PT86913B - Processo de preparacao de sistemas droga-lipido de baixa toxicidade - Google Patents

Description

presente invento refere-se ao processo de preparação de composições compreendendo complexos de lípiuos não lipossómicos em associação com drogas hidrofóbicas tóxicas tais como o antibiótico de polieno, anfotericina B. As composições de lípido são preferivelmente uma combinação dos fosfolípidos, dimiristoilfosfatiuilcolina (DMPC) e dimiristcilfosfatidilglicerol (DMPG), numa proporção molar de cerca de ?:3· Os complexos de lípiuc contêm um agente bioactivo e podem ser preparados de acordo com um certc número de procedimentos, para proporções de droga : lípido elevadas. Podem administrar-se estas composições de complexos com uma proporção de droga : lípido elevada (HDLCs), a mamíferos, tal comc o homem, para o tratamento de infecções, com uma eficácia substancialmente equivalente ou superior, e com menores toxicidades da droga, quando comparadas com as das drogas na sua fcrma livre. Descreve-se também um novo procedimento de carregamento de lipossomas que também pode ser utiliza do na formação dos HDLCs.

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-2MEtóúRIA DESCRITIVA presente pedido de patente é uma continuação do Pedido de Patente dos E.U.A. n^e 069 90θ, depositado em 6 ae Julho de 1987, que por sua vez é uma continuação do Pedido de Patente dos E.U.A. n^s 022 157, depositado em 5 de Março de 1987·

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO presente invento aescreve formulações e processos de pre paração de complexos ae lípiaos associados a urcgas com proporções de droga : lípide elevados (complexosae elevado teor de droga : lípiao ou HDLCs). Estas formulações têm geralmente uma efi cácia substancialmente equivalente ou superior à da mesma droga na sua forma livre, e têm ainda uma menor toxicidade. Descrevem-se também processos de preparação destes HDLCs. Mais particularmente, o presente invento descreve a utilização destes complexos de elevado teor de droga : lípido, compreendendo antibióticos de polieno antifungícos tóxicos, especificamente a anfotericina B e a nistatina.

Podem preparar-se os complexos deeLevado teor de droga : lípido (HDLCs) do presente invento por técnicas substancialmente idênticas às utilizadas na preparação de lipessomas. 0 presente invento inclui a utilização destas estruturas de HDLC associadas a agentes bioactivos tais como arogas, especialmente a antibiótico ae polieno tais como a anfotericina B e a nistatina.

presente invento descreve também um novo processo de pre paração de lipossomas (ou de HDLCs) que não envolve a utilização de solventes orgânicos. 0 aprisionamento ou associação da droga com os lipossomas ocorre através da formação de um intermediário em etanol, ou aquoso.

Os lipossomas são membranas constituídas por duas camadas de lípido completamente fechadas contendo um volume aquoso apri sionado. Os lipossomas podem ser vesículas unilamelares (possuindo uma única membrana de camada dupla) ou vesículas multilamelares (estrutura do tipo cebola” caracterizadas por múltiplas membranas de camada dupla, cada uma separada da seguinte

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-3por uma camada aquosa). A camada dupla é composta por duas monocamadas de lípido com uma região de cauda hidrofóbica e uma região de cabeça hidrcfílica. A estrutura de camada dupla da membrana é tal, que as caudas hidrofóbicas (não polares) das monocamadas de lípido se orientam na direcção do centro da camada dupla, enquanto que as cabeças hidrofílicas se orientam na direcção da fase aquosa.

A preparação original de lipossomas de Bangham et al. (J.

l.lol. Biol. , 1965, 13:238-252) envolve a suspensão de fosfolípidos num solvente orgânico que depois se evapora até à secura, deixando no vaso reaccional um filme de fosfolípido. Adiciona- se seguidamente uma quantidade apropriada de fase aquosa, deixa-se a mistura inchar e di spersam-se, por meios mecânicos, os lipossomas resultantes que consistem em vesículas multilamelares (MLVs). Esta técnica serviu de base para o desenvolvimento de vesículas unílamelares pequenas, sonicadas (tratadas com ultrassons), descrito porPapahadjqpouLos et áL. (Biochem. Biophys. Acta. , 19Ó7, 135: :624-638), e de vesículas unilamelares grandes.

Para preparar lipossomas podem usar-se as técnicas de preparação de vesículas unilamelares grandes (LUVs), tais como evaporação de fase inversa, procedimento de infusão e diluição com oetergentes. No texto Liposomes, Marc Ostro, ed., Mareei Dekker, Inc., New York, 1983, Capítulo 1, cujas partes pertinen tes são aqui incorporadas por referência, pode encontrar-se uma compilação destes e de outros métodos para a preparação de lipossomas. Ver também Szoka, Jr. et al., (1980, Ann. Rev. Biophys. Biceng., 9:4ó7), cujas partes pertinentes são também aqui incorporadas por referência. Em Cullis et al., PCT Publication n^e 87/OO238, de 16 de Janeiro de 1988, descreve-se um método particularmente preferido para a preparação de LUVs, intitulado Extrusion Technique for Producing Unilamellar Vesicles aqui incorporado por referência. As vesículas preparadas por esta técnica, designadas por LUVETS, são extrudidas sob pressão atra vés de um filtro de membrana. Podem também preparar-se vesículas por uma técnica de extruâo através de um filtro de 200 nm; estas vesículas são conhecidas pela designação de VET^q·

Podem expor-se estas vesículas a pelo menos um ciclo de conge-

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-4lação e degelo antes da técnica de extrusão; este procedimento é descrito em Mayer et al. , 1985, Biochem. et. Biophys. Acta. , 817:193-19t>, intitulado Solute Distributions and Trapping Efficiencies Cbserved in Freeze-Thawed Multilamellar Vesicles,'' cujas partes relevantes são aqui incorporadas por referência.

Na prática do presente invento prefere-se uma classe de lipossomas, e um processo para a sua formação, caracterizada por ter uma distribuição lamelar de soluto substancialmente uniforme. Os lipossomas desta classe preferida são designados por vesículas plurilamemares estáveis (SPLU), tal como se cefine na Patente dos E.U.A. n⁸ 4 522 803 de Lenk et al., e inclui vesículas monofásicas, tal como se descreve na Patente dos E.U.A. n® 4 588 578 de Fountain et al., e vesículas multilamelares congeladas e descongeladas (FATMLV) tal como anteriormente se descreveu.

Para preparar lipossomas têm-se utilizado uma variedade de esteróis e dos seus derivados soláveis em água; ver específicamente Janoff et al., Patente dos E.U.A. n® 4 721 612, publicada em 26 de Janeiro de 1988 e intitulada Steroidal Liposomes. Mayhew et al., PCT Publication n® WO 85/00968, publicado em 14 de Março de 1985, descreve um método para reduzir a toxicidade de drogas por encapsulação destas em lipossomas compreendendo alfa-tocoferol e certos derivados seus. Para preparar lipossomas tem-se também utilizado uma variedade de tocoferois e os seus derivados soláveis em água; ver Janoff et al., PCT Publication n⁸ 87/02219, publicado em 23 de Abril de 1987, intitulado Alpha Tocopherol-Based Vesicles” e aqui incorporado por referência.

Num sistema de entrega lípossoma-droga, o agente bioactivo, tal como uma ciroga, está aprisionado no lipossoma e é então administrado ao paciente a tratar. Ver por exemplo Rahraan et al., Patente dos E.U.A. n⁸ 3 993 754; Sears, Patente dos E.U.A. n⁸ 4 145 410; Papahadjopoulos et al., Patente dos E.U.A, n⁸4 235 871 Schneider, Patente dos E.U.A. n® 4 224 179; Lenk et al., Patente dos E.U.A. n® 4 522 803; e Fountain et al., Patente dos E.U.A. n® 4 588 578. Alternativamente, se a droga é lipofilica, esta pode assoei ar-se à camada dupla de lipido. No presente invento,

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-5os termos aprisionar ou encapsular deverão ser entendidos como incluindo, tanto a aroga no volume aquoso do lipcssoma, como a droga associada a dupla camada de lípido.

Muitas drogas, que são úteis no tratamento de doenças, apre sentam toxicidades no paciente; estas toxicidades podem ser car diotoxicidade, corno acontece com a droga antitumor a doxorubicina, ou nefrotoxicidade, como acontece com os antibióticos de aminoglicosido ou de polieno, tal como a anfotericina B. A anfotericina B é um antibiótico de polieno antifungíco, extremamen te tóxico, com a maior segurança, única no tratamento de infecções fúngicas mortais (Taylor et al. , Am. Rev. Respir. Dis.,1982, 125:610-611). Em virtude de a anfotericina B ser uma droga hidrofóbica, é insolúvel em solução aquosa e é comercializada na forma de uma dispersão coloidal em desoxicolato, um detergente que é usado para a suspender, que é ele próprio tóxico. 0 éster de metilo da anfotericina B e a anfotericina B têm também mostrado ser activos contra o vírus HTLV-III/LAV, um retrovírus com envelope de lípiao que aparece na etidogia do sindroma da imunodeficiência adquirida (SIDA) (Schaffner et al., Biochem, Pharmacol., 1986, 35:4110-4113). Neste estudo adicionou-se sal de ácido ascórbico do éster de metilo da anfotericina B (solúvel em água) e anfotericina B, a culturas separadas de células infectadas com HTLV-III/LAV e testaram-se as células para avaliar a replicação do vírus. Os resultados mostraram que o éster de metilo da anfotericina B e a anfotericina B protegeram as células alvo contra os efeitos citopáticos do vírus, de uma forma similar à que se demonstrou para o vírus herpes (Stevens et al., Arch. Virol., 1975, 48:391).

Têm aparecido na literatura artigos comunicando a utiliza ção da anfotericina B encapsulada em lipossomas. Juliano et al (Annals N. Y. Acad. Sei., 1985, 446:390-402) discute o tratamento de infecções fúngicas sistémicas com anfotericina B lipossómica. Estes lipossomas compreendem fosfolípido, por.exemplo dimiristoilfosfatiuilcolina (DMPC) e âimiristoilfosfatidilglicerol (DMPG) numa proporção molar de 7:3, e colesterol. Cs estudos de toxicidade aguda (LD^_Q s) e os testes in vitro, comparando a anfotericina B nas formas livre e aprisionada em lipossomas,

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Portugal mostraram menores toxicidades utilizando preparações lipossómicas com substancialmente a mesma potência antifúngica. Lopez-Berestein et al. (J. Infect, Dis., 1986, 151:704-710 administraram anfotericina B encapsulada em lipossomas a pacientes infectados com infecções fúngicas sistémicas. Os lipossomas compreendiam uma proporção molar de DMPC:DMpG de 7:3, e encapsulou- se a droga com um rendimento superior a 90/6. Como resultado do tratamento com droga lipossómica, com uma percentagem molar de anfotericina B de 5^, 66/6 dos pacientes tratados responderam favoravelmente, com a remissão da infecção fúngica, quer parcial, quer completa. Lopez-Berestein et al. (J. Infect. Dis.,

1983, 147:939-945), Ahrens et al. , (S. Jour. Med. Vet. Mycol. ,

1984, 22:161-166), Panosian et al. (Antimicrob. Agents Chemo., 1984, 25:655-656), e Tremblay et al. (Antimicrob, Agents Chemo., 1984, 26:170-173) testaram também a eficácia comparativa, da anfotericina B livre versus anfotericina B lipossómica, no tratamento e profilaxia em ratinhos, de candidíase e de leishmaniose sistémicas (Panosian et al., supra.). No tratamento de candidíase verificou-se um melhor índice terapêutico com a anfotericina B encapsulada em lipossomas. Em todos os casos verificou-se que podem ser toleradas dosagens muito maiores de anfotericina E, quando esta droga está encapsulada em lipossomas. Nc tratamento de leishmaniose as formulações de anfotericina B-lipossoma ou tinham um efeito muito pequeno ou não tinham mesmo qualquer efeito.

Tem-se também preparado prolipossomas (lípido e droga revestidos num transportador solúvel para formar um material granular) compreendendo DMPC:DMPG, ergosterol e anfotericina B (Payne et al. , J. Pharm. Sei., 1986, 75:330-333)·

Noutros estudos, comparou-se o tratamento intravenoso da criptococose em ratinhos com anfotericina B lipossómica com o tratamento similar com desoxicolato de anfotericina B. (Graybill et al. , J. Infect. Dis., 19θ2, 145:748-752). Os ratinhos tratados com anfotericina E lipossómica mostraram maiores tempos de sobrevivência, menores contagens de criptococus nos tecido e menor toxicidade aguda. Os lipossomas multilamelares usados neste estudo continham ergosterol. Taylor et al. (Am. Rev.

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Resp. Dis., 1982, 125:610-611) trataram a histoplasmose em ratinhos com anfotericina B lipossómica, compreendendo os lipossomas ergcsterol e fosfolípidos. As preparações lipossomicas foram menos tóxicas, mais eficazes no tratamento aa histoplasmose, e alteraram as distribuições no soro e nos tecidos, com menores níveis no soro e maiores concentrações no fígado e no baço do que as que se obtêm com as preparações de anfotericina livre.

Nos estudos anteriormente referidos, usaram-se lipossomas contende lípidos para diminuir a toxicidade da droga aprisionada, nc sentido de aumentar o teor em lípido nas formulações por forma a tampenar a toxicidade da droga. 0srequerentes verificaram surpreendentemente que de facto, um constituinte lípide em pequena percentagem uiminui muito eficientemente a toxicidade. Na preparação dos HDLCs da invenção por um processo MLV, pode resultar uma população mista de HDLCs com MLVs; estas preparações utilizam ue cerca de 5 a cerca de 25 por cento molar de droga (anfotericina B), aumentando a proporção de HDLCs com c aumento da percentagem molar de droga. As preparações que utilizam de 25 por cento molar a cerca de 50 por cento molar de droga são substancialmente HDLCs isentos de lipossomas. Alternativamente, as preparações contenuo 5 P°- cento molar de droga hidrofóbica e menos, são substancialmente lipossómicas com alguns HELCs. Se necessário a separação dos HELCs das populações heterogéneas pode realizar-se usando qualquer técnica de separação conhecida na arte, por exemplo, por centrifugação de gradiente de densidades.

Os processos usados para preparar estes HDLCs podem ser substancialmente os mesmos que se utilizam para preparar lipossemas, embora no presente invento, usando elevadas proporções de droga : lípide, se formem mais HDLCs qo que lipossomas, com uma inesperadamente maior redução na toxicidade quando comparada com a das formulações lipossómicas.

SUiJARÍU DA INVENÇÃO presente invento descreve o processo ae preparação de sistemas de HDLC. (complexos com elevada proporção de droga:

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'.lipido), que compreendem lípiaos e agentes bioactivos, incluindo drogas. Estes HDLCs podem compreender fosfolípidos tais como DMPC e DiíPG, preferivelmente numa proporção melar de 7:3, ou fosfolípidos, ou fosfolípidos ae ácidos gordos, saturados. 0 agente bioactivc é preferivelmente uma droga, tal como urna droga antifungíca, tal como a nistatina ou a anfctericina B. A percentagem molar de droga presente é preferivelmente de cerca de 6 a cerca de 5C por cento molar, preferivelmente de 3θ a por cento molar. As composições farmacêuticas de HDLCs, compreendenuo preferivelmente uma droga tal como a anfctericina B, são preparadas compreendendo transportadores ou diluentes farmacêuticamente aceitáveis, e estas composições podem ser administradas parenteralmente. Estas composições são usadas no tratamento de doenças infecciosas, tais como infecções fúngicas, por administração destas composições a mamíferos incluindo o homem. As composições contendo HDLC do presente invento incluem composições substancialmente isentas de lipossomas e composições substancialmente isentas de lipossomas contende a droga. Geralmente as composições contêm substancialmente não mais do que cerca de 10 por cento em peso de lípido, preferivelmente não mais do que cerca de 5$, e mais preferivelmente não mais do que cerca de 3/?.

Descrevem-se vários processos de preparação de HDLCs da invenção; por exemplo, técnicas que solubilizam primeiro a droga, especificamente anfctericina B num solvente tal como DMSO ou metanol. Solubiliza-se o lípido (preferivelmente DMPC:DMPG numa proporção molar de 7:3) num solvente tal como diclorometanc, e misturam-se as soluções de droga e de lípido. Podem evaporar-se os solventes sob pressão reduzida, resultando um filme' fino de lípide-droga. pode hidratar-se o filme numa solução aquosa tal como soro fisiológico salino, PBS ou tampão de glicina, for mando-se os HDLCs. Alternativamente, pode adicionar-se a solução aquosa à fase oe solvente contendo droga e lípido, antes da evaporação do solvente. Como cutra alternativa, pode ressuspender-se o filme resultante de lípido-droga seco num solvente, tal como diclorcmetano e evaporar-se de novo sob pressão reduzida antes da hidratação ao filme. Pode usar-se também um processo . 67 441 ( TLC 128α

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de desidratação; neste processo desidrata-se um filme seco de lípido-droga para formar um floco que é hidratado com solução aquosa.

Num processo alternativo ae preparação de HELCs da invenção formam-se partículas de lipido (ou lipossomas) contendo agente bioactivo (arcga, por exemplo antifungícos de polieno tal como a anfotericina E), preparadas pelo processo ilLV, contendo cerca ae 6 por cento a 50 P^cr cento molar de anfotericina B e sujeitam-se depois as partículas (ou lipossomas) a um ciclo de aquecimento, a.uma temperatura de cerca de 25 C a cerca de 60 C, muito preferivelmente de cerca de ÓO°C. Forma-se por este ciclo um complexo de anfotericina B/ lipido mais altamente ordenado e menos tóxico.

Num outro aspecto do presente invento usa-se uma técnica de espectros ae absorvância para determinar a toxicidade de um complexo de droga (por exemplo, um antifungíco de polieno tal como a anfotericina E) - lipido. 0 espectro de absorvância de uma droga é específico dessa aroga; a assinatura da droga pode ser um pico ou uma série ae picos na gama do visivel ou do ultra-violeta. 0 pico de assinatura da anfotericina B, (representado na figura 12, dissolvida em desoxicolato), situa-se entre os 300 e os $00 nm, e tem picos caracterlsticos, cujo mais representativo se encontra a 413 nm. Pode usar-se quantitativamente a atenuação deste pico, devida à complexação da arcga com o lipido, comc medida da toxicidade do HDLC. Por outras palavras, o grau de toxicidade pode ser determinado pela intensidade da altura do picc de absorvância.

Descreve-se também um processo de carregamento de lipossomas compreendendo a dispersão da droga, especificamente do’ antibiótico de polieno, anfotericina E, por sonicação num solvente, tal comc etanol, ao qual se adicionou um ácido, tal como o ácido clorídrico. Hidrata-se um filme de lipido, compreendendo especificamente DMPC:DiíPG numa proporção molar de 7:3, com uma solução aquosa, especificamente, com um tampão aquoso tal como PBS, e carrega-se umaaliquota da solução acidificada de etanol contendo a droga nos lipossomas, por adição desta à preparação de lipossomas. Remove-se o etanol na suspensão resultante e

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-10ressuspende-se a solução com uma solução aquosa. Dependendo da proporção molar de droga co-misturada com o lípido, o processo favorec° a formação de HDLCs em vez de lipossomas; por exemplo para uma percentagem molar de droga de cerca de 16 e superior, formam-se mais HDLCs do que lipossomas. Alternativamente para uma percentagem molar de droga de 0-15 por cento, o processe favorece a formação de lipossomas. Por este processo cie carregamento com etanol acidificado podem preparar-se lipossomas ou HDLCs para utilização como composições farmacêuticas, pela adição de transportadores ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis e podem usar-se no tratamento de infecções fúngicas por administração a um mamífero tal como o homem.

Breve Descrição dos Desenhos

A figura 1 4 um gráfico ilustrando a toxicidade aguda medida pelo valor de LD^q como função da percentagem molar de anfotericir.a B na preparação.

A figura 2 é ura espectro de calorimetria de varrimento diferencial de uma preparação lipossómica (MLV) contendo 5 per cen to molar de anfctericina B.

A figura 3 θ um espectro de calorimetria de varrimento diferencial de uma preparação de HDLC (processo MLV) contendo 25 por cento molar de anfotericina B.

A figura 4 é um gráfico de um gradiente isopícnico de lipossomas muitilameiares contendo 5 por cento molar de anfotericina B. Lípido (linha a cheio); anfotericina B (linha a tracejado).

A figura 5 é um gráfico de um gradiente isopícnico de HDLCs (processo MLV) preparados com 5θ por cento molar de anfotericina B. Lípido (linha a cheio); anfotericina B (linha a tracejado).

A figura 6 mostra gráficos de dados de difraeção de raies-X para preparações de lipossomas e de HDLCs (processo MLV) contendo 5 e 50 por cento molar de anfotericina B (respectivamente) A figura 7 mostra espectros de RMN-^p de preparações de HDLCs (processe MLV) contendo 2$ e 5θ por cento molar de anfo67 441

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tericina B.

A figura 8 mostra espectros de RMN-^p de preparações de lipossomas (MLV) contendo 0 e 5 por cento molar de anfotericina B.

A figura 9 é um gráfico de um gradiente de densidades isopicnico de lipossomas, contendo anfotericina B, preparados pelo processo do etanol acidificado, contendo 5 por cento molar de anfotericina B. Lípido (linha a cheio); anfotericina B (linha a tracejado).

A figura 10 é um espectro de absorvância da anfotericina B livre dissolvida em desoxicolato.

A figura 11 são espectros de absorvância de anfotericina B 5$ molar (a), anfotericina B 25$ molar (b), anfotericina B 25% molar após aquecimento (c) e anfotericina B 50$ molar (d), em DMfCcDMPG 7:3«

A figura 12 é um espectro de absorvância de anfotericina B 25$ molar em DMpC:DMPG 7:3, antes (a) e após (b) aquecimento durante 10 minutos a ÓC°C.

A figura 13 é um espectro de DSC de DMPC/DMPG 7:3 contendo anfotericina B 25$ molar, antes (a) e após (b) o ciclo de aquecimento, comparados com c espectro dc DMPC/DMPG puro (c).

A figura 14 é um espectro de RMN-^p de complexos de DMPC/ /DMPG numa proporção molar de 7:3, contendo anfotericina B 25$ molar, antes (a) e após (b) o ciclo de aquecimento a 60°C.

A figura 15 é um gráfico demonstrando a influência da força iónica na incorporação da anfotericina B em lipossomas de DMPC:DMPG.

A figura 16 mostra o efeito da temperatura de incubação na velocidade de incorporação da anfotericina B em lipossomas' de DMPC:DMPG.

A figura 17 mostra a influência da estrutura do lipossoma na incorporação de anfotericina B em MLVs ou LUVs de DMPC:DMPG.

Descrição detalhada da invenção

No presente invento descrevem-se complexos não lipossómicos com elevados teores ae drcga : lípido, com propriedades únicas,e

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-12os prccesscs utilizados na sua preparação. Estes HDLCs contêm um agente bicactivo tal como uma droga hidrofóbica, que, quando se administra o HDLC a um organismo, pode ter uma eficácia substancialmente equivalente ou superior e uma menor toxiciuade, quando comparadas com as da droga administrada, quer na sua forma livre, quer na forma lipossómica. Estes HDLCs compreendem uma proporção molar de droga : lípido elevada (superior a cerca de 5$ molar em droga). 0 presente invento demonstra surpreendentemente a menor toxicidade dps complexos contendo menos lipido, tais como os presentes sistemas de HDLC, quando comparados com os sistemas lipossómicos. 0 presente invento envolve formulações de HDLC para utilização como drogas, e sistemas transportadores em associação com drogas tais como os antibióticos de pclieno anti-fúngicos, anfotericina B e nistatina. Estas formulações, ao contrário do que acontece com as formulações correntes comercialmente disponíveis, são estáveis em soluções aquosas tais como soro fisiológico salino.

Adicionalmente, descreve-se um novo método de carregamento de lipossomas que compreende o carregamento de lipossomas por aprisionamento de uma droga através da formação de um intermediário ae solvente. Este solvente tem as caracteristicas de solubilizar o agente bioactivo, tal comc a anfotericina B, de não romper a estrutura da membrana do lipossoma e ue ser compatível com uma solução aquosa tal como água. 0 etancl é um destes solventes. Este processo decorre sem a utilização de solventes orgânicos. Dependendo da percentagem molar de droga usada na preparação, formar-se-ãc HDLCs em vez de lipossomas. No caso de se favorecer a formação de HDLCs, o processe carrega os HDLCs com droga.

Os HDLCs referem-se a lípiaos associados a droga na forma de partículas, sendo estas partículas não lipossómicas por natureza. Quando se fermam usando um processo MLV, estes HDLCs são caracterizados por exemplo, por: (1) micrograficos electrónicos de fractura de congelamento (Deamer et al., Biochim. Biophys. Acta, 1970, 219:47- 60), que demonstram a presença de complexos lipossómicos; (2) medições do volume capturado (Deamer et al., Chem. Phys. Lipids, 19θό, 40:167-188), que mostram ser os volu

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-13mes aprisionados essencialmente nulos sendo pois as preparações não lipcssómicas; (3) calorimetria de varrimento diferencial (DSC) (Chapman, D., em: Liposome Technology, GregGriadis, G. , ed., 1984, CRC Press, Boca Raton), que mostram a ausência da dupla camada de lípido da fase de pré-transição ou de transição principal: (4) espectros de RMN-^^P (Cullis et al., 19^2 em: Membrane Fluidity in Biology, Academic Press, Inc., London &

N.Y.), que sugerem características de lípide altamente imobilizado (isotrópico largo); e (?) dados de difraeção de raios X (Shipley et al. , em: Biomembranes, 1973* Chapman, D. e VJallach, D., eds., Vol 2:1, Academic Press, Inc., London à N.Y.), indicativos de fase lípida em gel. A associação completa da droga com o lípido, tal como é evidenciado por centrifugação de gradiente de densidades, é também característica destes sistemas. Mesta técnica centrífuga-se o gradiente a uma força elevada (cer ca de 230 000 x g) durante cerca de 24 horas. Isto assegura que todos os componentes no gradiente atingem as suas posições de equilíbrio de densidades. Os perfis de eluição destes sistemas mostram a sobreposição dos picos de droga e de lípido, o que in dica que toda a droga está associada com o lípido.

Um aspecto do presente invento consiste numa proporção de droga : lípido, para a qual se formam HDLCs, que resulta numa eficácia substancialmente equivalente ou superior da uroga, diminuindo geralmente a toxicidade aguda, tal como é determinado pelos valores de LD^ em ratinhos (figura 1). Os requerentes verificaram que uma percentagem molar de droga hiarofóbica compreendida entre cerca de ó e $0 por cento satisfaz estas condições, situando-se uma percentagem preferida entre cerca de 15 e 50, mais preferivelmente entre cerca de 25 e 50* muito preferivelmente entre cerca de 25 e 35 por cento molar de droga hidrof óbica.

Quando as concentrações de droga excedem cerca de 6 por cento molar e se aproximam de 25$ molar, formam-se populações mistas de lipossomas e de HDLCs. Dentro desta gama, quando a percentagem molar de droga se aproxima de 25* forma-se uma maior percentagem de estruturas de HDLC do que de lipossomas. Para concentrações de droga de cerca de 5 por cento molar e inferio67 441

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res, e até um limite mais baixo de concentração de lípido, conhecido na arte como a concentração micelar crítica, estão presentes populações mistas de HDLC/lipossomas, embora estejam presentes principalmente estruturas lipossómicas. Estes lipos somas podem ser preparados de acordo com o novo processo de for mação de um intermediário de etanol, do presente invento.

As várias dispersões de droga-lípido observadas por centrifugação de densidade são características dos HDLCs anteriormente referidos. As separações do complexo de droga-lípido (DMPC: :DMPG, numa proporção molar de 7:3) nas colunas de sacarose de densidade isopícnica, mostram a formação de bandas que é dependente da proporção de droga : lípido e do processo de preparação. Em sistemas preparauos pelo processo MLV compreendendo 5 por cento mclar.de droga, observam-se duas bandas principais de ma terial; uma aos lipossomas e outra onde a droga está associada com o lípido (HDLCs). As preparações contendo 25 e 5θ por cento molar de droga mostraram uma única banda onde a maioria da droga está associada com o lípido. Surpreendentemente, estes sistemas com baixa percentagem melar de lípido/percentagem molar de droga mais elevada, foram menos tóxicos. A figura 1 mostra valores de LD^Ínig/kg) em ratinhos em função droga, anfotericina B, na preparação, tam para percentagens molares entre 5 da percentagem molar de

Os valores de LD e 50 por cento, e d aumenecre scem depois para 60 por cento molar. Representa-se também o valor de LD^q para a forma desta droga comercialmente^^ungizona, a cerca de 3,5 mg/kg. A lise de células sanguíneas (hemolise) demonstra o mesmo fenómeno de toxicidade.

Os estudos de volume capturado (aprisionamento de soluto ( em pl) por ^ímole de lípido) realizados em preparações de ?ZLV de associações de droga-lípido, com percentagem molar de droga: lípido variável, demonstram a natureza invulgar das formulações com 25λ molar e com valores superiores (JDLC); estes sistemas não aprisionam soluto e não são por isso lipossómicos. As micrografias electrónicas de fractura de congelação destes mesmos sistemas demonstram a presença de lipossomas para percentagens molares de droga entre 0 e 5 por cento, mas para percentagens molares de droga entre 25 e 50 por cento, verifica- se a presen

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-15ça de HDLCs não lipossómicos.

Os testes de calorimetria de varrimento diferencial, reali zados em preparações de MLV com percentagens molares de droga variáveis, demonstram os mesmos fenómenos isto é, os espectros mostram picos de transição característicos do lípido no estado de dupla camada não perturbada, para uma percentagem molar de droga de 5 por cento (figura 2), mas para uma percentagem molar de droga de 25 por cento (figura 3) não se observam picos de transição. No caso da percentagem molar de droga de 25 por cen to, todo o lípido está completamente associado com a droga, i. e., as cadeias acilo do lípido não estão disponíveis para sofrer uma transição cooperativa. Estes dados confirmam os resultados de centrifugação ae densidade que mostram, para uma concentração de droga de 5 por cento molar, um pico duplo de lípido associado à droga e de lípido livre (figura 6), e para concentrações de droga de 25 e 5θ por cento molar, um único pico para o qual todo o lípido está associado com a droga (figura 5)·

Os dados de raios X para 5 por cento molar (processo MLV) mostram a presença de uma fase de lípido em gel para baixas tem peraturas, com uma transição para uma fase cristalina líquida para a temperatura característica de 23°C. Contudo, para uma percentagem molar de droga de 5θ por cento, o lípido está na fase de gel para todas as temperaturas; não existe qualquer transição devido ao facto de todo o lípido estar em íntima associação com a droga (figura 6). Os dados similares obtidos a partir de estudos de RMN-^P mostram a ausência de sinal do lípido livre para estas formulações com percentagens molares de droga mais elevauas (25 e 5θ) (HDLCs); o ombro do campo baixo e o pico do campo alto, característicos deste tipo de lípido, estão ausentes (figura 7), enquanto que para amostras com percentagens molares de droga de 0 e 5 por cento, estas característlcas são visíveis (figura Ô).

Se bem que os sistemas de complexos de lípidos com as suas elevadas proporções de droga-lípido associadas sejam um dos aspectos do presente invento, na formação destes complexos de lípido podem usar-se procedimentos para a formação de liposscmas. Especificamente, estes procedimentos incluem os procedimentos

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ί.,

-Ιοpara preparar lipossomas conhecidos como vesículas multilamelares (ilV). Podem usar-se outros processos, por exemplo, processos com os quais se formam vesículas plurilamelares estáveis (SPLV), grandes vesículas unilamelares que se formam por um procedimento ae extrusão (LUVETS), ou outros procedimentos conhecidos na arte para formação de lipossomas. Lenk et al., Patente dos E.U.A. n⁵ 4 522 8l>3, publicada em 11 de Junho de 198? descreve o processo para formação de SPLVs, e Cullis et al. , PCT Application n⁵ Wc 80/00238, publicada em 16 de Janeiro de 1986, descreve o procedimento LUVET; as partes relevantes de cada uma destas referências sãc aqui incorporadas por referência. No novo aspecto da formação de lipossomas do presente invento, preparam-se os lipossomas em solução aquosa à qual se adiciona a droga a ser'aprisionada em etanol acidificado. Numa outra concretização da formação de lipossomas, de acordo com o presente invento, incorpora-se a anfotericina B nos lipossomas via formação de um intermediário aquoso. Nesta técnica, suspende-se a anfotericina B numa solução aquosa, por exemplo água destilada, por sonicação. Mistura-se então a droga em suspensão, com uma suspensão de lípiao em solução aquosa, tal como água destilada ou solução de cloreto de sódio. Incuba-se a mistura a uma temperatura igual ou superior à temperatura de transição do lípiao utilizado, com a resultante formação de MLVs.

Os lípidos que se podem usar (1) na preparação de complexos ae lípiao, e (2) na nova técnica de preparação de lipossomas do presente invento, sãc os fosfolípiaos tais como fosfatidilcolina (PC), fosfatiailetanolamina (PE), fosfatidilserina (PS), fosfatidilglicerol (PG), ácido fosfatídico (PA), fosfatidilinositol (PI), esfingomielina (SPM), etc., sózinhos ou em combinação. Podem também usar-se fosfolípidos saturados tais como PC de soja hidrogenada, Os fosfolípidos podem ser sintéticos ou obtidos a partir de fontes naturais tais como ovo ou soja. Composições de lípidos adicionais são por exemplo os ácidos gordos saturados tais como o ácido mirístico. Nas concretizações preferidas usam-se os fosfolípidos, dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC) e dimiristoilfosfatidilglicerol (DMPG) em combinação, numa propor ção melar qualquer, de cerca de 99:1 a cerca de 1:99 de DMPC:

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-17:Dj1PG, preferivelmente numa proporção molar de 7:3· Podem também usar-se a DNIPC e a dimiristoilfosfatidilserina (DMPS) em combinação. A DMPC pode contudo usar-se sozinha. Os complexos de lípido e os lipossomas podem também conter um componente esteróide como parte da fase de lípido, e estes esteroides podem ser o colesterol, derivados de polietilenoglicol do colesterol (colesteróis PEG), coprostanol, colestanol, colestano, derivados de ácidos orgânicos de esterois tais como hemissuccinato de colesterol (CH3), etc. Como agentes de formação de complexos ou de lipossomas pedem também usar-se derivados de ácidos orgânicos de tocoferois, tais como o hemissucinato de alfa-tocoferol (THS). Geralmente, podem preparar-se ambos os complexos contendo CHS e THS, e as suas formas de sal tris, per qualquer método conhecido na arte para a preparação de lipossomas conten do estes esteróis. Em particular, ver os procedimentos de Janoff et al., Patentes dos E.U.A. n® 4 721 614, publicada em 26 de Janeiro de 1983, intitulada Steroidal Liposomes, e Janoff et al., PCT Publication n® 87/02219, publicada em 23 de Abril de 1987 intitulada Alpha-Tocopherol Based Vesicles, depositada em 24 de Setembro de 1986 respectivamente, cujas partes relevantes são aqui incorporadas por referência.

Mo presente invento podem usar-se agentes bioactivos tais como arogas. No caso dos HDLC, usam-se agentes bioactivos que são hidrofóbicos; no caso dos lipossomas os agentes bioactivos podem ser, quer hidrofóbicos quer hidrofílicos, na medida em que os lipossomas aprisionam ambos os tipos de agentes. Estes agentes bioactivos incluem, mas não estão limitados aos antibióticos de polieno, tais como os agentes antifungicos, pimaricina, canúicidina, filipina, e preferivelmente, nistatina-e anfotericina B. Podem usar-se outros agentes bioactivos que incluem, mas não estãc limitados a compostos antibacteriancs tais como os aminoglicosiaos, por exemplo, a gentamicina, compostos antivirais tais como a rifampacina, compostos antiparasitas tais como derivados de antimónio, compostos antineoplásticos tais como a vimblastina, vincristina, mitomicina C, doxor rubicina, daunorrubicina, metotrexato e cisplatina, entre outros, proteínas tais como albumina, toxinas tais como a toxina

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-18diftérica, enzimas tais como a catalase, hormonas tais como estrcgénios, neurotransrnissores tais como a acetilcolina, lipopro teínas tais como a lipoproteína alfa, glicoproteínas tais como o ácido hialurónico, imunoglobulinas tais como a IgG, imunomoduladores tais como os interferões ou as interleucinas, corantes tais como o Arsenazo III, radlomarcadores tais como o C, com- postos radio-opacos tais como o Te, compostos fluorescentes tais como a carboxifluoresceína, polissacarídeos tais como o glicogénio, moléculas de ligação a receptores de células tais como a proteína ao receptor de estrogénio, anti-inflamatórios não esteróides tais como a indometacina, acetato de ácido salícílico, ibuprofeno, sulindaco, piroxicam e naproxeno; anti-inflamatórios tais como a dexametasona, agentes antiglaucómicos tais como o- timolol ou a pilocarpina, anestésicos tais como a dibucaína, ácidos nucleicos tais como a timina, polinucleotídeos tais como polímeros de ARN, agentes cardiovasculares tais como o bloqueador alfa, o bloqueador beta, os bloqueadores do canal de cálcio, inibidores de ACE e etc., agentes CNS e prostaglandinas.

Durante a preparação dos HDLCs, tal como na preparação geral de lipossomas, podem usar-se solventes orgânicos. Os solventes orgânicos adequados são aqueles que têm polaridades e propriedades dieléctricas intermédias (aqueles com uma polaridade intermédia a cargas eléctricas opostas), que solubilizam lipídos, e incluem, mas não estão limitados a clorofórmio, metanol, dimetilsulfóxido (DMSO), diclorometano, e misturas de solventes tais como clorofórmio:metanol (70:30) e benzeno:metanol (70:30). Como resultado formam-se soluções contendo os lípidos definidos como sendo misturas nas quais os componentes se'encon tram uniformemente distribuídos. Os solventes são escolhidos preferivelmente, ccm base na sua biocompatibilidade, baixa toxicidade e inflamabilidade. Quando se solubiliza a uroga especificamente a anfotericina B, prefere-se o DMSO pois a droga é mais solúvel em DMSO. 0 DMSO pode ser substituído por metanol com o concomitante aumento do volume do solvente. Para solubilizar o lípido usa-se preferivelmente o diclorometano devido à sua baixa toxicidade em humanos. No novo processo de prepara

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-19ção de lipossomas dG presente invento os solventes preferidos são o etanol ou soluções aquosas.

'^To passe de hidratação da formação do HDLC, podem usar-se soluções aquosas tais como água destilaua (por exemplo água USr para injecção), soro fisiológico salino ou tampões aquosos. Po dem usar-se tampões aquosos que incluem, mas que não estão limitados a, soluções salinas tamponadas tais como solução salina tamponada co fosfato (PBS), tampões de hidrocloreto de tri s—( hidroximetil )aminometano (tris) ou tampões de glic.ina, a um pH de cerca de 7₅O a 7,5, preferivelmente de 7,2.

Nos passos de formação dos HDLCs ou dos novos lipossomas pode usar-se um passo de sonicação. Um tal procedimento é realizado num sonicadGr de banho durante cerca de 15 a cerca de 30 minutos,, a 25°C, a cerca de 5C~6O Hz.

podem dimensionar-se os HDLCs ou os lipossomas assim preparados, por extrusão através de um filtro de acordo com o procedimento de Cullis et al., fCT rublicaticn n° 88/CO238, publicado em 16 de Janeiro de 1986, cujas partes relevantes são aqui incorporadas por referência. Estes procedimentos de dimensionamento permitem a formação de populações de partículas homogéneas em relação ao tamanho. A filtração dos HDLCs pode realizar-se, por exemplo, através de um filtro de membrana com um percurso tortuoso ou com um percurso linear, tal come um filtro de policarbonato.

Cs HDLCs ou os lipossomas preparados de acordo com os novos processos do presente invento podem ser sujeitos a um proce dimento de liofilização ou de desidratação nas várias etapas da formação. Por exemplo, pode liofilizar-ce o filme de lípido após a remoção dc solvente e antes da adição da droga. Alternativamente, podp liofilizar-se o filme de lípiao-droga antes da hidratação do HDLC ou dc liposscma. Pode realizar-se esta desidratação por exposição do lípido, HDLC ou lipossoma a pressão reduzida, removendo-se deste modo todo o solvente da suspensão. Alternativa cu adicionalmente, pode também desidratar-se a preparação de HDLC ou de liposscma, finalmente hidratada colocando-a num meio envolvente de azeto líquido e congelanuo-a antes do passo de desidratação. Pode realizar-se a desidra

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-20tação com ccngelarnento prévio, na presença de um ou mais açúcares protectores na preparação, de acordo com as técnicas de Bally et al., PCT Publication n^c 86/01103 publicada em 27 ae Fe vereirc de 1986, cujas partes relevantes são aqui incorporadas por referência e oe Schneider et al., Patente aos E,U.A. n^c

229 3óC, publicada em 21 de Outubro de 1980. Estas técnicas aumentam o armazenamento prolongado e a estabilidace das preparações. Na desidratação das preparações de complexos de lípido anteriormente referidas podem usar-se quaisquer outros métodos adequados _óá conhecidos ou que ainda se venham a conhecer.

Um processo ae preparação dos HDLCs do presente ir.vento compreende um procedimento MLV caracterizado por se dissolver o agente bioactivo (por exemplo uma droga) em metanol num balão, ao qual se adiciona depois um lípido, tal como DMPC e DMPG numa proporção melar de DMPC:DMPG de 7:3, ^e71 clorofórmio. Após roto evaporação da solução sob pressão reduzida, ressuspende-se o filme seco em eBS e sónica-se num sonicador de banho (a cerca de 25°C durante cerca de 3G' minutos, a cerca de 5O-6C Hz) até se ter uma solução límpida. Para percentagens melares de droga: :iípidc de cerca de 6 e superiores (até cerca de 6ϋ por cento molar), as preparações são constituídas por estruturas de HDLC não lipossómicas, substancialmente isentas de lipossemas. As toxicidades das preparações de HDLC são dependentes da razão droga:lípiao; as preparações com maiores percentagens de droga: rlípido (cerca de 16 a 5G por cento molar de droga) mostram menor toxicidade aguda do que as preparações de menor proporção droga:lípido (cerca de 6-15 por cento molar de droga). Tal como anteriormente se referiu, as preparações contendo até cerca de por cento molar de droga são substancialmente lipossómicas.

Outro método é um procedimento MLV modificado pelo qual se seca o filme ue aroga-lípido sob pressão reduzida num balão de vidro para produzir um floco de drcga-lípido. Pulveriza-se este floco na forma de um pó que se hidrata homogeneamente quando se adiciona uma solução aquosa. Este procedimento envolve uma solução ua droga num solvente orgânico tal como DMSO ou metanol a que se segue a mistura com um lípido (muito preferivelmente uma mistura de DMPCiDMPG numa proporção molar de 7:3) em diclo67 441

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rometano. Seca-se então a mistura sob pressão reduzida até se formar um filme que é depois seco, por exemplo r.um balão de vidre, sob pressão reduzida. Hidrata-se o pó anidro resultante com uma solução salina aquosa e aquece-se formando-se uma suspensão oe droga-lípido. Como anteriormente se referiu, a formação de HDLCs, lipossomas e suas misturas, e o seu concomitante grau de toxicidade, depende da proporção de droga : lípido.

Na preparação dos HDLCs podem usar-se outros processos.

Um destes processos compreende um procedimento SPLV caracterizado por se dissolver a droga num solvente tal como c DMSC. Seca-

- se um lípido (tal como DMPC:DMPG numa proporção melar de 7:3) num solvente (por exemple clorofórmio ou diclorometano) sob pres são reduzida até se formar um filme fino, e adiciona-se ao lípido um solvente orgânico tal como diclorometano. à susper.são de lípide adiciona-se umaalíquota da droga (por exemple, anfotericina B) em solução e sonica-se a mistura resultante até se obter uma solução límpiaa. Adiciona-se uma solução aquosa tampenada (por exemple solução salina tamponada) e coloca-se de novo a mistura sob pressão reduzida para remover o diclorometano. Hicrata-se ainda a pasta resultante com PBS e sonica-

- se até se obter uma solução límpida. Tal como no procedimento anterior a preparação resultante será de HDLC ou lipossómica dependendo da proporção molar de droga : lípido utilizada. Os valeres de LD^q determinados em ratinhos usando esta preparação mostraram, com proporções de drega : lípido elevadas, toxicidades menores.

Um outro processo compreende um procedimento SPLV modificado caracterizado por se misturar a droga num solvente orgânico (por exemple, DÀISU) com o lípido (por exemplo DMPC:DMPG) em solução, e por se adicionar uma solução aquosa tamponada (por exemplo, rES), seguindo-se a evaporação do solvente sob azoto ccm sonicação. Adiciona-se uma quantidade adicional de PBS e filtra-se a solução resultante, preferivelmente através de um filtro de 5 micrcn e centrífuga-se depois a cerca de 10 000 x g durante cerca de 10 minutos. Remove-se a solução sobrenadante, descarrega-se e ressuspende-se o bole num solvente aquoso (PES). Após uma segunda lavagem” por centrifugação, ressuspende-se o

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-22bolo resultante em FBS. Tal como nas preparações anteriormente referidas, a toxicidade aguda das preparações está directamente relacionada com a proporção droga : lípido; isto é, quanto mais elevada por esta proporção (até cerca de 60 per cento molar de droga), menos toxica é a preparação.

Ainda um outro processo SrLV compreende uma preparação caracterizada por se misturarem as soluções de droga-solvente e de lípido como anteriormente, com a diferença de se adicionar água para injecção, USP, em vez de solução salina e de se aquecer a suspensão a 37°C. Evapora-se oe novo o solvente, sob azo ( to com scnicação, adicicna-se mais água para injecção e mantem- se a solução a 37°C durante cerca de 1G minutos. As preparações são assepticamente filtradas através de um filtro de 0,1 ou 0,15 mícron usando c método LUVET. Este método compreende um procedimento de extrusão pele qual, por filtração a pressões de cerca de 700 psi se produzem lipossomas, e é descrito por Cullis et al., PCT Publicatlon n^c 86/99238, publicada em 16 de Janeiro de 1986, cujas partes relevantes são aqui incorporadas por referência. Estas preparações podem também ser desidratadas de acGrdo com os métodos de Bally et al. , tal como anteriormente se descreveu. Os testes de toxicidade aguda demonstram de novo os efeitos aliviantes de uma proporção de droga : lípido elevada, na toxicidade da droga.

7. Um outro prccesso envolve a dissolução da droga, em etanol anidro acidificado, por sonicação. Liofiliza-se um lípido (por exemplo uma mistura de DMPC:DMPG numa proporção molar de 7:3) dissolvido num solvente (por exemplo, benzeno:metanol), mistura-se depois com vortex com um solvente aquoso (por exemplo, ΡΒΞ), adicicna-se a solução acidificada de álcool-dróga e agita-se a temperatura ambiente. Liofiliza-se depois a preparação e re-hiarata-se com tampão aquoso. Alternativamente, pode evaporar-se o solvente obtendo-se um filme de droga : lípido que se pode hidratar com uma solução aquosa. As mais baixas toxicidades agudas estão de novo associadas com preparações de maiores proporções de drega:lípido. Quando se usa uma concentração molar de droga de cercade 5 por cento e inferior, o pro cesso produz principalmente lipossomas, quando comparado com a

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-23utilização de percentagens molares de droga de 6 por cento e superiores que cão origem principalmente a HDLCs. A centrifugação de preparação num gradiente ce uensidade confirma que todo o lípido está associado com a droga. A preparação pode depcis ser liofilizada, o que remove o etanol, e re-hiaratada com uma solução aquosa tal como água destilada.

Numa outra concretização do presente invento para a fcrmação de lipossomas, incorpora-se a anfotericina B nos lipossomas através da formação de um intermediário aquoso. Nesta técnica, suspende-se a anfotericina B numa solução aquosa, por exemplc água destilada, por sonicação. Mistura-se depois a droga em suspensão com uma suspensão do lípido em solução aquosa, tal como água destilada ou solução de cloreto ce sódic. Incuba- se a mistura a uma temperatura igual ou superior à temperatura de transição do lípido utilizado com a formação resultante d e MLV 3.

Crê-se que as preparações com uma proporção molar de anfotericina E : lípido elevada exibem uma toxicidade baixa em virtude das maiores interacções anfotericina B- anfotericina B na matriz de lípido. Isto pode ser demonstrado por espectroscopia de absorvância. A abscrvância a 413 nm, por exemplo, devida à anfotericina B livre em descxicolato é superior à de 5% molar de enfctericina B em lípido, não aquecida. Além disso, a absor<. vância para 25% molar de anfotericina B é superior à exibida por 50% molar de anfotericina B em lípido (ver a figura 10).

Usa-se a técnica do espectro de abscrvância para determinar a toxicidade de um complexo de droga (por exemplo, anfotericina B) - lípido. 0 espectro de absorvância de uma drcga é específico dessa drcga; a assinatura da anfotericina B (representado na figura 12, dissolvida em desoxicolato), situa-se entre cs 300 e os 500 nm e tem picos caracteristicos, o mais representativo dos quais aparece a 413 nm. Pode usar-se quantitativamente a atenuação neste pico, por complexação da droga com um lípide, como medida da toxicidade do HDLC. Quando complexados desta forma, qualquer dos lípidos anteriores revelará os picos de absorvância caracteristicos, embora algo atenuados, aqui referidos uma vez que os espectros são específicos da aro67 441

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ga.

3e se aquecem a 25~óO°C os sistemas anfotericina B - lípidos que exibem menos do que a toxicidade máxima tamponante (por exemplo amostras de 25% molar), atenua-se a toxicidade do sistema resultante (ver figura 11). Esta atenuação continua até um máximo da toxicidade, observada quando a anfotericina B está complexada com 5&% molar de lípido (ver figura 11). Uma explicação possível é a de que esta atenuação ocorre porque o lípido está numa fase separada e é deste modo expelido da anfotericina B no passe de aquecimento, permitindo uma associação mais íntima da anfotericina B com ela própria, e originando assim um sistema mer.os tóxico. A existência dò lípido expelido é demonstrada pela reaparição ( após aquecimento) ae uma endotérmica, observada no espectro de calorimetria por varrimento diferencial (ver figura 12), consistente com o lípido substancialmente isento de anfotericina B. Além disso, a existência do lípido expelido pode ser demonstrada pelo estreitamento do sinal de RaN-^P que tem origem em sistemas aquecidos (ver figura 13)· Este estreitamento é de novo consistente com uma con centração de anfotericina B no lípido substancialmente reduzida.

Finalmente, a microscopia electrónica da fractura de congelamento de sistemas aquecidos revela a existência de lípido (e de lipossomas) após o aquecimento, existência esta ainda não anteriormente observada. A análise de amostras não aquecidas demonstra a existência de complexos sem lípido livre, caracterí stica de sistemas que exibem interaeções intramoleculares entre o lípido e a anfotericina B.

Quando se realizaram os estudos anteriores em amostras con tendo molar de anfotericina B, observaram-se pequenas‘diferenças er.tre as amostras estudadas antes e após o aquecimento. Presumivelmente, para um teor de 5^% molar, a interaeção da dro ga com o lípido é tãc grande que não existe qualquer lípido disponível para ser expelido da estrutura. Estas amostras demonstram então sinais substancialmente não modificados, tanto antes como depois do aquecimento quando estudadas por DSC e por RMN.

A teoria ae que c lípido na fase separada deixa a anfoteri67 441

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cina B num ambiente mais conducente h interacção anfotericina B -anfotericina 3 (e assim menos tóxica) pode ser suportada pela espectroscopia ae absorvância. Os espectros originários de sis temas aquecidos são muito menos intensos (significando uma toxicidade reduzida) do que os dos sistemas não tratados. Num dos casos um tal aquecimento resultou num valor de LD^ superior a 3θ mg/kg quando comparado com uma preparação não aquecida com um valor de LDda absorvância í de 15 mg/kg.

413 nm após

Notou-se neste aquecimento.

aso a atenuação

Pode demonstrar-se o processo de aquecimento anterior com qualquer tipo de lipossoma ou partícula de lipido, ou com qualquer processo de preparação de lipossomas ou de partículas de lipido, tal como qualquer u;n dos anteriormente referidos, embora neste exemplo se tenha usado o processo MLV. Similarmente, podem usar-se quaisquer lípidos ou fosfolípidos anteriormente referidos, bem como quaisquer solventes ou tampões aquosos aqui anteriormente mencionados. Por exemplo, seca-se o lipido (em qualquer quantidade para formar lipossomas, tal como DMPC:DMPG numa proporção molar de 7:3), em suspensão num solvente orgânico tal como clorofórmio, para formar um filme fino nas paredes de um balão de fundo redondo. Dissolve-se a anfotericna B (ou qualquer outra droga tal como foi anteriormente descrito) em qualquer solvente apropriado (sendo um solvente apropriado um solvente que dissolve a droga, especificamente por exemplo, a anfotericina B). No presente invento pode usar-se qualquer per centagem molar de droga (anfotericina B) que forme lipossomas ou partículas de lipido. Especificamente, no presente invento usa-se uma percentagem molar de anfotericina B compreendida entre cerca de 5 e cerca ae Quando se pretende preparar lipossomas usa-se uma percentagem molar de aroga para lipido de 5% de droga e inferior. Para a preparação de HDLCs usa-se uma percentagem molar de droga compreendida entre cerca de ó e cerca de 5b por cento. Para uma percentagem molar de droga de 25% e superior, a população é substancialmente constituída por HDLCs

No presente aspecto de aquecimento da invenção, dissolve- se a anfotericina B em metanol, numa concentração de 10 mg de anfotericina B por 100 ml de metanol, ou seja, 0,1 mg/ml de an

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-26fotericina B. Adiciona-se o metanol contendo anfotericina B dissolvida (160,0 ml) ao filme de lípido e ressuspende-se o fil me. Sujeita-se então a suspensão resultante a rotoevaporação sob pressão reduzida até se formar um filme fino. Ressuspende- se depois o filme de lípido-anfotericina B numa áLÍ quota de solu ção aquosa cujo volume é suficiente para formar lipossomas ou partículas ue lípido, tal como por exemplo 4,0 ml. Pode então agitar-se a suspensão e sonicar-se, durante vários minutos, até cerca de uma hora, e aquece-se em banho-maria a uma temperatura de cerca de 25°C até cerca de ÓO°C, durante cerca de 10 a cerca de 400 minutos.

Outro processo para preparar os HDLCs da invenção inclui a utilização de um passo de homogeneização em vez de sonicação. Podem preparar-se os HDLCs por exemplo, de acordo com o processo SPLV, onde se pode adicionar a droga (por exemplo, anfotericina B) a um solvente apropriado (tal como DMSO) e agita-se com um misturador mecânico para dissolver toda a droga. Se necessário, pode então filtrar-se a solução, removendo-se quaisquer partículas de droga não dissolvida. Pode então dissolver-se o MPC:LMPG, numa proporção molar de 7:3_? num solvente apropriado (tal como diclorometano), e mistura-se depois o lípido com a solução de droga-DMSO. Adiciona-se então à mistura uma solução aquosa, tal como uma solução salina, e removem-se os solventes orgânicos por evaporação rotativa a cerca de 35-45°C. Após a remoção dos solventes dilui-se a mistura de droga-lípido resultante com solução aquosa, tal como solução salina, e moi-se a suspensão de HDLCs usando um homogeneizador. Para este rpocedimento é aceitável qualquer diopositivo de homogeneização ou mcínho de cololdes que moa as partículas, mas usa-se preferivelmente um moinho de coloídes Gifford Wood. Moem-se as partículas até se ter uma dimensão de partículas aceitável, por exemplo, caracterizada por %% das partículas terem um diâmetro inferior a 10 yim, preferivelmente com uma dimensão compreendida entre cerca de 4 e cerca de 10 microns, ou durante cerca de 15-30 minutos. Poaem fazer-se passar as partículas através do moinho uma ou um número múltiplo de vezes, depenuendo da dimensão e da homogeneidade desejadas. Podem analisar-se as partículas de

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-27HDLC para avaliar a distribuição de tamanhos usando o classificador de partículas Malvern. Se necessário podem remover-se as partículas maiores e mais pequenas por quaisquer métodos conhecidos na arte para separar partículas, por exemplo por filtração. Este processo resulta preferivelmente, na obtenção de partículas com diâmetros compreendidos entre cerca de 0,2 jim e 10,0 ;im.

Na prática cio presente invento podem usar-se outros métodos conhecidos pelos peritos na arte para a preparação de lipossomas·, a invenção dos HDLCs não está limitada somente aos processos anteriormente referidos para a sua preparação.

Podem usar-se terapeuticamente as preparações de HDLC e os lipossomas, resultantes dos novos processos do presente invento, em animais (incluindo o homem) para o tratamento de um certo número de infecções ou condições que necessitem de: (1) administrações repetidas; (2) entrega retardada de uma aroga na sua forma bioactiva; ou (3) uma menor toxicidade com uma eficácia substancialmente equivalente ou superior à de droga em questão na sua forma livre. Estas condições incluem, mas não estão limitadas a, infecções fúngicas, tanto locais como sistémicas, tal corno as que podem ser tratadas com agentes antifúngicos tais como a nistatina e a anfotericina B, e a doenças virais tais como o síndroma da imunodeficiência adquirida (SIDA) e o herpes. Adicionalmente, as preparações da invenção são estáveis em solução aquosa.

C modo de administração da preparação pode determinar os locais e as células do organismo aos quais o composto será entregue. Os HDLCs e cs lipossomas do presente invento podem ser administradas sozinhas, mas serão geralmente administradas em mistura com um transportador farmacêutico, seleccionado tendo em vista a via de administração desejada e a prática farmacêutica convencional. A entrega a um local específico, por exemplo, pode ser muito facilmente conseguida por aplicação local (se a infecção é externa, por exemplo, em áreas tais.como os olhos, a pele, os ouvidos, ou em afecções tais como feridas ou queimaduras). Estas aplicações locais podem estar na forma de cremes, pomadas, geles, emulsões ou pastas, para aplicação directa na área afectada. Alternativamente, as preparações podem

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TLC 12Sà

Portugal

-2Ôser injectadas parenteralmente, por exemplo, intravenosa, intra muscular ou subcutaneamente. Para administração parenteral, podem usar-se, por exemplo, preparações na forma de uma sdução aquosa estéril que pode conter outros solutos, por exemplo sais cu glucose, suficientes para tornar a solução isotónica. Gs pe ritos na arte podem conceber outras utilizações dependendo das propriedades particulares da preparação.

Podem usar-se as composições aa invenção para o tratamento da asma, por insuflação ue uma suspensão aquosa pulverizada dos lipossomas ou dos HDLCs, nos pulmões. Por exemplo, podem suspender-se os lipossomas ou os HDLCs num solvente adequado que pode ser transformado em aerosol por um pulverizador pneumático ou ultrassónico, ou mais convenientemente, por um vaporizador autónomo que é propulsionado pela pressão do gas de uma carga de fluorocarboneto. São também aceitáveis outros sistemas de inalação, tais como aqueles onde os lipossomas ou HDLCs são entregues na forma ue partículas, quer como um pó seco, quer como uma suspensão num sistema transportador adequado. Após a formação dc aeroscl a maior parte do solvente propulsor perde-se por evaporação flash e é substituído pela humidade no tracto respiratório conduzindo à deposição das partículas.

Para administração a humanos no tratamento curativo ou profiláctico de doenças fúngicas ou virais, o médico determinará finalmente a dosagem apropriada para um dado sujeito humano e, como seria de esperar, esta variará de acordo com a idade, peso e resposta do inuividuo, bem como com a naturezae gravidade dos sintomas do paciente. A uosagem de droga na forma de HDLC ou de lipossoma rondará geralmente a utilizada para a droga na for ma livre. Em alguns casos porém, pode ser necessário administrar dosagens fera destes limites.

Cs exemplos seguintes são apresentados apenas com o propósito ue ilustrar e não de limitar o campo ao presente invento.

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-29EXEMPLO 1

A 100 ml de metanol num balão de fundo redondo de 500 ml, adicionou-se anfotericina B (10 mg; percentagem molar total de droga, 5 por cento) e sonicou-se a mistura até se ter uma solução límpida. Este passo de sonicação foi realizado num sonicador de banho durante cerca de 15 minutos a 25°C, a cerca de 506o Hz. Adicionou-se dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC) (100 mg em 1,0 ml de clorofórmio) bem como 42 mg de dimiristoilfosfatiúilglicerol (DL'PG) (em 0,42 ml ae clorofórmio). Secou-se a dis persãc resultante por evaporação rotativa a ÓO°C sob pressão reduzida, obtenuo-sc no balão um filme fino. Ressuspendeu-se o filme em 4,0 ml de PBS, transferiu-se a solução para um tubo de vidro e sonicou-se até se obter uma solução límpiaa.

Repetiu-se o exemplo anterior com percentagens molares de anfotericina B de 16,7, 20, 25* 33* 50 e 6o por cento. Nos estudos de toxicidade aguda (LD^) que medem a dosagem de droga que provoca em ratinhes 50$ de mortes, obtiveram-se valores superiores à medida que a percentagem molar de droga aumentava, até uma percentagem molar de anfotericina B ae 50 por cento.

EXEMPLO 2

Adicioncu-se a anfotericina B (140 mg; percentagem molar total de droga, 5 por cento) a 1,5 de dimetilsulfóxido (DM30) Dissolveram-se o DMPC (1400 mg) e o DMPG (600 mg) em 50 ml de diclorometano e transferiram-se as duas soluções para um balão. Agitou-se a solução até esta ficar límpida e secou-se depois por rotoevaporação sob pressão reduzida obtendo-se um filme no balão, e secou-se então num balão de vidro durante 1-4 dias. Após esta secagem pulverizou-se o filme, que entretanto se tinha transformado em flocos secos, obtendo-se um pó e misturou- se o pó com 10C ml ou 5θ ml de solução salina a 0,.9$, ou com 5o ml de água USP para injecção. Aqueceu-se a suspensão resultante durante uma hora a 37°C.

Repetiu-se o exemplo anterior usando metanol em vez de DMSO como solvente para a suspensão de anfotericina B e para •6? 441

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Portugal

-30percentagens molares de anfotericina B de 10, 16,7 e 33 por cen to. Em vez do DMPC:DMPG numa porporção molar de 7:3 usaram-se 1 g e 2 g de fosfatidilcolina de ovo.

EXEMPLO 3

Dissolveu-se a anfGtericina B (100 mg; percentagem melar total de droga, 5 por cento) em 2,0 ml de DMSO. Codissolverarc-

- se DMPC (100 mg em 1,0 ml) e DMrG (42 mg em 0,42 ml) em clorofórmio num balão, e removeu-se o clorofórmio por rotoevaporação sob pressão reduzida. Adicionou-se diclorometano (20 ml) ao ba lãc seguir.de—se a adiçãc de 0,2 ml da solução de reserva de anfotericina B. Sonicou-se esta suspensão até se obter uma solução límpida-(durante cerca de 1 minuto) nas mesmas condições que no exemplo 1. Adicionou-se PBS (0,3 ml), pH 7,2, e removeu-

- se então o diclorometano sob uma corrente de azoto com sonicação. Ressuspendeu-se a pasta resultante em 10,0 ml ae PBS e centrifugou-se a 10 000 x g durante 10 minutos, seguindo-se uma sonicação de banhe uurante cerca de 20 minutos.

Repetiu-se o exemplo anterior com percentagens molares de anfotericina B de lo,7, 20, 25, 33, % e 60 por cento.

EXEMPLO 4

Dissolveu-se a anfotericina B (140 mg, percentagem molar tctal de uroga, 5 por cento) em 1,5 ml de diclorometano. Misturaram-se as duas soluções até se ter uma solução límpida, transferiram-se para um balão e misturaram-se com 8,0 ml de pBS. Evaporou-se o diclorometano sob uma corrente de azoto mantendo a solução num sonicadcrde banho. A sonicação foi realizada como no exemplo 1. Aaicior.ou-se PBS (32 ml) e filtrou-se a solução com um filtro de Teflon de politetrafluoroetileno (PTFE), com poros de 5 micron, lavou-se duas vezes por centrifugação e suspendeu-se fir.almente em 100 ml de PBS.

Repetiu-se o exemplo anterior usando 4,0 e 12,0 ml de PBS para hicratar o lípido.

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-31EXEMPLO 5

Dissolveu-se a anfotericina B (140 mg; percentagem molar total ae drcga, 5 por cento) em 1,5 ml de DMSO. Dissolveram-se o DMPC (1400 mg) e o DMPG (Ó00 mg) em 5θ ml de diclorometano. Misturaram-se as duas soluções até se obter uma solução límpida, transferiu-se a mistura para um balão e secou-se, por rctoevapcraçãc sob pressão reduzida até se obter um filme fino. Ressuspendeu-se depois o filme em 5θ ml de diclorometano e a esta solução adicienaram-se 8,0 ml de PBS. Removeu-se o diclorcmeta no per evaporação sob azoto com sonicação, de acordo com o procedimento do Exemplo 1. Hidratou-se adicionalmente a pasta resultante cora 32 ml de PES e lavou-se a suspensão, duas vezes per centrifugação, ressuspendeu-se finalmente em 100 ml de PBS e fez-se passar através de um filtro de teflcn (PTFE) com ura diâmetro de' poro de 5 microm.

Repetiu-se c exemplo anterior usando tampão de glicina, a pH 3, 8 e 9, em vez de PBS.

Repetiu-se também o exemplo anterior usando 5,θ, 10,0, 15)0 e 20,0 ml de PBS como volumes de tampão de hidratação.

EXEMPLO 6

Dissolveu-se a anfotericina E (140 mg; percentagem molar total de droga, 5 por cento) em 1,5 ml ue DMSO. Dissolveu-se fosfatiailcolina u° evo (EPC) (2,0 g) em 50 g de diclorometano e mi stararam-se as duas soluções num balão. Adicionou-se PBS (8,0 ml) e remeveu-se o solvente sob uma corrente de azoto com sonicação, ae acordo com o procedimento do exemplo 1. Adicionou- se PBS (200 ml).

Repetiu-se o procedimento anterior usando percentagens molares de anfotericina B de 10 e 20 por cento.

EXEMPLO 7

Dissolveu-se a anfotericina B (140 mg; percentagem molar total de drega, 5 por cento) em 1,5 ml de DMSO. Dissolveram-se o DMPC (1400 mg) e o DMPG (600 mg), num balão de funde redondo de 5θ6 ml, com 5θ g de diclorometano. Misturaram-se as duas

-32•67 4-41

TLC 128a rortugal soluções num. balão e adicionaram-se 10 ml de água para injecção, USP, a 37°C. Evaporou-se c solvente usando uma corrente de azoto com sonicação, de acordo com c procedimento do exemplo 1, adicionaram-se depois 50 ml de água para injecção, USP, e aqueceu- se a solução a 37°C durante 30 minutos.

Repetiu-se o exemplo anterior com percentagens molares de anfotericina E de 10 e 16,7 por cento seguindo-se a passagem da solução através de um filtro de policarbonato de percurso de pas sagem linear de 3 micron, adquirido na Mucleopore.

EXEMPLO 8

Misturou-se a anfotericina B (140 mg; percentagem molar total de droga, 16,7 por cento) com 50 ml de metanol, sonicou-

- se a mistura durante 15 minutos para formar uma solução, e fez

-se uepois passar a solução através de um filtro de percurso tor tucso de C,22 micron (mistura de celulose e de ésteres de acetato-nitrato) adquirido na Millex. Codissolveram-se o DMPC (350 mg) e o DMPG (150 mg) em 50 g de diclorometano, e misturou

- se a solução resultante com a solução de filtrado. Evaporaram -se os solventes sob uma corrente de azoto com sonicação, de acordo com o procedimento do exemple 1. Adicionou-se PBS (50ml) Liofilizou-se metade da preparação (25 ml) de acordo com os pro cedímentos de liofilização convencionais.

EXEMPLO 9

A 2,0 ml de etanol anidro adicionaram-se 10 pl de ácido clorídrico IN. Ao etanol acidificado adicicnou-se anfotericina B (20 mg; percentagem molar total de droga, 5 por cento) e sonicou-se a mistura até se obter uma solução límpida, sob condições análogas às do exemplo 1 com a diferença de o tempo de sonicação ter sido de 36' segunaos a 60 segundos. Colocaram-se o DMPC (200 mg) e o DMPG (42 mg) num tubc de ensaio ao qual se adicionou uma solução de benzeno:metanol (7θί3θ)» θ liofilizou-

- se a solução como no exemplo 8. Misturou-se o lípido seco com 2 ml de PES e dispersou-se a mistura por mistura em vortex.

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Λ

Adicicr.ou-se a solução de anfctericina B (0,2 ml) ao lípido e deixou-se a mistura sob agitação de um dia para o outro. Colocaram-se os MLVs de DMPC:DMPG (200 ul) resultantes, num gradiente ce cbnsiuade de sacarose e centrifugou-se durante 24 horas a 22°C a 230 000 x g. Os resultados apresentam-se na figura 11; toda a anfctericina B estava associada com o lipido, numa distribuição alargaua com c topo do grauiente contende a maior parte do lípide e localizando-se o pico mais importante da anfotericir.a E no funde do gradiente. Alternativamente, licf ili zaram- se os MLVs de, DMPCíLMPG resultantes e re-hidrataram-se com âgua destilada (2,0 ml).

Repetiu-se o exemplo anterior usando percentagens molares de anfotericina B de 7, 9, 16,7, 17, 20, 2?, 33, ?0 e 6o por cento. rara percentagens molares de droga de 16,7 por cento e superiores, formaram-se principalmente HDLCs. Os gradientes de centrifugação de densidade destas preparações com proporções de droga : lípido elevados são similares aos apresentados na figura 5, onoe toda a droga e lípido estão co-asscciados num único pico.

EXEMPLO 10

Prepararam-se amostras com 2$ por cento molar de anfotericina B-DMPC:DMPG para difraeção de raios-X, DSC, microscopia electrónica da fractura de congelação, e estudosde como se segue: Suspenderam-se o DMPC:DMPG numa proporção molar de 7:3 (total de lípido, 44 mg) e 20 mg de anfotericina B (percentagem molar de anfotericina B, 25 por cento) em eloreformio:metanol 70:3° v/v) e evaporou-se a mistura sob pressão reduzida a 55°C até se formar um filme fino nas paredes do balão. Hidratou-se o filme com 8,0 ml de uma solução ue Hepes 20 mM e de NaCl 25ú mM, pH 7,2, a 22°C, por mistura em ' vortex com esferas de vidro. Centrifugou-se a preparação a 10 000 χ g durante 10 minutos, decantou-se o sobrenadante e ressuspendeu-se o bolo em 1,0 ml de tampão de Hepes/NaCl. Sonicou-se então a preparação num scnicador de banho durante 20 minutos a 25°C, 50-60 Hz.

Repetiu-se o procedimento anterior com percentagens mola-

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-34res de anfotericina B ae C, 5, ® 50 por cento.

EXEMPLO 11

Para determinar o volume capturado de lipossomas e de HDLCs contendo anfotericina B, seguiu-se o seguinte procedimento:

Combinaram-se o DMPC (100 mg) e c DMPG (42 mg) ambos em cloroformio, com 10 mg de anfotericina B (25^ molar) em metanol (0,1 mg de anfotericina B por ml) num balão. Removeu-se o solvente sob pressão reduzida a 37°C. Ao filme seco de lípido adicionou-se, com agitação, PBS (3»7 ml) ao qual se tinham adicionado 0,3 ml de uma solução diluída de inulina-^H em água destilada. Colocou-se umaalíquota desta solução (10,2 ml) num “cocktail de cintilação e contou-se num contador de cintilação beta para determinar a radioactividade. Testou-se uma segunda alíquota de acordo com o rr.étcdc de Bartlett, J. Biol. Chem. , 1959, 2 234:466-466 para determinar o fosfato. Centrifugou-se a suspensão de drcga lípiao a 10 COO x g durante 10 minutes, uescarregcu-se o sobrenadante e ressuspendeu-se o bolo em PBS. Realisaram-se os passos ae centrifugação e ressuspensão do belo duas vezes mais; recolheu-se a última ressuspensão (100 pl) e contou-se num contador ce cintilação beta. Para determinar o fosfato usou-se uma segunda alíquota da ressuspensão final do bole como anteriormente. Calculou-se a precentagem de aprisionamento da inulina dividindo as contagens radioactivas finais pelas contagens iniciais e multiplicando por 100. Calculcu-se também o volume capturado (jil de inulina aprisicnada/|imole de lípido).

Repetiu-se c procedimento anterior usando percentagens molares de anfotericina B de 0, 5 e 5θ%·

EXEMPLC 12

Prepararam-se partículas de anfotericina B por secagem de

15,5 mg de DMPC e de 6,5 mg de DMPG (proporção molar de 7:3), a partir de cerca de 1C ml de clorofórmio, nas paredes laterais de um balão de fundo redondo de 100 ml. Suspendeu-se a anfote

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TLC 123a rortugal

ricina B (1C mg) em 100 ml de metanol, adieionaram-se os 100 ml da solução de metanol ao balãc e ressuspendeu-se c filme de lípido c-btendo-se uma concentração de anfotericina B 25/ molar. Secou-se então a mistura por roteevaporação a 37°C até se formar um filrr.e fino nas paredes laterais do balão. Hidratou-se depois o filme com 4,0 ml de uma solução de Hepes 10 mM e de HaCl 150 mM (pH 7,2) usando esferas de vidro, e soniccu-se durante 3C minutes obtende-se uma suspensão final. Aqueceu-se depois uma amostra desta solução a 00 C durante 10 minutes, por imersão num banho- maria . Caracterizou-se a suspensão resultante per DSC, RZ'\ e por microscopia electrónica da fractura de congelação.

Repetiu-se o procedimento anterior, sem aquecimento da amostra. Manteve-se a amostra a 22°C, e caracterizou-se também pelas técnicas anteriormente referidas.

EXEMPLO 13

Repetiram-se os materiais e os procedimentos do exemplo 12 usando 50/ molar e 5/ molar de anfotericina B. Caracterizaram- se estes sistemas per DSC, ESR e per microscopia electrónica da fractura de ccngelação.

EXEMPLO 14

As medições de DSC foram realizadas numa unidade .MicroCal

J.^rC-l da MiCro Cal, Inc., Amherst, MA. E. U.A. Injectaram-se volumes de amostra de 0,70 ml, contendo 5-9 mg de suspensão, na célula de amostras e usando o mesmo volume de tampão na célula de referência. Aqueceram-se as amostras quer a cerca de 26°C/ /hera quer a cerca de 37 C/hora. Os testes em duplicado da mesma amostra ccni a mesma histeria deram temperaturas de início e de finalização reprodutíveis a menos de 0,2°C. Em geral, aqueceran-se as amostras a uma temperatura de ÓO°C, (não a temperaturas mais elevadas) e arrefeceram-se depois a 7-4°C durante pele menos 2 horas por forma a assegurar uma história da amostra consistente.

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TLC 128á

Portugal

-36EXEMPLO 15

Os espectros de RAíN foram obtidos a 145,7 MHz num espectrómetro de R.VN Bruker AM36O de campo largo usando 8000 pontos para o traçado, une. largura de campo de 5θ 000 Hz e uma largura de impulse de 20 ^useg· correspondente a um impulso de 45° . Acumularam-se os espectro até 10 000 transientes.

EXEMPLO 16

Colocou-se umaalíquota de 0,1-0,3 ^1 do espe^ime entre um par de placas suporte ue cobre Belzers (Nashua NH) e mergulhou- se rapidamente, de 23°C , em propano líquido. Fracturaram-se as amostras' e implicaram-se num dispositivo de replicação dupla, numa unidaae de fractura de congelação Belzers, num vácuo de 2 x 10 ⁰ mbar ou melhor e a -115°C. Removeram-se as cópias por flutuação em HNO^ 3N, a que se seguiu a lavagem com uma série de soluções ue hipoclorito de sódio de concentração variável. Limparam-se final mente as amostras com água destilada e recolhetam-se em redes de cobre de 300 Hex mesh (Polysciences, PA). Observaram-se as replicas num microscópio electrónico Philips 300 com uma ampliação de 3θ00 a 22000 vezes.

EXEMPLO 17

Traçaram-se os espectros de absorvância (como nas figuras 12 e 13) por diluição da anfotericina B em tampão Hepes/NaCl até uma concentração de anfotericina B de 25 Colocou-se a amostra numa célula ae um Espectrofotometro Beckman e traçou-se o espectro ae absorvância para comprimentos de onda de 300 a 500 nrn. Leram-se as absorvâncias da amostra contra um branco de tampão.

EXEMPLO 18

Marcaram-se as amostras para ESR com uma série de isómeros posicionais de ácidos uoxilesteáricos onde o grupo identificador '67 441

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Portugal

-37doxilo estava presente em posições diferentes ao longo da cadeia qg ácido gordo. Efectuou-se a marcação por incorporação da sonda, por agitação e sonicação a partir de uma solução etanclica que foi seca até se formar um filme fino na parede lateral de um tubo de ensaio. Todas as amostras foram marcauas a 1 por cento molar.

Regi starara-se os espectros de E3R num Espectrometro de E3R IB11 Instruments ER100D com regulação da temperatura de fluxo do azoto gasoso. Para seguir a temperatura da amostra usou-se uma sonda termistora calibrada externa Omega Engineering, Inc., Stan ford, CA E.U.A.). Registaram-se os espectros de E3R para uma potência de microonua de 10 1577 e para uma frequência de microonda de 9,11 GHZ com uma largura de campo de 100 0 e com uma amplitude de modelação de campo de 100 KHZ de 0,32 G. Calculou- se o parâmetro de ordem a partir da separação hiperfina máxima (A aiax).

EXEMPLO 19

Adicionou-se a anfotericina B (337,5 g) a 3375 ml de DMSO e misturou-se a anfotericina B (100 mg/ml) até a dissolução (durante cerca de 3 horas) usando um misturador mecânico. Transferiu-se a mistura para um vaso de pressão de aço inoxidável (51 de capacidade) e filtrou-se através de um filtro Sartofluor de 0,22 pm e de urn filtro ae profundidade de polipropileno (Pall Profile, Pall, Inc., Glen Cove, N.Y.) E.U.A. .

Num vaso de pressão de 40 1, misturaram-se 50,8 kg de diclcrometano cora 225,0 g de DMPC e com 99,0 g de DLIPG, aurante

3,5 horas, até se dissolverem completamente. Transferiu-se a sclução de lípido resultante através de um filtro de Teflon de

0,22 micron, 0,2 M Sartofluor, para um tanque de processamento de aço inoxidável. Lavou-se o vaso de pressão de 40 1 com 55,2 kg adicionais de diciorometanoe filtraram-se similarmente para o tanque de processamento. Preparou-se o tanque de processamento para mistura rotativa da solução de lípido a 195 rpm e transferiu-se então a solução de anfotericina B em DMSO para o tanque. Adicionou-se depois ao tanque uma solução de cloreto de

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TLC 120Λ

Portugal sódio (16,2 e 0,9$ USP), através de um filtro de policarbonato jíillipak 100 ce 0,22 pm.

Usando um permutador de calor ajustado a 35°C em série com o tanque de processamento, fez-se passar uma corrente aquecida de azoto líquido através dc tanque e removeu-se o solvente durante um períoco de 12 horas. Diluiu-se o complexo de droga-lípido resultante com cloreto de sódio 0,9$ USP (7000 ml) e trans feriu-se para o tanque através de um filtro Millipak 100 de 0,22 microm.

Homogeneizaram-se os HDLCs resultantes usando um moinho de coloídes Gifford Wood e uma bomba de“lobe^rotativo. Fizeram-se passar os HDLCs através da cabeça do moinho de coloídes para um ajustamento do intervalo de 0,5 ml com uma pressão de apoio de 10 psi durante 3,0 horas resultando a obtenção de partículas com menos do que 20 r.icron. A dimensão das partículas de HDLC foi analisada num contador de partículas Malvern.

EXEMPLO 20

Pipeti.u-se c lípide (DMPCíDMPG numa proporção molar de 70:30 num tctal de 102,6/imole) dissolvido em clorofórmio para um balão de funoo redondo de 5θθ ml· Dissolveu-se a nistatina (500 mg) em 1,0 1 de metanol (0,5 mg/ml) por sonicação num sonicador de banho Branson. Adicionou-se a nistatina dissolvida (5,0 ml) ao balão de fundo redondo contendo o lípido e agitou-se: removeu-se depois o solvente por evaporação rotativa a 45°C durante 15 minutos, e re-hidratar.?m-se as preparações resultantes com solução salina (5,0 ml) por mistura em vortex com esferas de vidro. Por exame com microscópio óptico éram visíveis os lipossomas.

Repetiu-se c procedimento anterior usando 25, 50, 75 e 100$ molar ue nistatina. Os exames por microscopia electrónica da fractura de congelação mostraram que a preparação contendo 25$ molar de nistatina era constituída por HDLCs não lipossómícos.

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Portugal

-39EXEMPL0 21

Hidratou-se o lípido (DMPC:DMPG numa proporção molar de ?: : 3, 14,8 ^ímol/ml) em água destilada e incubou-se a 4°C. Extrudiram-se dez vezes os MLVs resultantes através ue dois filtros de policarbonato associados usando o procedimento LUVET.

Dispersou-se a anfotericina B em água destilada, usando um sonicador de banho, numa concentração de 10,8ole/ml. Adicionou-se a dispersão de anfotericina B à suspensão de lípido até se terem concentrações finais de lípido e de anfotericina B de

respectivamente. Para remover a anfotericina b não incorporada, centrifugaram-se 20 ml da amostra a 15 000 x g durante 3o minutos num rotor Ti60 ou Sl·'.' 27 (Beckmar.) a'22°C, numa ultracentrífuga Beckman L8-Ó0. Removeu-se o sobrenadante isento ue anfotericina B sem perturbar o bolo de lipossomas. Mediram-se os lipossomas resultantes por reflexão quase elástica ua luz e verificou-se terem diâmetros superiores a 1,0 p.m.

Repetiu-se o procedimento anterior usando condições de incubação a 23°C usando solução de NaCl 150 mil e de Na2?0^ 10 mM, pH 7,4, para hidratar os lípidos. Mediram-se os lipossomas resultantes por reflexão quase elástica da luz e verificou-se terem diâmetros superiores a 1,0 jun. A velocidade de incorporação da anfotericina B pelos lipossomas era mais alta quando a força iénica do meio era mais baixa (água destilada vs. NaCl 15o πώί) (figura 17).

A figura 16 mostra a incorporação de anfotericina B em lipossomas de DMPC: LúlrG sob várias condições da temperatura de incubação. A velocidade de incorporação é semelhante a 23°C e a 45°C.

A uroga acumula-se também quando o lípido está na fase de gel i.e.,

EXEMPLO 22

Utilizaram-se os .materiais e os procedimentos do Exemplo 20 mas aqui suspendeu-se o lípido em água destilada com a anfo-

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TLC 12ÓA

Portugal

tericina B a 22°C.

Os lipossomas resultantes eram unilamelares e por reflexão quase elástica da luz verificou-se que tinham um diâmetro médio oe cerca de 0,1-0,2 ^im. A figura 19 mostra que a velocidade ae incorporação da anfotericina B é mais rápida nas primeiras duas horas ccm estes LUVs do que com os MLVs.

/7 /

-4167 441 TLC 12 ÕA

Portugal reivindicações l^s. - Processo de preparação de uma composição compreendendo um complexo de agente bioactivo-lípido (HDLC) caracterizado por se associar uma solução de agente bioactivo com uma solução lipiuica e eventualmente se desidratar a mistura resultante , sendo a proporção molar de agente bioactivo para lipido de pelo menos cerca de 6 por cento.

Claims (39)

1. l^s. - Processo de preparação de uma composição compreendendo um complexo de agente bioactivo-lípido (HDLC) caracterizado por se associar uma solução de agente bioactivo com uma solução lipiuica e eventualmente se desidratar a mistura resultante , sendo a proporção molar de agente bioactivo para lipido de pelo menos cerca de 6 por cento.
2. 2*. - Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a composição estar substancialmente isenta de lipossomas.
3. 3^è. - Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo- facto de o lipido compreender um fosfolípido.
4. 4⁹. - Processo, ae acordo com a reivinaicação 3, caracterizado pelo facto de o fosfolipido compreender um fosfolipido saturado ou um áciao gordo/saturado.
5. 5’^:. - Processo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de o fosfolipiao compreender fosfatidilcolina e fosfatidilglicerol.
6. 6^a. - Processo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de a fosfatidilcolina ser a dimiristoilfosfatidilcolina e o fosfatidilglicerol ser o uimiristoilfosfatidilglicerol.
7. 7^ê. - Processo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de a fosfatidilcolina e o fosfatidilglicerol estarem presentes numa proporção molar de cerca de 7:3.
8. 8^?. - Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a percentagem molar de agente bioactivo em relação ao fosfolipido estar compreendida entre cerca de 6 e 50 por cento.
9. 9^e. - Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto ae a percentagem molar de agente bioactivo estar compreendida entre cerca de 25 e 5θ por cento.

   -4267 441

   TLC 128 Λ

   Portugal
10. 10*. - Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o agente bioactivo ser uma droga.
11. 11*. - Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto ue c agente bioactivo ser um agente antifúngico.
12. 12*. - Processo, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo facto de o agente antifúngico ser um antibiótico de polieno.
13. 13*. - Processo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo facto de o agente antifúngico ser a anfotericina 3.
14. 14*. - Processo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo facto de o agente antifúngico ser a nistatina.
15. 15*. - Processo, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo facto de a anfotericina B estar presente numa percentagem molar compreendida entre cerca de 6 e 5θ por cento.
16. 16*. - Processo, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pele facto de a anfotericina B estar presente numa percentagem molar compreendida entre cerca de 25 e 50 por cento.
17. 17*. - Processo, de preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado por compreender a associação do HDLC preparado de acordo com a reivindicação 1 com um transportador ou diluente farmaceuticamente aceitável.
18. 18«. - Processo, de acordo com a reivindicação 1/, caracterizado pelo facto de o transportador ou diluente serem os adequados para a composição ser adaptada a administração parentexal·.
19. 19^a. - Processo, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo facto de a composição compreender um agente antifúngico.
20. 20*. - Processo, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo facto de c agente antifúngico ser a anfo-tericina B.
21. 21*. - Processo, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo facto ue a anfotericina B estar presente numa percentagem molar compreendida entre cerca de 25 e 5θ por cento.

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    TLC 128A

    Portugal
22. 22·. - Processo, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo facto de a dimensão do HDLC estar compreendida entre cerca de 0,2 e cerca de 10 micra.
23. 23·. - Processo, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo facto de o agente antifúngico ser a nistatina.
24. 24·. - Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a composição contendo o agente bioactivo estar substancialmente isenta de lipossomas.
25. 25·. - Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a dimensão do HDLC estar compreendida entre cerca de 0,2 e cerca de 10 micra.
26. 26* - Processo de formação de um HDLC ou de um lipossoma, compreendendo uma droga e um lípido, caracterizado por compreender os passos de:

    (a) formação de lipossomas compreendendo pelo menos um lípido;

    (b) suspensão da droga em etanol acidificado; e (c) mistura da suspensão de droga do passo (b) com a dos lipossomas do passo (a).
27. 27*. - Processo, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo facto de a droga estar presente numa percentagem molar de cerca de 5 por cento.
28. 28*. - Processo, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo facto de a droga estar presente numa percentagem molar de cerca de 25 por cento.
29. 29*. - Processo, de preparação de uma composição, compreendendo um HDLC, caracterizado por compreender os passos de:

    (a) dissolução de pelo menos um lípido num solvente orgânico de polaridade intermédia;

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    TLC 128A

    Portugal (b) dissolução da droga num solvente orgânico biocompatível; e (c) mistura da solução de (a) com a solução do passo (b).
30. 30^a. - Processo, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo facto de a droga estar presente numa percentagem molar compreendida entre cerca de 25 e 50 por cento.
31. 31^a. - Processo, de preparação de uma composição, compreendendo um HDLC, caracterizado por compreender os passos de:

    (a) dissolução de pelo menos um lípido num solvente orgânico de polaridade intermédia;

    (b) dissolução da droga num solvente orgânico;

    (c) mistura da solução do passo (a) com a do passo (b); e (d) desidratação da mistura resultante do passo (c) anterior.
32. 32^a. - Processo de preparação de um HDLC, caracterizado por compreender os passos de:

    (a) dissolução de pelo menos um lípido num solvente orgânico de polaridade intermédia;

    (b) dissolução da droga num solvente orgânico biocompatível;

    (c) mistura do produto do passo (a) com o do passo (b);

    (d) evaporação, do solvente da mistura do passo (c) anterior, sob pressão reduzida para produzir uma película lipídica seca; e (e) adição de uma solução aquosa à película do passo (d).
33. 33^a. - Processo de preparação de um HDLC, caracterizado por compreender os passos de:

    (a) dissolução da droga num solvente orgânico biocompatível;

    (b) dissolução de pelo menos um lípido num solvente orgânico de polaridade intermédia e mistura desta solução com a solução do passo (a);

    (c) adição de uma solução aquosa à mistura das soluções (a) e (b) anterior e evaporação dos solventes sob pressão

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    TLC 128A

    Portugal reduzida para formar uma pasta; e (d) adição de solução aquosa à pasta do passo (c) anterior.
34. 34·. - Processo de formação de um HDLC compreendendo os passos de formação de uma preparação pelo processo MLV, que contém anfotericina B e DMPC : DMPG numa proporção molar de 7:3 e de aquecimento da preparação.
35. 35*. - Processo, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo facto de a anfotericina B estar presente numa percentagem molar de cerca de 25 a cerca de 50 por cento.

    (
36. 36*. - Processo, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo facto de se aquecer a preparação a uma temperatura de cerca de 60 *C durante cerca de 10 minutos.
37. 37*. - Processo para determinação da toxicidade de um HDLC caracterizado por compreender a leitura do espectro de absorvância da preparação de HDLC e a medição da intensidade do pico.
38. 38*. - Processo de preparação de uma composição compreendendo um lipossoma HDCL compreendendo uma droga e um lípido numa proporção molar droga : lípido elevada, que ( compreende os passos de:

    (a) suspensão de uma droga numa solução aquosa;

    (b) suspensão de um lípido numa solução aquosa;

    (c) mistura dos produtos dos passos (a) e (b); e (d) incubação do produto do passo (c) a uma temperatura igual ou superior à temperatura de transição do lípido.
39. 39*. - Processo, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo facto de se suspender a droga em solução aquosa por tratamento sónico.

    Lisboa,

    -4. MM Í9c8

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    TLC 128A

    Portugal

    -45Por THE LIPOSOME COMPANY, INC.

    - O AGENTE OFICIAL - &

    FIG. 1

    THE LIPOSOME COMPANY

    2/17

    FIG.

    TEMPERATURA

    THE LIPOSOME COMPANY

    3/17

    FIG.

    ^d3V

    TEMPERATURA

    THE LIPOSOME COMPANY

    4/17 (Ηή g vu τοτίβ q.ojuy αο

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    Número da fracção (HUI) oPTdyi

    THE LIPOSOME COMPANY

    5/17 (Κή opTdyi

    Gradiente isopínico de partículas - 50% molar de Anfo.

    Numero da fracção

    THE LIPOSOME COMPANY

    6/17

    THE LIPOSOME COMPANY

    7/17

    THE LIPOSOME COMPANY

    FIG.

    THE LIPOSOME COMPANY

    9/17

    FIG.

    _E_0l X HdO

    Fracção numero

    THE LIPOSOME COMPANY

    10/17

    FIG. 10

    I I I 1 I-------------------------Γ

    300 350 400 450 500 550 nn

    THE LIPOSOME COMPANY ii/17 ^C°MPak^ty

    THE ^LTpOSOM£

    ΤΗΕ ^LXPOSom_£ ^Co^PANy

    13/17

    FIG. 13

    I I I-----------------------------------------------1---------------------------------------15 20 25 30

    Temperatura,* C

    Calorimetria de varrimento diferencial - Varrimento de:

    (A) Partículas de 25% molar de Anfo. B DMPC/DMPG (7:3) formadas a 22°C (B) A mesma amostra ciclizada a 6CPC durante 10 mn.

    (C) DMPC/DMPG (7:3) puros

    THE LIPOSOME COMPANY

    14/17

    FIG. 14

    RMN- p de:

    (A) Partículas de 25% molar de Anfo. B DMPC/DMPG (7:3) formadas a 22°C (B) A mesma amostra ciclizada a 6O°C durante 20 mn.

    THE LIPpSOME COMPANY

    15/17

    FIG. 15

    NaCl (mH)

    THE LIPOSOME COMPANY

    16/17

    Influência da temperatura na incorporação da Anfotericina em vesículas de DMPC:DMPG

    FIG. 16

    THE LIPOSOME COMPANY

    17/17 (, ω Ό α> rH ο Ε <Λ α> r-<

    Ο Ε C «5 α •Η υ •Η

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    ΔFIG. 17 *

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