, og at de derfor ikke kan undergå en kooperativ overgang. Disse data bekræfter de ved densitetscentrifugering opnåede data, som viser en dobbelttop for lipid-associeret medikament og for frit lipid ved en medikamentkoncentration på 5 mol-% (fig. 6), men kun en enkelt top, når hele mængden af lipid er knyttet til medikamentet ved koncentrationer af 10 medikamentet på 25 og 50 mol-% (fig. 5).

Røntgendata ved 5 mol-% (MLV-processen) viser gelfase-lipid ved lave temperaturer, idet der ses en overgang til flydende krystallinsk fase ved den karakteristiske temperatur på 23 °C. Ved en medikamentkoncentration på50 15 mol-% er lipidet imidlertid i gelfase ved alle temperaturer; der ses ikke nogen overgang, som skyldes, at hele mængden af lipid er i tæt association med medikamentet (fig. 6) tilsvarende data for 31P-NMR-undersøgelseme viser, at der mangler et frit lipid-signal for disse højere molprocenter (25 og 50 mol-% HDLC’er). De for denne type lipid karakteristiske signaler (en "skulder" ved 20 lavt felt og en top ved højt felt) mangler (fig. 7), mens de er synlige i prøverne med 0 og 5 mol-% medikament (fig. 8).

Selvom lipid-kompleks-systemer med deres tilknyttede høje medika-ment/lipid-forhold udgør et af aspekterne ved den foreliggende opfindelse, 25 kan man også anvende liposom-dannende procedurer til fremstilling af disse lipid-komplekser. Nærmere bestemt inkluderer disse procedurer sådanne, . som fører til liposomer, der kendes som multilamellare vesikler (MLV). Andre processer, som kan anvendes, er de processer, som danner stabile plurilamellare vesikler (SPLV), store unilamellare vesikler dannet ved 30 ekstrudering (LUVET'er) eller andre liposom-dannende procedurer, som er velkendte for fagmanden. Fremgangsmåden til dannelse af SPLV'er er beskrevet i US patentskrift nr. 4 522 803, og LUVET-proceduren er beskrevet i internationale patentansøgning nr. PCT7WO86/00238. Ifølge opfindelsen dannes liposomeme i vandig opløsning, hvortil man sætter medikamentet, 15 DK 176010 B1 meme i vandig opløsning, hvortil man sætter medikamentet, der skal ind-kapsles, i ethanol tilsat syre. Ifølge en anden udførelsesform for opfindelsen inkorporerer man amphotericin B i liposomeme via et vandigt mellemprodukt.

Ved denne teknik suspenderer man amphotericin B i en vandig opløsning, 5 f.eks. destilleret vand, ved sonisk behandling. Det suspenderede medikament blandes derefter med en suspension af lipidet i vandig opløsning, såsom rent vand eller en natriumchloridopløsning. Blandingen inkuberes ved en temperatur svarende til overgangstemperaturen for det anvendte lipid eller derover, hvorved der dannes FMLV'er.

10

Lipideme, som (1) kan anvendes til fremstilling af lipid-komplekseme, og som (2) udnyttes i den nye liposom-dannelsesteknik ifølge opfindelsen er phospholipider såsom phosphatidylcholin (PC), phosphatidylethanolamin (PE), phosphatidylserin (PS), phosphatidylglycerol (PG), phospatidinsyre 15 (PA), phosphatidylinositol (PI), sphingomyelin (SPM) og lignende, enten ale ne eller i kombination. Man kan også anvende mættede phospholipider, såsom hydrogeneret soja-PC. Phospholipideme kan være syntetiske, eller de kan være afledt af naturlige kilder, såsom æg eller soja. Som yderligere eksempler på lipid-sammensætninger kan nævnes de mættede fedtsyrer, så-20 som myristinsyre. Ved de foretrukne udførelsesformer anvender man phospholipideme dimyristoylphosphatidylcholin (DMPC) og dimy-ristoylphosphatidylglycerol (DMPG) i kombination i et hvilket som helst molforhold fra omkring 99:1 til omkring 1:99 DMPC/DMPG, fortrinsvis i et molforhold på omkring 7:3. Man kan også anvende DMPC og dimyristoylphosphati-25 dylserin (DMPS) i kombination. Det er imidlertid også muligt at anvende DMPC alene. Lipid-komplekseme og liposomeme kan også indeholde en steroid-komponent som del af lipidfasen, og sådanne steroider kan være cholesterol, polyethylenglycol-derivater af cholesterol (PEG-cholesteroler), coprostanol, cholestanol, cholestan, organiske syrederivater af steroler, så-30 som cholesterol-hemisuccinat (CHS) og lignende. Man kan også anvende organiske syrederivater af tocopheroler som kompleks- eller liposom-dannende ingredienser, såsom α-tocopherol-hemisuccinat (THS). Både CHS- og THS-holdige komplekser og deres tris-saltformer kan generelt frem- 16 DK 176010 B1 stilles ved en hvilken som helst kendt metode til fremstilling af liposomer, som indeholder disse steroler. Der kan især henvises til procedurerne beskrevet i US patentskrift nr. 4 721 614 og i international patentansøgning nr. PCT/US87/02219.

5

Bioaktive forbindelser, såsom lægemidler, kan anvendes i forbindelse med den foreliggende opfindelse. Når der er tale om HDLC'er, er de anvendte bioaktive forbindelser hydrofobe, mens de bioaktive forbindelser, når der er tale om liposomer, enten kan være hydrofobe eller hydrofile, eftersom lipo-10 somer indeslutter begge typer af forbindelser. Sådanne bioaktive forbindelser omfatter (men er ikke begrænset til) polyen-antibiotika, såsom de antifungale midler pimaricin, candicidin, filipin og fortrinsvis nystatin og amphotericin B.

Andre bioaktive forbindelser, som kan anvendes, omfatter (men er ikke begrænset til) antibakterielle forbindelser såsom aminoglycosider, f.eks. genta-15 mycin, antivirale forbindelser såsom rifampacin, anti-parasitiske forbindelser såsom antimon-derivater, antineoplastiske forbindelser såsom vinblastin, vin-cristin, mitomycim C, doxorubicin, daunorubicin, methotrexat og cisplatin, « proteiner såsom albumin, toxiner såsom difteri-toxin, enzymer såsom katala-se, hormoner såsom østrogener, neurotransmittere såsom acetylcholin, li-20 poproteiner såsom alpha-lipoprotein, glycoproteiner såsom hyaluronsyre, immunoglobuliner såsom IgG, immunomodulatorer såsom interferoner eller interleukiner, farvestoffer såsom Arsenazo III, forbindelser til radiomærkning såsom 14C, forbindelser til frembringelse af radio-uklarhed såsom ^Te, fluorescerende forbindelser såsom carboxyfluorescein, polysaccharider såsom 25 glycogen, cellereceptor-bindende molekyler såsom østrogen-receptor-protein, ikke-steroide antiinflammatoriske midler såsom indomethacin, sali-cylsyreacetat, ibuprofen, sulindac, piroxicam og naproxen; antiinflammatoriske midler såsom dexamethason, antiglaucoma-midler såsom timolol eller pilocarpin, anæstetika såsom dibucain, necleinsyrer såsom thymin, poly-30 nucleotider såsom RNA-polymerer, cardiovaskulære midler såsom a-blokkere, β-blokkere, calcium-kanal-blokkere, ACE-inhibitorer og lignende, CNS-midler og prostaglandiner.

i 17 DK 176010 B1

Under fremstillingen af de omhandlede HDLC'er kan man, lige som ved den generelle fremstilling af liposomer, anvende organiske opløsningsmidler. Egnede organiske opløsningsmidler er sådanne, som har intermediære polariteter og dielektriske egenskaber (d.v.s. en polaritet, som ligger midt imellem de 5 modsatte elektriske ladninger), og som solubiliserer lipider, og de omfatter (men er ikke begrænset til) chloroform, methanol, dimethylsulfoxid (DMSO), methylenchlorid og opløsningsmiddelblandinger såsom chloroform/methanol (70:30) og benzen/methanol (70:30). Som et resultat heraf dannes opløsninger, som er defineret som blandinger, hvori komponenterne er ensartet for-10 delt, og som indeholder lipideme. Opløsningsmidlerne udvælges fortrinsvis på basis af deres bioforligelighed, på basis af lav toxicitet og under hensyn til vanskelig antændelighed. Når man skal solubilisere medikamentet, især amphotericin B, foretrækker man DMSO, eftersom medikamentet lettest opløses i DMSO. Man kan dog anvende methanol i stedet for DMSO, men her-15 ved forøger man opløsningsmidlets volumen. Når man skal solubilisere lipi-det, anvender man fortrinsvis methylenchlorid, fordi dette opløsningsmiddel udviser ringe toxicitet over for mennesker. Ifølge opfindelsen er de foretrukne opløsningsmidler ethanol og vandige opløsninger.

20 Under hydratiseringstrinnet af HDLC-dannelse kan man anvende vandige opløsninger, såsom destilleret vand (eksempelvis USP-vand til injektion), saltvand eller vandige puffere. De anvendelige vandige puffere omfatter (men er ikke begrænset til) pufferholdigt saltvand, såsom phosphatpufferholdigt saltvand ("PBS"), tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-hydrochlorid ("tris") eller 25 glycin-puffere med pH-værdier på omkring 7,0-7,5, fortrinsvis 7,2.

Under dannelse af de omhandlede HDLC’er eller de hidtil ukendte liposomer kan man gennemføre et sonikeringstrin. En sådan procedure foretages i et bad i omkring 15-30 minutter ved 25 °C og ved ca. 50-60 Hz.

30

De dannede HDLC'er eller liposomer kan inddeles efter størrelse ved ekstru-dering igennem et filter i overensstemmelse med proceduren beskrevet i international patentansøgning nr. PCT/US88/00238. Ved en sådan procedure 18 DK 176010 B1 bliver det muligt at danne homogene populationer af partikler med hensyn til størrelsen. F.eks. kan filtreringen af HDLC'er gennemføres igennem et membranfilter med bugtede eller retlinjede kanaler, såsom et polycarbonatfilter.

5 De ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen dannede HDLC'er eller liposo-mer kan underkastes en lyophilisering eller en dehydratisering på forskellige trin af dannelsesprocessen. F.eks. kan man lyophilisere lipid-filmen efter fjernelse af opløsningsmidler, men før tilsætning af medikamentet. Alternativt kan man lyophilisere lipid-medikament-filmen, inden man hydratiserer de 10 omhandlede HDLC'er eller liposomer. En sådan dehydratisering kan gennemføres ved at udsætte de omhandlede lipider, HDLC'er eller liposomer for et reduceret tryk, hvorved man fjerner hele mængden af suspenderende opløsningsmiddel. Alternativt eller i tilslutning hertil kan den endelige hydratise-rede HDLC- eller liposom præparation også dehydratiseres ved, at man an-15 bringer den i et omgivende medium i flydende nitrogen og nedfryser den forud for dehydratiserings trinnet. Dehydratisering under forudgående frysning kan foretages i nærværelse af en eller flere beskyttende sukkerarter i præparationen i overensstemmelse med teknikken beskrevet i international patentansøgning nr. PCT/US86/01103 eller teknikken beskrevet i US patentskrift 20 nr. 4 229 360. Sådanne teknikker forøger langtidsholdbarheden og stabiliteten af præparationerne. Andre egnede metoder, som kendes nu eller opdages senere, kan anvendes i forbindelse med dehydratiseringen af de ovenfor beskrevne lipid-kompleks-præparationer.

25 En af metoderne til dannelse af de omhandlede HDLC'er er en MLV-procedure, hvori den bioaktive forbindelse (eksempelvis et lægemiddel) opløses i methanol i en kolbe, hvortil der derefter sættes et lipid, såsom DMPC og DMPG i et molforhold på ca. 2:3 i chloroform. Efter rotationsinddampning af opløsningen ved reduceret tryk resuspenderes den tørrede film i PBS og 30 sonikeres i et bad (ved omkring 25 °C i ca. 30 minutter, ca. 50-60 Hz) indtil klarhed. Ved molforhold imellem medikament og lipid på ca. 6 og derover (op til omkring mol-%) er præparationerne ikke-liposomale HDLC-strukturer, som i det væsentlige er uden indhold af liposomer. HDLC-præparationernes toxi- 19 DK 176010 B1 citet er afhængig af forholdet imellem medikament og lipid, idet præparationer med højere medikament/lipid-forhold (omkring 16-50 mol-% medikament) udviser en mindre akut toxicitet end præparationer med lavere forhold (omkring 6-15 mol-% medikament). Som omtalt ovenfor er de præparationer, 5 som indeholder op til omkring 5 mol-% medikament, i det væsentlige liposo-male.

En anden metode er en modificeret MLV-procedure, hvorved den ovenfor producerede medikament-lipid-film tørres i en glasklokke under reduceret 10 tryk til frembringelse af en flage af medikament og lipid. Denne flage pulveriseres til et pudder, som hydratiseres homogent, når der tilsættes en vandig opløsning. Denne procedure involverer, at medikamentet opløses i et organiske opløsningsmiddel, såsom DMSO eller methanol, og at opløsningen derefter blandes med et lipid (fortrinsvis DMPC/DMPG i et molforhold på 7:3) i 15 methylenchlorid. Derefter tørres blandingen under reduceret tryk til en film, som derefter underkastes tørring, eksempelvis i en glasklokke, under reduceret tryk. Det resulterende tørre pudder hydratiseres med saltvand og opvarmes til opnåelse af en medikament-lipid-suspension. Som omtalt i det foregående afhænger dannelsen af HDLC'er, liposomer og blandinger deraf, så-20 vel som den ledsagende grad af toxicitet, af forholdet imellem medikament og lipid.

Man kan anvende andre metoder til dannelse af HDLC'er. En sådan metode er en SPLV-procedure, hvori medikamentet opløses i et opløsningsmiddel 25 såsom DMSO. Et lipid (såsom DMPC/DMPG i et molforhold på 7:3) i et op- løsningsmiddel (eksempelvis chloroform eller methylenchlorid) tørres til en | tynd film under reduceret tryk, hvorefter der sættes et organisk opløsningsmiddel, såsom methylenchlorid, til lipidet. En prøve af medikamentet (eksempelvis amphotericin B) i opløsning sættes til lipid-suspensionen, hvorefter 30 den resulterende blanding underkastes en sonisk behandling indtil klarhed.

Der tilsættes en pufferholdig vandig opløsning (eksempelvis pufferholdigt saltvand), hvorefter blandingen atter anbringes under reduceret tryk for at fjerne methylenchloridet. Den pasta, som herved bliver tilbage, hydratiseres i i 20 DK 176010 B1 yderligere med PBS og sonikeres til klarhed. Ligesom ved den ovennævnte procedure vil den resulterende præparation være en HDLC-præparation eller en liposomalpræparation i afhængighed af det anvendte molforhold imellem medikament og lipid. Hos mus, som har fået indgivet denne præparation, har 5 LDso-værdieme udvist lavere toxiciteter, når medikament-lipid-forholdene var højere.

En anden metode er en modificeret SPLV-procedure, hvorved medikamentet i et organisk opløsningsmiddel (eksempelvis DMSO) blandes med lipid (ek-10 sempelvis DMPC/DMPG) i opløsning, hvorefter der tilsættes en pufferholdig ' vandig opløsning (eksempelvis PBS). Opløsningsmidlet afdampes derefter under nitrogen, samtidigt med, at der gennemføres en sonisk behandling.

Der tilsættes en yderligere mængde PBS, hvorefter den resulterende opløsning filtreres, fortrinsvis igennem et 5 pm filter, og centrifugeres ved omkring 15 10.000 x g i omkring 10 minutter. Supematant-opløsningen fjernes og bort hældes, hvorefter bundfaldet resuspenderes i et vandigt opløsningsmiddel (PBS). Efter endnu en "udvaskning" ved centrifugering resuspenderes det resulterende bundfald i PBS. Ligesom ved de ovenfor beskrevne præparationer har den akutte toxicitet direkte relation til forholdet imellem medikament 20 og lipid, hvilket vil sige, at jo højere forholdet imellem medikament og lipid er (op til omkring 60 mol-% medikament), jo mindre toxisk er præparationen.

Der findes også en SPLV-metode, hvorved medikament, opløsningsmiddel og lipidopløsning blandes som ovenfor, men hvor der tilsættes vand til injek-25 tionsbrug (USP) i stedet for saltvand, hvorefter den resulterende suspension opvarmes til 37 °C. Opløsningsmidlet afdampes atter under nitrogen, mens der foretages en sonisk behandling, og der tilsættes mere vand, hvorefter suspensionen holdes ved 37 °C i ca. 10 minutter. Det resulterende præparat sterilfiltreres igennem et filter med en porestørrelse på 0,1 eller 0,15 pm un-30 der anvendelse af LUVET-metoden. Denne metode er en extruderingsproce-dure, hvorved liposomeme dannes ved filtrering under tryk på omkring 50 kg/cm2, og den er beskrevet i international patentansøgning nr. PCT/US86/00238. Sådanne præparationer kan også dehydratiseres ved an- 21 DK 176010 B1 vendelse af metoden beskrevet i international patentansøgning nr. PCT/US86/01103. Afprøvninger med hensyn til akut toxicitet viser også her den forbedrede virkning af et højt forhold imellem medikament og lipid på medikamentets toxicitet.

5

Endnu en metode, som skal nævnes, involverer at man opløser medikamentet i sur vandig ethanol under sonisk behandling. Et lipid (eksempelvis DMPC/DMPG i et molforhold på 7:3) opløst i et opløsningsmiddel (eksempelvis benzen/methanol) lyofiliseres og blandes derefter med et vandigt opløs-10 ningsmiddel (eksempelvis PBS), hvorefter man tilsætter opløsningen af sur alkohol og medikament og omrører blandingen ved stuetemperatur. Den resulterende præparation bliver derefter lyofiliseret og rehydratiseret ved hjælp af en vandig puffer. Alternativt kan man afdampe opløsningsmidlet, hvilket efterlader en lipid-medikament-film, som kan hydratiseres med en vandig 15 opløsning. Også her er lavere akutte toxiciteter associeret med præparater med højere forhold imellem medikament og lipid. Når man anvender en medikamentkoncentration på omkring 5 mol-% og derunder, fører processen fortrinsvis til liposomer i modsætning til anvendelsen af omkring 6 mol-% og derover, som fortrinsvis fører til HDLC’er. Centrifugering af præparationen på 20 en densitetsgradient bekræfter, at hele lipidmængden er associeret med medikamentet. Præparationen kan derefter lyofiliseres, hvorved man fjerner ethanolen, og rehydratiseres i en vandig opløsning, såsom destilleret vand.

Ifølge en anden liposom-dannende udførelsesform for opfindelsen inkorpore-25 rer man amphotericin B i liposomer via et vandigt mellemprodukt. Ved denne teknik suspenderer man amphotericin B i en vandig opløsning, f.eks. destilleret vand, ved sonikering. Det suspenderede medikament blandes derefter med en suspension af lipid i vandig opløsning, såsom destilleret vand eller saltvand. Blandingen inkuberes ved det anvendte lipids overgangstemperatur 30 eller derover, idet der herved dannes MLV’er.

De ovenfor omtalte præparationer med højt molforhold imellem amphotericin B og lipid menes at udvise en lav toxicitet på grund af forøgede vekselvirk- 22 DK 176010 B1 ninger imellem amphotericin B-molekyler i lipid-matricen. Dette kan demonstreres ved absorbansspektroskopi. F.eks. er absorbansen ved 413 nm, som skyldes frit amphotericin B i deoxycholat, større end den absorbans, som iagttages for ikke-opvarmet 5 mol-% amphotericin B i lipid. Endvidere er ab-5 sorbansen af 25 mol-% amphotericin B større end den absorbans, som udvises af 50 mol-% amphotericin B i lipid (se fig. 10).

Man benytter teknikken med absorbansspektre til at bestemme toxiciteten af et medikament-lipid-kompleks (hvor medikamentet eksempelvis er amphote-10 ricin B). Absorbansspektret af et medikament er specifikt for det pågældende medikament. Signaturen af amphotericin B (vist påfig. 12 i opløsning i deoxycholat) er mellem 300 og 500 nm og har karakteristiske toppe, af hvilke den mest repræsentative viser sig ved 413 nm. Man kan dæmpe denne top ved at kompleksbinde medikamentet med et lipid, og denne kendsgerning kan 15 udnyttes kvantitativt som et mål for toxiciteten af HDLC. Et hvilket som helst af de ovennævnte lipider må, når de kompleksbindes på denne måde, forventes at resultere i den (omend dæmpede) karakteristiske absorbans, som er omtalt ovenfor, eftersom spektrene er specifikke for medikamentet.

20 Hvis amphotericin B-lipid-systemer, som udviser mindre end den maximale toxicitet (f.eks. prøver med 25 mol-%), opvarmes til 25-60 °C, dæmpes toxiciteten af det resulterende system (se fig. 11). Denne dæmpning forløber indtil det toxicitetsmaximum, som observeres, når amphotericin B kompleksbindes med 50 mol-% lipid (se fig. 11). En mulig forklaring er, at denne dæmpning 25 optræder, fordi lipidet undergår faseseparation og derefter uddrives fra amphotericin B under opvarmningstrinnet, hvilket gør det muligt for amphotericin B at foretage en tættere binding til sig selv og dermed frembringe et mindre toxisk system. Det uddrevne lipid viser sig ved, at der efter opvarming atter optræder en endoterm, som kan ses ved differentialskanning kalorimetri 30 (se fig. 12), hvilket er i overensstemmelse med et lipid, som i det væsentlige er uden indhold af amphotericin B. Desuden kan det uddrevne lipid påvises gennem en indsnævring af det 31P-NMR-signal, som opstår ud fra de opvarmede systemer (se fig. 13). Også denne indsnævring er i overensstemmelse 23 DK 176010 B1 med et lipid, som er reduceret betydeligt med hensyn til amphotericin B-koncentration.

Endelig afslører frysefraktur-elektronmikroskopi af opvarmede systemer, at 5 der eksisterer lipider (og liposomer) efter opvarmning, som ikke tidligere har været observeret. Den ikke-opvarmede prøve viser, at der findes komplekser uden frit lipid, som er karakteristiske for systemer, der udviser intramolekylæ-re vekselvirkninger imellem lipidet og amphotericin B.

10 Når man gennemførte de ovennævnte undersøgelser på prøver indeholdende 50 mol-% amphotericin B, kunne man observere små forskelle imellem prøver, som var undersøgt før opvarmning, og prøver, som var undersøgt efter opvarmning. På et niveau svarende til 50 mol-% er vekselvirkningen imellem medikamentet og lipidet sandsynligvis så stor, at der ikke er yderlige-15 re lipid til stede, som kan uddrives fra strukturen. Disse prøver demonstrerer derfor i det væsentlige uændrede signaler, både før og efter opvarmning, når de undersøges ved DSC og NMR.

Teorien om, at det faseseparerede lipid forlader amphotericin B i omgivelser, 20 som bidrager mere til den indbyrdes amphotericin B-vekselvirkning (og som således er mindre toxisk), understøttes af absorbansspektroskopi. De spektre, som opstår ud fra opvarmede systemer, er væsentligt mindre intense (en signifikant mindre toxicitet) i sammenligning méd ikke-behandlede systemer.

I et tilfælde resulterede en sådan opvarmning i en LDso-værdi på over 30 25 mg/kg i sammenligning med en ikke-opvarmet præparation med en LDso-værdi på 15 mg/kg. I dette tilfælde bemærkede man en dæmpning ved 413 nm efter opvarmning.

Den ovenfor beskrevne opvarmningsproces kan eftervises med en hvilken 30 som helst type af liposom- eller lipid-partikler eller dannelsesprocesser for liposom- eller lipid-partikler, såsom de ovenfor omtalte, men i dette eksempel anvendte man MLV-processen. På lignende måde kan man anvende et hvilket som helst af de tidligere nævnte lipider eller phospholipider, og man kan 24 DK 176010 B1 anvende vilkårlige opløsningsmidler eller vandige puffere som omtalt i det foregående. F.eks. tørres et lipid (i en hvilken som helst mængde, som vides at danne liposomer, såsom DMPC/DMPG i et molforhold på 7:3), som er suspenderet i et organisk opløsningsmiddel såsom chloroform, til en tynd film 5 på en indersiden af rundbundet kolbe. Amphotericin B (eller et hvilket som helst andet medikament som tidligere beskrevet) opløses i et passende organisk opløsningsmiddel (idet et passende opløsningsmiddel er et opløsningsmiddel, som opløser det specifikke medikament, f.eks. amphotericin B).

I forbindelse med den foreliggende opfindelse kan man anvende en hvilken 10 som helst mol-% af medikamentet (amphotericin B), som danner liposomer eller lipid-partikler. I forbindelse med den foreliggende opfindelse anvender man specifikt fra ca. 5 til ca. 50 mol-% amphotericin B. Når der skal dannes liposomer, anvender man et molforhold imellem medikament og lipid på 5 mol-% medikament eller derunder. Til dannelse af HDLC’er anvender man 15 fra ca. 6 til ca. 50 mol-% medikament. Ved 25 mol-% medikament og derover er populationen af natur i det væsentlige HDLC.

I forbindelse med den ovenfor omtalte opvarmning opløste man amphotericin B i methanol i en mængde på 10 mg amphotericin B pr. 100 ml methanol 20 svarende til 0,1 mg/ml amphotericin B. Methanolen, som indeholdt opløst amphotericin B (100,0 ml) blev sat til lipid-filmen, og filmen blev resuspende- ret. Den resulterende suspension blev derefter rotationsinddampet under reduceret tryk, hvilket gav en tynd film. Denne lipid-amphotericin B-film blev derefter resuspenderet i en prøve af den vandige opløsning, hvis volumen 25 var tilstrækkeligt til at danne liposomer eller lipid-partikler, f.eks. omkring 4,0 ml. Herefter kan suspensionen omrøres og sonikeres i et tidsrum på mellem nogle minutter og ca. 1 time, og den kan opvarmes i et vandbad ved ca. 25-60 °C i ca. 10-400 minutter.

30 En anden metode til at danne de omhandlede HDLC'er kan være valgt blandt de metoder, som gør brug af et homogeniseringstrin i stedet for sonikering.

F.eks. kan man fremstille de omhandlede HDLC'er i overensstemmelse med SPLV-processen, hvori et medikament (f.eks. amphotericin B) kan sættes til j 25 DK 176010 B1 et passende opløsningsmiddel (såsom DMSO) og blandes ved hjælp af en mekanisk mixer for at få hele mængden af medikamentet bragt i opløsning.

Om nødvendigt kan opløsningen derefter filtreres, hvorved man Ijemer alle ikke-opløste partikler af medikamentet. Et molforhold imellem DMPC og 5 DMPG på 7:3 kan derefter opløses i et passende opløsningsmiddel (såsom methylenchlorid), hvorefter lipidet kan blandes med medikament-DMSO-opløsningen. En vandig opløsning, eksempelvis saltvand, sættes derefter til blandingen, hvorefter de organiske opløsningsmidler fjernes ved rotations-inddampning ved omkring 35-45 °C. Efter fjernelse af opløsningsmidlet for-10 tyndes den resulterende blanding af medikament og lipid med en vandig opløsning, såsom saltvand, hvorefter suspensionen af HDLC’er formales ved hjælp af en homogenisator. En hvilken som helst homogeniseringsanordning eller kolloidmølle, som kan formale partiklerne, er acceptabel til den procedure, men fortrinsvis anvender man en Gifford Wood kolloidmølle. Partiklerne 15 formales, indtil der er opnået en acceptabel partikelstørrelse, f.eks. således at 90 % af partiklerne har en diameter på mindre end 10 pm, fortrinsvis mellem ca. 4 og ca. 10 pm, eller også formales partiklerne i 15-30 minutter. Man kan lede partiklerne igennem møllen en eller flere gange i afhængighed af, hvilken størrelse og homogenitet man ønsker. HDLC-partikleme kan analyse-20 res med hensyn til størrelsesfordeling, idet man hertil anvender et Malvem apparat. Om nødvendigt kan de partikler, der er for store eller for små, fjernes ved en hvilken som helst kendt metode til partikelseparation, eksempelvis ved filtrering. En sådan proces skal fortrinsvis resultere i partikler med en diameter på mellem ca. 0,2 og ca. 10,0 pm.

25

Andre metoder til dannelse af liposomer, som er kendte for fagmanden, kan anvendes ved den praktiske udøvelse af den foreliggende opfindelse. Opdagelsen af de omhandlede HDLC'er er ikke udelukkende begrænset til de ovennævnte processer til deres fremstilling.

30 HDLC-præparaterne og de liposomer, som opstår ved processerne ifølge opfindelsen, kan anvendes terapeutisk i pattedyr (herunder mennesker) til behandling af et antal forskellige infektioner eller tilstande, som kræver (1) 26 DK 176010 B1 gentagen administration, (2) langvarig afgivelse af medikamentet i dettes bioaktive form eller (3) nedsat toxicitet under opretholdelse af en i det væsentlige tilsvarende eller højere effektivitet i forhold til det tilsvarende frie medikament. Sådanne tilstande omfatter (men er ikke begrænset til) svampein-5 fektioner, såvel topiske som systemiske, såsom infektioner, der kan behandles med antifungale midler, såsom nystatin og amphotericin B, samt erhvervet immundefekt-syndrom (AIDS) og herpes. Præparationerne ifølge opfindelsen er desuden stabile i vandig opløsning.

10 Den udvalgte administrationsmåde for præparatet kan bestemme de steder og de celler i organismen, hvor forbindelsen afgives. De omhandlede HDLC'er og liposomer kah administreres alene, men generelt bliver de indgivet i blanding med et farmaceutisk bærestof, som er udvalgt under hensyn til den påtænkte indgivelsesvej og sædvanlig farmaceutisk praksis. F.eks. kan 15 man lettest opnå, at medikamentet bliver afgivet på et bestemt sted i organismen, ved topisk påføring (hvis infektionen er extern, eksempelvis på områder såsom øjne, hud eller ører, eller på læsioner såsom sår eller forbrændinger). En sådan topisk påføring kan foregå i form af cremer, salver, geler, emulsioner eller pastaer, som påføres direkte på det angrebne område. Al-20 ternativt kan der være tale om parenteralt injicerede præparater, som f.eks. indgives intravenøst, intramuskulært eller subkutant. Til parenteral administration kan man f.eks. anvende en steril vandig opløsning, som kan indeholde andre opløste bestanddele, f.eks. en tilstrækkelig mængde salte eller gly-cose til at gøre opløsningen isotonisk. Andre anvendelsesmuligheder, som 25 afhænger af præparatets bestemte egenskaber, vil være nærliggende for fagmanden.

Midlerne ifølge opfindelsen kan anvendes til behandling af astma, idet man installerer en nebuliseret vandig suspension af de omhandlede liposomer 30 eller HDLC'er i lungerne. F.eks. kan disse liposomer eller HDLC’er suspenderes i et passende opløsningsmiddel, som kan aerosoliseres ved hjælp af en pneumatisk eller ultrasonisk nebulisator, eller (mere bekvemt) ved hjælp af en nebulisator, som drives af gastrykket fra en carbonfluorid-tablet. Andre 27 DK 176010 B1 inhalationssystemer, såsom systemer, hvori de omhandlede liposomer eller HDLC’er afgives i partikelform, enten som et tørt pulver eller som en suspension i et passende bærestof, kan også anvendes. Efter aerosoliseringen går det meste af det opløsningsmiddel, som anvendes som drivmiddel, tabt ved 5 inddampning, og det erstattes af den fugtighed, som indsuges gennem luftvejene, hvilket fører til en afsætning af partiklerne.

Til kurativ eller profylaktisk behandling af fungale eller virale sygdomme hos j mennesker vil den ansvarlige læge bestemme den korrekte dosis til den på-10 gældende patient, og denne dosis må forventes at variere i afhængighed af patientens alder, vægt og respons såvel som i afhængighed af arten og sværhedsgraden af patientens symptomer. Doseringen af medikamentet i HDLC- eller liposomal-form vil generelt være af omtrent samme størrelsesorden som den, der anvendes for det tilsvarende frie medikament. I nogle 15 tilfælde kan det imidlertid være nødvendigt at indgive doser, som falder uden for disse grænser.

Opfindelsen illustreres nærmere ved de følgende eksempler.

20 EKSEMPEL 1 i ! j 10 mg amphotericin B (ialt 5 mol-% medikament) blev sat til 100 ml methanol i en 500 ml rundbundet kolbe, og blandingen blev sonikeret, indtil den var klar. Dette sonikeringstrin blev foretaget i et bad ved 25 °C i omkring 15 mi-25 nutter (ca. 50-60 Hz). Der tilsattes 100 mg dimyristoylphosphatidylcholin (DMPC) i 1,0 ml chloroform samt 42 mg dimyristoylphosphatidylglycerol (DMPG) i 0,42 ml chloroform. Den resulterende dispersion blev tørret ved rotationsinddampning ved 60 °C under reduceret tryk, hvorved der dannedes en tynd film i kolben. Denne film blev resuspenderet i 4,0 ml PBS, hvorefter 30 opløsningen blev overført til et glasrør og sonikeret til klarhed.

Det ovenfor beskrevne eksempel blev gentaget med henholdsvis 16,7, 20, 25, 33, 50 og 60 mol-% amphotericin B. Den akutte toxicitet (LDso), som er et 28 DK 176010 B1 mål for dån dosis af medikamentet, der fremkalder en 50% dødelighed hos mus, var højere i takt med, at molprocenten af medikamentet blev forøget op til 50 mol-% amphotericin B.

5 EKSEMPEL 2 140 mg amphotericin B (ialt 5 mol-% medikament) blev sat til 1,5 ml di-methylsulfoxid (DMSO). 1400 mg DMPC og 600 mg DMPG blev opløst i 50 ml methylenchlorid, hvorefter de to opløsninger blev overført til en kolbe, den 10 resulterende opløsning blev omrørt, indtil den var klar, og derefter tørret ved rotationsinddampning under reduceret tryk til frembringelse af en film på indersiden af kolben. Derefter blev kolben tørret i 1-4 dage i en glasklokke. Efter en sådan tørring blev filmen, som havde dannet tørre flager, pulveriseret til et pudder og blandet med enten 100 eller 50 ml 0,9 % saltvand eller med 15 50 ml vand til injektionsbrug (USP). Den resulterende suspension blev op varmet til 37 °C i 1 time.

Det ovenstående eksempel blev gentaget under anvendelse af methanol i stedet for DMSO som suspenderende opløsningsmiddel for amphotericin B, 20 og der anvendtes molprocenter for amphotericin B på 10,16,7 og 33.1 stedet for DMPC/DMPG i et molforhold på 7:3 anvendte man henholdsvis 1 g og 2 g ægge-phosphatidylcholin.

EKSEMPEL 3 25 100 mg amphotericin B (ialt 5 mol-%) blev opløst i 2,0 ml DMSO. Samtidigt opløstes 100 mg DMPC og 42 mg DMPG i 1,42 ml chloroform i en kolbe, hvorefter chloroformen blev fjernet ved rotationsinddampning under reduceret tryk. Der sattes 20 ml methylenchlorid til kolben efterfulgt af 0,2 ml af 30 stamopløsningen af amphotericin B. Den resulterende suspension blev soni-keret til klarhed (omkring 1 minut) under de betingelser, der anvendtes i eksempel 1. Derefter tilsattes 0,3 ml PBS. pH 7,2, hvorefter methylenchloridet blev fjernet under en strøm af nitrogen samtidig med sonikeringen. Den re- 29 DK 176010 B1 suiterende pasta blev resuspenderet i 10,0 ml PBS og centrifugeret ved 10.000 x g i 10 minutter, hvorefter der blev foretaget en sonikering i et bad i omkring 20 minutter.

5 Det ovenstående eksempel blev gentaget under anvendelse af henholdsvis 16,7, 20, 25, 33, 50 og mol-% amphotericin B.

EKSEMPEL 4 10 140 mg amphotericin B (ialt 5 mol-%) blev opløst i 1,5 ml methylenchlorid. De to opløsninger blev blandet indtil klarhed overført til en kolbe og blandet med 8.0 ml PBS. Methylenchloridet blev inddampet under en nitrogenstrøm samtidigt med, at der blev foretaget en sonisk behandling i et bad. Denne behandling foregik på samme måde som beskrevet i eksempel 1. Der tilsattes 15 32 ml PBS, hvorefter opløsningen blev filtreret igennem et polytetrafluorethy- len (PTFE)-teflon-filter med en porestørrelse på 5 pm, vasket to gange ved centrifugering og endelig suspenderet i 100 ml PBS.

Det ovenstående eksempel blev gentaget under anvendelse af henholdsvis 20 4,0 og 12,0 ml PBS for at hydratisere lipidet.

EKSEMPEL 5 140 mg amphotericin B (ialt 5 mol-%) blev opløst i 1,5 ml DMSO. Samtidigt 25 blev 1400 mg DMPC og 600 mg DMPG opløst i 50 ml methylenchlorid. De to opløsninger blev blandet indtil klarhed, overført til en kolbe og tørret til en tynd film ved rotationsinddampning under reduceret tryk. Filmen blev derefter resuspenderet i 50 ml methylenchlorid, og der sattes 8,0 ml PBS til denne opløsning. Methylenchloridet blev fjernet ved inddampning under nitrogen 30 under samtidig sonisk behandling i overensstemmelse med proceduren fra eksempel 1. Den resulterende pasta blev yderligere hydratiseret med 32 ml PBS, hvorefter suspensionen blev vasket to gange ved centrifugering. Til i 30 DK 176010 B1 sidst blev suspensionen resuspenderet i 100 ml PBS og ledt igennem et teflon (PTFE) filter med en porestørrelse på 5 pm.

Det ovenstående eksempel blev gentaget ved anvendelse af en glycin-puffer 5 med en pH-værdi på henholdsvis 3, 6 og 9 i stedet for PBS.

Det ovenstående eksempel blev også gentaget ved anvendelse af henholdsvis 5,0, 10,0,15,0 og 20,0 ml PBS som hydratiserende puffer.

10 EKSEMPEL 6 140 mg amphotericin B (ialt 5 mol-%) blev opløst i 1,5 ml DMSO. Samtidig opløstes 2,0 g ægge-phosphatidylcholin (EPC) i 50 g methylenchlorid, og de to opløsninger blandedes i en kolbe. Der tilsattes 8,0 ml PBS, hvorefter op-15 løsningsmidlet blev fjernet under en strøm af nitrogen under sonikering på samme måde som beskrevet i eksempel 1. Der tilsattes 200 ml PBS.

Det ovenstående eksempel blev gentaget under anvendelse af 10 og 20 mol-% amphotericin B.

20 EKSEMPEL 7 140 mg amphotericin B (ialt 5 mol-%) blev opløst i 1,5 ml DMSO. derefter blev 1400 mg DMPC og 600 mg DMPG opløst i 50 g methylenchlorid i en 25 500 ml rundbundet kolbe. De to opløsninger blev blandet i en kolbe, og der tilsattes 10 ml vand til injektionsbrug (USP) ved 37 °C. Opløsningsmidlet blev afdampet under anvendelse af en nitrogenstrøm og under samtidig sonikering i overensstemmelse med proceduren fra eksempel 1, hvorefter der tilsattes 50 ml vand til injektionsbrug (USP). Den resulterende opløsning blev op-30 varmet til 37 °C i 30 minutter.

Det ovenstående eksempel blev gentaget under anvendelse af 10 og 16,7 mol-% amphotericin B, hvorefter man ledte opløsningen igennem et polycar- 31 DK 176010 B1 bonatfilter med en porestørrelse på 3 pm (retlinede porer), som kan fås fra Nucleopore.

EKSEMPEL 8 5 140 mg amphotericin B (ialt 16,7 mol-%) blev blandet med 50 ml methanol, og blandingen blev sonikeret i 15 minutter til dannelse af en opløsning, som derefter blev ledt igennem et filter med bugtede porer med en porestørrelse på 0,22 pm (blandede celluloseacetat- og cellulosenitratestere), som kan fås 10 fra Millex. 350 mg DMPC og 150 mg DMPG blev samtidigt opløst i 50 g methylenchlorid, og opløsningen blev blandet med den ovennævnte filtratopløsning. Opløsningsmidlerne blev afdampet under en nitrogenstrøm samtidigt med, at der blev foretaget en sonikering efter processen beskrevet i eksempel 1. Efter denne behandling tilsattes 50 ml PBS. Halvdelen af præparatio-15 nen (25 ml) blev lyophiliseret under anvendelse af standardprocedurer.

EKSEMPEL 9

Til 2,0 ml vandfri ethanol sattes 10 pi 1N saltsyre. Der sattes 20 mg ampho-20 tericin B (ialt 5 mol-%) til den syreholdige ethanol, hvorefter den resulterende blanding blev sonikeret til klarhed under de i eksempel 1 angivne betingelser, idet dog sonikeringstiden var 30 sekunder i stedet for 60 sekunder. I et reagensglas anbragtes 200 mg DMPC og 42 mg DMPG, hvorefter der tilsattes en blanding af benzen og methanol (70:30). Den resulterende opløsning blev 25 lyophiliseret som beskrevet i eksempel 8, og det tørrede lipid blev blandet med 2,0 ml PBS, hvorefter den resulterende blanding blev dispergeret ved at hvirvle glasset rundt. Til lipidet sattes amphotericin B-opløsningen (0,2 ml), i i og den resulterende blanding omrørtes natten over. De resulterende DMPC:DMPG-MLV'er (200 pi) blev overlejret på en saccharosedensitetsgra-30 dient og centrifugeret i 24 timer med 230 000 x g ved 22 °C. Resultaterne fremgår af fig. 11. Hele mængden af amphotericin B blev associeret med lipidet, idet der opnåedes en bred fordeling, hvor toppen af gradienten indeholdt størstedelen af lipidet, mens hovedtoppen for amphotericin B forekom i bun- 32 DK 176010 B1 det af gradienten. Alternativt blev de resulterende DMPC:DMPG-MLV'er lyophiliseret og rehydratiseret med 2,0 ml destilleret vand.

Det ovenstående eksempel blev gentaget under anvendelse af 7, 9,16,7,17, 5 20, 25, 33, 50 og 60 mol-% amphotericin B. Når man kom op på molprocenter på 16,7 og derover, dannedes der fortrinsvis HDLC'er. Gradienterne for sådanne høje medikament/lipid-forhold ved densitetscentrifugering svarer til de gradienter, som er vist på fig. 5, hvor hele mængden af medikament og lipid samtidig er associeret i en enkelt top.

10 EKSEMPEL 10

Prøver af 25 mol-% amphotericin B i DMPC/DMPG blev fremstillet til røntgendiffraktion, DSC, frysefraktur-elektronmikroskopi og 31P-NMR- i 15 undersøgelser som følger: DMPC/DMPG i et molforhold på 7:3 (44 mg totalt j lipid) og 20 mg (25 mol-%) amphotericin B blev suspenderet i en blanding af chloroform og methanol (70:30 v/v). Suspensionen blev inddampet under reduceret tryk ved 55 °C, hvorved der dannedes en tynd film på kolbens inderside. Denne film blev hydratiseret med 8,0 ml af en blanding indeholden-20 de 20 mM HEPES og 250 mM NaCI, pH 7,2, ved 22 °C ved omrystning med små glasperler. Præparationen blev centrifugeret ved 10.000 x g i 10 minutter, og supematanten blev dekanteret fra, hvorefter bundfaldet blev re-suspenderet i 1,0 ml af HEPES/NaCI-pufferen. Præparationen blev derefter sonikeret i et bad i 20 minutter ved 25 °C og ved 50-60 Hz.

25

Den ovennævnte procedure blev gentaget under anvendelse af henholdsvis 0,5 og 50 mol-% amphotericin B.

EKSEMPEL 11 30

Med henblik på at bestemme det indesluttede volumen af de amphotericin B-holdige liposomer og HDLC’er fulgte man den følgende procedure: 33 DK 176010 B1 100 mg DMPC og 42 mg DMPG, begge opløst i chloroform, blev kombineret i 10 mg amphotericin B (25 mol-%) i methanol (0,1 mg/ml amphotericin B) i en kolbe. Opløsningsmidlet blev fjernet under reduceret tryk ved 37 °C. Der tilsattes 3,7 ml PBS, hvortil der var sat 0,3 ml af en fortyndet 3H-inulin-5 opløsning i destilleret vand, til den tørre lipid-film under omrøring. En prøve (10,2 ml) af denne opløsning blev anbragt i en såkaldt scintillationsNcocktair og optalt med hensyn til radioaktivitet i en beta-scintillationstæller. En anden prøve blev analyseret for phosphat i henhold til metoden beskrevet af Bartlett, J.Biol.Chem..1959.234:466-468. Lipid-medikament suspensionen blev 10 centrifugeret ved 10.000 x g i 10 minutter, og supematanten blev borthældt, ( hvorefter bundfaldet blev resuspenderet i PBS. Centrifugeringen og re- suspenderingen af bundfaldet blev gennemført to gange mere, idet den sidste resuspension blev opsamlet (100 pi) og underkastet optælling i en β-scintillationstæller. En anden prøve af den endelige resuspension af bundfal-15 det blev analyseret for phosphat som beskrevet ovenfor. Indeslutningen af inulin i procent blev beregnet ved at dividere de endelige radioaktive tællinger med de oprindelige tællinger og multiplicere med 100. Det indesluttede volumen (μΙ indkapslet inulin/pmol lipid) blev også beregnet.

20 Den ovenstående procedure blev gentaget under anvendelse af 0,5 og 50 mol-% amphotericin B.

EKSEMPEL 12 25 Partiklerne af amphotericin B blev fremstillet ved, at man tørrede 15,5 mg DMPC og 6,5 mg DMPG (molforhold 7:3) fra en opløsning i omkring 10 ml chloroform, således at der dannedes en film på siderne af en 100 ml uindbundet kolbe. Man suspenderede 10 mg amphotericin B i 100 ml methanol, hvorefter man satte 100,0 ml af methanol opløsningen til kolben. Herved blev 30 lipid-filmen suspenderet, hvilket gav 25 mol-% amphotericin B. Blandingen blev derefter tørret under rotationsinddampning ved 37 °C til en tynd film på kolbens sider. Filmen blev derefter hydratiseret med 4,0 ml 10 mM HEPES og 150 mM NaCI (pH 7,2) ved hjælp af små glasperler og sonikeret i 30 mi- 34 DK 176010 B1 nutter, hvorved der dannedes en endelig suspension. En prøve af denne suspension blev derefter opvarmet til 60 °C i 10 minutter ved neddypning i et vandbad. Den resulterende suspension blev karakteriseret ved DSC, NMR og frysefraktur-elektronmikroskopi.

5

Den ovennævnte procedure blev gentaget uden opvarmning af prøven. Denne prøve blev holdt ved 22 °C og blev ligeledes karakteriseret ved de ovennævnte teknikker.

10 EKSEMPEL 13

De i eksempel 12 anvendte materialer og procedurer blev gentaget under | anvendelse af henholdsvis 50 og 5 mol-% amphotericin B. Disse systemer blev karakteriseret ved DSC, ESR og frysefraktur-elektronmikroskopi.

15 EKSEMPEL 14 DSC-målinger blev gennemført på en Micro Cal MC-1 enhed fra Micro Cal,

Inc., Amherst, MA. Prøvevolumener på 0,70 ml, som indeholdt 5-9 mg su-20 spension, blev injiceret i prøvecellen, idet der anbragtes et tilsvarende volumenpuffer i referencecellen. Prøverne blev enten opvarmet til ca. 26 °C eller ca. 37 °C i 1 time. Dobbelte gennemkøringer af den samme prøve under de samme betingelser gav start- og sluttemperaturer, som var reproducerbare ned til 0,2 °C. Generelt blev de prøver, som indeholdt amphotericin B opvar-25 met til 60 °C (ingen højere) og derefter afkølet til 7-4 g eC i mindst 2 timer med henblik på at sikre overensstemmelse imellem de enkelte prøver.

EKSEMPEL 15 30 Der blev optaget NMR spektre ved 145,7 MHz på et Bruker AM360 NMR spektrometer med stor udboring under anvendelse af 8K data til registreringen, en udslagsbredde på 50.000 Hz og en pulsbredde på 20 psekunder DK 176010 B1 35 svarende til en puls på 45 0. Spektrene blev akkumuleret ud fra op til 10.000 indsvingninger.

EKSEMPEL 16 5

En prøve på 0,1-0,3 μΙ blev anbragt imellem et par støtteplader af kobber fra Balzers (Nashua, NH) og hurtigt overført fra 23 °C til flydende propan. Prøverne blev knust og replikeret på en dobbeltreplikationsanordning i en Bal· zers frysefraktur-enhed ved en temperatur på -115 °C og under et vakuum på 10 2 x 10'6 mbar eller derunder, de opnåede kopier blev skyllet i 3N HNO3 og derefter underkastet udvaskning med en serie af forskellige natriumhypochlo-ritopløsninger. Endelig blev prøvekopierne vasket med destilleret vand og opsamlet på 50 pm kobbernet (Polysciences, PA). Prøverne blev betragtet i et Philips 300 elektronmikroskop med en forstørrelse på3.000-22.000 gange.

15 EKSEMPEL 17

Aborbansspektre (som i figurerne 12 og 13) blev frembragt ved at fortynde amphotericin B i HEPES/NaCI-puffer til en koncentration af amphotericin B 20 på 25 μΜ/liter. En prøve blev anbragt i prøvekuvetten i et Beckman spektro-fotometer og aflæst ved 300-500 nm. Prøvekuvetten blev afløst over for en tilsvarende blindprøve indeholdende puffer.

EKSEMPEL 18 25

Prøver for ESR blev mærket med en serie af positions-isomerer af doxylstea-rinsyrer, hvori den "rapporterende" doxylgruppe var til stede i forskellige stillinger langs fedtsyrekæden. Mærkningen blev effektueret ved at inkorporere prøven ved omrystning og sonikering ud fra en ethanol opløsning, som blev 30 tørret til en tynd film på indersiden af reagensglas. Alle prøver blev mærket til 1 mol-%.

j 36 DK 176010 B1 ESR-spektrene blev optaget på et IBM Instruments ER100D ESR spektrome-ter under regulering af temperaturen ved hjælp af en strøm af nitrogengas.

En ekstern kalibreret thermistor-probe (Omega Engineering, Inc., Stamford, CA) blev benyttet til at overvåge prøvens temperatur. ESR-spektrene blev 5 optaget ved en mikrobølgestyrke på 10 pW og en mikrobølgefrekvens på 9,11 GHz med et feltudslag på 100 G og en 100 KHz feltmodulationsamplitude på 0,32 G. Størrelsesparameteren blev beregnet ud fra den maksimale hyperfine opdeling (A max).

10 EKSEMPEL 19 337,5 g amphotericin B blev sat til 3375 ml DMSO, hvorefter amphotericin B (100 mg/ml) blev blandet til opløsning (omkring 3 timer) ved anvendelse af en mekanisk mixer. Blandingen blev overført til en trykbeholder af rustfrit stål 15 (kapacitet 5 liter) og filtreret igennem et 0,22 pm Sartofluor filter og et polypropylen dybdefilter (Pali Profile, Pall, Inc., Glen Cove, N.Y.).

I en trykbeholder med kapacitet 40 liter blev 50,8 kg methylenchlorid blandet med 225,0 g DMPC og 99,0 g DMPG i 3,5 timer for at sikre en fuldstændig 20 opløsning. Den resulterende lipidopløsning blev overført igennem et 0,2 m2 Sartofluor 0,22 pm-teflon-filter til en forarbejdningstank af rustfrit stål. Trykbeholderen med kapacitet 40 liter blev vasket med yderligere 55,2 kg methylenchlorid, som på lignende måde blev filtreret over i forarbejdningstanken.

Denne blev indstillet således, at lipid opløsningen blev blandet under rotation 25 med 195 omdrejninger pr. minut, hvorefter opløsningen af amphotericin B og DMSO blev overført til tanken. Der tilsattes derefter 16,2 liter af en na-triumchloridopløsning (0,9 % USP) igennem et 0,22 pm Millipak 100 polycar-bonatfilter.

30 Ved anvendelse af en varmeveksler, som var indstillet på35 °C, i serieforbindelse med forarbejdningstanken ledte man en strøm af flydende nitrogen igennem tanken, hvorved opløsningsmidlet blev fjernet over en periode på12 timer. Det resulterende lipid-medikament-kompleks blev fortyndet med 7000 37 DK 176010 B1 ml natriumchlorid (0,9 % USP) og overført til tanken igennem et Millipak 100 filter med porestørrelse 0,22 pm.

De resulterende HDLC'er blev homogeniseret ved anvendelse af en Gifford 5 Wood kolloidmølle og en roterende knastpumpe. HDLC'eme blev ledt igennem kolloidmøllens hoved, som var indstillet til en spaltevidde på 0,0125 mm, under et baggrundstryk på 0,7 kg/cm2 i 3,0 timer, hvilket resulterede i partikler med en størrelse på mindre end 20 pm. Partikelstørrelsen af de resulterende HDLC'er blev analyseret ved hjælp af en Malvem partikeltæller.

10 EKSEMPEL 20

Lipid (102,6 pmol i alt, 70:30 molforhold mellem DMPC og DMPG) opløst i chloroform blev pipetteret ind i en 500 ml rundbundet kolbe. 500 mg nystatin 15 blev opløst i 1,0 ml methanol (0,5 mg/ml) ved sonikering i en Branson bad-sonikator. Det opløste nystatin (5,0 ml) blev sat til den rundbundede kolbe, som indeholdt lipidet, og blandet hermed, hvorefter opløsningsmidlet blev fjernet ved rotationsinddampning ved 45 °C i 15 minutter. Det resulterende produkt blev rehydratiseret I 5,0 ml saltvand ved omrystning med små glas-20 perler. Ved undersøgelse i lysmikroskop viste det sig, at liposomeme var synlige.

Den ovenstående procedure blev gentaget ved anvendelse af 25, 50, 75 og 100 mol-% nystatin. Ved undersøgelse ved frysefraktur-elektronmikroskopi 25 viste det sig, at præparationen, som indeholdt 25 mol-% nystatin, bestod af i ikke-liposomale HDLC'er. ' EKSEMPEL 21 30 14,8 pmol/ml lipid (DMPC og DMPG i et molforhold på 7:3) blev hydratiseret i destilleret vand og inkuberet vand ved 4 °C. De resulterende MLV'er blev ekstruderet 10 gange igennem to på hinanden anbragte polycarbonatfiltre, 1 idet man anvendte LUVET-proceduren.

j i i i 38 DK 176010 B1

Amphotericin B blev dispergeret i destilleret vand under sonisk behandling, indtil koncentrationen var 10,8 pmol/ml. Dispersionen af amphotericin B blev sat til lipid-suspensionen til en endelig koncentration af lipid og amphotericin 5. B på henholdsvis 13,5 pmol/ml og 0,98 pmol/ml. For at fjerne ikke-inkorporeret amphotericin B centrifugerede man 20 ml af prøven i 30 minutter ved 15.000 x g i en Ti60 eller SW 27 rotor (Beckman) ved 22 °C i en Beckman L8-60 ultracentrifuge. Det supernatant-fri amphotericin B blev fjernet uden at ødelægge liposom-bundfaldet. De resulterende liposomer blev målt 10 ved kvasielektrisk lysspredning, og det viste sig, at deres diameter var over 1,0 pm.

Den ovenstående procedure, ved hvilken man anvendte en inkubationstem-peratur på 23 °C, blev gentaget ved anvendelse af 150 mM NaCI, 10 mM 15 Na2P04, pH 7,4 for at hydratisere lipideme. De resulterende liposomer blev målt ved kvasielektrisk lysspredning, og det viste sig, at deres diameter var over 1,0 pm. Hastigheden af liposomemes optagelse af amphotericin B var højst, når ionstyrken af mediet var lav (destilleret vand imod 150 mM NaCI) (fig. 17).

20

Fig. 16 viser optagelsen af amphotericin B i DMPC/DMPG-liposomer under forskellige betingelser i henseende til inkubationstemperatur. Optagelseshastigheden er den samme ved 23 °C og ved 45 °C. Der sker også en akkumulering af medikamentet, når lipidet er i gelfase, dvs. ved 15 °C.

25 EKSEMPEL 22

Man anvendte de i eksempel 20 beskrevne materialer og procedurer, idet dog lipidet, som var suspenderet i destilleret vand, blev inkuberet med 30 amphotericin B ved 22 °C. De resulterende liposomer var unilamellare og viste sig at have en middeldiameter på omkring 0,1-0,2 pm (målt ved kvasie- j lektrisk lysspredning). Fig. 19 viser, at hastigheden af amphotericin B- ' optagelsen er højere i de første to timer med disse LUV'er end med MLV'er.

Claims (23)

39 DK 176010 B1

1. En farmaceutisk sammensætning omfattende et hydrofobt kompleks af et 5 bioaktivt middel og et lipid, kendetegnet ved, lipidet omfatter en mættet fedtsyre eller et phospholipid, at indholdet af det bioaktive middel i komplekset er mindst ca. 6 mol-% og komplekset er i det væsentlige fri for liposomer.

2. Sammensætning ifølge krav 1, k endetegnet ved, at det bioaktive middel er et antifungalt polyen antibiotikum.

3. Sammensætning ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at lipidet omfatter phospholipid. 15

4. Sammensætning ifølge ethvert af kravene 1-3, kend eteg-n e t ved, at indholdet af det bioaktive middel er mellem 6 og 50 mol-%.

5. Sammensætning ifølge krav 4, kendetegnet ved, at det 20 bioaktive middel er et polyen antifungalt middel og at indholdet af det polyen antifungale middel er mellem 6 og 50 mol-%.

6. Sammensætning ifølge ethvert af kravene 1-5, kend eteg- n e t ved, at lipidet omfatter et mættet phospholipid eller en mættet fedt-25 syre.

7. Sammensætning ifølge ethvert af kravene 1-6, kendetegne t ved, at phospholipidet omfatter phosphatidylcholin og phosphati-dylglycerol. 30

8. Sammensætning ifølge krav 7, kendetegnet ved, at phosphatidylcholinet er dimyristoylphosphatidylcholin, og at phosphatidylgly-cerolen er dimyristoylphosphatidylglycerol. DK 176010 B1 40 .

9. Sammensætning ifølge krav 8, kendetegnet ved, at phosphatidylcholinet og phosphatidylglycerolen er i et molforhold på omkring 7:3. 5

10. Sammensætning ifølge krav 2 - 9, k endetegnet ved, at indholdet af polyen antifungalt middel er mellem 25 og 50 mol-%.

11. Sammensætning ifølge ethvert af kravene 2 - 10, k e nd e -10 tegnet ved, at det polyen antifungale middel er amphotericin B.

12. Sammensætning ifølge ethvert af kravene 2-10,kende-tegnet ved, at det polyen antifungale middel er nystatin.

13. Sammensætning ifølge ethvert af kravene 1 · 12, k e n de leg n e t ved, at partikelstørrelsen af det hydrofobe kompleks af bioaktivt middel og lipid er mellem 0,2 og 10 pm.

14. Farmaceutisk præparat ifølge ethvert af kravene 1-13, som yderligere j 20 omfatter et farmaceutisk acceptabelt bærestof eller fortyndingsmiddel. i !

15. Farmaceutisk præparat ifølge krav 14, som er beregnet til parenteral indgivelse.

16. Farmaceutisk præparat ifølge krav 14 eller 15, anvendt til behandling af en infektions sygdom i et pattedyr med en effektiv mængde af det farmaceutiske præparat, specielt svampe infektioner og virus infektioner.

17. Fremgangsmåde til fremstilling af et farmaceutisk præparat ifølge ethvert 30 af kravene 1 -13, som omfatter et hydrofobt kompleks af et bioaktivt middel og et lipid, kendetegnet ved, at fremgangsmåde omfatter trinene: 41 DK 176010 B1 (a) mindst ét lipid opløses i et organisk opløsningsmiddel med intermediær polaritet, (b) det bioaktive middel opløses i et bioforligeligt organisk opløsningsmiddel, og 5 (c) opløsningen fra trin (a) blandes med opløsningen fra trin (b).

18. Fremgangsmåde til fremstilling af et farmaceutisk præparat ifølge ethvert af kravene 1-13, som omfatter et hydrofobt kompleks af et bioaktivt middel og et lipid, kendetegnet ved, at fremgangsmåde omfatter trinene: 10 (a) mindst ét lipid opløses i et organisk opløsningsmiddel med intermediær polaritet, (b) det bioaktive middel opløses i et organisk opløsningsmiddel, (c) opløsningen fra trin (a) blandes med opløsningen fra trin (b) og 15 (d) blandingen fra trin (c) ovenfor dehydratiseres.

19. Fremgangsmåde til fremstilling af et farmaceutisk præparat ifølge ethvert af kravene 1-13, som omfatter et hydrofobt kompleks af et bioaktivt middel og et lipid, kendetegnet ved, at fremgangsmåde omfatter trinene: 20 (a) mindst ét lipid opløses i et organisk opløsningsmiddel med intermediær polaritet, (b) det bioaktive middel opløses i et bioforligeligt organisk opløsningsmiddel, (c) produktet fra trin (a) blandes med produktet fra trin (b), 25 (d) opløsningsmidlet fra blandingen fra trin (c) afdampes under reduceret tryk til frembringelse af en tørret lipid-film og (e) en vandig opløsning tilsættes filmen fra trin (d).

20. Fremgangsmåde til fremstilling af et farmaceutisk præparat ifølge ethvert 30 af kravene 1-13, som omfatter et hydrofobt kompleks af et bioaktivt middel og et lipid, kendetegnet ved, at fremgangsmåde omfatter trinene: 42 DK 176010 B1 (a) det bioaktive middel opløses i et bioforiigeligt organisk opløsningsmiddel, (b) mindst ét lipid opløses i et organisk opløsningsmiddel med intermediær polaritet og opløsningen blandes med opløsningen fra trin (a), 5 (c) en vandig opløsning tilsættes de ovennævnte blandede opløsninger (a) og (b) og opløsningsmidlerne afdampes under reduceret tryk til dannelse af en pasta; og derpå (d) tilsættes en vandig opløsning til pastaen fra trin (c) ovenfor.

21. Fremgangsmåde til bestemmelse af toxiciteten af et hydrofobt kompleks af et bioaktivt middel og et lipid, som defineret i ethvert af kravene 1-13, ved at aflæse absorbansspektrum for præparatet af det hydrofobe kompleks af bioaktivt middel og lipid, og måle topintensiteten.

22. Fremgangsmåde til fremstilling af en sammensætning omfattende et hy drofobt kompleks af et bioaktivt middel og et lipid omfattende et lægemiddel og et lipid i et højt molforhold mellem lægemidlet og lipidet, kendetegnet ved, at fremgangsmåde omfatter trinene: 20 (a) et lægemiddel suspenderes i en vandig opløsning, (b) et lipid suspenderes i en vandig opløsning, (c) produkterne fra trin (a) og trin (b) blandes og (d) produktet fra trin (c) inkuberes ved en temperatur på eller over lipidets overgangstemperatur. 25

23. Fremgangsmåde ifølge krav 22, kendetegnet ved, at man suspenderer lægemidlet i en vandige opløsning ved sonisk behandling. j