NO179995B

NO179995B - Fremgangsmåte for fremstilling av legemiddel-lipidsystemer med lav toksisitet inneholdende polyen-antibiotika

Info

Publication number: NO179995B
Application number: NO884391A
Authority: NO
Inventors: Andrew Stuart Janoff; Lawrence Boni; Thomas D Madden; Pieter R Cullis; Robert P Lenk; John J Kearns; Anthony G Durning; Robert Klimchak; Joel Portnoff
Original assignee: Liposome Co Inc
Priority date: 1987-03-05
Filing date: 1988-10-04
Publication date: 1996-10-21
Also published as: ES2070131T3; NO1998012I1; KR970002870B1; DK176010B1; ES2070131T5; NO944071D0; DK98089D0; DE3852961D1; NO1998013I1; NO884391L; CN1044093C; EP0282405A3; DE3852961T2; EP0282405B1; CA1338701C; DK98089A; NZ223660A; EP0282405A2; AU622405B2; IL85607A0

Abstract

Fremgangsmåter og preparater er beskrevet for lkke-llposomale llpldkomplekser 1 forbindelse med toksiske hydrofobe legemidler så som polyenantlblotlkumet amphoterlcln B. Llpidpreparatene er fortrinnsvis en kombinasjon av fosfollpldene dlmyrlstoylfosfatldylkolln (DMPC) og dlmyrlstoylfosfatldylglyserol (DMPG) 1 et molforhold på ca. 7:3. Llpldkompleksene Inneholder et bloaktlvt middel, og kan fremstilles ved en rekke fremgangsmåter, ved heye legemiddel:1lpldforhold. Disse preparatene av høyt forhold legemiddel:llpldkomplekser (HDLCer) kan administreres til pattedyr så som mennesker for behandling av infeksjoner, med 1 det vesentlige ekvivalent eller høyere vlrknlngsfullhet, og reduserte legemlddeltokslslteter, enn med legemidlene 1 deres frie form. Beskrevet er også en ny liposom-fremstllllngsfremgangsmåte, som også kan anvendes ved fremstillingen av HDLCene.

Description

Foreliggende oppfinnelse er rettet mot fremgangsmåter for fremstilling av legemiddel-assosierte lipidkomplekser med høye legemiddel:lipidforhold (høye legemiddel:lipidkomplekser , eller HDLCer) inneholdende polyen-antibiotika. Slike preparater er når det gjelder effektivitet generelt i det vesentlige ekvivalente med, eller hedre enn, det samme legemiddelet i fri form, men har lavere toksisitet. I tillegg er det beskrevet fremgangsmåter for fremstilling av slike HDLC'er. Nærmere bestemt er oppfinnelsen rettet mot fremstillingen av disse høye legemiddel:lipidkompleksene med toksiske antisopp-polyenantibiotika, nærmere bestemt amphotericin B og nystatin.

De høye legemiddel:1ipidkompleksene (HDLC'er) som her omtales, kan fremstilles ved teknikker som i det vesentlige er de samme som de som anvendes for fremstilling av liposomer. Oppfinnelsen innbefatter fremstilling av disse HDLC-strukturene i forbindelse med bioaktive midler så som legemidler, nærmere bestemt polyen-antibiotika, så som amphotericin B og nystatin.

Mange legemidler som er nyttige for behandling av sykdom viser toksisiteter i pasienten, slike toksisiteter kan være kardiotoksisitet, som med anti-tumorlegemiddelet dokso-rubicin, eller nefrotoksisitet, som med aminoglykosid eller polyen-antibiotika, så som amphotericin B. Amphotericin B er et meget toksisk antisopp polyenantibiotikum som viser den største påliteligheten ved behandling av livstruende soppinfeksjoner (Taylor et al., Am. Rev. Respir. Dis., 1982, 125:610-611). Fordi amphotericin B er et hydrofobt legemiddel, er det uoppløselig i vandig oppløsning og er kommersielt tilgjengelig som en kolloidal dispersjon i desoksykolat, et rensemiddel som benyttes for å suspendere den, som i seg selv er toksisk. Amphotericin B metylester og amphotericin B har også vært vist å være aktive mot HTLV-III/LAV-viruset, et lipid-omhyllet retrovirus, som er påvist i etiologien ved ervervet immunsviktsyndrom (AIDS) (Schaffner et al., Biochem, Pharmacol., 1986, 35:4110-4113). I denne undersøkelsen ble amphotericin B metylesteraskorbinsyresalt (vannoppløselig) og amphotericin B tilsatt til separate kulturer av HTLV-III/LAV-infiserte celler, og cellene ble analysert med henblikk på replikering av viruset. Resultat-ene viste at amphotericin B metylester og amphotericin B beskyttet målceller mot de cytopatiske virkningene av viruset, tilsvarende det som er demonstrert for herpesviruset (Stevens et al., Arch. Virol., 1975, 48:391).

I mange undersøkelser har lipidholdige liposomer vært benyttet for å redusere toksisiteten av det innesluttede legemiddelet, med tendens mot økning av lipidinnholdet i preparatene for å buffre legemiddeltoksisitet. I forbindelse med foreliggende oppfinnelse er det overraskende funnet at et lavt innhold av lipidbestanddel reduserer toksisiteten mest effektivt. Ved fremstillingen av HDLCene ifølge oppfinnelsen ved en MLV-fremgangsmåte kan det oppstå en blandet populasjon av HDLC'er med MLVer; disse preparatene er de hvor det anvendes fra ca. 5 til ca. 25 mol-# legemiddel (amphotericin B), andelen av HDLCer øker når mol-% legemiddel øker. Preparater hvor det anvendes 25 mol-% til ca. 50 mol-% legemiddel er i det vesentlige HDLCer, frie for liposomer. Alternativt er preparater inneholdende 5 mol-# hydrofobt legemiddel og mindre i det vesentlige liposomale med visse HDLC'er. Separasjonen av HDLC'er fra hetrogene populasjoner kan, om nødvendig, utføres ved anvendelse av en hvilken som helst separasjonsteknikk som er kjent, f.eks. tetthetsgradient-sentrifugering.

Fremgangsmåtene som anvendes for å fremstille disse HDLCene kan være i det vesentlige de samme som de som anvendes for å fremstille liposomer, men i foreliggende oppfinnelse hvor det anvendes høye legemiddel:lipidforhold, dannes mer HDLCer enn liposomer med uventet stor reduksjon i toksisitet, sammenlignet med liposomalpreparatene.

Ved foreliggende oppfinnelse tilveiebringes en fremgangsmåte for fremstilling av et preparat innbefattende HDLC, som innbefatter et polyen-antisopp-antibiotikum og minst ett fosfo-lipid, kjennetegnet ved at den omfatter trinnene: (a) oppløsning av minst et fosfo-lipid i et organisk opp-løsningsmiddel av middels polaritet; (b) oppløsning av legemiddelet i et biokompatibelt

organisk oppløsningsmiddel; og

(c) blanding av oppløsningen fra (a) med oppløsningen fra

trinn (b),

hvor konsentrasjonen av antisopp-antibiotikumet i komplekset er mellom 25 mol-# og 50 mol-#, og hvor preparatet er i det vesentlige fritt for liposomer.

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremstilling av HDLC (komplekser med høyt legemiddel:lipidforhold) -systemer som innbefatter lipider og bioaktive midler innbefattende legemidler. Slike HDLCer innbefatter fosfolipider, så som DMPC og DMPG, fortrinnsvis i et 7:3 molforhold eller mettede fosfolipider eller fettsyrefosfolipider. Det bioaktive middelet er et antisopplegemiddel, så som nystatin eller amphotericin B. Mol-$ av legemiddelet som er tilstede er fortrinnsvis fra 25 til 50 mol-#, fortrinnsvis 30 til 50 mol-#. Farmasøytiske preparater av HDLCene, fortrinnsvis innbefattende et legemiddel amphotericin B, fremstilles innbefattende farmasøytisk akseptable bærere og fortynnere, og disse preparatene kan administreres parenteralt. Slike preparater benyttes for å behandle infeksjonssykdommer, så som soppinfeksjoner, ved administrering til pattedyr, så som mennesker. De HDLC-holdige preparatene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse innbefatter de preparatene som er i det vesentlige frie for liposomer og preparater som er i det vesentlige frie for liposomer som innkapsler legemiddelet. De innbefatter generelt ikke mer enn 10 vekt-# lipid, fortrinnsvis ikke mer enn 556, og mest foretrukket ikke mer enn 3$. Forskjellige fremgangsmåter for fremstilling av HDLC'ene ifølge oppfinnelsen er beskrevet, f.eks. teknikker som først oppløseliggjør legemiddelet, nærmere bestemt amphotericin B i et oppløsningsmiddel så som DMSO eller metanol. Lipidet (fortrinnsvis DMPCrDMPG i et 7:3 molforhold) oppløseliggjøres i et oppløsningsmiddel så som metylenklorid, og lipid og legemiddeloppløsningene blandes. Oppløsningsmiddelene kan avdampes under redusert trykk, slik at det oppstår en tynn lipid-legemiddelfilm. Filmen kan hydratiseres i en vandig oppløsning så som saltvann, PBS, eller glysinbuffer, slik at det dannes HDLCer. Alternativt kan den vandige oppløsningen tilsettes til det oppløsningsmiddel-holdige legemiddelet og lipidfasen før inndampning av oppløsningsmiddelet. Som et annet alternativ kan den resulterende tørre 1ipid-legemiddelfilmen resuspenderes i et oppløsningsmiddel, så som metylenklorid, og igjen inndampes under redusert trykk før hydratisering av filmen. En dehydratiseringsfremgangsmåte kan også benyttes; i denne prosessen dehydratiseres en tørr lipid-legemiddelf ilm slik at det dannes et flak som hydratiseres med vandig oppløsning.

I en alternativ fremgangsmåte for fremstilling av HDLCene ifølge oppfinnelsen dannes lipidpartikler (eller liposomer) inneholdende bioaktivt middel (legemiddel, f.eks. polyen antisoppmidler, så som amphotericin B) ved MLV-prosessen inneholdende 25$ til 50 mol-% amphotericin B, og deretter underkastes partiklene (eller liposomene) en oppvarmings-syklus ved 25°C til 60°C, mest foretrukket ca. 60°C. En slik syklus danner et sterkere ordnet og mindre toksisk amphotericin B/1ipidkompleks.

Ifølge et annet trekk ved oppfinnelsen benyttes en absorbans-spektrumsteknikk for å bestemme toksisiteten av et legemiddel (f.eks. et polyen antisoppmiddel, så som amphotericin B)-lipidkompleks. Absorbansspekteret for et legemiddel er spesifikt for dette legemiddelet; signaturen av legemiddelet kan være en topp eller serier av topper i det ultrafiolette eller det synlige området. Signaturtoppen for amphotericin B (som fremtrer i fig. 12, oppløst i deoksykolat), er mellom 300 og 500 nm, og har karakteristiske topper, den mest representative av disse toppene er den som oppstår ved 413 nm. Svekkelsen av denne toppen ved kompleksdannelse av legemiddelet med lipid, kan benyttes kvantitativt som et mål for toksisiteten av HDLC. Med andre ord, kan toksisitets-graden bestemmes ved hjelp av intensiteten for absorbans-topphøyden. Fig. 1 er en grafisk fremstiling som angir akutt toksisitet målt ved hjelp av LD50 som en funksjon av mol-% amphotericin B i preparatet. Fig. 2 er et spektrum oppnådd ved differensiell sveipkalorimetri av et liposomalt (MLV) preparat inneholdende 5 mol-# amphotericin B. Fig. 3 er et spektrum fra differensiell sveipkalorimetri av et HDLC-preparat (MLV-prosess) inneholdende 25 mol-% amphotericin B. Fig. 4 er en grafisk fremstilling av en isoteknisk gradient for multilamellære liposomer inneholdende 5 mol-% amphotericin B. Lipid (heltrukken linje); amphotericin B (prikket linje). Fig. 5 er en grafisk fremstilling av en isopyknisk gradient for HDLC'er (MLV-prosess) fremstilt med 50 mol-# amphotericin B. Lipid (heltrukken linje); amphotericin B (prikket linje). Fig. 6 viser grafiske fremstillinger av røntgendiffraksjons-data for liposom og HDLC-preparater (MLV-prosess) inneholdende (henholdsvis) 5 og 50 mol-% amphotericin B. Fig.. 7 viser <31>P-NMR-spektra for HDLC-preparater (MLV-prosess) inneholdende 25 og 50 mol-% amphotericin B. Fig. 8 viser <31>P-NMR-spektra for liposom (MLV) preparater inneholdende 0 og 5 mol-# amphotericin B. Fig. 9 er en grafisk fremstilling av en isopyknisk tetthetsgradient for amphotericin B-holdige liposomer dannet ved hjelp av den surgjorte etanolprosessen inneholdende 5 mol-# amphotericin B. Lipid (heltrukken linje); amphotericin B (prikket linje). Fig. 10 er et absorbansspektrum for fritt amphotericin B oppløst i deoksykolat. Fig. 11 er absorbansspektra for 5 mol-% amphotericin B (a), 25 mol-% amphotericin B (b), 25 mol-% amphotericin B etter oppvarming (c), og 50 mol-% amphotericin B (d), i 7:3

DMPC:DMPG.

Fig. 12 er et absorbansspektrum for 25 mol-% amphotericin B i 7:3 DMPC :DMPG både før (a) og etter (b) oppvarming i 10 minutter ved 60°C. Fig. 13 er et DSC-spektrum for 7:3 DMPC/DMPG inneholdende 25 mol-% amphotericin B både før (a), og etter (b) varmesykling, sammenlignet med spekteret for ren DMPC/DMPG (c). Fig. 14 er et <31>P-NMR-spektrum for komplekser av 7:3 molforhold DMPC/DMPG inneholdende 25 mol-% amphotericin B før (a) og etter (b) varmesykling ved 60°C. Fig. 15 er en grafisk fremstilling som demonstrerer innvirkningen av ionestyrken på opptaket av amphotericin B i DMPC:DMPG-liposomer. Fig.. 16 viser virkningen av inkuberingstemperatur på raten for amphotericin B-opptak i DMPC:DMPG-liposomer. Fig. 17 viser innvirkningen av liposomstruktur på opptak av amphotericin B i DMPC :DMPG MLVer eller LUV* er.

Ikke-liposomale komplekser med høyt legemiddel:lipidforhold (HDLCer) som har unike egenskaper, og fremgangsmåter for deres fremstilling er beskrevet. Disse HDLCene inneholder et bioaktivt middel så som et hydrofobt legemiddel som, når HDLC administreres til en organisme, kan ha i det vesentlige ekvivalent eller større virkningsfullhet og lavere toksisitet enn legemiddelet administrert i enten fri eller liposomal form. Slike HDLCer omfatter et høyt legemiddel;lipid-molforhold (større enn 25 mol-% legemiddel). Foreliggende oppfinnelse demonstrerer overraskende den nedsatte toksisiteten for komplekser inneholdende mindre lipid, som foreliggende HDLC-systemer, sammenlignet med de liposomale systemene. Oppfinnelsen innbefatter HDLC-preparater for anvendelse som bærersystemer for legemiddel i forbindelse med legemidler så som antisopp-polyenantibiotikumet amphotericin B og nystatin. Slike preparater er, i motsetning til de i dag kommersielt tilgjengelige preparatene, stabile i vandige oppløsninger, så som saltvann.

HDLCer refererer til legemiddel-assosiert lipid i partikkelform, slike partikkelmaterialer er ikke-liposomale av natur. Når de fremstilles ved anvendelse av en MLV-prosess, ka-rakteriseres slike HDLCer f.eks. ved: (1) fryse-brudd-elektronmikrobilder (Deamer et al., Biochim. Biophys. Acta, 1970, 219:47-60), som demonstrerer ikke-liposomale komplekser; (2) målinger av innesluttet volum (Deamer et al., Chem. Phys. Lipids, 1986, 40:167-188), som demonstrerer i det vesentlige null innesluttede volumer og derfor er ikke-liposomale; (3) differensiell sveipkalorimetri (DSC)

(Chapman, D., i: Liposome Technology, Gregoriadis, G., red., 1984, CRC Press, Boca Raton), som ikke viser noen lipid-

dobbeltlags for-overgangsfase eller hovedovergang; (4) <31p_ >NMR-spektra (Cullis et al., 1982 i: Membrane Fluidity in Biology, Åcademic Press, Inc., London & N.Y.), som viser egenskaper for sterkt immobilisert lipid (bredt isotropt); og (5) røntgendiffraksjonsdata (Shipley et al., i: Bio-membranes, 1973, Chapman, D. og Wallach, D., redaktører, bind 2:1, Åcademic Press, Inc., London & N.Y.), som er indikativ for gel-faselipid. Karakteristisk for disse systemene er videre den fullstendige assosieringen av legemiddelet med lipidet, hvilket fremgår ved tetthetsgradientsentrifugering. I denne teknikken sentrifugeres gradienten med en forhøyet kraft (ca. 230 000 g) i ca. 24 timer. Dette sikrer at alle komponentene i gradienten når sine 1ikevektstetthetsposisjon-er . Elueringsprofiler av disse systemene viser overlappende legemiddel og lipidtopper, dette indikerer at alt legemiddelet er assosiert med lipidet.

Et trekk ved foreliggende oppfinnelse er et legemiddel:lipid-forhold som danner HDLCer som resulterer i i det vesentlige ekvivalent eller høyere virkningsfullhet for legemiddelet samtidig som det generelt nedsetter akutt toksisitet, målt ved LD50 i mus (fig. 1). Det er i forbindelse med foreliggende oppfinnelse funnet at mellom 25 og 50 mol-% hydrofobt legemiddel oppfyller slike krav, mest foretrukket mellom 25 og 35 mol-% hydrofobt legemiddel.

Karakteristisk for de ovenfor nevnte HDLCene er forskjellige legemiddel-lipiddispersjoner som observeres ved tetthetssentrifugering. Seperasjonen av legemiddel-lipid (DMPC:DMPG ved et 7:3 molforhold)-kompleks på de isopykniske sukrose-tetthetskolonnene viser bånddannelse som er avhengig av legemiddel:1ipidforholdet og fremstillingsfremgangsmåten. Preparater inneholdende 25 og 50 mol-% legemiddel viste et enkelt bånd hvori det minste av legemiddelet er assosiert med lipidet. Overraskende var disse lavt-1ipid/høyere mol-% legemiddel systemene mindre toksiske. Fig. 1 viser LD50 (mg/kg) i mus som en funksjon av mol-% av legemiddelet amphotericin B i preparatet. LD5Q-verdiene øker mellom 25 og 50 mol-% legemiddel, faller deretter av ved 60 mol-%. Avsatt er også LD5Q-verdien for den kommersielt tilgjengelige formen av dette legemiddelet; "Fungizone", ved ca. 3,5 mg/kg. In vitro blodcellelysering (hemolyse) demonstrerer det samme toksisitetsfenomenet.

Undersøkelser av oppfanget volum (inneslutning av oppløst stoff ( i pl ) pr. jimol lipid) utført på MLV-preparater av legemiddel-1ipidassosieringer ved varierende mol-% legemiddel, demonstrerer den uvanlige naturen av preparater med 25 mol-% eller høyere (HDLC); disse systemene inneslutter intet oppløst stoff og er derfor ikke liposomale. Fryse-brudd-elektronmikroskopundersøkelsen av disse samme systemene demonstrerer liposomer ved 0 og 5 mol-% legemiddel, men ikke-liposomale HDLCer ved 25 og 50 mol-% legemiddel.

Differensielle sveipkalorimetriundersøkelser utført på MLV-preparatene med varierende mol-% legemiddel demonstrerer det samme fenomenet; dvs. spektrene viser overgangstopper som er karakteristiske for det uperturberte dobbeltlagstilstands-lipidet ved 5 mol-% legemiddel (fig. 2), men ingen overgangs-topp ved 25 mol-% legemiddel (fig. 3). I tilfellet 25 mol-% legemiddel er alt lipidet fullstendig assosiert med legemiddelet, dvs. acylkjedene av lipidet er ikke frie til å undergå en kooperativ overgang. Disse dataene bekrefter dataene fra tetthetssentrifugering som viser en dobbelt topp for lipid-tilknyttet legemiddel og fritt lipid ved lege-middelkonsentrasjonen på 5 mol-% (fig. 6), men en enkelt topp hvor alt lipidet er assosiert med legemiddelet ved lege-middelkonsentrasjoner på 25 og 50 mol-% (fig. 5).

Røntgendata ved 5 mol-% (MLV-prosess) viser gel-faselipid ved lave temperaturer, med en overgang til flytende krystallinsk fase ved den karakteristiske temperaturen på 23"C. Ved 50 mol-% legemiddel er lipidet imidlertid i gelfasen ved alle temperaturer; det er ingen overgang på grunn av at alt lipidet er i tett tilknytning til legemiddelet (fig. 6). Tilsvarende data -for <31>P-NMR-studier viser mangelen på det frie lipidsignalet for disse høyere (25 og 50) mol-% legemiddelpreparatene (HDLC'er); lavfeltskulderen/høy-feltstoppen, som er karakteristisk for denne typen lipid, er fraværende (fig. 7), mens den er synlig i legemiddelprøvene på 0 og 5 mol-% (fig. 8).

Lipidene som kan (1) anvendes ved fremstilling av lipidkompleksene, og (2) benyttes i den nye HDCL-fremstillings-teknikken ifølge foreliggende oppfinnelse, er fosfolipider så som fosfatidylkolin (PC), fosfatidyletanolamin (PE), fosfat-idylserin (PS), fosfatidylglyserol (PG), fosfatidinsyre (PA), fosfatidylinositol (PI), sfingomyelin (SPM), og lignende, alene eller i kombinasjon. Mettede fosfolipider, så som hydrogenert soya PC, kan også benyttes. Fosfolipidene kan være syntetiske eller avledet fra naturlige kilder så som egg eller soya. En ytterligere 1ipidsammensetning er de mettede fettsyrene så som myristinsyre. I de foretrukkede utførelsene benyttes fosfolipidene dimyristoylfosfatidylkolin (DMPC) og dimyristoylfosfatidylglyserol (DMPG) i kombinasjon i et hvilket som helst molforhold, fra 99:1 til 1:99 DMPC:DMPG, fortrinnsvis i et molforhold på 7:3. DMPC og dimyristoylfos-fatidylserin (DMPS) kan også benyttes i kombinasjon. Imidlertid kan DMPC benyttes alene. Lipidkompleksene kan også inneholde en steroidkomponent som en del av lipidfasen, slike steroider kan være kolesterol, polyetylenglykolderivater av kolesterol (PEG-kolesteroler), koprostanol, kolestanol, kolestan, organiske syrederivater av steroler, så som kolesterolhemisuccinat (CHS) og lignende. Organiske syre-drivater av tokoferoler kan også benyttes som kompleks-eller 1iposomdannende bestanddeler, så som alfa-tokoferol-hemisuccinat (THS). Både CHS- og THS-holdige komplekser og deres tris-saltformer kan generelt fremstilles ved en hvilken som helst fremgangsmåte som er kjent innen teknikken for fremstilling av liposomer inneholdende disse sterolene. Se spesielt fremgangsmåtene ifølge Janoff et al., US patent nr. 4 721 614, utstedt 26. januar, 1988, med tittelen "Steroidal Liposomes", og Janoff et al., PCT-publikasjon nr. 87/02219, publisert 23. april, 1987, med tittelen "Alpha-Tocopherol Based Vesicles", inngitt 24. september, 1986, relevante deler av disse er innbefattet heri som henvisning.

Bioaktive midler, så som legemidler, kan benyttes ved foreliggende oppfinnelse. I tilfellet med HDLC'er er de bioaktive midlene som benyttes de som er hydrofobe. Slike bioaktive midler er polyenantibiotika, så som antisoppmidlene pimaricin, candicidin, filipin og fortrinnsvis, nystatin og amphotericin B.

Under fremstilling av HDLCene, kan organiske oppløsnings-midler benyttes. Egende organiske oppløsningsmidler er de med mellomliggende polariteter og dielektriske egenskaper (de som har en polaritet i mellom motsatte elektriske ladninger), som oppløseliggjør lipider, og innbefatter, men er ikke begrenset til, kloroform, metanol, dimetylsulfoksyd (DMSO), metylenklorid, og oppløsningsmiddelblandinger så som kloroform, metanol (70:30) og benzen:metanol (70:30). Som et resultat dannes oppløsninger, definert som blandinger hvori komponentene er uniformt fordelt; inneholdende lipidene. Oppløsningsmidler velges fortrinnsvis på basis av deres bio-kompatibilitet, lav toksisitet og uantennelighet. Ved oppløseliggjøring av legemiddelet, nærmere bestemt amphotericin B, er DMSO foretrukket ettersom legemiddelet er mest oppløselig i DMSO. Metanol kan anvendes i stedet for DMSO med en tilsvarende økning i oppløsningsmiddelvolumet. For oppløseliggjøring av lipid anvendes fortrinnsvis metylenklorid på grunn av dets lave toksisitet i mennesker.

I hydratiseringstrinnet av HDLC-dannelsen kan vandige oppløsninger, så som destillert vann (f.eks. USP-vann for injeksjon), saltvannsoppløsning, eller vandige buffere benyttes. Vandige buffere som kan benyttes innbefatter, men er ikke begrenset til, buffrede saltvannsoppløsninger, så som fosfatbuffret saltvannsoppløsning ("PBS"), tris-(hydroksy-metyl)-aminometanhydroklorid ("tris")-buffere, eller glysin-buffere ved pH på ca. 7,0 på ca. 7,5, fortrinnsvis 7,2.

I fremstillingstrinnene for HDLCene kan et trinn med ultralydsbehandling gjennomføres. En slik fremgangsmåte gjennomføres i et ultralydsbad i 15 til 30 minutter, ved 25°C, ved 50-60 Hz.

HDLC'ene som er dannet, kan størrelsesbestemmes ved eks-trudering gjennom et filter ifølge fremgangsmåten til Cullis et al., PCT-publikasjon nr. 88/00238, publisert 16. januar, 1986, hvorav relevante deler er innbefattet heri som henvisning. Slike størrelsesbestemmelsesfremgangsmåter tillater dannelsen av homogene populasjoner av partikler med hensyn på størrelse. For eksempel kan filtreringen av HDLCene utføres gjennom en buktet vei eller rett gjennom membranfilteret, så som et polykarbonatfilter.

HDLCene fremstilt ved de nye fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse, kan underkastes en lyofiliserings-eller dehydratiseringsfremgangsmåte ved forskjellige trinn av fremstillingen. For eksempel kan lipidfilmen lyofiliseres etter fjernelse av oppløsningsmiddelet og før tilsetning av legemiddelet. Alternativt kan lipid-legemiddelfilmen lyofiliseres før hydratisering av HDLC. Slik dehydratisering kan utføres ved å eksponere lipidet eller HDLC mot redusert trykk, slik at alt det suspenderende oppløsningsmiddelet fjernes. Alternativt, eller i tillegg, kan det endelige hydratiserte HDLC eller 1iposompreparatet også dehydratiseres ved å plassere det i omgivende medium i flytende nitrogen og nedfryse det før dehydratiseringstrinnet. Dehydratisering med forutgående nedfrysning kan utføres i nærvær av en eller flere beskyttende sukkertyper ved fremstilling ifølge teknikkene til Bally et al., PCT-publikasjon nr. 86/01103, relevante deler av denne er innbefattet heri som henvisning, og Schneider et al., US patent nr. 4 229 360. Slike teknikker forbedrer langtids-lagringen og stabiliteten av preparatene. Andre egnede fremgangsmåter kan benyttes ved dehydratiseringen av de ovenfor omtalte lipidkomplekspreparatene.

En fremgangsmåte for fremstilling av HDLCene ifølge foreliggende oppfinnelse er en MLV-fremgangsmåte, hvori det bioaktive middelet (f.eks. et legemiddel) oppløses i metanol i en kolbe hvor til det deretter tilsettes lipid som DMPC og DMPG i et molforhold på ca. 7:3 for DMPC :DMPG, i kloroform. Etter rotofordampning av oppløsningen ved redusert trykk resuspenderes den tørkede filmen i PBS og ultralydsbehandles i et ultralydsbad (ved ca. 25" C i ca. 30 minutter, 50-60 Hz) inntil klarhet. Ved molforhold for legemiddel:lipid på ca. 6 og høyere (til ca. 60 mol-%), er preparatene ikke-liposomale HDLC-strukturer som er i det vesentlige frie for liposomer. Toksisiteter av HDLC-preparatene er avhengig av legemiddel:-lipidforholdet, preparater med høyere legemiddel:lipidfor-hold (25-50 mol-% legemiddel) viser mindre akutt toksisitet enn preparater med lavere legemiddel:lipidforhold.

En annen fremgangsmåte er en modifisert MLV-fremgangsmåte hvorved den ovenfor fremstilte legemiddel-lipidfilmen tørkes i en glassklokke under redusert trykk for fremstilling av et legemiddel-lipidflak. Dette flaket pulveriseres til et pulver som hydratiseres homogent når vandig oppløsning tilsettes. Denne fremgangsmåten innbefatter oppløsning av legemiddelet i et organisk oppløsningsmiddel, så som DMSO eller metanol, etterfulgt av blanding med et lipid (fortrinnsvis et 7:3 molforhold for DMPC:DMPG) i metylenklorid. Blandingen tørkes deretter under redusert trykk til en film som deretter tørkes, f.eks. i en glassklokke under redusert trykk. Det resulterende tørkede pulveret hydratiseres med en vandig saltvannsoppløsning og oppvarmes for fremstilling av en legemiddel-lipidsuspensjon. Som omtalt ovenfor avhenger dannelsen av HDLC'er, liposomer og blandinger derav, og den medfølgende graden av toksisitet, av legemiddel:1ipid-forholdet.

Andre fremgangsmåter kan benyttes ved fremstillingen av HDLCer. En slik fremgangsmåte er en SPLV-fremgangsmåte hvori legemiddelet oppløses i et oppløsningsmiddel, så som DMSO. Et lipid (så som et 7:3 molforhold mellom DMPCDMPG) i et oppløsningsmiddel (f.eks. kloroform eller metylenklorid) tørkes til en tynn film under redusert trykk, og et organisk oppløsningsmiddel, så som metylenklorid, tilsettes til lipidet. En porsjon av legemiddelet (f.eks. amphotericin B) i oppløsning tilsettes til lipidsuspensjonen, og den resulterende blandingen ultralydsbehandles til klarhet. En buffret vandig oppløsning (f.eks. buffret saltvann) tilsettes og blandingen plasseres igjen under redusert trykk for å fjerne metylenkloridet. Den resulterende pastaen hydratiseres videre med PBS og ultralydsbehandles til klarhet. Som med den ovenfor nevnte fremgangsmåten vil det resulterende preparatet være HDLC eller liposomalt avhengig av molforholdet som anvendes for legemiddel: lipid. LD50 i mus ved anvendelse av dette preparatet viste lavere toksisiteter enn med høyere legemiddel:1ipidforhold.

Nok en fremgangsmåte er en modifisert SPLV-fremgangsmåte hvori legemiddelet i organisk oppløsningsmiddel (f.eks. DMSO) blandes med lipid (f.eks. DMPC:DMPG) i oppløsning, og en buffret vandig oppløsning (f.eks. PBS) tilsettes, etterfulgt av fordampning av oppløsningsmiddelet under nitrogen under ultralydsbehandling. I tillegg tilsettes PBS og den resulterende oppløsningen filtreres, fortrinnsvis gjennom et 5 pm filter, sentrifugeres deretter ved 10 000 x g i ca. 10 minutter. Supernatantoppløsningen ble fjernet, kastet, og pelleten ble resuspendert i vandig oppløsningsmiddel (PBS). Etter en andre "vasking" ved sentrifugering resuspenderes den resulterende pelleten i PBS. Som med de ovenfor omtalte preparatene er den akutte toksisiteten av preparatene direkte forbundet med legemiddel:lipidforholdet, dvs. jo høyere forholdet er (til ca. 60 mol-% legemiddel), jo mindre toksisk er preparatet.

Amphotericin B-lipidpreparatene med høyt molforhold omtalt ovenfor antas å vise lav toksisitet på grunn av forsterkede amphotericin B-amphotericin B-vekselvirkninger i lipid-matriksen. Dette kan demonstreres ved absorbansspektroskopi. Absorbansen ved 413 mn, som f.eks. oppstår fra fritt amphotericin B i deoksykolat, er større enn den for uoppvarmet 5 mol-% amphotericin B i lipid. Videre er absorbansen for 25 mol-% amphotericin B større enn den som vises av 50 mol-% amphotericin B i lipid (se fig. 10).

Absorbansspektrumteknikken benyttes for å bestemmes toksisiteten av et legemiddel (f.eks. amphotericin B)-lipidkompleks. Absorbansspekteret for et legemiddel er spesifikt for dette legemiddelet, signaturen for amphotericin B (som fremgår i fig. 12, oppløst i deoksykolat), er mellom 300 og 500 nm, og har karakteristiske topper, den mest representative av disse toppene oppstår ved 413 nm. Svekkelsen av denne toppen ved kompleksdannelse av legemiddelet med et lipid, kan benyttes kvantitativt som et mål for toksisiteten av HDLC. Et hvilket som helst av de ovenfor nevnte lipidene vil, når det kompleksbindes på denne måten, ventes å resultere i den karakteristiske, om enn svekkede, absorbansen som her er omtalt, idet spektrene er spesifikke for legemiddelet.

Dersom amphotericin B-lipidsystemer som viser mindre enn maksimal toksisitetsbuffring (f.eks. prøver med 25 mol-%) oppvarmes til 25-60°C, svekkes toksisiteten av det resulterende systemet (se fig. 11). Denne svekkelsen' forløper til et maksimum til toksisiteten som observeres når amphotericin B kompleksbindes med 50 mol-% lipid (se fig. 11). En mulig forklaring er at denne svekkelsen finner sted fordi lipidet er faseseparert og derved utelukket fra amphotericin B i oppvarmingstrinnet, hvilket tillater nærmere assosiering av amphotericin B med seg selv, og følgelig et mindre toksisk system. Det utelukkede lipidet demonstreres ved den gjentatte tilsynekomsten (etter oppvarming) av en endoterm som kan sees i det differensielle sveipkalorimetrispekteret (se fig. 12), som stemmer overens med lipid i det vesentlige fritt for amphotericin B. Videre kan den utelukkede væsken demonstreres ved avsmalningen av <31>P-NMR-signalet som oppstår fra de oppvarmede systemene (se fig. 13). Igjen er denne avsmalningen overensstemmende med lipid som har vesentlig redusert amphotericin B-konsentrasjon.

Endelig avslører frysebruddselektronmikroskopi av oppvarmede systemer eksistensen av lipid (og liposomer) etter oppvarming, som ikke tidligere har vært observert. Den uopp-varmede prøven demonstrerer komplekser uten fritt lipid, karakteristisk for systemer som viser intramolekylær vekselvirkning mellom lipidet og amphotericin B.

Når de ovenfor nevnte undersøkelsene blir utført på prøver inneholdende 50 mol-% amphotericin B, ble det observert små forskjeller mellom prøver undersøkt før og etter oppvarming. Tilsynelatende er, ved 50 mol-% nivået, interaksjonen for legemiddelet med lipidet så stor at det ikke finnes ytterligere lipid tilgjengelig for utstøtning fra strukturen. Disse prøvene demonstrerer derfor i det vesentlige uendrede signaler både før og etter oppvarming når de undersøkes ved DSC og NMR.

Teorien at det faseseparerte lipidet etterlater amphotericin B i en omgivelse som i større grad fører til amphotericin B-amphotericin B-vekselvirkning (og følgelig er mindre toksisk) kan understøttes ved hjelp av absorbansspektroskopi. Spektrene som oppstår fra oppvarmede systemer er langt mindre intense (hvilket angir lavere toksisitet) sammenlignet med ubehandlede systemer. I et .tilfelle resulterte slik oppvarming i en LD50 større enn 30 mg/kg sammenlignet med et uoppvarmet preparat med en LD50 på 15 mg/kg. I dette tilfellet ble svekkelse av absorbansen ved 413 nm registrert etter oppvarming.

Den ovenfor angitte oppvarmingsprosessen kan demonstreres med en hvilken som helst type liposom eller lipidpartikkel eller liposom eller lipidpartikkeldannelsesprosess, så som en hvilken som helst av de som er angitt ovenfor, men i dette tilfellet ble MLV-prosessen anvendt. Tilsvarende kan et hvilket som helst av de tidligere angitte lipidene eller fosfolipidene benyttes, på samme måte som et hvilket som helst oppløsningsmiddel eller en hvilken som helst vandig buffer som angitt ovenfor. For eksempel suspenderes lipid (i en hvilken som helst mengde som er kjent for å danne liposomer, så som DMPC:DMPG i et 7:3 molforhold) i et organisk oppløsningsmiddel, så som kloroform, tørkes til en tynn film på siden av en rundbundet kolbe. Amphotericin B (eller et hvilket som helst annet legemiddel som angitt ovenfor) oppløses i et hvilket som helst egnet organisk oppløsningsmiddel (et egnet oppløsningsmiddel er et som oppløser legemiddelet, f.eks. spesifikt amphotericin B). I foreliggende oppfinnelse kan en hvilken som helst mol-% legemiddel (amphotericin B) som danner liposomer eller lipidpartikler anvendes. Nærmere bestemt anvendes ved foreliggende oppfinnelse fra 25 til 50 mol-% amphotericin B.

I det foreliggende oppvarmingstrekket ved foreliggende oppfinnelse oppløses amphotericin B i metanol ved 10 mg amphotericin B pr. 100 ml metanol, eller 0,1 mg/ml amphotericin B. Metanolen inneholdende oppløst amphotericin B (100,0 ml) tilsettes til lipidfilmen, og filmen resuspenderes. Den resulterende suspensjonen rotofordampes deretter under redusert trykk til en tynn film. Lipid-amphotericin B-filmen resuspenderes deretter i en porsjon av vandig opp-løsning, hvis volumet er tilstrekkelig til å danne liposomer eller lipidpartikler, så som f.eks. 4,0 ml. Suspensjonen kan deretter omrøres og ultralydsbehandles i flere minutter til 1 time, og oppvarmes i et vannbad ved fra 25° C til 60°C i 10 til 400 minutter.

En annen fremgangsmåte for fremstilling av HDLC'ene innbefatter anvendelse av et homogeniseringstrinn fremfor ultralydsbehandling. For eksempel kan HDLCene fremstilles ved SPLV-prosessen, hvori et legemiddel (f.eks. amphotericin B) kan tilsettes til et egnet oppløsningsmiddel (så som DMSO) og blandes ved hjelp av en mekanisk blander for å oppløse alt legemiddelet. Om nødvendig kan oppløsningen deretter filtreres, slik at eventuelle uoppløste partikler av legemiddelet fjernes. Et molforhold på 7:3 av DMPC:DMPG kan deretter oppløses i et egnet oppløsningsmiddel (så som metylenklorid), og lipidet deretter blandes med legemiddel-DMSO-oppløsningen. En vandig oppløsning så som saltvann tilsettes deretter til blandingen, og de organiske opp-løsningsmidlene fjernes ved rotasjonsfordampning ved 35-45°C. Etter oppløsningsmiddelsfjernelse fortynnes den resulterende legemiddel-lipidblandingen med vandig opp-løsning, så som saltvann, og suspensjonen av HDLC nedmales ved anvendelse av en homogenisator. En hvilken som helst homogeniseringsinnretning eller kolloidmølle som vil male ned partiklene er akseptabel for denne fremgangsmåten, men fortrinnsvis anvendes en "Gifford Wood" kolloidmølle. Partiklene nedmales inntil en akseptabel partikkelstørrelse er oppnådd, f.eks. hvori 90% av partiklene er under 10 pm i diameter, fortrinnsvis med et størrelsesområde på 4 til 10 mikrometer, eller i 15-30 minutter. Partiklene kan føres en gang eller et større antall ganger gjennom møllen, avhengig av den ønskede størrelsen og homogeniteten. HDLC-partiklene kan analyseres med henblikk på størrelsesfordeling ved anvendelse av "Malvern"-partikkelstørrelsesbestemmeren. Om nødvendig kan større og mindre partikler fjernes ved en hvilken som helst kjent fremgangsmåte innen teknikken for separasjon av partikler, som ved filtrering. En slik prosess resulterer fortrinnsvis i partikler med diameter mellom 0,2 pm og 10,0 pm.

HDLC-preparatene som oppstår ved de nye prosessene ifølge foreliggende oppfinnelse, kan benyttes terapeutisk i dyr (innbefattende mennesker) ved behandlingen av en rekke infeksjoner eller sykdomstilstander som krever: (1) gjentatte administreringer; (2) vedvarende avgivelse av et legemiddel i dets bioaktive form; eller (3) den nedsatte toksisiteten med i det vesentlige ekvivalent eller større virkningsfullhet enn det aktuelle frie legemiddelet. Slike tilstander innbefatter, men er ikke begrenset til, soppinfeksjoner, både topiske og systemiske, som de som kan behandles med antisoppmidler så som nystatin og amphotericin B og virussykdommene ervervet immunsviktsyndrom (AIDS) og herpes. I tillegg er preparatene stabile i vandig oppløsning.

Fremgangsmåten for administrering av preparatet kan bestemme setene og cellene i organismen hvortil forbindelsen avleveres. HDLCene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse kan administreres alene, men vil generelt bli administrert i blanding med en farmasøytisk bærer valgt med henblikk på den planlagte administreringsmåten og standard farmasøytisk praksis. For eksempel kan avleverelse på et spesifikt sete enklest oppnås ved topisk påføring (dersom infeksjonen er ekstern, f.eks. på arealer som øyne, hud, i ører, eller på skader så som sår eller forbrenninger). Slike topiske anvendelser kan foretas i form av kremer, salver, geler, emulsjoner eller pastaer, for direkte påføring på det angrepne området. Alternativt kan preparatene injiseres parenteralt, f.eks. intravenøst, intramuskulært eller subkutant. For parenteral administrering kan de f.eks. benyttes i form av en steril vandig oppløsning som kan inneholde andre oppløste stoffer, f.eks. nok salter eller glukose til å gjøre oppløsningen isotonisk. Andre anvendelser, avhengig av de spesielle egenskapene for preparatet, kan være åpenbare for fagmannen.

Preparatene fremstilt ifølge oppfinnelsen kan benyttes for behandling av astma, ved å innføre en forstøvet vandig suspensjon av HDLC'ene i lungene. For eksempel kan HDLC'ene suspenderes i et egnet oppløsningsmiddel som kan fremstilles som aerosol ved hjelp av en pneumatisk eller ultralydsfor-støver eller mer hensiktsmessig, ved hjelp av en enhets-forstøver som drives ved gasstrykk fra en fluorkarbonpellet. Andre inhaleringssystemer, så som de hvori HDLCene avleveres i partikkelform, enten som et tørt pulver eller som en suspensjon i et egnet bærersystem, er akseptable.. Etter aerosoldannelsen tapes det meste av drivoppløsningsmiddelet ved plutselig fordampning og erstattes av fuktighet i luftveien, hvilket fører til avsetning av partiklene.

For administrering til mennesker ved helbredende eller profylaktisk behandling av sopp— eller virussykdommer, vil den foreskrivende legen bestemme den egnede dosen for et gitt menneske, og denne kan ventes å variere avhengig av alderen, vekten og individets respons, så vel som naturen og alvoret av pasientens symptomer. Doseringen av legemiddelet i HDLC-form vil generelt være tilnærmet den mengden som anvendes for det frie legemiddelet. I visse tilfeller kan det imidlertid være nødvendig å administrere doser utenfor disse grensene.

De følgende eksemplene er gitt for å illustrere oppfinnelsen.

Eksempel 1

Amphotericin B (10 mg; totalt legemiddel 5 mol-%) ble tilsatt til 100 ml metanol i en 500 ml rundbundet kolbe og blandingen ble ultralydsbehandlet inntil den var klar. Dette ultralyds-behandlingstrinnet ble utført i et ultralydsbad i ca. 15 minutter ved 25°C og ved 50-60 Hz. Dimyristoylfosfatidylkolin (DMPC) ble tilsatt (100 mg i 1,0 ml kloroform), så vel som 42 mg dimyristoylfosfatidylglyserol (DMPG) (i 0,42 ml kloroform). Den resulterende dispersjonen ble tørket ved rotasjonsfordampning ved 60 °C under redusert trykk for fremstilling av en tynn film i kolben. Filmen ble resuspendert i 4,0 _ml PBS, oppløsningen ble overført til et glassrør og "ultralydsbehandlet til klarhet.

Eksempelet ovenfor ble gjentatt med 16,7, 20, 25, 33 og 60 mol-% amphotericin B. Undersøkelser av akutt toksisitet (LD5Q), som er et mål for dosen av legemiddel som gir en 50% dødsrate i mus, var høyere når mol-% av legemiddelet øket, opptil 50 mol-% av amphotericin B.

Eksempel 2

Amphotericin B (140 mg; totalt legemiddel 5 mol-%) ble tilsatt til 1,5 ml dimetylsulfoksyd (DMSO). DMPC (1400 mg) og 600 mg DMPG ble oppløst i 50 ml metylenklorid, og de to oppløsningene ble overført til en kolbe. Oppløsningen ble blandet inntil den var klar og deretter tørket ved rotofordampning under redusert trykk, slik at det ble dannet en film på kolben, deretter tørket 1-4 dager i en glassklokke. Etter slik tørking ble filmen, som hadde dannet tørkede flak, pulverisert til et pulver og blandet med 100 ml eller 50 ml 0,9% saltvannsoppløsning, eller 50 ml USP-vann for injeksjon. Den resulterende suspensjonen ble oppvarmet til 37°C i en time.

Eksempelet ovenfor ble gjentatt ved anvendelse av metanol i stedet for DMSO som det suspenderende oppløsningsmiddelet for amphotericin B, og ved mol-% for amphotericin B på 10, 16,7 og 33. 1 g og 2 g av eggfosfatidylkolin ble benyttet i stedet for 7:3 molforholdet mellom DMPC:DMPG.

Eksempel 3

Amphotericin B (100 mg; totalt legemiddel 5 mol-%) ble oppløst i 2,0 ml DMSO. DMPC (100 mg i 1,0 ml) og DMPG (42 mg i 0,42 ml) ble sammen oppløst i kloroform i en kolbe, og

kloroformen ble fjernet ved rotofordampning under redusert <;> trykk. Metylenklorid (20 ml) ble tilsatt til kolben etterfulgt av tilsats av 0,2 ml av forrådsoppløsningen av amphotericin B. Denne suspensjonen ble ultralydsbehandlet til

klarhet (ca. 1 minutt) under de betingelsene som er angitt i eksempel 1. PBS (0,3 ml), pE 7,2, ble tilsatt og metylenkloridet ble deretter fjernet under en strøm av nitrogen under ultralydsbehandling. Den resulterende pastaen ble resuspendert i 10,0 ml PBS og sentrifugert ved 10 000 x g i 10 minutter, etterfulgt av ultralydsbehandling i bad i ca. 20 minutter.

Eksempelet ovenfor ble gjentatt ved anvendelse av 16,7, 20, 25, 33, 50 og 60 mol-% amphotericin B.

Eksempel 4

Prøver av 25 mol-% amphotericin B-DMPC:DMPG ble preparert for røntgendiffraksjon, DSC, frysebruddselektronmikroskop, og <31>P-NMR-studier på følgende måte: Et 7:3 molforhold mellom DMPC: DMPG (44 mg totalt lipid) og 20 mg amphotericin B (25 mol-% amphotericin B) ble suspendert i kloroform:metanol (70:30 v/v), og ble inndampet under redusert trykk ved 55°C til en tynn film på siden av en kolbe. Filmen ble hydratisert med 8,0 ml 20 mM Hepes, 250 mM NaCl, pH 7,2, ved 220 C ved virvelblanding med glassperler. Preparatet ble sentrifugert ved 10 000 x g i 10 minutter, supernatanten dekantert, og pelleten resuspendert i 1,0 ml av Hepes/NaCl-bufferen. Preparatet ble deretter ultralydsbehandlet i et ultralydsbad i 20 minutter ved 25°C, 50-60 Hz.

Fremgangsmåten ovenfor ble gjentatt ved anvendelse av 0,5 og 50 mol-% amphotericin B.

Eksempel 5

For å bestemme det innesluttede volumet av amphotericin B-holdige HDLCer, ble følgende fremgangsmåte fulgt: DMPC (100 mg) og 42 mg DMPG, begge i kloroform, ble blandet med 10 mg amphotericin B (25 mol-%) i metanol (0,1 mg/ml amphotericin B) i en kolbe. Oppløsningsmiddelet ble fjernet under redusert trykk ved 37° C. PBS (3,7 ml) hvortil det var tilsatt 0,3 ml av en fortynnet <3>H-inulinoppløsning i destillert vann ble tilsatt til den tørre lipidfilmen under omrøring. En porsjon (10,2 ml) av denne oppløsningen ble plassert i scintillasjonsblanding og telt for radioaktivitet i en beta-scintillasjonsteller. En andre porsjon ble analysert med henblikk på fosfat ved fremgangsmåten ifølge Bartlett, J. Biol. Chem., 1959, 234:466-468. Lipid-lege-middelsuspensjonen ble sentrifugert ved 10 000 x g i 10 minutter, supernatanten ble kastet, og pelleten ble resuspendert i PBS. Sentrifugerings- og pelletsresuspensjons-trinnene ble utført ytterligere to ganger; den siste resuspensjonen ble inndelt i prøver (100 pm) og telt i en beta-scintillasjonsteller. En andre porsjon av den endelige pellet-resuspensjonen ble analysert med henblikk på fosfat som angitt ovenfor. Prosent oppfangning av inulin ble beregnet ved å dividere de endelige radioaktive tellingene med utgangstellingene og multiplisere med 100. Oppfanget volum (pl inulin oppfanget/pmol lipid) ble også beregnet.

Fremgangsmåten ovenfor ble gjentatt ved anvendelse av 0, 5 og 50 mol-% amphotericin B.

Eksempel 6

Amphotericin B-partikler ble fremstilt ved å tørke 15,5 mg DMPC og 6,5 mg DMPG (molforhold 7:3) fra ca. 10 ml kloroform på sidene av en 100 ml rundbundet kolbe. Amphotericin B (10 mg) ble suspendert i 100 ml metanol og 100,0 ml av metanol-oppløsningen ble tilsatt til kolben, og lipidfilmen ble suspendert, slik at det ble oppnådd 25 mol-% amphotericin B. Blandingen ble deretter tørket under rotofordampning ved 37°C til en tynn film på siden av kolben. Filmen ble deretter hydratisert med 4,0 ml 10 mM Hepes, 150 mM NaCl (pH 7,2) ved anvendelse av glassperler, og ultralydsbehandlet i 30 minutter slik at det ble oppnådd en endelig suspensjon. En prøve av denne suspensjonen ble deretter oppvarmet til 60°C i 10 minutter ved neddykning i et vannbad. Den resulterende suspensjonen ble karakterisert ved DSC, NMR og frysebruddselektronmikroskopi.

Fremgangsmåten ovenfor ble gjentatt, uten oppvarming av prøven. Denne prøven ble holdt ved 22°C, og ble også karakterisert ved de ovenfor angitte teknikkene.

Eksempel 7

Materialene og fremgangsmåtene fra eksempel 6 ble gjentatt ved anvendelse av 50 mol-% og 5 mol-% amphotericin E. Disse systemene ble karakterisert ved DSC, ESE og frysebruddselektronmikroskopi.

Eksempel 8

DSC-målinger ble utført på en "Micro Cal MC-1"-enhet fra Micro Cal, Inc., Amherst, MA. Prøvevolumer på 0,70 ml inneholdende 5-9 mg suspensjon ble injisert i prøvecellen, det samme volum buffer ble benyttet i referansecellen. Prøver ble oppvarmet enten ved ca. 26°C/time eller ca. 37°C/time. Duplikatforsøk med den samme prøven med samme historie ga starttemperaturer og fullførelsestemperaturer som var reproduserbare innenfor 0,2°C. Generelt ble prøver inneholdende amphotericin B oppvarmet til 60°C (ikke høyere), og deretter avkjølt til 7-4°C i minst to timer for å sikre konsistent prøvehistorie.

Eksempel 9

NMR-spektra ble oppnådd ved 145,7 MHz på et "Bruker AM360 wide bore" NMR-spektrometer ved anvendelse av 8K datapunkter for vurdering, en sveipbredde på 50 000 Hz og en pulsbredde på 20 jjsek. tilsvarende en 45° puls. Spektra ble akkumulert for opptil 10 000 transienter.

Eksempel 10

En porsjon på 0,1-0,3 pl av prøven ble anbrakt mellom et par Balzers (Nashua, NH)-kobberbærerplater og raskt bråkjølt fra 23° C i flytende propan. Prøver ble brutt og replikert på en dobbelt replikeringsinnretning i en Balzers fryse-brudds-enhet ved et vakuum på 2 x 10"^ mbar eller bedre og ved 115°C. Replika ble flottert av i 3N HN03, etterfulgt av vasking i en inndelt serie av natriumhypoklorittoppløsninger. Disse ble endelig renset i destillert vann og opptatt på 300 Hex mesh kobbernett (polysciences, PA). Replikaene ble betraktet i et "Philips 300" elektronmikroskop ved en forstørrelse på 3 000 til 22 000 ganger.

Eksempel 11

Absorbansspektra (som i fig. 12 og 13) ble fremstilt ved å fortynne amphotericin B i Hepes/NaCl-buffer til 25 jjM liter amphotericin B. En prøve ble plassert i prøvekyvetten av et Beckmann spektrof otometer og avlest ved 300 til 500 nm. Prøvekuvetten ble avlest mot en blindbuffer.

Eksempel 12

Prøver for ESR ble merket med en serie av posisjonsmessige isomerer av doksylsteriske syrer hvor doksylreportergruppen var tilstede ved forskjellige posisjoner langs fettsyre-kjeden. Merking ble bevirket ved å inkorporere proben ved virvelblanding og ultralydsbehandling fra en etanolisk oppløsning som ble tørket til en tynn film på siden av et forsøksrør. Alle prøver ble merket i et omfang på 1 mol-%.

ESR-spektra ble registrert på et "IBM-instruments ER100D ESR-spektrometer" med temperaturregulering ved hjelp av nitrogen-gass-strøm. En ytre kalibrert termistorprobe (Omega Engineer-ing, Inc., Stamford, CA) ble benyttet for å overvåke temperaturen av prøven. ESR-spektra ble registrert ved en mikro-bølgeeffekt på 10 MW og en mikrobølgefrekvens på 9,11 GHz med et feltsveip på 100 G og en 100 kHz feltmoduleringsamplitude på 0,32 G. Ordningsparameterene ble beregnet fra den maksi-male hyperfine oppsplittingen (A max).

Eksempel 13

Amphotericin B (337,5 g) ble tilsatt til 3 375 ml DMSO og amphotericin B (100 mg/ml) ble blandet til oppløsning (ca. 3 timer) ved anvendelse av en mekanisk blander. Blandingen ble overført til en trykkbeholder av rustfritt stål (kapasitet 5 liter), og filtrert gjennom 0,22 pm "Sartofluor"-filter og polypropylendybdefilter (Pall Profile, Pall, Inc., Glen Cove,

N.Y. ) .

I en 40 liters trykkbeholder ble 50,8 kg metylenklorid blandet med 225,0 g DMPC og 99,0 g DMPG, i 3,5 timer for fullstendig oppløsning. Den resulterende lipidoppløsningen ble overført gjennom et 0,2 m<2> "Sartofluor" 0,22 pm teflon-filter inn i en bearbeidelsesbeholder av rustfritt stål. Den 40 liters trykkbeholderen ble vasket med ytterligere 55,2 kg metylenklorid og tilsvarende filtrert i bearbeidelsesbeholderen. Bearbeidelsesbeholderen ble innstilt for å blande lipidoppløsningen ved rotasjon ved 195 opm, og amphotericin B DMSO-oppløsningen ble deretter overført til beholderen. Natriumkloridoppløsning (16,2 1, 0,9% USP) ble deretter tilsatt til beholderen gjennom et 0,22 pm "Millipak 100" polykarbonatfilter.

Ved anvendelse av en varmeveksler innstilt på 35 0 C i serie med bearbeidelsesbeholderen ble en oppvarmet flytende nitrogenstrøm ført over tanken og oppløsningsmiddelet ble fjernet i løpet av et tidsrom på 12 timer. Det resulterende lipid-legemiddelkomplekset ble fortynnet med natriumklorid 0,9% USP/700 ml), overført'til beholderen gjennom et "Millak 100" 0,22 pm filter.

De resulterende HDLCene ble homogenisert ved anvendelse av "Gifford Wood"-kolloidmøllen og en rotasjons"lobe"pumpe. HDLCer ble ført gjennom kolloidmøllehodet ved en gap-innstilling på 0,013 mm med tilbaketrykket på 68,95 kPa i 3 timer, dette resulterte i partikler mindre enn 20 pm. Partikkelstørrelse for HDLCene ble analysert ved hjelp av "Malvern"-partikkeltelleren.

Eksempel 14

Lipid (102,6 pmol totalt, 70:30 molforhold mellom DMPC:DMPG) oppløst i kloroform ble pipetert inn i en 500 ml rundbunnet kolbe. Nystatin (500 mg) ble oppløst i 1,0 1 metanol (0,5 mg/ml) ved ultralydsbehandling i et Branson ultralydsbe-handlingsbad. Oppløst nystatin (5,0 ml) ble tilsatt til den rundbundede kolben inneholdende lipid og blandet; oppløs-ningsmiddelet ble deretter fjernet ved rotasjonsfordampning ved 45 °C i 15 minutter, og de resulterende preparatene ble rehydratisert i saltvann (5,0 ml) ved virvelblanding med glassperler. Ved lysmikroskopisk undersøkelse var liposomer synlige.

Fremgangsmåten ovenfor ble gjentatt ved anvendelse av 25, 50, 75 og 100 mol-% nystatin. Ved undersøkelse ved frysebruddselektronmikroskopi ble preparatene inneholdene 25 mol-% nystatin funnet å være ikke-liposomale HDLCer

Eksempel 15

Lipid (14,8 jjmol/ml, 7:3 molforhold for DMPC: DMPG) ble hydratisert i destillert vann og inkubert ved 4°C. De resulterende MLVene ble ekstrudert mellom to over hverandre stilte polykarbonatfiltere ti ganger ved anvendelse av LUVET-fremgangsmåten.

Amphotericin B ble dispergert i destillert vann ved anvendelse av et ultralydsbad ved en konsentrasjon på 10,8 umol/ml. Amphotericin B dispersjonen ble tilsatt til lipidsuspensjonen til en endelig lipid og amphotericin B-konsentrasjon på henholdsvis 13,5 jjmol/ml og 0.98 pmol/ml. For å fjerne uinkorporert amphotericin B ble 20 ml av prøven sentrifugert ved 15 000 x g i 30 minutter i en "Ti60" eller "SW 27"-rotor (Beckman) ved 22°C i en "Beckman L8-60" ultrasentrifuge. Det supernatantfrie amphotericin B ble fjernet uten å forstyrre 1iposompelleten. De resulterende liposomene ble målt ved kvasielastisk lysspredning og ble funnet å være større enn 1,0 pm i diameter.

Fremgangsmåten ovenfor ved anvendelse av inkuberingsbe-tingelser på 23°C ble gjentatt ved anvendelse av 150 mM NaCl, 10 mM NagPC^, pH 7,4 for å hydratisere lipidene. De resulterende liposomene ble målt ved kvasielastisk lysspredning og ble funnet å være større enn 1,0 pm i diameter. Raten for amphotericin B-opptak av liposomer var høyest når ionestyrken for mediet var lav (destillert vann vs. 150 mM NaCl)(Fig. 17).

Fig. 16 viser opptaket av amphotericin B i DMPC:DMPG-liposomer under varierende betingelser for inkuberingstemperatur. Opptaksraten er tilsvarende ved 23°C og 45° C. Legemiddelet akkumuleres også når lipidet er i gelfasen, dvs. ved 15°C.

Eksempel 16

Materialene og fremgangsmåtene fra eksempel 20 ble anvendt, men lipidet suspendert i destillert vann ble inkubert med amphotericin B ved 22°C. De resulterende liposomene var unilamellære og hadde en midlere diameter på 0,1 - 0,2 pm bestemt ved kvasielastisk lysspredning. Fig. 19 viser at raten for aphotericin B-opptak er raskere i de første to timene med disse LUV'ene enn med MLVene.

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et preparat innbefattende HDLC, som innbefatter et polyen-antisopp-antibiotikum og minst ett fosfo-lipid, karakterisert ved at den omfatter trinnene: (a) oppløsning av minst et fosfo-lipid i et organisk opp-løsningsmiddel av middels polaritet; (b) oppløsning av legemiddelet i et biokompatibelt organisk oppløsningsmiddel; og (c) blanding av oppløsningen fra (a) med oppløsningen fra trinn (b), hvor konsentrasjonen av antisopp-antibiotikumet i komplekset er mellom 25 mol-% og 50 mol-%, og hvor preparatet er i det vesentlige fritt for liposomer.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1 for fremstilling av et preparat innbefattende HDLC, karakterisert ved at den i tillegg innbefatter trinnet: (d) dehydratisering av blandingen fra trinn (c) ovenfor.

3. Fremgangsmåte ifølge foregående krav for fremstilling av HDLC, karakterisert ved at den i tillegg innbefatter trinnene: (d) inndampning av oppløsningsmiddelet fra blandingen i trinn (c) under redusert trykk for fremstilling av tørket fosfolipidfilm; og (e) tilsetning av én vandig oppløsning til filmen i trinn (d).

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den innfatter trinnene: (d) tilsetning av en vandig oppløsning til de blandede oppløsningene fra trinn (a) og (b); (e) fjernelse av organiske oppløsningsmidler og vandig fase fra produktet fra trinn (d) for å dannen pasta, og (f) tilsetning av en vandig fase til pastaen fra trinn (e).

5 . Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den innbefatter trinnene: (d) fjernelse av organisk oppløsningsmiddel fra produktet f ra trinn (c); (e) tilsetning av en vandig fase til produktet fra trinn (d) under omrøring, og (f) oppvarming av produktet fra trinn (e).

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at preparatet oppvarmes til ca. 60° C :L ca. 10 minutter.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at antibiotikumet og lipidet blandes ved: (a) suspensjon av antisopp-antibiotikumet i en vandig oppløsning, (b) suspensjon av fosfolipidet i en vandig oppløsning, (c) blanding av produktene fra trinnene (a) og (b); og (d) inkubering av produktet fra trinn (c) ved eller over overgangstemperaturen for lipidet.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at antisopp-antibiotikumet suspenderes i vandig oppløsning ved ultralydsbehandling.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at antibiotikumet og lipidet blandes ved: (a) oppløsning av lipidet i et organisk oppløsnings-middel av middels polaritet; (b) oppløsning av antibiotikumet i et biokompatibelt, organisk oppløsningsmiddel; og (c) blanding av oppløsningen fra trinn (a) med oppløs-ningen fra trinn (b).