NO180147B - Fremgangsmåte for fremstilling av HDLC eller et liposom innbefattende et polyen-antisopp-antibiotikum og et lipid - Google Patents

Abstract

Det er beskrevet en fremgangsmåte for fremstilling av EDLC eller et liposom innbefattende et polyen-antisopp-antibiotikum og et lipid. Fremgangsmåten er kjennetegnet ved at den innbefatter trinnene: (a) fremstilling av liposomer innbefattende minst et lipid; (b) suspensjon av legemiddelet i surgjort etanol;og (c) blanding av legemiddelsuspensjonen fra trinn (b) og liposomene fra trinn (a).

Description

Foreliggende oppfinnelse er rettet mot en fremgangsmåte for fremstilling av HDLC (legemiddel-assosierte lipidkomplekser med høye legemiddel:lipidforhold) eller et liposom innbefattende et polyen-antisopp-antibiotikum og et lipid.

Liposomer er fullstendig lukkede 1ipid-dobbeltlagsmembraner inneholdende et innesluttet vandig volum. Liposomer kan være unilamellære vesikler (som har et enkelt membran-dobbeltlag) eller multilamellaere vesikler (løklignende strukturer kjennetegnet ved flere membran-dobbeltlag, hvert separert fra det neste ved et vandig lag). Dobbeltlaget består av to lipidmonolag som har et hydrofobt "hale"-område og et hydrofilt "hode"-område. Strukturen av membran-dobbeltiaget er slik at de hydrofobe (upolare) "halene" av 1ipidmonolagene orienterer seg mot senteret av dobbeltlaget, mens de hydrofile "hodene" orienterer seg mot den vandige fasen.

Den opprinnelige liposomfremstillingen ifølge Bangham et al.

(J. Mol. Biol., 1965, 13:238-252) innbefatter suspensjon av fosfolipider i et organisk oppløsningsmiddel som deretter inndampes til tørrhet slik at det etterlates en fosfolipid-film på reaksjonsbeholderen. Deretter tilsettes en egnet mengde vandig fase, blandingen får "svelle", og de resulterende liposomene som består av multilamellaere vesikler (MLV) dispergeres ved hjelp av mekaniske innretninger. Denne teknikken tilveiebringer grunnlaget for utviklingen av de små ultralydsbehandlede unilamellære vesiklene beskrevet av Papahadjopoulos et al. (Biochem. Biophys. Acta., 1967, 135:624-638), og store unilamellære vesikler.

Teknikker for fremstilling av store unilamellære vesikler (LUV), så som revers fasefordampning, infusjons-fremgangsmåter og rensemiddelfortynning, kan benyttes for fremstilling av liposomer. En oversikt over disse og andre fremgangsmåter for fremstilling av liposomer kan finnes i teksten "Liposomes", Marc Ostro, red., Marcel Dekker, Inc., New York, 1983, kapittel 1, hvis aktuelle deler er innbefattet heri som henvisning. Se også Szoka, Jr. et al., (1980, Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9:467), hvis aktuelle deler er innbefattet heri som henvisning. En spesielt foretrukket fremgangsmåte for fremstilling av LUV er beskrevet i Cullis et al., PCT-publikasjon nr. 87/00238, 16. januar, 1986, med tittelen "Extrusion Technique for Producing Unilamellar Vesicles" innbefattet heri som henvisning. Vesikler fremstilt ved denne teknikken, betegnet LUVETS, ekstruderes under trykk gjennom et membranfilter. Vesikler kan også fremstilles ved en ekstruderingsteknikk gjennom et 200 nm filter; slike vesikler er kjent som VET^oq- Disse vesiklene kan eksponeres mot minst en fryse- og opptiningssyklus før ekstruderings-teknikken; denne fremgangsmåten er beskrevet i Mayer et al., 1985, Biochem. et. Biophys. Acta., 817:193-196, med tittelen "Solute Distributions and Trapping Efficiencies Observed in Freeze-Thawed Multilamellar Vesicles", relevante deler er innbefattet heri som henvisning.

Ved utførelsen av foreliggende oppfinnelse er en klasse av liposomer og en fremgangsmåte for deres fremstilling foretrukket, disse er kjennetegnet ved at de har i det vesentlige lik lamellær fordeling av oppløst stoff. Denne foretrukne klassen av liposomer er betegnet som stabile plurilamellære vesikler (SPLV) som definert i US patent nr. 4 522 803 (Lenk et al.) og innbefatter enfasede vesikler som beskrevet i US patent nr. 4 588 578 (Fountain et al.) og frosne og opptinte multilamellaere vesikler (FATMLV) som beskrevet ovenfor.

En rekke steroler og deres vannoppløselige derivater har vært benyttet for å danne liposomer; se nærmere bestemt Janoff et al., US patent nr. 4 721 612, med tittelen "Steroidal Liposomes". Mayhew et al., PCT-publikasjon nr. WO 85/00968, publisert 14 mars, 1985, beskriver en fremgangsmåte for reduksjon av toksisiteten av legemidler ved å innkapsle dem i liposomer innbefattende alfa-tokoferol og visse derivater derav. Videre har en rekke tokoferoler og deres vannopp-løselige derivater vært benyttet for å danne liposomer; se Janoff et al., PCT-publikasjon nr. 87/02219, publisert 23 april, 1987, med tittelen "Alpha Tocopherol-Based "Vesicles" innbefattet heri som henvisning.

I et 1iposom-legemiddelavleveringssystem innesluttes det bioaktive middelet, så som et legemiddel, i liposomen og administreres deretter til pasienten som skal behandles. Se f.eks. Rahman et al., US patent nr. 3 993 754; Sears, US patent nr. 4 145 410; Papahadjopoulos et al., US patent nr. 4 235 871; Schneider, US patent nr. 4 224 179; Lenk et al., US patent nr. 4 522 803; og Fountain et al., US patent nr. 4 588 578. Dersom alternativt legemiddelet er lipofilt kan det assosieres med lipid-dobbeltlaget. Ved foreliggende oppfinnelse skal betegnelsene "inneslutte" eller "innkapsle" forstås som innbefattende både legemiddelet i det vandige volumet av liposomen så vel som legemiddelet forbundet med 1ipid-dobbeltiaget.

Mange legemidler som er nyttige for behandling av sykdom viser toksisiteter i pasienten, slike toksisiteter kan være kardiotoksisitet, som med anti-tumorlegemiddelet dokso-rubicin, eller nefrotoksisitet, som med aminoglykosid eller polyen-antibiotika, så som amphotericin B. Amphotericin B er et meget toksiskt anti-sopp polyenantibiotikum som viser den største påliteligheten ved behandling av livstruende soppinfeksjoner (Taylor et al., Am. Rev. Respir. Dis., 1982, 125:610-611). Fordi Amphotericin B er et hydrofobt legemiddel, er det uoppløselig i vandig oppløsning og er kommersielt tilgjengelig som en kolloidal dispersjon i desoksykolat, et rensemiddel som benytes for å suspendere den, som i seg seg er toksisk. Amphotericin B metylester og amphotericin B har også vært vist å være aktive mot HTLV-III/LAV-viruset, et lipid-omhyllet retrovirus, som er påvist i etiologien ved ervervet immunsviktsyndrom (AIDS) (Schaffner et al., Biochem, Pharmacol., 1986, 35:4110-4113). I denne undersøkelsen ble amphotericin B metylesteraskorbinsyresalt (vannoppløselig) og amphotericin B tilsatt til separate kulturer av HTLV-III/LAV-infiserte celler, og cellene ble analysert med henblikk på replikering av viruset. Resultatene viste at amphotericin B metylester og amphotericin B beskyttet målceller mot de cytopatiske virkningene av viruset, tilsvarende det som er demonstrert for herpesviruset (Stevens et al., Arch. Virol., 1975, 48:391).

Rapporter vedrørende anvendelsen av 1iposom-innkapslet amphotericin B er angitt i litteraturen. Juliano et al.

(Annals N.Y. Acad. Sei., 1985, 446:390-402) diskuterer behandlingen av systemiske soppinfeksjoner med liposomal amphotericin B. Slike liposomer innbefatter fosfolipid, f.eks. dimyristoylfosfatidylkolin (DMPC) og dimyristoyl-fosfatidylglyserol (DMPG) i et 7:3 molforhold, og kolesterol. Studier av akutt toksisitet (LC50) og in vitro -analyser med sammenligning av fritt og liposom-innesluttet amphotericin B viste lavere toksisiteter ved anvendelse av de liposomale preparatene med i det vesentlige uendret anti-sopppotens. Lopez-Berestein et al. (J. Infect. Dis., 1986, 151:704-710) administrerte liposom-innkapslet amphotericin B til pasienter med systemiske soppinfeksjoner. Liposomene innbefattet et 7:3 molforhold av DMPC:DMPG, og legemiddelet var innkapslet ved en effektivitet større en 90%. Som et resultat av 1iposom-legemiddelbehandlingen med 5 mol-# amphotericin B, viste bb% av de behandlede pasientene god respons, med enten delvis eller fullstendig remisjon av soppinfeksjonen. Lopez-Berestein et al. (J. Infect. Dis., 1983, 147:939-945), Ahrens et al., (S. Jour. Med Vet. Mycol., 1984, 22:161-166), Panosian et al. (Antimicrob. Agents Chemo., 1984, 25:655-656), og Tremblay et al. (Antimicrob. Agents Chemo., 1984, 26:170-173) undersøkte også den sammenlignende virkningsfull-heten av det frie og det liposomale amphotericin B ved behandling og profylakse av systemisk candidiasis og leishmaniasis (Panosian et al., supra. ) i mus. De fant en forhøyet terapeutisk indeks med det liposom-innkapslede amphotericin B ved behandlingen av candidiasis. I alle tilfeller ble det funnet at langt høyere doser av amphoter-

icin B kan tolereres når dette legemiddelet er innkapslet i liposomer. Amphotericin B-liposompreparatene hadde liten eller ingen effekt ved behandlingen av leishmaniasis.

Proliposomer (lipid og legemiddel belagt på en oppløselig bærer slik at det dannes et granulært materiale) innbefattende DMPC:DMPG, ergosterol, og amphotericin B har også vært fremstilt (Payne al., J. Pharm. Sei., 1986, 75:330-333).

I andre undersøkelser ble intravenøs behandling av krypto-kokkosis i mus med liposomalt amphotericin B sammenlignet med tilsvarende behandling med amphotericin B-desoksykolat (Graybill et al., J. Infect. Dis., 1982, 145:748-752). Mus behandlet med liposomal-amphotericin B viste lengre over-levelsestider, lavere vevstellinger av kryptokokker og redusert akutt toksisitet. Multilamellaere liposomer anvendt i denne undersøkelsen inneholdt ergosterol. Taylor et al.

(Am. Rev. Resp. Dis., 1982, 125:610-611) behandlet histo-plasmose i mus med liposomal-amphotericin B hvor liposomene inneholdt ergosterol og fosfolipider. Liposomalpreparatene var mindre toksiske, mer effektive ved behandling av histo-plasmose, og hadde endrede serum- og vevsfordelinger, med lavere serumnivåer og høyere lever- og miltkonsentrasjoner enn for preparatene med fritt amphotericin B.

I de ovenfor nevnte undersøkelsene ble lipidholdige liposomer benyttet for å redusere toksisiteten av det innesluttede legemiddelet, med tendens mot økning av lipidinnholdet i preparatene for å buffre legemiddeltoksisitet. I forbindelse med foreliggende oppfinnelse er det overraskende funnet at et lavt innhold av lipidbestanddel reduserer toksisiteten mest effektivt. Ved fremstillingen av EDLC ved en MLV-fremgangsmåte kan det oppstå en blandet populasjon av HDLC med MLV; disse preparatene er de hvor det anvendes fra 5 til 25 mol-% legemiddel (amphotericin B), andelen av EDLC øker når mol-% legemiddel øker. Preparater hvor det anvendes 25 mol-# til 50 mol-# legemiddel er i det vesentlige HDLC, frie for liposomer. Alternativt er preparater inneholdende 5 mol-% hydrofobt legemiddel og mindre i det vesentlige liposomale med visse HDLC. Separasjonen av HDLC fra heterogene populasjoner kan, om nødvendig, utføres ved anvendelse av en hvilken som helst seperasjonsteknikk som er kjent, f.eks. tetthetsgradient-sentrifugering.

Fremgangsmåtene som anvendes for å fremstille disse HDLC kan være i det vesentlige de samme som de som anvendes for å fremstille liposomer, men i foreliggende oppfinnelse hvor det anvendes høye legemiddel:lipidforhold, dannes mer HDLC enn liposomer med uventet stor reduksjon i toksisitet, sammenlignet med liposomalpreparatene.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer følgelig en fremgangsmåte for fremstilling av HDLC eller et liposom innbefattende et polyen-antisopp-antibiotikum og et lipid, kjennetegnet ved at den innbefatter trinnene: (a) fremstilling av liposomer innbefattende minst et

lipid;

(b) suspensjon av legemiddelet i surgjort etanol; og (c) blanding av legemiddelsuspensjonen fra trinn (b) og

liposomene fra trinn (a).

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremstillingen av HDLC (komplekser med høyt legemiddel:lipidforhold) -systemer som innbefatter lipider og bioaktive midler innbefattende legemidler. Slike HDLC kan innbefatte fosfolipider, så som DMPC og DMPG, fortrinnsvis i et 7:3 molforhold eller mettede fosfolipider eller fettsyrefosfolipider. Det bioaktive middelet er et legemiddel, nærmere bestemt et anti-sopplege-middel, så som nystatin eller amphotericin B. Mol-# av legemiddelet som er tilstede er fortrinnsvis fra 5 til 25 mol-%. Farmasøytiske preparater av HDLC, fortrinnsvis innbefattende et legemiddel amphotericin B, fremstilles innbefattende farmasøytisk akseptable bærere og fortynnere, og disse preparatene kan administreres parenteralt. Slike preparater benyttes for å behandle infeksjonssykdommer, så som soppinfeksjoner, ved administrering til pattedyr, så som mennesker. De HDLC-holdige preparatene innbefatter de preparatene som er i det vesentlige frie for liposomer og preparater som er i det vesentlige frie for liposomer som innkapsler legemiddelet. De innbefatter generelt ikke mer enn 10 vekt-# lipid, fortrinnsvis ikke mer enn 5%, og mest foretrukket ikke mer enn 3%.

I forbindelse med oppfinnelsen benyttes en absorbansspek-trumsteknikk for å bestemme toksisiteten av et polyen anti-soppmiddel, så som amphotericin B-lipidkompleks. Absorbansspekteret for et legemiddel er spesifikt for dette legemiddelet; signaturen av legemiddelet kan være en topp eller serier av topper i det ultrafiolette eller det synlige området. Signaturtoppen for amphotericin B (som fremtrer i fig. 12, oppløst i deoksykolat), er mellom 300 og 500 nm, og har karakteristiske topper, den mest representative av disse toppene er den som oppstår ved 413 nm. Svekkelsen av denne toppen ved kompleksdannelse av legemiddelet med lipid, kan benyttes kvantitativt som et mål for toksisiteten av HDLC. Med andre ord kan toksisitetsgraden bestemmes ved hjelp av intensiteten for absorbanstopphøyden.

En liposom-beleggingsprosess er også beskrevet hvori legemiddelet, nærmere bestemt polyen-antibiotikumet amphotericin B dispergeres ved ultralydsbehandling i etanol hvor til det er tilsatt en syre, så som saltsyre. En lipidfilm, nærmere bestemt innbefattende DMPC:DMPG i et molforhold på ca. 7:3, hydratiseres med en vandig oppløsning, nærmere bestemt vandig buffer, så som PBS, og en porsjon av den surgjorte etanoloppløsningen inneholdende legemiddelet innføres i liposomene ved å tilsette denne til liposompreparatet. Etanolen i den resulterende suspensjonen fjernes, og oppløsningene resuspenderes med en vandig oppløsning. Avhengig av molforholdet for legemiddelet blandet med lipidet fremmer prosessen dannelsen av HDLC fremfor liposomene; f.eks. ved mol-% legemiddel på ca. 16 og mer, dannes mer HDLC enn liposomer. Alternativt fremmer prosessen ved 0-15 mol-% legemiddel, dannelse av liposomer. Liposomer eller HDLC fremstilt ved hjelp av denne surgjorte etanolbeleggings-prosessen kan fremstilles for anvendelse som farmasøytiske preparater ved tilsats av farmasøytiske akseptable bærere eller fortynningsmidler, og kan benyttes ved behandlingen av soppinfeksjoner ved administrering til et pattedyr, så som et menneske. Fig. 1 er en grafisk fremstilling som angir akutt toksisitet målt ved hjelp av LD50 som en funksjon av mol-% amphotericin B i preparatet. Fig. 2 er et spektrum oppnådd ved differensiell sveipkalorimetri av et liposomalt (MLV) preparat inneholdende 5 mol-% amphotericin B. Fig. 3 er et spektrum fra differensiell sveipkalorimetri av et HDLC-preparat (MLV-prosess) inneholdende 25 mol-# amphotericin B. Fig. 4 er en grafisk fremstilling av en isopyknisk gradient for multilamellære liposomer inneholdende 5 mol-# amphotericin B. Lipid (heltrukken linje); amphotericin B (prikket linje). Fig. 5 er en grafisk fremstilling av en isopyknisk gradient for HDLC (MLV-prosess) fremstilt med 50 mol-% amphotericin B. Lipid (heltrukken linje); amphotericin B (prikket linje). Fig. 6 viser grafiske fremstillinger av røntgendiffraksjons-data for liposom og HDLC-preparater (MLV-prosess) inneholdende (henholdsvis) 5 og 50 mol-# amphotericin B. Fig. 7 viser <31>P-NMR-spektra for HDLC-preparater (MLV-prosess) inneholdende 25 og 50 mol-% amphotericin B. Fig. 8 viser <31>P-NMR-spektra for liposom (MLV) preparater inneholdende 0 og 5 mol-% amphotericin B. Fig. 9 er en grafisk fremstilling av en isopyknisk tetthetsgradient for amphotericin B-holdige liposomer dannet ved hjelp av den surgjorte etanolprosessen inneholdende 5 mol-% amphotericin B. Lipid (heltrukken linje); amphotericin B (prikket linje). Fig. 10 er et absorbansspektrum for fritt amphotericin B oppløst i deoksykolat. Fig. 11 er absorbansspektra for 5 mol-% amphotericin B (a), 25 mol-% amphotericin B (b), 25 mol-% amphotericin B etter oppvarming (c), og 50 mol-% amphotericin B (d), i 7:3

DMPC:DMPG.

Fig. 12 er et absorbansspektrum for 25 mol-% amphotericin B i 7:3 DMPC: DMPG både før (a) og etter (b) oppvarming i 10 minutter ved 60°C. Fig. 13 er et DSC-spektrum for 7:3 DMPC/DMPG inneholdende 25 mol-% amphotericin B både før (a), og etter (b) varmesykling, sammenlignet med spekteret for ren DMPC/DMPG (c). Fig. 14 er et <3>^P-NMR-spektrum for komplekser av 7:3 molforhold DMPC/DMPG inneholdende 25 mol-% amphotericin B før (a) og etter (b) varmesykling ved 60°C. Fig. 15 er en grafisk fremstilling som demonstrerer innvirkningen av ionestyrken på opptaket av amphotericin B i DMPC:DMPG-1iposomer. Fig. 16 viser virkningen av inkuberingstemperatur på raten for amphotericin B-opptak i DMPC:DMPG-1iposomer. Fig. 17 viser innvirkningen av 1iposomstruktur på opptak av amphotericin B i DMPC:DMPG MLV eller LUV.

Ikke-liposomale komplekser med høyt legemiddel:lipidforhold (HDLC) som har unike egenskaper, og fremgangsmåter for deres fremstilling er beskrevet. Disse HDLC inneholder et bioaktivt middel så som et hydrofobt legemiddel som, når HDLC administreres til en organisme, kan ha i det vesentlige ekvivalent eller større virkningsfullhet og lavere toksisitet enn legemiddelet administrert i enten fri eller liposomal form. Slike HDLC omfatter et høyt legemiddel;lipidmolforhold (større enn 5 mol-% legemiddel). Foreliggende oppfinnelse demonstrerer overraskende den nedsatte toksisiteten for komplekser inneholdende mindre lipid, som foreliggende HDLC-systemer, sammenlignet med de liposomale systemene. Oppfinnelsen innbefatter HDLC-preparater for anvendelse som bærersystemer for legemiddel i forbindelse med legemidler så som anti-sopp-polyenantibiotikumet amphotericin B og nystatin. Slike preparater er, i motsetning til de i dag kommersielt tilgjengelige preparatene, stabile i vandige oppløsninger, så som saltvann.

I tillegg er det beskrevet en ny liposom-beleggingsfremgangs-måte som fyller liposomer ved å innkapsle et legemiddel via et oppløsningsmiddel-mellomprodukt. Dette oppløsningsmiddel har den egenskapen at det oppløseliggjør det bioaktive middelet, så som amphotericin B, det oppbryter ikke liposom-membranstrukturen, og det er kompatibelt med en vandig oppløsning, så som vann. Et slikt oppløsningsmiddel er etanol. Denne fremgangsmåten forløper uten anvendelse av andre organiske oppløsningsmidler. Avhengig av mol-% av legemiddel som benyttes ved fremstillingen, dannes HDLC fremfor liposomer. I tilfelle hvor dannelsen av HDLC er favorisert fyller fremgangsmåten HDLC med legemiddel.

HDLC refererer til legemiddel-assosiert lipid i partikkel-form, slike partikkelmaterialer er ikke-liposomale av natur. Når de fremstilles ved anvendelse av en MLV-prosess, ka-rakteriseres slike HDLC f.eks. ved: (1) fryse-bruddelektron-mikrobilder (Deamer et al., Biochim. Biophys. Acta, 1970, 219:47-60), som demonstrerer ikke-liposomale komplekser; (2) målinger av innesluttet volum (Deamer et al., Chem. Phys. Lipids, 1986, 40:167-188), som demonstrerer i det vesentlige null innesluttede volumer og derfor er ikke-liposomale; (3) differensiell sveipkalorimetri (DSC) (Chapman, D., i: Liposome Technology, Gregoriadis, G., red., 1984, CRC Press, Boca Eaton), som ikke viser noen 1ipiddobbeltlags for-overgangsfase eller hovedovergang; (4) <31>P-NMR-spektra (Cullis et al., 1982 i: Membrane Fluidity in Biology, Academic Press, Inc., London & N.Y.), som viser egenskaper for sterkt immobilisert lipid (bredt isotropt); og (5) røntgendiffraksjonsdata (Shipley et al., i: Biomembranes, 1973, Chapman, D. og Wallach, D. , redaktører, bind 2:1, Academic Press, Inc., London & N.Y.), som er indikative for gel-faselipid. Karakteristisk for disse systemene er videre den fullstendige assosieringen av legemiddelet med lipidet, hvilket fremgår ved tetthetsgradientsentrifugering. I denne teknikken sentrifugeres gradienten med en forhøyet kraft (ca. 230 000 g) i ca. 24 timer. Dette sikrer at alle komponentene i gradienten når sine 1ikevektstetthetsposisjoner. Eluer-ingsprofiler av disse systemene viser overlappende legemiddel og lipidtopper, dette indikerer at alt legemiddelet er assosiert med lipidet.

Et trekk ved foreliggende oppfinnelse er et legemiddel:lipidforhold som danner HDLC som resulterer i i det vesentlige ekvivalent eller høyere virkningsfullhet for legemiddelet samtidig som det generelt nedsetter akutt toksisitet, målt ved LD50 i mus (fig. 1). Når legemiddelkonsentrasjoner overskrider ca. 6 mol-% og nærmer seg 25 mol-% dannes blandede populasjoner av liposomer og HDLC. Innenfor dette området er en større prosent av strukturene HDLC enn liposomer når mol-% av legemiddelet nærmer seg 25. Ved legemiddelkonsentrasjoner på ca. 5 mol-% eller mindre, og til en nedre grense for lipid kjent for fagmannen som "den kritiske micellekonsentrasjonen" er blandede HDLC/liposom-populasjoner tilstede, men hovedsakelig liposomale strukturer. Slike liposomer kan dannes ved den nye etanol-mellom-produktsprosessen ifølge foreliggende oppfinnelse.

Karakteristisk for de ovenfor nevnte HDLC er forskjellige legemiddel-lipiddispersjoner som observeres ved tetthetssentrifugering. Seperasjonen av legemiddel-1ipid (DMPCrDMPG ved et 7:3 molforhold)-kompleks på de isopykniske sukrose-tetthetskolonnene viser bånddannelse som er avhengig av legemiddel:lipidforholdet og fremstillingsfremgangsmåten. I systemer innbefattende 5 mol-% legemiddel fremstilt ved MLV-prosessen observeres to hovedbånd av materialet; et for liposomer og et hvor legemiddelet er assosiert med lipidet (HDLC). Preparater inneholdende 25 og 50 mol-% legemiddel viste et enkelt bånd hvori det minste av legemiddelet er assosiert med lipidet. Overraskende var disse lavt-lipid/- høyere mol-% legemiddelsystemene mindre toksiske. Fig. 1 viser LD50 (mg/kg) i mus som en funksjon av mol-% av legemiddelet amphotericin B i preparatet. LDsg-verdiene øker mellom 5 og 50 mol-% legemiddel, faller deretter av ved 60 mol-%. Avsatt er også LD5g-verdien for den kommersielt tilgjengelige formen av dette legemiddelet; "Fungizone", ved ca. 3,5 mg/kg. In vitro blodcellelysering (hemolyse) demonstrerer det samme toksisitetsfenomenet.

Undersøkelser av oppfanget volum (inneslutning av oppløst stoff ( i ytl) pr. pmol lipid) utført på MLV-preparater av legemiddel-lipidassosieringer ved varierende mol-% legemiddel, demonstrerer den uvanlige naturen av preparater med 25 mol-% eller høyere (HDLC); disse systemene inneslutter intet oppløst stoff og er derfor ikke liposomale. Fryse-brudd-elektronmikroskopier av disse samme systemene demonstrerer liposomer ved 0 og 5 mol-% legemiddel, men ikke-liposomale HDLC ved 25 og 50 mol-% legemiddel.

Differensielle sveipkalorimetriundersøkelser utført på MLV-preparatene med varierende mol-% legemiddel demonstrerer det samme fenomenet; dvs. spektrene viser overgangstopper som er karakteristiske for det uperturberte dobbeltlagstilstands-lipidet ved 5 mol-% legemiddel (fig. 2), men ingen overgangs-topp ved 25 mol-% legemiddel (fig. 3). I tilfellet 25 mol-% legemiddel er alt lipidet fullstendig assosiert med legemiddelet, dvs. acylkjedene av lipidet er ikke frie til å undergå en kooperativ overgang. Disse dataene bekrefter dataene fra tetthetssentrifugering som viser en dobbelt topp for lipid-tilknyttet legemiddel og fritt lipid ved lege-middelkonsentras j onen på 5 mol-% (fig. 6), men en enkelt topp hvor alt lipidet er assosiert med legemiddelet ved lege-middelkonsentras joner på 25 og 50 mol-% (fig. 5).

Røntgendata ved 5 mol-% (MLV-prosess) viser gelfaselipid ved lave temperaturer, med en overgang til flytende krystallinsk fase ved den karakteristiske temperaturen på 23°C. Ved 50 mol-% legemiddel er lipidet imidlertid i gelfasen ved alle temperaturer; det er ingen overgang fordi alt lipidet er i tett tilknytning til legemiddelet (fig. 6). Tilsvarende data for 33-P-NMR-studier viser mangelen på det frie lipidsignalet for disse høyere (25 og 50) mol-% legemiddelpreparatene (HDLC); lave feltskulderen/høyfeltstoppen, som er karakteristisk for denne typen lipid, er fraværende (fig. 7), mens den er synlig i legemiddelprøvene på 0 og 5 mol-% (fig.

Selv om lipidkomplekssystemer med deres assosierte høye legemiddel-lipidforhold er et trekk av foreliggende oppfinnelse kan 1iposom-dannende fremgangsmåter benyttes ved fremstillingen av disse lipidkompleksene. I trekket med den nye liposomfremstillingen ifølge foreliggende oppfinnelse, dannes liposomer i vandig oppløsning hvortil legemiddelet som skal innesluttes tilsettes, i surgjort etanol. I en annen utførelse av 1iposomfremstillingen inkorporeres amphotericin B i liposomer via et vandig mellomtrinn. I denne teknikken suspenderes amphotericin B i en vandig oppløsning, f.eks. destillert vann, ved ultralydsbehandling. Det suspenderte legemiddelet blandes deretter med en suspensjon av lipid i vandig oppløsning, så som destillert vann eller natriumkloridoppløsning. Blandingen inkuberes ved, eller over, overgangstemperaturen for det anvendte lipidet, med resulterende dannelse av MLV.

Lipidene som kan (1) anvendes ved fremstilling av lipidkompleksene, og (2) benyttes i den nye liposomfremstillings-teknikken, er fosfolipider så som fosfatidylkolin (PC), fosfatidyletanolamin (PE), fosfatidylserin (PS), fosfatidyl-glyserol (PG), fosfatidinsyre (PA), fosfatidylinositol (PI), sfingomyelin (SPM), og lignende, alene eller i kombinasjon. Mettede fosfolipider, så som hydrogenert soya PC, kan også benyttes. Fosfolipidene kan være syntetiske eller avledet fra naturlige kilder så som egg eller soya. En ytterligere 1ipidsammensetning er de mettede fettsyrene så som myristin-syre. I de foretrukkede utførelsene benyttes fosfolipidene dimyristoylfosfatidylkolin (DMPC) og dimyristoylfosfatidyl-glyserol (DMPG) i kombinasjon i et hvilket som helst molforhold, fra 99:1 til 1:99 DMPC:DMPG, fortrinnsvis i et molforhold på 7:3. DMPC og dimyristoylfosfatidylserin (DMPS) kan også benyttes i kombinasjon. Imidlertid kan DMPC benyttes alene. Lipidkompleksene og liposomene kan også inneholde en steroidkomponent som en del av lipidfasen, slike steroider kan være kolesterol, polyetylenglykolderivater av kolesterol (PEG-kolesteroler), koprostanol, kolestanol, kolestan, organiske syrederivater av steroler så som kolesterolhemisuccinat (CHS), og lignende. Organiske syredrivater av tokoferoler kan også benyttes som kompleks-eller liposomdannende bestanddeler, så som alfa-tokoferol-hemisuccinat (THS). Både CHS- og THS-holdige komplekser og deres tris-saltformer kan generelt fremstilles ved en hvilken som helst fremgangsmåte som er kjent innen teknikken for fremstilling av liposomer inneholdende disse sterolene. Se spesielt fremgangsmåtene ifølge Janoff et al., US patent nr. 4 721 614, med tittelen "Steroidal Liposomes", og Janoff et al., PCT-publikasjon nr. 87/02219, publisert 23. april, 1987, med tittelen "Alpha-Tocopherol Based Vesicles", relevante deler av disse er innbefattet heri som henvisning.

Bioaktive midler så som legemidler kan benyttes ved foreliggende oppfinnelse. I tilfellet med HDLC er de bioaktive midlene som benyttes de som er hydrofob; i tilfelle med liposomer, kan de bioaktive midlene være enten hydrofobe eller hydrofile idet liposomer inneslutter begge typer midler. Slike bioaktive midler innbefatter polyenantibiotika så som anti-soppmidlene pimaricin, candicidin, filipin og fortrinnsvis, nystatin og amphotericin B.

I hydratiseringstrinnet av HDLC-dannelsen kan vandige oppløsninger så som destillert vann (f.eks. USP-vann for injeksjon), saltvannsoppløsning, eller vandige buffere benyttes. Vandige buffere som kan benyttes innbefatter buffrede saltvannsoppløsninger så som fosfatbuffret salt-vannsoppløsning ("PBS"), tris-(hydroksymetyl)-aminometan-hydroklorid ("tris" )-buffere, eller glysinbuffere ved pH på 7,0 til 7,5, fortrinnsvis 7,2.

I fremstillingstrinnene for HDLC eller de nye liposomene kan et trinn med ultralydsbehandling gjennomføres. En slik fremgangsmåte gjennomføres i et ultralydsbad i 15 til 30 minutter, ved 25°C, ved 50-60 Hz.

HDLC eller liposomene som er dannet kan størrelsesbestemmes ved ekstrudering gjennom et filter ifølge fremgangsmåten til Cullis et al., PCT-publikasjon nr. 88/00238, publisert 16. januar, 1986, hvorav relevante deler er innbefattet heri som henvisning. Slike størrelsesbestemmelsesfremgangsmåter tillater dannelsen av homogene populasjoner av partikler med hensyn på størrelse. For eksempel kan filtreringen av HDLC utføres gjennom en buktet vei eller rett gjennom membran-filteret, så som et polykarbonatfilter.

HDLC eller liposomene fremstilt ved de nye fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse, kan underkastes en lyofili-serings- eller dehydratiseringsfremgangsmåte ved forskjellige trinn av fremstillingen. For eksempel kan lipidfilmen lyofiliseres etter fjernelse av oppløsningsmiddelet og før tilsetning av legemiddelet. Alternativt kan lipid-lege-middelfilmen lyofiliseres før hydratisering av HDLC eller liposomen. Slik dehydratisering kan utføres ved å eksponere lipidet, HDLC, eller liposomen mot redusert trykk slik at alt det suspenderende oppløsningsmiddelet fjernes. Alternativt, eller i tillegg, kan det endelige hydratiserte HDLC eller 1iposompreparatet også dehydratiseres ved å plassere det i omgivende medium i flytende nitrogen og nedfryse det før dehydratiseringstrinnet. Dehydratisering med forutgående nedfrysning kan utføres i nærvær av en eller flere be-skyttende sukkertyper ved fremstilling ifølge teknikkene til Bally et al., PCT-publikasjon nr. 86/01103, publisert 27. februar, 1986, relevante deler av denne er innbefattet heri som henvisning, og Schneider et al., US patent nr. 4 229 360. Slike teknikker forbedrer langtidslagringen og stabiliteten av preparatene. Andre egnede fremgangsmåter kan benyttes ved dehydratiseringen av de ovenfor omtalte lipidkomplekspre-paratene.

Amphotericin B-lipidpreparatene med høyt molforhold omtalt ovenfor antas å vise lav toksisitet på grunn av forsterkede amphotericin B-amphotericin B-vekselvirkninger i lipid-matriksen. Dette kan demonstreres ved absorbansspektroskopi. Absorbansen ved 413 mn, som f.eks. oppstår fra fritt amphotericin B i deoksykolat er større enn den for uoppvarmet 5 mol-% amphotericin B i lipid. Videre er absorbansen for 25 mol-% amphotericin B større enn den som vises av 50 mol-% amphotericin B i lipid (se fig. 10). Absorbansspektrumteknikken benyttes for å bestemmes toksisiteten av et legemiddel (f.eks. amphotericin B)-lipidkompleks. Absorbansspekteret for et legemiddel er spesifikt for dette legemiddelet, signaturen for amphotericin B (som fremgår i fig. 12, oppløst i deoksykolat), er mellom 300 og 500 nm, og har karakteristiske topper, den mest representative av disse toppene oppstår ved 413 nm. Svekkelsen av denne toppen ved kompleksdannelse av legemiddelet med et lipid, kan benyttes kvantitativt som et mål for toksisiteten av HDLC. Et hvilket som helst av de ovenfor nevnte lipidene vil, når det kompleksbindes på denne måten, ventes å resultere i den karakteristiske, om enn svekkede, absorbansen som her er omtalt, idet spektrene er spesifikke for legemiddelet.

Dersom amphotericin B-lipidsystemer som viser mindre enn maksimal toksisitetsbuffring (f.eks. prøver med 25 mol-%) oppvarmes til 25-60°C, svekkes toksisiteten av det resulterende systemet (se fig. 11). Denne svekkelsen forløper til et maksimum til toksisiteten som observeres når amphotericin B kompleksbindes med 50 mol-% lipid (se fig. 11). En mulig forklaring er at denne svekkelsen finner sted fordi lipidet er faseseparert og derved utelukket fra amphotericin B i oppvarmingstrinnet. Hvilket tillater nærmere assosiering av amphotericin B med seg selv, og følgelig et mindre toksisk system. Det utelukkede lipidet demonstreres ved den gjentatte tilsynekomsten (etter oppvarming) av en endoterm som kan sees i det differensielle sveipkalorimetrispekteret (se fig. 12), som stemmer overens med lipid i det vesentlige fritt for amphotericin B. Videre kan den utelukkede væsken demonstreres ved avsmalningen av <3>lp<->NMR-signalet som oppstår fra de oppvarmede systemene (se fig. 13). Igjen er denne avsmalningen overensstemmende med lipid som har vesentlig redusert amphotericin B-konsentrasjon.

Endelig avslører frysebruddselektronmikroskopi av oppvarmede systemer eksistensen av lipid (og liposomer) etter oppvarming, som ikke tidligere har vært observert. Den u-oppvarmede prøven demonstrerer komplekser uten fritt lipid, karakteristisk for systemer som viser intramolekylær vekselvirkning mellom lipidet og amphotericin B.

Når de ovenfor nevnte undersøkelsene ble utført på prøver inneholdende 50 mol-# amphotericin B, ble det observert små forskjeller mellom prøver undersøkt ført og etter oppvarming. Tilsynelatende er, ved 50 mol-% nivået, interaksjonen for legemiddelet med lipidet så stor at det ikke finnes ytterligere lipid tilgjengelig for utstøtning fra strukturen. Disse prøvene demonstrerer derfor i det vesentlige uendrede signaler både før og etter oppvarming når de undersøkes ved DSC og NMR.

Teorien at det faseseparerte lipidet etterlater amphotericin B i en omgivelse som i større grad fører til amphotericin B-amphotericin B-vekselvirkning (og følgelig er mindre toksisk) kan understøttes ved hjelp av absorbansspektroskopi. Spektrene som oppstår fra oppvarmede systemer er langt mindre intense (hvilket angir lavere toksisitet) sammenlignet med ubehandlede systemer. I et tilfelle resulterte slik oppvarming i en LD50 større enn 30 mg/kg sammenlignet med et uoppvarmet preparat med en LD5Q på 15 mg/kg. I dette tilfellet ble svekkelse av absorbansen ved 413 nm registrert etter oppvarming.

Den ovenfor angitte oppvarmingsprosessen kan demonstreres med en hvilken som helst type liposom eller 1ipidpartikkel eller liposom eller 1ipidpartikkeldannelseprosess, så som en hvilken som helst av de som er angitt ovenfor, men i dette tilfellet ble MLV-prosessen anvendt. Tilsvarende kan et hvilket som helst av de tidligere angitte lipidene eller fosfolipidene benyttes. I foreliggende oppfinnelse kan en hvilken som helst mol-% legemiddel (amphotericin B) som danner liposomer eller lipidpartikler anvendes. Nærmere bestemt anvendes ved foreliggende oppfinnelse fra 5 til 25 mol-% amphotericin B. Når liposomer skal dannes anvendes et legemiddel til 1ipidmolforhold på 5 mol-% legemiddel og mindre. For dannelsen av HDLC anvendes 6 til 25 mol-% legemiddel. Ved 25 mol-% legemiddel og høyere er popula-sjonen hovedsakelig HDLC av natur.

Andre fremgangsmåter som er kjente for fagmannen for fremstilling av liposomer kan anvendes ved utførelsen av foreliggende oppfinnelse.

HDLC-preparatene og liposomene som oppstår ved de nye prosessene ifølge foreliggende oppfinnelse, kan benyttes terapeutisk i dyr (innbefattende mennesker) ved behandlingen av en rekke infeksjoner eller sykdomstilstander som krever: (1) gjentatte administreringer; (2) vedvarende avgivelse av et legemiddel i dets bioaktive form; eller (3) den nedsatte toksisiteten med i det vesentlige ekvivalent eller større virkningsfullhet enn det aktuelle frie legemiddelet. Slike tilstander innbefatter soppinfeksjoner, både topiske og systemiske, som de som kan behandles med antisoppmidler så som nystatin og amphotericin B. I tillegg er preparatene ifølge oppfinnelsen stabile i vandig oppløsning.

Fremgangsmåten for administrering av preparatet kan bestemme setene og cellene i organismen hvortil forbindelsen av-leveres. HDLC og liposomene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse kan administreres alene, men vil generelt bli administrert i blanding med en farmasøytisk bærer valgt med henblikk på den planlagte administreringsmåten og standard farmasøytisk praksis. For eksempel kan avleverelse på et spesifikt sete enklest oppnås ved topisk påføring (dersom infeksjonen er ekstern, f.eks. på arealer som øyne, hud, i ører, eller på skader, så som sår eller forbrenninger). Slike topiske anvendelser kan foretas i form av kremer, salver, geler, emulsjoner eller pastaer, for direkte påføring på det angrepne området. Alternativt kan preparatene injiseres parenteralt, f.eks. intravenøst, intramuskulært eller subkutant. For parenteral administrering kan de f.eks. benyttes i form av en steril vandig oppløsning som kan inneholde andre oppløste stoffer, f.eks. nok salter eller glukose til gjøre oppløsningen isotonisk. Andre anvendelser, avhengig av de spesielle egenskapene for preparatet, kan være åpenbare for fagmannen.

For administrering til mennesker ved helbredende eller profylaktisk behandling av soppsykdommer, vil den fore-skrivende legen bestemme den egnede dosen for et gitt menneske, og dene kan ventes å variere avhengig av alderen, vekten og individets respons, så vel som naturen og alvoret av pasientens symptomer. Doseringen av legemiddelet i HDLC eller liposomal form vil generelt være tilnærmet den mengden som anvendes for det frie legemiddelet. I visse tilfeller kan det imidlertid være nødvendig å administrere doser utenfor disse grensene.

De følgende eksemplene er gitt for å illustrere oppfinnelsen.

Eksempel 1

Til 2,0 ml vannfri etanol ble det tilsatt 10 pl av 1N-saltsyre. Amphotericin B (20 mg; samlet legemiddel 5 mol-%) ble tilsatt til den surgjorte etanolen og blandingen ble ultralydsbehandlet til klarhet under betingelsene angitt i eksempel 1, bortsett fra at ultralydsbehandlingstiden var 30 sekunder til 60 sekunder. DMPC (200 mg) og DMPG (42 mg) ble plassert i et forsøksrør hvortil det ble tilsatt en ben-zen:metanol (70:30)-oppløsning, og oppløsningen ble lyofilisert som i eksempel 8. Det tørkede lipidet ble blandet med 2,0 ml PBS og blandingen ble dispergert ved virvelblanding. Amphotericin B-oppløsningen (0,2 ml) ble tilsatt til lipidet, og blandingen ble omrørt over natten. De resulterende DMPC:DMPG MLV (200 pl) ble anbrakt som lag på en sakkarose tetthetsgradient og sentrifugert i 24 timer ved 22°C ved 230 000 x g. Resultatene er vist i fig. 11; alt amphotericin B var assosiert med lipidet, i en bred fordeling hvor toppen av gradienten inneholdt mest av lipidet og hoved-amphotericintoppen ved bunnen av gradienten. Alternativt ble de resulterende DMPC:DMPG MLV lyofilisert og rehydratisert med destillert vann (2,0 ml).

Eksempelet ovenfor ble gjentatt ved anvendelse av 7, 9, 16.7, 17, 20, 25, 33, 50 og 60 mol-% amphotericin B. Ved mol-% av legemiddel på og over 16.7, ble for det meste HDLC dannet. Tetthets-sentrifugeringsgradienter av slike preparater med høyt legemiddel:1ipidforhold tilsvarer de som er vist i fig. 5, hvor alt legemiddelet og lipidet er assosiert i en enkelt topp.

Eksempel 2

Prøver av 25 mol-56 amphotericin B-DMPC:DMPG ble preparert for røntgendiffraksjon, DSC, frysebruddselektronmikroskop, og <31>P-NMR-studier på følgende måte: Et 7:3 molforhold mellom DMPC :DMPG (44 mg totalt lipid) og 20 mg amphotericin B (25 mol-% amphotericin B) ble suspendert i kloroform:metanol (70:30 v/v), og ble inndampet under redusert trykk ved 55°C til en tynn film på siden av en kolbe. Filmen ble hydrati-sert med 8,0 ml 20 mM Hepes, 250 mM NaCl, pH 7,2, ved 22 ° C ved virvelblanding med glassperler. Preparatet ble sentrifugert ved 10 000 x g i 10 minutter, supernatanten dekantert, og pelleten resuspendert i 1,0 ml av Hepes/NaCl-bufferen. Preparatet ble deretter ultralydsbehandlet i et ultralydsbad i 20 minutter ved 25°C, 50-60 Hz.

Fremgangsmåten ovenfor ble gjentatt ved anvendelse av 0,5 og 50 mol-% amphotericin B.

Eksempel 3

For å bestemme det innesluttede volumet av amphotericin B-holdige liposomer og HDLC, ble følgende fremgangsmåte fulgt: DMPC (100 mg) og 42 mg DMPG, begge i kloroform, ble blandet med 10 mg amphotericin B (25 mol-%) i metanol (0,1 mg/ml amphotericin B) i en kolbe. Oppløsningsmiddelet ble fjernet under redusert trykk ved 37°C. PBS (3,7 ml) hvortil det var tilsatt 0,3 ml av en fortynnet <3>H-inulinoppløsning i destillert vann ble tilsatt til den tørre lipidfilmen under omrøring. En porsjon (10,2 ml) av denne oppløsningen ble plassert i scintillasjonsblanding og telt for radioaktivitet i en beta-scintillasjonsteller. En andre porsjon ble analysert med henblikk på fosfat ved fremgangsmåten ifølge Bartlett, J. Biol. Chem., 1959, 234:466-468. Lipid-legemiddelsuspensjonen ble sentrifugert ved 10 000 x g i 10 minutter, supernatanten ble kastet, og pelleten ble resuspendert i PBS. Sentrifugerings- og pelletsresuspensjons-trinnene ble utført ytterligere to ganger; den siste resuspensjonen ble inndelt i prøver (100 pm) og telt i en beta-scintillasjonsteller. En andre porsjon av den endelige pellet-resuspensjonen ble analysert med henblikk på fosfat som angitt ovenfor. Prosent oppfangning av inulin ble beregnet ved å dividere de endelige radioaktive tellingene med utgangstellingene og multiplisere med 100. Oppfanget volum (pl inulin oppfanget/pmol lipid) ble også beregnet.

Fremgangsmåten ovenfor ble gjentatt ved anvendelse av 0, 5 og 50 mol-% amphotericin B.

Eksempel 4

DSC-målinger ble utført på en "Micro Cal MC-l"-enhet fra Micro Cal, Inc., Amherst, MA. Prøvevolumer på 0,70 ml inneholdende 5-9 mg suspensjon ble injisert i prøvecellen, det samme volum buffer ble benyttet i referansecellen. Prøver ble oppvarmet enten ved ca. 26°C/time eller ca. 37°C/time. Duplikatforsøk med den samme prøven med samme historie ga starttemperaturer og fullførelsestemperaturer som var reproduserbare innenfor 0,2 °C. Generelt ble prøver inneholdende amphotericin B oppvarmet til 60°C (ikke høyere), og deretter avkjølt til 7-4° C i minst to timer for å sikre konsistent prøvehistorie.

Eksempel 5

NMR-spektra ble oppnådd ved 145,7 MHz på et "Bruker AM360 wide bore" NMR-spektrometer ved anvendelse av 8K datapunkter for vurdering, en sveipbredde på 50 000 Hz og en pulsbredde på 20 psek. tilsvarende en 45° puls. Spektra ble akkumulert for opptil 10 000 transienter.

Eksempel 6

En porsjon på 0,1-0,3 pl av prøven ble anbrakt mellom et par Balzers- (Nashua, NH)-kobberbærerplater og raskt bråkjølt fra 23°C i flytende propan. Prøver ble brutt og replikert på et dobbelt replikeringsinnretning i en Balzers fryse-brudds-enhet ved et vakuum på 2 x IO-<6> mbar eller lavere og ved 115°C. Replika ble flottert av i 3N HN03, etterfult av vasking i en inndelt serie av natriumhypoklorittoppløsninger. Disse ble endelig renset i destillert vann og opptatt på 300 Hex mesh kobbernett (polysciences, PA). Replikaene ble betraktet i et Philips 300 elektronmikroskop ved en forstør-relse på 3 000 til 22 000 ganger.

Eksempel 7

Absorbansspektra (som i fig. 12 og 13) ble fremstilt ved å fortynne amphotericin B i Hepes/NaCl-buffer til 25 pM liter amphotericin B. En prøve ble plassert i prøvekuvetten av et Beckmann spektrofotometer og avlest ved 300 til 500 nm. Prøvekuvetten ble avlest mot en blindbuffer.

Eksempel 8

Prøver for ESR ble merket med en serie av posisjonsmessige isomerer av doksylsteriske syrer hvor doksylreportergruppen var tilstede ved forskjellige posisjoner langs fettsyre-kjeden. Merking ble bevirket ved å inkorporere proben ved virvelblanding og ultralydsbehandling fra en etanolisk oppløsning som ble tørket til en tynn film på siden av et forsøksrør. Alle prøver ble merket i et omfang på 1 mol-%. ESR-spektra ble registrert på et "IBM-instruments ER100D ESR-spektrometer" med temperaturregulering ved hjelp av nitrogen-gass-strøm. En ytre kalibrert termistorprobe (Omega Engine-ering, Inc., Stamford, CA) ble benyttet for å overvåke temperaturen av prøven. ESR-spektra ble registrert ved en mikrobølgeef f ekt på 10 MW og en mikrobølgef rekvens på 9,11 GHZ med et feltsveip på 100 G og en 100 kHz feltmodulerings-amplitude på 0,32 G. Ordningsparameterene ble beregnet fra den maksimale hyperfine oppsplittingen (A max).

Claims (3)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av HDLC eller et liposom innbefattende et polyen-antisopp-antibiotikum og et lipid, karakterisert ved at den innbefatter trinnene: (a) fremstilling av liposomer innbefattende minst et 1ipid; (b) suspensjon av legemiddelet i surgjort etanol; og (c) blanding av legemiddelsuspensjonen fra trinn (b) og liposomene fra trinn (a).

2 . Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at legemiddelet er tilstede i en mengde på 5 mol-%.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at legemiddelet er tilstede i en mengde på ca. 25 mol-%.