KR970002870B1

KR970002870B1 - 저독성 약물-지질계

Info

Publication number: KR970002870B1
Application number: KR1019880701402A
Authority: KR
Inventors: 안드렌 에쓰 자노프; 로렌스 보오니; 토마스 마덴; 피터 알 쿨리스; 로버트 피 린크; 죤 제이 케아른스; 안토니 지 듀링
Original assignee: 더 리포조옴 캄파니, 인코포레이티드; 알렌 부룸
Priority date: 1987-03-05
Filing date: 1988-03-03
Publication date: 1997-03-12
Also published as: FI102724B1; IE880600L; AU1799088A; FI102724B; IE67152B1; NO179995C; NZ223660A; PT86913A; CN88101864A; NO179995B; AU622405B2; DE3852961T2; NO884391L; EP0282405B1; DK98089D0; NO180147C; EP0282405B2; GR3015916T3; DK98089A; HK1007495A1

Abstract

내용 없음

Description

저독성 약물-지질계

제1도는 제제중의 알포테리신 B의 몰퍼세트의 함수로서 ID₅₀으로 측정된 급성 독성의 그래프.

제2도는 암포테리신 B를 5몰퍼센트 함유한 리포좀(MLV) 제제의 시차 주사 열량측정 스펙트럼.

제3도는 암포테리신 B를 25몰퍼센트 함유한 HDLC 제제(MLV법)의 시차 주사 열량측정 스펙트럼.

제4도는 암포테리신 B를 5몰퍼센트 함유한 다층 리포좀의 등밀도 기울기 그래프지질(직선), 암포테리신 B(점선).

제5도는 암포테리신 B 50몰퍼센트로 제조된 HLDC(MLV법)의 등밀도 기울기 그래프·지질(직선); 암포테리신 B(점선).

제6도는 암포테리신 B를 각각 5몰퍼센트 및 50몰퍼센트 함유한 리포좀 및 HLDC 제제(MLV법)에 대한 X선 회절분석 데이터의 그래프.

제7도는 암포테리신 B를 25 및 50몰퍼센트 함유한 HLDC 제제(MLV법)의³¹P-NMR 스펙트럼.

제8도는 암포테리신 B를 0 및 5몰퍼센트 함유한 리포좀(MLV) 제제의³¹P-NMR 스펙트럼.

제9도는 암포테리신 B 5몰퍼센트를 함유하는 산성화된 에탄올법에 의해 제조된 암포테리신 B 함유 리포좀의 등밀도 기울기 그래프·지질(직선); 암포테리신 B(점선).

제10도는 데옥시콜레이트중에 용해된 유리 암포테리신 B의 흡수 스펙트럼.

제11도는 DMPC : DMPG가 7 : 3에 있어서 암포테리신 B 5몰퍼센트(a), 암포테리신 B 25몰퍼센트(b), 가열후의 암포테리신 25몰퍼센트(c), 및 암포테리신 B 50몰퍼센트의 흡수 스펙트럼.

제12도는 60℃에서 10분간 가열하기 전(a) 및 가열한 후(b)의 DMPC : DMPG 7 : 3중의 암포테리신 B 25몰퍼센트의 흡수 스펙트럼.

제13도는 가열전(a) 및 가열후(b)의 암포테리신 B 25몰퍼센트 함유한 DMPC/DMPC=7 : 3의 DSC 스펙트럼과 순수한 DMPC/DMPG의 스펙트럼(c).

제14도는 60℃에서의 가열하기전(a)과 가열한 후(b)의 암포테리신 B 25몰퍼센트 함유한 DMPC/DMPC의 몰비가 7 : 3인 착화합물의³¹P-NMR 스펙트럼.

제15도는 이온강도가 DMPC : DMPG 리포좀속으로의 암포테리신 B의 흡수에 미치는 영향을 예시한 그래프.

제16도는 항온처리온도가 DMPC : DMPG 리포좀속으로의 암포테리신 B의 흡수에 미치는 영향을 나타낸 도면.

제17도는 리포좀구조가 DMPC : DMPG MLV 또는 LUV속으로의 암포테리신 B의 흡수에 미치는 영향을 나타낸 도면.

본 발명은 1987. 3. 5 미국 출원 제022,157호의 일부 계속 출원인 1987. 7. 6의 미국 출원 제069,908호의 일부 계속 출원이다.

본 발명은 약물 : 지질의 비율이 큰 약물이 관련된 지질 착화합물(약물 : 지질의 비가 큰 착화합물, 즉 HLDC)의 제조방법과 그 제제에 관한 것이다. 이러한 제제들은 유리형태의 저독성인 동일한 약물과는 그 효능이 거의 같거나 이보다 큰것이다. 더우기 이러한 HDLC 제제의 제법에 관한 것이다. 특히 본 발명은 독성의 항진균성 폴리엔(polyene) 항생물질 특히 암포테리신 B와 나이스태틴(nystatin)이 있는 약물 : 지질의 비가 큰 착화합물의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 약물 : 지질의 비가 큰 착화합물(HDLC)는 리포좀(liposome) 제법과 거의 같은 방법으로 제조할 수 있다

본 발명에는 약물, 특히 암포테리신 B와 나이스태린과 같은 폴리엔 항생물질 등과 같은 생리활성제와 더불어 이들 HDLC 구조를 가진 것들의 용도를 포함하고 있다.

본 발명의 또다른 특징으로서는 유기 용매를 사용함이 없이 리포좀(또는 HDLC)을 제조하는 신규 방법에 관한 것이다.

리포좀속에 약물을 결합[또는 함입(含入)]시킬때는 에탄올 또는 수성 중간체를 경유시킨다. 리포좀은 함입된 수성 매체를 함유하는 완전히 밀폐된 지질 이중층 막이다. 리포좀은 단일층 소포(unilamellar vesicle) (이들은 단일단의 2중층을 가짐) 또는 다층 소포(다중막 2중층이 서로 수성층에 의해 격리된 특징을 가지고 있는 양파모양 구조) 이다. 2중층은 소수성(hydrophobic)의 ''꼬리''영역과 진수성(hydrophilic)의 ''머리''영역을 가진 두가지의 지질 단일층으로 되어 있다. 막 2중층의 구조는 지질 단일층의 소수성(무극성)의 ''꼬리'' 부분이 2중층의 중심을 향해 있는 반면 진수성의 ''머리''부분은 수성상(aqueous phase)을 향해 있다.

Bangham 등에 의한 최초의 리포좀 제제(J. Mol. Biol, 1965, 13 : 238-252)는 유기 용매중에 인지질을 현탁시킨 다음 증발건조시켜 반응용기에 인지질 필름을 생성시키는 것이다. 다음에는 적당량의 수성상을 첨가해서 된 혼합물을 팽윤시켜 여기서 얻은 다층 소포(MLV : multilamellar vesicles)로 된 리포좀을 기계적인 수단으로 분산시킨다. 이 방법에 따라 소형의 음파 파쇄된 단일층 소포(Papahadjopou1os et al. Biochem. Biophys. Acta. 1967, 135 : 624-638) 및 대형의 단일층 소포를 제조하게 되는 기초가 마련된다.

역상(逆相) 증발법, 침출법 및 세척제 희석법등과 같은 대형의 단일층 소포(LUV : large unilamellar vesicles) 제조방법을 사용하여 리포좀을 제조한다. 여러가지 리포좀 제조방법에 관해서는 문헌(Liposomes, Marc Ostro, ed. Marcel Dekker, Inc. New York, 1983, Chapter 1) 에 나와 있다. LUV 제조에 있어서 특히 바람직한 방법은 다른 문헌(Cullis et al. PCT Pub1ication No. 87/00238, 1986년 1월 16일 책자 명칭 "Exhusion Technique for Producing Unilamellar Vesicles")에 나와 있다. 이 방법으로 만든 소포를 LUVETS라 하는데 이들을 막 필터를 통해 가압하에 압출한다. 또한 200nm 필터속을 통과시키는 압출법으로 소포를 제조하기도 하는데 이들 소포를 VET₂₀₀이라 한다.

이들 소포를 최소한 1회의 동결-해동 사이클에 노출시킨 다음 압출처리한다. 이 방법에 관해서는 문헌(Mayer et al. 1985, Biochem. et. Biophys. Acta. 817 : 193-196, 명칭 ''Solute Distributions and Trapping Efficiencies Observed ln Freeze-Thawed Multilamellar Vesicles") 에 나와 있다.

본 발명의 실시예 있어서 리포좀 부류와 이들 제조방법은 거의 동일한 용질분포가 바람직하다. 이러한 바람직한 리포좀은 미국 특허 제4,522,803호에서 정의된 바와 같이 안정한 복층 소포(SPLV : stable plurilamellar vesicle)가 우세하고 미국 특허 제4, 588,578호에 있는 바와 같은 단상(monophasic) 소포와 위에 나온 동결-해동 다층 소포(FATMLV : frozen and thawed multilamellar vesicle)를 포함한다.

여러가지 스테롤과 이들의 수용성 유도체를 사용하여 리포좀을 제조하고 있다(Janoff et al. 미국 특허 제4,721,612호 참조). Mayhew 등은 알파 토코페롤과 이들의 유도체로 된 리포좀에 약물을 캡슐화함으로써 약물의 독성을 저하시키는 방법에 대하여 기술하고 있다(PCT Pubilcation No. WO 85/00968, 1985. 3. 14), 또한 여러가지 토코페롤과 이들의 수용성 유도체를 사용하여 리포좀을 제조하고 있다(Janoff et al. PCT Publication NO 87/02219, 1987. 4. 23 발행, 명칭 ''Alpha Tocopherol-Based Vesicles).

리포좀-약물 방출계에 있어서 약물과 같은 생체활성체를 리포좀속에 함입시킨 다음 환자에게 투여한다(예를 들자면 미국 특허 제3,993,754호, 미국 특허 제4,145,410호, 미국 특허 제4,235,871호, 미국 특허 제4,224,179호, 미국 특허 제4,522,803호, 미국 특허 제4,588,578호 같은 것이 있다). 또한 약물이 친유성이면 지질 2중층과 결합한다. 본 발명에 있어서 ''함입시킨다'' 도는 ''캡슐화 한다.''라는 말은 약물을 수성상태의 리포좀속에 수용시킨다거나 지질 2중층과 결합한 약물을 뜻하는 것이다. 질환치료용의 대다수 약물은 환자에게 독성을 나타내는데 이러한 독성은 항종양 약물인 독소루비신의 경우처럼 심장에 독성을 나타내는 것이거나 암포테리신 B 같은 폴리엔 항생물질 또는 아미노글리코시드의 경우처림 신장독성을 나타내는 것이다. 암포테리신 B는 극히 독성이 많은 항진균성, 폴리엔 항생물질로서 생명에 위협을 주는 진균성 감염증 치료에만 큰 신빙성을 가지고 있다(Taylor et al. Am. Rev. Respir. Dis. 1982, 125.: 610-611). 암포테리신 B가 소수성 약물이기 때문에 수용액에는 용해하지 않으며 그 자체가 독성인 것은 현탁시키는데 사용되는 세척제인 데스옥시콜레이트중의 콜로이드 분산물로 시판되고 있다. 암포테리신 B 메틸에스테르와 암포테리신 B는 후천성 면역결핍증(AIDS)의 병인학(炳因學)에 있는 바와 같이 지질로 피복된 퇴행성 바이스러인 HTLV-III/LAV 바이러스에 대해 활성이 있다(Schaffner et al. Biochem Pharmaco1. 1986.,35 : 4110-4113). 이 연구에 있어서 암포테리신 B 메틸에스테르 아스코르브산염(수용성)과 암포테리신 B를 첨가하여 HTLV-IlI/LAV 감염세포 균주를 분리하여 세포를 바이러스 복제에 대해 검정하였다. 결과에 의하면 암포테리신 B 메

틸에스테르와 암포테리신 B는 바이러스의 세포변성효과에 대해 표적세포를 보호하였는데 이것은 헤르페스바이러스에 대해 나타난 것과 유사한 것이었다(Stevens et al. Arch Vlro1. 1975, 48 : 391).

리포좀 캡슐화 암포테리신 B의 용도에 관한 보고서는 문헌에 나와 있다. Juliano 등은 전신 진균성 감염을 리포좀 암포테리신 B로 치료할 수 있다고 하고 있다(Annals N. Y. Acad. Sc1. 1985, 446 : 390-402). 이러한 리포좀은 예컨데 디미리스토일포스파티딜콜린(DMPC)와 디미리스토일포스파티닐글리세롤(DMPG)가 몰비로 7 : 3인 인지질과 콜레스테롤로 되어 있다. 유리 및 리포좀 함입 암포테리신 B를 비교하는 생채의 시험과 급성 독성 연구(LD₅₀)결과를 보면 리포좀 제제에서 저독성이 나타났고 항진균성도 거의 변함이 없었다. Lopez-Berestem 등(J. Infect. Dis. 1986, 151: 704-7l0)은 전신 진균감염 환자에게 리포좀 함입 암포테리신 B를 투여했다. 리포좀은 DMPC : DMPG=7 : 3의 몰비로 된 것이었고 약물은 그 효능이 90% 이상이 되게 캡슐화된 것이었다. 암포테리신 B 5몰퍼센트에서의 리포좀-약뭍 치료결과 치료를 받은 환자중의66%는 반응이 좋았고 진균성 감염이 일부 또는 완전히 없어졌다. 여러 사람들이 쥐(mouse)의 전신 캔디디아 감염증과 라이시마니아 감염증의 치료 및 예방에 있어서 유리 암포테리신 B와 리포즘 암포테리신 B의 효능을 비교 시험하였다[Lopez-Berestein et al.(J. Infect. Dis. 1983, 147 : 939-945; Ahrens et al. S. Jour. Med. Vet. Myco1. 1984, 22 : 161-166; Panosian et al. Antimicrob. Agents Chemo. 1984, 25: 655-656; Tremblay et al. Antimicrob. Agents Chemo. 1984, 26: 170-17여 이들의 시험결과를 보면 캔디디아 감염증 치료에 있어서 리포좀 캡슐화 암포테리신 B에서 치료지수가 크게 나타났다는 것이다. 모든 경우에 있어서 암포테리신 B를 리포좀속에 캡슐화하면 이 약물의 용량을 크게 해도 된다는 것을 확인하였다. 암포테리신 B-리포좀 제제는 라이시마니아 감염증 치료효과가 없었다.

DMPC : DMPG, 에르고스테롤 및 암포테리신 B로 되어 있는 프로리포좀(Proliposome : 가용성 담체위에다 지질과 약물을 코우팅하여 과립상 물질로 만든것)도 제조되고 있다(Payne et al. J. Pharm. Sci. 1986, 75 : 330-333).

기타 연구에 있어서 리포좀 암포테리신 B를 사용하여 쥐의 효모균증을 정맥투여하여 치료한 결과를 암포테리신 B-데스옥시 콜레이트로 유사한 방법으로 치료해서 얻은 결과와 비료하였다(Graybil et al. J. Infect. Dis. 1982, 145 : 748-752). 리포좀-암포테리신 B로 처리된 쥐에 있어서는 생존시간이 훨씬 길었고 호모균속의 조직 측정계수도 훨씬 작았으며 급성 독성도 감소하였다. 이 연구에 사용된 다층 리포좀에는 에르고스테롤이 함유되어 있었다. Taylor등(Am. Rev. Resp. Dis. 1982, 125 : 610-61l)을 리포좀에 에르고스테롤과 인지질을 함유한 리포좀-암포테리신 B를 사용하여 쥐의 히스토플라스마병을 치료하였다. 리포좀 제제의 독성은 거의 없었고 히스트플라스마병 치료효능이 크게 나타났고 혈청과 조직분포를 변화시켜 주었으며 혈청수준을 저하시켰고 간장과 비장의 농도를 유리 암포테리신 B 제제의 경우보다 크게 유지하였다.

위에 나온 연구에 있어서 지질을 함유하는 리포좀을 사용하여 함입된 약물의 독성을 개선하였는데 제제중의 지질함량은 크게 해줌으로써 약물의 독성을 완화시켰다. 놀라운 사실은 실제로 지질함량이 작은 성분은 대개 독성을 효율적으로 감소시킨다는 점이다. MLV법에 의한 본 발명의 HDLC의 제제에 있어서 HDLC와 MLV를 혼합할 수 있다. 이들 제제는 약물(암포테리신 B) 약물이 약 5-약 25몰퍼센트이고 HDLC의 비율이 약물의 몰퍼센트 증가에 따라 증가하고 있다는 것이다. 약물이 25몰퍼센트-약 50몰퍼센트인 제제는 거의가 리포좀이 없는 HDLC이다.

또한 소수성 약물을 5-몰퍼센트 이하 함유하는 제제는 거의가 HDLC가 약간 있는 리포좀이다. 필요에 따라 불균일계로부터 HDLC를 분리할때는 공지의 분리방법, 예컨데 밀도기울기 원심분리법 같은 것을 사용 한다. 이들 HDLC를 제조할때 사용되는 방법은 리포좀 제조시의 경우와 거의 동일하나 약물 : 지질의 비율이 큰 본 발명에 있어서 리포좀 제제에 비해 독성이 크게 감소된 것으로서 리포좀 보다 HDLC가 많은 것이 생성된다.

본 발명은 약물을 비롯한 생체활성제와 지질로 된 HDLC계(high drug : lipid ratio complexes)에 관한 것이다. 이러한 HDLC는 DMPC와 DMPG 같은 인지질이 7 : 3의 몰비로 되어 있거나 포화 인지질 또는 지방산 인지질로 되어 있다. 생체활성제는 나이스테틴이나 암포테리신 B 같은 항진균성 약물인 것이 바람직하다. 약물의 함량은 약 6-약 50몰퍼센트인 것이 바람직한데 30-50몰퍼센트인 것이 좋다. 암포테리신 B 같은 약물로 되어 있는 HDLC의 약 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체나 부형제로 되어 있는데 이들 조성물을 비경구로 투여한다. 이 조성물을 사용하여 인간 같은 포유동물에다 투여해서 진균성 감염증과 같은 감염증들을 치료한다. 본 발명의 HDLC 함유 조성물에는 리포좀의 거의 없는 조성물과 약물이 함입된 리포좀이 거의 없는 조성물을 포함한다. 지질의 함량은 약 10wt.% 정도, 바람직하게는 약 5wt.% 정도, 보다 더 바람직하게는 약 3wt.%이다.

본 발명의 HDLC를 제조하는 여러가지 방법이 나와 있는데 예컨데 DMSO나 메탄올 같은 용매중에서 약물 특히 암포테리신 B를 먼저 용해시키는 방법이 있다. 지질(바람직하게는 DMPC : DMPG가 7 : 3의 몰비인 것)을 염화메틸렌 같은 용매중에 용해하고나서 지질과 약물용액을 혼합한다. 용매를 감압하에 증발시켜 얇은 지질-약물 필름을 얻는다. 이 필름을 염수, PBS 또는 글리신 완충액 같본 수용액중에서 수화(hydration)시켜 HDLC를 제조한다. 또한 수용액을 용매를 함유하는 약물과 지질상(相)에다 가한 다음 용매를 증발시킨다. 또다른 방법으로는 제조된 건조한 지질-약물 필름을 염화메틸렌 같은 용매중에 재현탁시키고 감압하에 다시 증발시킨 다음 필름을 수화시킨다. 탈수법을 사용할 수도 있다. 이 방법에 있어서 건조한 지질-약물 필름을 탈수시켜 수용액으로 수화되는 플레이크(flake)를 얻는다.

본 발명의 HDLC를 제조하는 다른 방법에 있어서 암포테리신 B를 약 6-50몰퍼센트 함유하는 MLV법으로 제조된 생체활성제(약물, 예컨데 암포테리신 B 같은 폴리엔 항진균제)를 함유한 지질입자(또는 리포좀)을 제조한 후 이들 입자(또는 리포좀)을 약 25-약 60℃가 가장 바람직하게는 약 60℃에서 가열처리한다. 이러한 가열처리에 의하여 독성이 없는 암포테리신 B/지질 착화합물을 얻게 된다.

본 발명의 또다른 특징으로는 흡수 스펙트럼법을 사용하여 약물(예 : 암포테리신 B 같은 플리엔 항진균제)-지질 착화합물의 독성을 측정한다. 약물의 흡수 스펙트럼은 약물마다 특징이 있다. 자외선 또는 가시광선 범위내에서 약물의 특정 피이크가 하나 또는 여럿 나타난다. 암포테리신 B의 특성 피이크(제12도의 것은 데옥시콜레이트에 용해한 것임)는 300-500nm 사이에 있는데 이들 피이크의 가장 대표적인 것은 413nm에서 나타나는 것이다. 약물과 지질이 착화합물을 형성함으로써 이 피이크가 감소하게 되는 것을 이용하여 HDLC의 독성을 정량적으로 측정한다. 다시 말하자면 흡수 피이크의 높이의 정도(강도)를 가지고 독성정도를 측정한다.

약물, 특히 폴리엔 항생물질인 암포테리신 B를 음파 파쇄법에 의해 염산이 첨가되어 있는 에탄올 같은 용매중에 분산시키는 리포좀-부가법도 나와 있다. 지질 필름, 특히 DMPC : DMPG가 약 7 : 3의 몰비인 것을 수용액, 특히 PBS 같은 완충액으로 수화시키고 약물을 함유한 산성의 에탄올 용액의 일부를 취하여 리포좀 제제에다 가해서 리포좀 속에 부가한다. 생성된 현탁액중의 에탄올을 제거하고 용액을 수용액으로 다시 현탁시킨다. 지질과 혼합된 약물의 몰비에 따라 각 방법에서는 리포좀 보다는 오히려 HDLC가 생성한다. 예를 들자면 약물의 약 16몰퍼센트 이상이 되면 리포좀 보다는 HDLC가 많이 생성된다. 또한 약물이 0-15몰퍼센트인 때는 리포좀이 잘 생성된다. 이러한 산성의 에탄올 부가법으로 제조된 HDLC 또는 리포좀을 제조하고 약제학적으로 허용되는 담체나 희석제를 첨가하여 약 조성들로 사용할 수 있고 인간 같은 포유동물에 투여하여 진균성 감염증을 치료하는데 사용할 수 있다. 독특한 성질을 가진 비리포좀계르서 약물: 지질의 비가 큰 착화합들(HDLC)과 그 제조법에 대하여 기술되어 있다. 이들 HDLC에는 소수성 약물 같은 생체활성제가 함유되어 있어서 HDLC를 조직에 투여하게 되면 유리상태 또는 리포좀상태로 투여된 약물에 비하여 거의 동일하거나 훨씬 큰 효능을 나타내며 그 독성은 훨씬 적다. 이러한 HDLC는 약물 : 지질의 몰비가 크다(약물 약 5몰퍼센트 이상). 본 발명에서 놀라울만치 입증되는 사실은 리포좀계에 비하여 본 발명의HDLC계와 같은 지질함량이 거의 없는 착물의 독성이 감소된다는 것이다. 본 발명에서는 항진균성의 폴리엔 항생물질인 암포테리신 B와 나이스태틴과 같은 약물이 결합된 약들 담체계로 사용되는 HDLC 제제가 포함된다. 이러한 제제는 현재 시판되고 있는 제제와는 달리 식염수 같은 수용액에서는 안정성이 있다. 더우기 용매를 통해 약물을 함입시키므로써 리포좀을 부가하는 새로운 리포좀 부가법에 관하며 기술되어 있다. 이 용매의 특징은 암포테리신 B 같은 생체활성제를 가용화하고 리포좀 막구조를 붕괴시키지 않으며 물과 같은 수용액과 혼화성이 있다는 것이다. 이러한 용매로는 에탄올이 있다. 이 방법은 유기 용매없이도 진행된다. 제조시에 사용되는 약물의 몰퍼센트에 따라 리포좀 보다는 오히려 HDLC가 생성된다. HDLC 생성이 바람직한 경우에는 이 방법에서는 약물에 HDLC를 부가한다.

HDLC란 비리포좀의 특성을 가진 입상의 약물결합 지질을 일컫는 것이다. MLV법을 사용하여 제조할 경우에는 HDLC의 특징은 (1) 비리포좀 착화합물을 입증하는 동결-파쇄 전자현미경 사진법(Deamer et al. Biochim. Biophys. Acta, 1970, 219 : 47-60); (2) 함입된 체적이 없고 따라서 비리포좀임을 나타내는 포착체적 측정법(Deamer et al. Chem. Phys. Lipids, 1986, 40 : 167-188); (3) 지질 2중층의 예비전이 상 또는 주전이를 나타내지 않는 시차 주사 열량측정법(DSC)(Chapman, D. ln : Liposome Technology, Gregoriadis, G. ed. 1984, CRC Press, Boca Raton); (4) 고도로 고정된 지질(광범위한 등방성)의 특징을 나타내는³¹P-NMR 스펙트럼(Cullis et al. 1982 in : Membrane Fluidity in Bio1ogy, Academic Press, Inc. London & N. Y); (5) 겔상 지질을 나타내는 X선 회절분석 데이터(Shipley et al. in : Biomembranes, 1973, Chapman, D. and Wllach, D. eds. Vo1 2 : 1, Academic Press, lnc., London & N.Y)등에 의해 확인된다. 또한 이들 계의 특징은 밀도기울기 원심분리법에서 입증되는 바와 같이 약물과 지질이 완전히 결합하고 있다는 것이다. 이 방법에 있어서 기울기는 상승된 힘(약 230,000×g)에서 약 24시간 동안 원심분리해서 생기는 것이다. 이 방법에 의하여 기울기내에 있는 모든 성분은 평형밀도 위치에 도달하게 된다. 이들 계의 용리 경향을 보면 약물과 지질 피이크가 중첩되어 있는데 이것은 모든 약물이 지질과 결합되어 있음을 나타내는 것이다.

본 발명의 한가지 특징은 쥐에 있어서 LD₅₀으로 측정된 급성 독성이 일반적으로 감소되면서 약물의 효능이 거의 동일하거나 크게 나타나는 HDLC를 제조할 수 있는 약물 :지질 비에 있는 것이다(제l도). 확인된 사실인 것은 소수성 약물이 약 6-50몰퍼센트이면 이러한 조건에 부합되는데 바람직한 비는 약 15-50이고 보다 바람직한 비는 약 25-50이며 가장 바람직한 비는 약 25-35이다. 약물 농도가 약 6몰퍼센트를 초과하여 25몰퍼센트에 접근하게 되면 리포좀과 HDLC가 혼합된 것이 생성된다. 이 범위내에서는 약물의 몰퍼센트가 25에 이르게 될수록 리포좀 보다 많은 퍼센트의 HDLC가 생긴다 약물 농도가 약 15몰퍼센트 이하가 되어 ''임계 미셀 농도''가 알려진 지질의 하한치까지 도달되면 HDLC와 리포좀이 혼합되긴 했으나 거의가 리포좀 구조인 것이 생긴다. 이러한 리포좀은 본 발명의 신규한 에탄올 중간체법에 의해 제조된다.

위에 나온 HDLC의 특징은 밀도 원심분리법에서 관철되는 각종 약물-지질 분산물이라는 것이다. 등밀도 슈크로오스 밀도 칼럼에서 약물-지질(DMPC : DMPG의 몰비=7 : 3) 착화합물을 분리하면 약물 : 지질비와 제조방법에 의존성인 밴드(band)가 나타난다. MLV법으로 제조한 약물 5몰퍼센트로 되어 있는 계에 있어서 물질중의 두가지 주밴드가 관찰되는데 그 한가지는 리포좀이고 나머지 한가지는 지질과 결합된 약물(HDLC)이다. 약물 25 및 50몰퍼센트를 함유하는 제제에서는 대부분의 약물이 지질과 결합해 있는 단일 밴드를 나타낸다. 놀랍게도 이들 저지질/고몰퍼센트 약물계는 독성이 없었다. 제1도를 보면 쥐에 있어서, LD₅₀(mg/kg)은 제제중의 약물인 암포테리신 B의 몰퍼센트의 함수로 나타나 있다. LD₅₀은 약물 5-50몰퍼센트 사이에서 증가하다가 60몰퍼센트에서 떨어지고 있다. 시판품(Fungizone)의 약 3.5mg/kg에서의 LD₅₀도 나와 있다.

생체회 혈구 용해작용(용혈작용)에서는 동일한 독성현상을 나타낸다. 약물의 몰퍼센트를 여러가지로 달리하여 약물-지질 결합이 된 MLV 제제에 대해서 실시된 포착체적 연구[지질 μmo1당 용질의 함입량(μ1)]결과를 보면 25몰퍼센트에서는 특이한 특성을 나타내고 있다. 이들 계는 용질을 전혀 함입하지 않기 때문에 리포좀이 아니다. 이들 동일한 계의 동결파쇄 전자현미경 사진을 보면 약물이 0 및 5몰퍼센트인 때의 리포좀을 나타내고 있으나 약물이 25 및 50몰퍼센트인 때는 비리포좀 HDLC를 나타내고 있다.

약물의 몰퍼센트를 각기 달리한 MLV 제제에 대해 실시된 시차 주사 열량측정에서도 동일한 현상을 보이고 있다. 즉 스펙트럼을 보면 약물이 5몰퍼센트일때 안정된 2중층 상태의 지질에 특징적인 전이 피이크를 보이고 있으나(제2도), 약물이 25몰퍼센트일때는 아무런 전이 피이크가 나타나지 않는다(제3도). 약물이 25몰퍼센트인 경우에 있어서 모든 지질은 완전히 약물과 결합하는데 즉 지질의 아실(acyl) 연쇄는 구속을 받아 공동전이를 일으키게 된다. 이 데이터로부터 약물 농도가 5몰퍼센트일때 지질결합 약물과 유리 지질의 2중 피이크를 보이지만(제6도), 약물 농도가 25 및 50몰퍼센트일때 모든 지질이 약물과 결합하고 있는 단일 피이크를 보이는(제5도). 밀도 원심분리 데이터를 확인할 수 있다.

5몰퍼센트(MLV법)일때의 X선 데이터를 보면 저온에서 겔상 지질이 나타나고 이때 23℃의 특징적인 온도에서 액상의 결정상으로의 전이를 보이고 있다. 그러나 약물 농도가 50몰퍼센트일때는 지질은 모든 온도에서 겔상에 있게 되고 모든 지질이 약물과 긴밀한 결합을 하고 있으므로 해서 아무런 전이를 보이지 않는다(제6도).³¹P-NMR 연구에서 얻는 유사한 데이터를 보면 약물 농도가 큰 (25 및 50)몰퍼센트인 제제(HDLC)에서는 유리 지질신호가 결핍되어 나타남을 알 수 있는데 이런 종류의 지질에 특징적연 낮은 필드의 쇼울더(shoulder)와 높은 필드의 피이크가 존재하지 않는 반면(제7도), 약물 농도가 0 및 5몰퍼센트인 시료에서는 나타나고 있다(제 8 도).

관련된 약물-지질의 비가 큰 지질 착화합물계가 본 발명의 한가지 특징이라 하더라도 이들 지질 착화합물 제조시에는 리포좀 제조법을 사용한다. 특히 이들 방법중에는 다층 소포(MLV : multilamellar vesicle)로 알려진 리포좀을 생성시키는 것들도 포함된다. 사용될 수 있는 기타 방법으로는 안정형 다층 소포(SPLV : stable plurilamellar vesicle), 압출법에 의한 대형 단일층 소포(LUVET) 또는 공지의 리포좀 제조법 등이 있다. SPLV 제법은 미국 특허 제4,522,803호에 나와 있고 LUVET 제법은 PCT 출원 WO 86/00238(l985. 1. l6)에 나와 있다. 본 발명의 신규의 리포좀 제조에 있어서 산성의 에탄올중에서 함입될 약물이 첨가되는 수용액중에서 리포좀을 제조한다. 본 발명의 또다른 리포좀 제조 실시태양에 있어서 수성의 중간체를 통해 리포좀속에 암포테리신 B를 첨가한다. 이 방법에 있어서 증류수 같은 수용액중에서 음파 파쇄에 의해 암포테리신 B를 현탁시킨 다음 증류수나 염화나트륨용액 등과 같은 수용액중 지질 현탁액과 혼합한다. 이 혼합물을 사용되는 지질의 전이온도에서 또는 그 이상의 온도에서 항온처리하여 MLV를 얻는다.

(1) 지질 착화합물 제조시 사용되고, (2) 본 발명의 신규의 리포좀 제조법에 사용되는 지질은 인지질[예 : 포스파티딜콜린(PC), 포스파티딜에탄올아민(PE), 포스파티딜세린(PS), 포스파티딜클리세롤(PG), 포스파디드산(PA), 포스파티딜이노시톨(PI), 스핑고미엘린(SPM)등] 단독 또는 그 혼합물이다. 수소첨가된 대두 PC 같은 포화 인지질도 사용된다. 인지질은 합성된 것이거나 계란 또는 대두 같은 선연불로부터 유도된 것이다. 또 지질 조성뭍은 미리스트산 같은 포화 지방산이다. 바람직한 실시태양에 있어서 인지질인 디미리스토일포스파티딜콜린(DMPC)와 디미리스토일포스 파티딜글리세롤(DMPG)을 어떠한 몰비로 조합해서 사용할 수 있는데 약 99 : 1-약 1 : 99 DMPC : DMPG의 범위내에서 사용할 수 있고 바람직한 몰비는 7 : 3이다. DMPC와 디미리스토일포스파티딜세린(DMPS)를 조합해서 사용해도 된다. 그러나 DMPC 단독으로 사용해도 된다. 지질 착화합물과 리포좀중에는 지질상의 일부로서 스태로이드 성분을 함유하기도 하는데 이러한 스테로이드로는 콜레스테롤, 콜레스테롤의 폴리에틸렌 클리콜 유도체(PEG-콜레스테롤), 코프로스탄올, 콜레스탄올, 콜레스탄, 스테롤의 유기 산 유도체[예 : 콜레스테롤 헤미숙시네이트(CHS)] 등이 있다. 토코페롤의 유기 산 유도체를 착화합물- 또는 리포좀 생성용 첨가제[예 : 알파 토코페롤 헤미숙시네이트(THS)]로 사용해도 된다. CHS- 및 THS-함유 착화합물과 이들의 염은 모두 이들 스테롤을 함유하는 리포좀 제조시의 공지된 방법에 따라 제조한다[특히 미국 특허 제4,72l,614호(1988. 1. 26)} "Steroidal Liposomes''와 PCT 공고 87/02219(1987. 4. 23), "Alpha-Tocopherol Based Vesicles"를 참조].

약물 같은 생체활성제를 본 발명에 사용한다. HDLC의 경우에 있어서 사용되는 생체활성제는 소수성의 것들이고 리포좀의 경우에 있어서 생체활성제는 소수성이거나 친수성일 수가 있는데 리포좀은 이들 두가지형의 생리활성제를 함입한다. 이러한 생체활성제에는 한정된 것은 아니지만 항진균제인 피마리신, 캔디시딘, 필리핀, 나이스태틴과 암포테리신 B 등과 같은 폴리엔 함생물질이 포함된다. 사용될 수 있는 기타 생체활성 체로는 한정된 것은 아니지만 아미노글리코시드 같은 항생물질(예 : 젠타마이신), 리파마이신 같은 항비루스 화합물, 안티몬 유도체 같은 구충성 화합물, 항종양성 화합물(예 : 빈블라스턴, 빈크리스단, 미토마이신 C, 독소루비신, 다우노루비신, 메토트렉세이트, 시스플라스틴등), 알부민 같은 단백질, 디프테리아 독소 같은 독소, 카탈라아제 같은 효소, 에스트로젠 같은 호르몬, 아세틸콜린 같은 신경전달물질, 알파 지방 단백질 같은 지방 단백질, 히아루론산 같은 당단백질, IgG 같은 면역글로블린, 인터페론 또는 인터루우킨 같은 면역조절인자, 아르세나조(Arsenazo) III 같은 염료,¹⁴C 같은 방사성 표지물,⁹⁹Te 같은 방사성 불투과성 화합물, 카르복시 플루오로세인 같은 형광화합물, 글리코겐 같은 다당류, 에스트로젠 수용체 단백질 같은 세포수용체 결합분자, 인도메타신, 살리실산 아세테이트, 이부프로펜, 술린닥, 피록시캄 및 나프톡센 등과 같은 비스테로이드성 소염물질, 덱사메타손 같은 소염물질, 티몰롤 또는 필로카르핀 같은 항녹내장제, 디부카인 같은 마취제, 티민 같은 헥산, RNA 중합체 같은 폴리뉴클레오티드, 알파차단제, 베타차단제, 칼슘채널차단제, ACE 억제제 등과 같은 심장혈관제, 프로스태그랜딘 같은 CNS제 등이 있다.

리포좀의 일반적인 제조시와 같이 HDLC 제조도중 유기 용매를 사용한다. 적당한 유기 용매는 중간 극성을 가지고 유전특성이 있는 것들(반대되는 전기 하전에 대해 중간정도의 극성을 가진 것들)인데 이것들은 지질을 용해시키며 그 예로서는 클로로포름, 메탄올, 디메틸술폭시드(DMSO), 염화메틸렌, 용매 혼합물[예; 클로로포름 메탄올(70: 30), 벤젠 : 메탄올(70 : 30)] 등이 있다. 결과적으로 각 성분들이 균일하게 분포된 혼합물로 정의되고 지질을 함유하는 용액이 생성된다. 용매를 선택할때는 생체적 합성, 저독성, 소염성 등을 기준으로 하는 것이 바람직하다. 약물, 특히 암포테리신 B를 용해시킬때는 DMSO가 바람직한데 그 이유는 그것이 DMSO에 잘 용해하기 때문이다. 메탄올 대신에 DMSO를 사용하고 이와 동시에 용매체적을 증가시킨다. 지질을 용해시킬 경우 인체에 저독성이라는 이유로 염화메틸렌을 사용한다.

본 발명의 신규의 리포좀 제조방법에 있어서 에탄올 또는 수용액이 바람직한 용매이다. HDLC 제조시의 수화단계에서 증류수, 식염수 또는 수성 완충액 같은 수용액을 사용한다. 사용되는 수성 완충액으로는 인산염 완충 식염수(PBS) 같은 완층 식염수, 트리스-(히드록시메틸)-아미노메탄 염산염("tris") 완충액 또는 pH 약 7.0-7.5, 바람직하게는 7.2인 글리신 완충액 등이 있다.

HDLC 또는 신규의 리포좀 제조단계에 있어서 음파 파쇄단계를 사용한다. 이 방법을 배드 음파 파쇄기(bath sonicator)에서 25℃ 및 약 50-60Hz에서 약 15-약 30분 처리한다.

Cullis 등의 방법(PCT Pbulication No 88/00238, 1986. 1. 16 공고)에 따라 필터를 통해 압출함으로써 HDLC 또는 리포좀을 분립(紛粒)한다. 이러한 분립방법에 의하여 입자크기가 균일한 것이 얻어진다. 예로서 폴리카보네이트 필터 같은 막 필터속으로 곧바로 통과시키거나 굴곡된 통로를 통과시켜 HDLC를 여과한다. 본 발명의 신규의 방법에 따라 제조된 HDLC 또는 리포좀을 여러가지 제조단계에서 동결건조 또는 탈수처리한다.

예컨데 용매를 제거하고 약물을 첨가하기 전에 지질 필름을 동결건조시킨다. 또한 지질-약물 필름을 동결건조한 다음 HDLC나 리포좀을 수화시킨다. 이러한 탈수방법은 지질, HDLC 또는 리포좀을 감압상태로 처리해서 모든 용매를 제거함으로써 가능하다. 또한 마지막으로 수화된 HDLC 또는 리포좀 제제를 약제 질소중의 매체중에 넣고 동결시킨 후 탈수시킴으로써 단수공정을 실시한다. 사전에 동결시켰다가 탈수할때는 공지 방법(Bally et al. PCT Publication No. 86/01103, 1986. 2. 27 공고; Schneider et al. 미국 특허 제4,229,360호)에 따른 제조방법에서 한가지 이상의 보호당 존재하에 탈수한다. 이 방법에 의하여 제제를 장기간 보관할 수 있고 그 안정성도 길게할 수 있다. 위에 나온 지질 착화합물 제제의 탈수시에 기타 적당한 방법을 사용한다.

본 발명의 HDLC 제조방법중 한가지 방법은 생체활성제(예 :약물)을 DMPC와 DMPG가 약 7 : 3의 몰비로 클로로포름과 함께 첨가되어 있는 플래스크중에서 메탄올에 용해시키는 MLV법이다. 감압하에 용액을 회전 증발시킨 다음 건조된 필름을 PBS중에 다시 현탁시켜 두고 배드 음파 파쇄기에서 음파 파쇄(약 25℃, 약 50-60Hz에서 약 30분 처리)한다. 약물 : 지질의 몰비가 약 6 이상(약 60몰퍼센트까지)인 경우 제제는 리포좀이 없는 비리포좀 HDLC 구조이다. HDLC 제제의 독성은 약물 : 지질의 비에 의존하며 약물 : 지질의 비가 큰 제제(약물의 농도가 약 16-50몰퍼센트)에 있어서는 그 비가 작은것 보다는 급성 독성이 거의 없다. 위에 나온 바와 같이 약물을 약 5몰퍼센트까지 함유하는 제제는 거의 리포좀이다.

또다른 방법은 개량된 MLV법인데, 이 방법에서는 감압하에 벨자아(bell jar)중에서 위에서 제조된 약뭍-지질 필름을 건조시켜 약물-지질 플레이크를 얻는다. 이 플레이크를 분쇄하여 분말로 만들어 수용액을 가하여 균질하게 수화시킨다. 이 방법에서는 DMSO나 메탄올 같은 유기 용매중에 약물을 가해 용액을 만든 다음 염화메틸렌중에 지질(DMPC : DMPG의 몰비 7 : 3)을 가해서 된 것과 혼합한다. 이 혼합뭍을 감압하에 건조시켜 필름을 얻고 이것을 감압하에 밸자아에서 건조시킨다. 제조된 건조분말을 식염수용액으로 수화시킨 다음 가열하여 약물-지질 현탁액을 얻는다. 위에 나온 바와 같이 HDLC, 리포좀 및 이들 혼합들의 제조와 독성 정도는 약물 : 지질의 비에 의존한다. HDLC 제조시에 기타 방법도 사용된다. 그 한가지 방법은 DMSO 같은 용매중에 약물을 용해시키는 SPLV법이다. 용매(예 : 클로로포름이나 염화메틸렌)중에 용해된 지질(예 : DMPC : DMPG의 몰비 7 : 3)을 감압하에 건조시켜 박막으로 만들고 염화메틸렌 같은 유기 용매를 지질에다 가한다. 용액중의 약물(예 : 암포테리신 B)의 분취액을 지질 현탁액에다 가하고 혼합들을 음파 파쇄하여 투명하게 한다. 완충용액(예 : 완충식염수)을 가하고 혼합물을 다시 감압하에 처리하여 염화메틸렌을 제거한다. 제조된 페이스트(paste)를 다시 PBS로 수화시킨 다음 음파 파쇄한다. 위에 나온 방법에서와 같이 생성된 제조는 약물 : 지질의 몰비에 따라 HDLC이거나 리포좀이다. 이 제제를 사용하여 쥐의 LD₅₀을 측정한 결과 약물 : 지질의 비가 큰 경우에 독성이 적었다.

또다른 방법은 개량된 SPLV법인데 이 방법에서는 유기 용매(예 : DMSO)중의 약물을 지질(예 : DMPC : DMPG)용액과 혼합하고 완충용액(예 : PBS)을 첨가한 다음 음파 파쇄하면서 질소분위기에서 용매를 증발시킨다. 추가로 PBS를 첨가하고 생성된 용액을 5마이크른 필터를 통해 여과한 다음 약 10,000×g에서 약 10분간 원심분리한다. 성청액을 제거하고 폘릿(pellet)을 다시 용매(PBS)중에 현탁시킨다. 원심분리에 의해 두번째는 세척한 다음 펠릿을 PBS에 다시 현탁시킨다. 위에 나온 제제에서 처럼 제제의 급성 독성은 약물 : 지질의 비에 직접 관련되는데 즉 비가 클수록(약물 약 60몰퍼센트까지) 제제의 독성은 작아진다.

또다른 SPLV법은 앞서와 같이 약물-용매 및 지질용액을 혼합하고 식염수 보다는 주사용 증류수를 가하고 현탁액을 37℃로 가열하는 방법이다. 음파 파쇄하면서 질소분위기에서 용매를 다시 증발시켰다가 주사용 물을 더 가하고 현탁액을 37℃에서 약 10분 유지한다. LUVET법을 사용하여 0.1 또는 0.15마이크론 필터를 통해 제제를 멸균여과한다. 이 방법은 압출법인데, 즉 리포좀을 약 700psi의 압력에서 여과하며 제조한 다음 공지방법(Cullis et al. PCT Publication No. 86/99238, 1986. 1. 16공고)으로 처리한다. 위에 나온 Bally 등의 방법에 따라 이 제제를 탈수한다. 급성 독성 시험결과 약물 : 지질 비가 큰 것일수록 약물의 독성의 경감 효과가 크게 나타났다.

또다른 방법은 산성의 에탄올중에 약물을 음파 파쇄법으로 용해시키는 것이다. 용매(예 : 벤젠 : 메탄올)에 용해된 지질(예 : DMPC : DMPG의 몰비 7 : 3)을 동결건조시킨 다음 용매(예 : PBS)와 혼합하고 실온에서 산성의 알코올-약물 용액을 가해 교반한다. 제제를 동결건조시키고 완층액으로 다시 수화시킨다. 또한 용매를 증발시켜 지질-약물 필름을 얻고 이것을 수용액으로 수화시킨다. 다시 약물 : 지질의 비가 큰 제제에 대해 급성 독성 시험을 한 결과는 저독성으로 나타났다. 약물 농도가 약 5몰퍼센트 이하인 경우에는 주로 HDLC를 생성하는 약 6몰퍼센트 이상의 농도에 비해 거의가 리포좀을 생성하고 있다. 제제의 밀도 기울기에 대한 원심분리결과 모든 지질이 약물과 결합되었음이 확인되었다. 이 제제를 동결건조하여 에탄올을 제거하고나서 증류수 같은 용액중에서 재수화 시킨다.

본 발명의 또다른 리포좀 제조 실시태양에 있어서 수성의 중간체를 통해 리포좀에다 암포테리신 B를 가한다. 이 방법에 있어서 음파 파쇄법으로 증류수 같은 수용액중에 암포테리신 B를 현탁시킨 다음 증류수나 염화나트름용액 같은 수용액중에 지질을 가해서된 현탁액과 혼합한다. 혼합를을 지질의 전이온도 또는 그 이상의 온도에서 항온처리하여 MLV를 얻는다. 위에 나온 암포테리신 B-지질의 몰비가 큰 제제는 지질 메트릭스중에서 암포테리신 B-암포테리신 B간의 상호작용이 크므로해서 저독성을 나타내는 것으로 생각된다. 이것은 횹광 분광분석법으로 증명이 된다. 예컨데 데옥시콜레이트중의 유리 암포테리신 B로부터 나오는 413nm에서 흡광도는 지질중의 가열되지 않는 암포테리신 B 5몰퍼센트에 대한 것보다 크다. 또한 암포테리신 B 25몰퍼센트의 흡광도는 지질중의 암포테리신 B 50몰퍼센트가 나타내는 것보다 크다(제10도).

홉광 스펙트럼법을 사용하여 약물(예 : 암포테리신 B)-지질 착화합물의 독성을 측정한다. 약물의 횹광 스펙트럼은 그 약물에 대해 독특하다. 암포테리신 B(제12도, 데옥시콜레이드중에 용해한 것)의 홉광도는 300-500nm 사이에 있고 특징적인 피이크를 나타내며 이들 피이크의 대부분은 413nm에서 나온다. 약물과 지질이 착화합물을 생성하므로 해서 이 피이크가 감쇠하는 것을 이용하여 HDLC의 정량적인 독성 측정을 한다. 위에 나온 지질중의 어떤 것이라도 이런 방법으로 착화합물을 생성할 때는 스펙트럼은 약물에 대해 특수한 것이기 때문에 감소된다 하더라도 특징적인 흡광도를 나타낸다 할 수 있다. 최대 독성 이하를 나타내는 암포테리신 B-지질계(예 : 25몰퍼센트의 시료)를 25-60℃로 가열하면 계의 독성은 감소된다(제11도). 이러한 감소는 암포테리신 B가 지질 50몰퍼센트와 착화합물을 형성할때 판찰되는 독성의 최대치까지 진행 된다.(제11도) 한가지 가능한 설명은 지질이 상분리됨으로써 가열단계에서 암포테리신 B에서 추방되기 때문에 감소효과가 나타나고 이로 인해 암포테리신 B와 그 자체가 가까이 결합해서 무독성의 계가 된다는 것이다. 추방된 지질은 시차 주사 열량측정 스펙트럼에서 나타나는 흡열현상이 다시 나타나는 것으로부터 알 수 있고(제12도), 이것은 암포테리신 B가 없는 지질과 거의 일치한다. 또한 추방된 지질은 가열된 계로부터 나오는³¹P-NMR 신호의 폭에서도 확인된다(제13도). 이러한 폭은 암포테리신 B의 농도중에서 감소된 지질과 일치한다.

결국 가열된 계의 동결파쇄 전자 현미경법에 의해 가열후의 이제까지 관찰되지 아니한 지질(및 리포좀)의 존재를 알 수 있다. 가열되지 아니한 시료로부터는 유리 지질과의 착물이 생성되지 아니하고 이것은 지질과 암포테리신 B 사이의 분자내 상호반응을 나타내는 계의 특징이다.

위의 연구를 암포테리신 B가 50몰퍼센트인 시료에 대해 수행했을 경우 가열전후의 시료 사이에 관찰된 결과에 약간의 차이가 있었다. 즉 50몰퍼센트인 경우 약물과 지질의 상호작용은 너무 커서 구조로부터 추방될 지질이 존재하지 않게된다. 따라서 이들 시료로부터는 DSC와 NMR로 연구했을 경우 가열전후에 신호의 변화가 나타나지 않는다.

상분리된 지질이 암포테리신 B-암포테리신 B간의 상호작용(따라서 독성은 없음)에 보다 통용되는 분위기중에 있는 암포테리신 B를 떠단다는 이론은 흡광 분광분석법에 의해 지지된다. 가열된 계로부터 오는 스펙트럼은 가열되지 아니한 계에 비해 치밀성이 없다(이것은 저독성을 뜻함). 한가지 경우에 있어서 이러한 가열에 의해 가열되지 아니한 제제의 경우가 LD₅₀이 15mg/kg인데 비해 LD₅₀은 30mg/kg 이상으로 나타났다. 이 경우에 있어서 413nm에서의 흡광도의 감소는 가열후에 나타났다.

위에 나온 가열방법을 이제까지 나온 것들중 어떤 방법처림 어떤 종류의 리포좀이나 지질 입자 제조방법 또는 리포좀이나 지질입자에 대해 확인이 된다. 그러나 이러한 예에 있어서 MLV법을 사용했다. 마찬가지로 이제까지 나온 지질이나 인지질중 어떤 것이라도 사용할 수 있는데 어머한 용매나 완층액의 경우도 마찬가지이다. 예컨데 클로로포름 같은 유기 용매중에 현탁시킨 지질(DMPC : DMPG 몰비 7 : 3)을 건조시켜 둥근바닥 플라스크 양쪽에 박막을 만든다. 적당한 유기 용매(암포테리신 B 같은 약물을 용해시키는 것이면됨)중에 암포테리신 B(또는 이제까지 나온 것과 같은 약물이면됨)을 용해시킨다. 본 발명에 있어서 리포좀이나 지질입자를 생성하는 약물(암포테리신 B)을 어떠한 몰퍼센트로 사용해도 된다. 특히 본 발명에 있어서 암포테리신 B를 약 5-약 50몰퍼센트 사용한다. 리포좀을 제조해야할 경우 약물 : 지질의 몰비에서 약물이 5몰퍼센트 이하인 것을 사용한다. HDLC 제조의 경우에 있어서 약물 약 6-약 50몰퍼센트를 사용한다. 약물이 25몰퍼센트 이상인 경우 집단은 거의 HDLC가 된다.

본 발명의 가열공정에 있어서, 메탄올 100m1담 암포테리신 B 10mg(즉 암포테리신 B 0.lmg/ml)을 용해하는데 용해된 암포테리신 B(100.0ml)을 함유하는 메탄올을 지질 필름에 가하여 필름을 다시 현탁시킨다. 생성된 현탁액을 감압하에 회전 증발시켜 박막을 얻는다. 지질-암포테리신 B 필름을 리포좀이나 지질입자를 생성하기에 충분한 체적의 수용액 분취량(약 4.0ml)중에 재현탁시킨다. 현탁액을 교반하고 수분-약 1시간 음파 파쇄한 다음 수중탕에서 약 25℃-약 60℃에서 약 10-약 400분간 가열한다.

본 발명의 또다른 HDLC 제조법은 음파 파쇄법보다는 균질화 단계를 사용하는 것이다. 예컨데 SPLV법에 따라 HDLC를 제조하는데 즉 적당한 용매(예 : DMSO)에다 약물(예 : 암포테리신 B)을 가하고 혼합기에서 혼합하여 약물전부를 용해시킨다. 필요에 따라서는 용액을 여과해서 미용해 약물입자를 제거한다. 적당한 용매(예 : 염화메틸렌)중에서 DMPC : DMPG의 몰비가 7 : 3 되게하여 용해하고 지질을 약물-DMSO 용액과 혼합한다. 식염수 같은 수용액을 혼합물에 가하고 약 35-45℃에서 회전 증발법으로 유기 용매를 제거한 다음 생성된 약물-지질 혼합물을 식염수 같은 수용액으로 회석하고 균질혼합기로 HDLC 현탁액을 분쇄 혼합한다. 입자를 미분쇄할 수 있는 균질화 장치나 콜로이드밀이면 이 방법에 사용할 수 있다. 입자를 허용되는 입자크기가 될때까지 밀링(milling)하는데 예컨데, 입자의 90%가 직경 10㎛ 이하, 바람직하게는 약 4-약 10 마이크론이 될때까지 밀링한다. 필요로 하는 입자크기와 균질도에 따라 입자를 밀(mil1) 속으로 수회 통과시킨다. 입도 분석기(Malvern particle sizer)를 사용하여 HDLC 입자의 입도분석을 한다. 필요에 따라 서는 여과법 같은 공지의 입자분리법으로 크고 작은 입자를 제거한다. 이 방법에 따라 직경이 약 0.2μm-10.0μm인 입자를 얻는다.

기타 리포좀 제조방법을 본 발명에 사용한다. 본 발명의 신규제법에서 얻게되는 HDLC 제제와 리포좀을(1) 반복투여, (2) 생체활성형태로 약물의 지속적인 방출 또는 (3) 약들의 효능이 동일하거나 크며 감소된 독성을 필요로 하는 여러가지 감염증이나 조건을 치료함에 있어서 동물(인간포함)에게 사용한다. 이러한 조건에 속하는 것으르는 제한된 것은 아니지만 나이스태틴과 암포테리신 B와 같은 항진균제로 치료되는 국소 또는 전신 진균감염증과 후천성 면역결핍증(AIDS) 및 헤르페스가 있다. 더우기 본 발명의 제제는 수용액중에서 안정하다.

이 제제의 투여방식에 따라 화합물이 방출되는 기관내의 위치와 세포가 결정된다. 본 발명의 HDLC와 리포좀을 단독으로 투여할 수 있으나 목적으로 하는 투여경로와 표준 약제학적 관례에 대해 선택된 약제학적 담체와의 혼합물로하여 투여하는 것이 보통이다. 예를들자면 특정위치에나 방출하자면 국소적용(만일 감염이 외부적인 것, 예컨데 눈, 피부, 귀이거나 상처나 화상같은 것일때)으로 쉽사리 할 수 있다. 이러한 국소적용시에는 크림, 연고, 겔, 에멀젼 또는 페이스트 형태로 하여 직접 적용한다. 또한 제제를 비경구로 주사, 예컨데 정맥내, 근육내 또는 복강내 주사할 수 있다. 비경구 투여시에는 기타 용질, 예컨데 용액을 등장성으로 하기에 충분한 량의 염이나 글루코오스를 함유하는 멸균 수용액 형태로 사용한다. 제제의 특수한 성질에 따라 기타 용도를 생각할 수 있다.

본 발명의 조성물을 사용하여 리포좀이나 HDLC의 분무된 현탁액을 폐속으로 스며들게 함으로써 천식을 치료한다. 예를들자면 리포좀이나 HDLC를 적당한 용매에 현탁시켜 기압식 또는 초음파식 분무기 또는 플루오로카본 펠릿으로부터 가스압에 의해 구동되는 자층식 분무기로 에어로졸화 한다. 리포좀이나 HDLC를 입자상태로 방출하는 것들 같은 기타 흡입계를 적당한 암체계중의 현탁액이나 건조분말로 구성해서 사용해도 된다. 에어로졸화한 후 대부분의 추진 용메는 플래쉬 중발에 의해 상실되고 호흡관내의 수분으로 대치됨으로해서 입자가 참착하게된다. 진균성 또는 바이러스성 질환의 치료 또는 예방을 위해 인간에게 투여한 경우에는 의사는 환자의 적절한 투여량을 결정해야 하는데 이 투여량은 환자의 년령, 체중, 증상의 정도등에 따라 달라진다. HDLC나 리포좀 형태중의 약물의 투여량을 유리 약물에 대해 사용된 것과 거의 같은 량이다. 그러나 어면 경우에 있어서 이들 범위를 넘어서는 투여량을 투여할 필요가 있다.

본 발명을 실시예에 따라 설명한다.

500m1 둥근바닥 플라스크중의 메탄올 100m1에다 암포테리신 B(10mg, 총 약량은 5몰퍼센트)을 가하고 혼합물을 투명할때까지 음파 파쇄처리하였다. 이 음파 파쇄처리단계를 배드 음파 파쇄기(bath sonicator)중에서 25℃에서 약 50-60Hz에서 15분간 실시하였다. 디미리스토일포스파티딜콜린(DMPC)(클로로포름 1.0m1중의 100mg)과 디미리스토일포스파티딜글리세롤(DMPG)(클로로포름 0.42ml중의 42mg)을 첨가했다. 생성된 분산액을 감압하에 60℃에서 회전증발법으로 건조시켜 플라스크내에 박막을 형성시켰다. 이 필름을 PBS 4.0m1에 다시 현탁시키고 유리판속에 옮긴다음 투명할 때까지 음파 파쇄하였다.

위의 실시예를 암포테리신 B 16.7, 20, 25, 33, 50 및 60몰퍼센트를 사용해서 반복하였다. 쥐에 있어서 50% 사망율을 나타내는 약물의 용량을 측정하는 급성 독성연구(LD₅₀)은 약물의 몰퍼센트가 50몰퍼센트까지 증가함에 따라 크게 나타났다.

(실시예 2)

암포테리신 B(140mg; 총 약물 5몰퍼센트)을 디메틸슬폭시드(DMSO) 1.5m1에 가하였다. DMPC(1400mg)와 DMPG 600mg는 염화메틸렌 50m1에 용해하고 두가지 용액을 플라스크에다 옮겼다. 용액이 투명할 때까지 혼합한 다음 감압하에 회전증발법으로 건조시켜 플라스크내에 필름을 형성시킨 후 벨자아에서 1-4일간 건조시켰다. 건조시킨 다음 건조된 플레이크상태의 필름을 분쇄하여 분말로 만들어 0.9% 식염수 100m1 도는 50m1 또는 주사용 물 50m1와 혼합하였다. 생성된 현탁액을 37℃에서 1시간 가열했다.

암포테리신 B의 현탁용 용매로서 DMSO 대신에 메탄올을 사용하고 암포테리신 B의 몰퍼센트 10, 16.7 및 33에서 위의 실시예를 반복하였다. 몰비가 7 : 3인 DMPC : DMPG 대신에 난(egg) 포스파티딜콜린 1g 및 2g을 사용했다.

(실시예 3)

암포테리신 B(100mg; 총 약물 5몰퍼센트)를 DMSO 2.0m1에 용해하였다. DMPC(1.0m1중의 100mg)와 DMPG(0.42m1중의 42mg)을 플라스크중에서 클로로포름에 용해하고 감압하에 회전증발법으로 클로로포름을 제거하였다. 플라스크에 염화메틸렌(20ml)을 가한다음 암포테리신 B 용액 0.2ml을 가하였다. 이 현탁액을 실시예 1에서와 같은 조건하에서 투명할때까지 음파 파쇄하였다.(약 1분). pH 7.2인 PBS(0.3ml)을 가하고 염화메틸렌을 음파 파쇄하면서 질소분위기에서 제거하였다. 생성된 페이스트를 PBS l0.0m1에 다시 현탁시키고 10,000×g에서 10분간 원심분리한 후 배드 음파 파쇄기에서 약 20분 처리했다.

암포테리신 B 167, 20, 25, 33, 50 및 60몰퍼센트 사용하여 위의 실시예를 반복했다.

(실시예 4)

암포테리신 B(140mg, 총 약물 5몰퍼센트)을 염화메틸렌 1.5ml에 용해하였다. 두가지 용액을 투명할때까지 혼합해서 플라스크에 옮긴다음 PBS 8.0ml와 혼합했다. 배드 음파 파쇄기에서 처리하면서 질소분위기에서 염화메틸렌을 증발시켰다. 실시예 1에서와 같이 음파 파쇄를 하였다. PBS(32ml)을 가하고 용액을 5마이크론 기공을 가진 폴리에틸렌플루오로에틸렌(PTEF)테플론필터로 여과하고 나서 2회 원심분리하고 최종적으로 PBS 100m1에 현탁시켰다.

PBS 4 : 0 및 12.0m1을 사용하고 위의 실시예를 반복하여 지질을 수화시켰다.

(실시예 5)

암포테리신 B(140mg; 총 약물 5몰퍼센트)을 DMSO 1.5m1에 용해하였다. DMPC(1400mg)와 DMPG 600mg을 염화메틸렌 50m1에 용해하였다. 두가지 용액을 투명할때까지 혼합하고 플라스크에 옮겨 감압하에 회전증발법으로 건조시켜 엷은 필름을 얻었다. 이 필름을 염화메틸렌 50m1에 다시 현탁시키고 나서 PBS 8.Om1을 가하였다. 실시예 1의 방법에 따라 음파 파쇄하면서 질소분위기에서 염화메틸렌을 증발시켜 제거하였다. 생성된 페이스트를 PBS 32m1로 다시 수화시키고 2회 원심분리하여 현탁액을 세척한 다음 마지막으로 PBS 100m1중에 다시 현탁시켜 5마이크론 기공크기를 가진 테플론(PTFE)필터를 통과시켰다.

PBS 대신에 pH 3, 6 및 9의 글리신 완충액을 사용하여 위의 실시예를 반복하였다.

PBS 50, 100, 150, 200m1을 수화용 완층제로 사용하여 위의 실시예를 반복하였다.

(실시예 6)

암포테리신 B(140mg, 총 약물 5몰퍼센트)을 DMSO 1.5ml에 용해하였다. 난포스파티틸콜린(EPC)(20g)을 염화메틸렌 50g에 용해하고 두가지 용액을 플라스크에서 혼합했다. PBS(8.0ml)을 첨가하고 실시예 1의 방법에 따라 음파 파쇄하면서 질소분위기에서 용매를 제거하고나서 PBS(200ml)를 가하였다.

암포테리신 B 10 및 20몰퍼센트를 사용하여 위의 실시예를 반복하였다.

(실시예 7)

암포테리신 B(140mg; 총 약물 5몰퍼센트)을 DMSO 15m1에 용해하였다. DMPC(1400mg)와 DMPG600mg을 500m1 둥근바닥 플라스크중에서 염화메틸렌 50m1에 용해하였다. 두가지 용액을 플라스크에서 혼합하고 37℃에서 주사용물 10m1을 가하였다. 실시예 1의 방법에 따라 음파 파쇄하면서 질소분위기에서 용매를 증발시키고 주사용 물 50mI을 가한다음 용액을 30분간 37℃로 가열했다.

암포테리신 B l0 및 16.7몰퍼센트를 사용하여 위의 실시예를 반복한 다음 3마이크론 기공이 있는 플리카보네이트 필터(Nucleopore)속으로 용액을 통과시켰다.

(실시예 8)

암포테리신 B(140mg; 총 약물 l6.7몰퍼센트)을 메탄올 50ml와 혼합한 것을 15분간 음파 파쇄하여 용액을 만든다음 0.22마이크론의 굴곡경로를 가진 필터(혼합된 셀룰로오스와 아세테이트 나이트레이트 에스테르)(시판품 : Millex)을 통과시켰다. DMPC(350mg)와 DMPG 150mg을 염화메틸렌 50g에 용해한 다음 위의 여액과 혼합했다. 실시예 1의 방법에 따라 음파 파쇄하면서 질소분위기에서 용매를 증발시켰다. PBS(50ml)을 가하고 제제의 절반(25ml)을 표준 동결전조법으로 동결건조시켰다.

(실시예 9)

무수에탄올 2.0m1에다 1N 염산 10μ1을 가한 것에다 암포테리신 B(20mg; 총 약물 5몰퍼센트)을 가하고나서 음파 파쇄시간을 30초-60초로 하는 것외에는 실시예 1에서와 같은 조건하에서 투명할때까지 음파 파쇄처리하였다. 벤젠 : 메탄올(70 : 30)용액이 첨가되어 있는 시험관내에 DMPC(200mg)와 DMPG(42mg)을 가하고 용액을 실시예 8에서처림 동결 건조하였다. 전조된 지질을 PBS 20m1와 혼합하고 혼합기에서 혼합하여 분산시켰다. 이 지질에다 암포테리신 B 용액(0.2ml)을 가하고나서 하루밤 교반했다. 생성된 DMPC : DMPG MLV(200μ1)을 슈크로오스 밀도 기울기에서 층상으로 만들어 230,000×g에서 22℃에서 24시간 원심분리하였다. 그 결과는 그림 11에 나와있다. 모든 암포테리신 B가 지질과 결합하였고 지질을 대부분 함유한 기울기의 상부에서는 광범위한 분포를 하고 있으며 기울기의 바닥부분에서는 암포테리신 B의 주피이크가 나타나고 있다. 또한 생성된 DMPC : DMPG MLV를 동결건조하여 증류수(2.0ml)로 재수화시켰다.

암포테리신 B 7, 9, l67, 17, 20, 25, 33, 50 및 60몰퍼센트를 사용하여 위의 실시예를 반복하였다. 약물의 몰퍼센트가 16.7인 때와 그 이상인 경우에서 대부분의 HDLC가 생성되었다. 이러한 약물 : 지질의 비가 큰 제제의 밀도 원심분리 기울기는 모든 약물과 지질이 단일 피이크에서 서로 결합되어 있는 경우에는 제5도의 것과 유사하다.

(실시예 10)

암포테리신 B 25몰퍼센트-DMPC : DMPG 시료를 다음과 같이 제조하여 X선 회절분석, DSC, 동결 파쇄 전자현미경 관찰 및³¹P-NMR 연구를 하였다. 즉 몰비가 7 : 3인 DMPC : DMPG(총 지질 44mg)와 암포테리신 B 20mg(암포테리신 B 25몰퍼센트)을 클로로포름 : 메탄올(70 30v/v)중에 현탁시키고 감압하에 55℃에서 증발시켜 플라스크 내부에 얇은 필름을 만들었다. 이 필름을 글라스 비이드(glass bead)와 함께 소용 돌이식 혼합법으로 20mM Hepes 8.0ml, 250mM NaC1, pH 7.2로 22℃에서 수화시켰다. 이 제제를 10,000×g에서 10분간 원심분리하여 상청액을 경사 분리하여 제거하고 펠릿을 Hepes/Nacl 완충액 1.0m1중에 다시 현탁시켰다. 이 제제를 배드 음파 파쇄기에서 25℃에서 50-60Hz에서 20분 음파 파쇄처리했다.

암포테리신 B 0, 5 및 50몰퍼센트를 사용하여 위의 방법을 반복했다.

(실시예 11)

암포테리신 B 함유 리포좀과 HDLC의 포착체적을 측정하기 의해 다음 방법을 따랐다.

클로로포름중에서 DMPC(100mg)과 DMPG 42mg을 가하고 메탄올중에 암포테리신 B l0mg(25몰퍼센트)를 가해서 된것(0.lmg/암포테리신 B ml)과 함께 플라스크중에서 혼합했다. 37℃에서 감압하에 용매를 제거했다. 증류수에 H-이눌린을 가해서된 묽은 용액 0.3m1가 첨가된 PBS(3.7ml)을 교반하면서 건조 지질 필름에 가했다. 이 용액의 일부(10.2ml)을 춰해 신틸레이션 칵테일(scintillation cocktail)에 넣고 베타 섬광계수기로 방사능을 측정했다. 두번째 분취액을 가지고 공지방법(Bartlett, J. Biol. Chem. 1959, 234 : 466-468)에 따라 인산염에 대한 검정을 하였다. 지질-약물 현탁액을 10,000×g에서 10분감 원심분리하고 상청액을 버리고 얻은 펠릿을 PBS중에 다시 현탁시켰다. 원심분리 및 펠릿 재현탁 단계를 2회 더 실시하였다. 최종 재현탁물을 시료채취(100μ1)하여 배타 섬광계수기에서 측정하였다. 최종 펠릿 재현탁물의 두번째 분취액을 가지고 위에서와 같이 인산염에 대해 검정하었다. 이눌린의 함임율(%)을 계산함에 있어서 최종 방사성 계수결과를 초기계수치로 나누고 100을 곱해주었다. 포착 체적(함입된 이눌린 μ1/지질 μmol)도 계산하였다.

암포테리신 B 0, 5 및 50몰퍼센트를 사용하여 위의 방법을 반복하였다.

(실시예 12)

클로로포름 약 10m1로부터 100m1 둥근바닥 플라스크의 양쪽에다 DMPC 15.5mg과 DMPG 6.5mg(몰비7 : 3)을 건조시켜 암포테리신 B 입자를 제조했다. 메탄올 100m1중에 암포테리신 B(10mg)를 현탁시키고 플라스크에다 메탄올용액 100.0m1을 가하고 지질 필름을 현탁시킴으로써 암포테리신 B 25몰퍼센트되게 하였다. 이 혼합물을 37℃에서 증발건조시켜 플라스크내에 얇은 필름을 형성시켰다. 이 필름을 글라스 비이드를 사용하여 10mM Hepes, 150mM NaC1(pH 7.2)로 수화시키고나서 30분간 음파 파쇄시켜 최종 현탁액을 얻었다. 이 현탁액 시료를 물중탕속에 담구어서 60℃에서 10분간 가열했다. 여기서 얻는 현탁액을 가지고 DSC, NMR 및 동결 파쇄 전자현미경에 의해 특징을 파악했다.

이 시료를 가열하지 않고 위의 방법을 반복하였다. 이 시료를 22℃에서 유지하고 위에 나온 방법으로 특징을 파악했다.

(실시예 13)

암포테리신 B 50몰퍼센트와 5몰퍼센트를 사용하여 실시예 l2의 물질과 방법을 반복했다. DSC, ESR 및 동결 파쇄 전자현미경법등에 의해 이들 계의 특징을 파악했다.

(실시예 14)

Micro Cal MC-1장치(Micro Cal. Inc., Amherst, MA)를 사용하여 DSC 측정을 했다. 현탁액 5-9mg을 함유한 시료체적 0.70m1을 시료셀(cell)기내로 주입했는데 이때 기준셀에서 동일 체적의 완충액을 사용 했다. 시료의 가열속도를 약 26℃/시간 또는 약 37℃/시간으로 하였다. 동일 과정에서 동일 시료로 2휘 시험하여 시작과 종료 온도재현성의 정확도를 0.2℃되게 했다. 일반적으로 암포테리신 B를 함유한 시료를 60℃로 가열한 다음 최소한 2시간동안 7-4℃로 냉각하여 시료의 열이력이 일관성이 있게 하였다.

(실시예 15)

8K 데이터 포인트, 스위프폭 50,000Hz 및 펄스폭 20μsec(400펄스에 상당함)을 사용하여 NMR 분광계(Bruker AM 360 wide bore NMR spectrometer)에서 145.7MHz에서 NMR 스펙트럼을 얻었다. 스펙트럼을 10,000트랜지엔트(transient) 까지 축적시켰다.

(실시예 16)

한쌍의 구리지지판(Balzer(Nashua, NH) copper support plate)사이에 시료의 분취액 0.1-0.3μ1을 삽입하고 신속하게 23℃에서 액체 프로판속으로 투입했다. 시료를 파쇄시키고 2×10^-6mbar 이상의 전공에서 -1l5℃에서 Balzer 동결-파쇄 장치중의 이중 복제기에서 복제하였다. 복제물을 3N HNO₃중에 부유시킨다음 하이포 아염소산나트름 용액중에 세척했다. 마지막으로 이들을 증류수에서 씻어서 300Hex 메쉬의 구리 그리드(Polysciences, PA)에다 놓았다. 필립스 300 전자현미경에서 배율 3, 000-22,000으로 하여 복제물을 관찰하였다.

(실시예 17)

Hepes/NaCl 완충액중에서 암포테리신 B를 희석하여 25μM 리터의 암포테리신 B를 만들어 흡광 스펙트럼(제12도 및 제13도)을 얻었다. 시료를 Beckman 분광광도계의 시료 크벳(cuvette)에 넣고 300-500nm에서 흡광도를 읽었다. 시료 크벳을 완충액 블랭크에 대해 읽었다.

(실시예 18)

독실(doxyl) 그룹이 지방산 사슬을 따라 상이한 위치에 존재하는 독실 스테아르산의 위치 이성체로 ESR용 시료를 표지(labelling) 하였다. 탐침물질을 혼합하고 에탄올 용액에서 음파 파쇄하여 둔후 건조시켜 시험판내에 얇은 필름이 생기게 함으로써 표지하였다. 모든 시료를 1몰퍼센트로 표지하였다.

질소 가스 유동 온도조절을 하면서 ESR 분광계(IBM Instruments ERl00D)에서 ESR 스펙트럼을 기록했다. 외부 고정된 더어미스터(thermistor) 탐침(Omega Engineering, Inc., STamford, CA)을 사용하여 시료 온도를 모니터링하였다. 필드 스위프 100G와 100KHZ 필드 모듈레이션 진폭 0.32G에서 마이크로 웨이브 파워 10MW 및 마이크로 웨이브 주파수 0.11GHZ로 ESR 스펙트럼을 기록했다. 최대 초미세 갈라지기(hyperfine splitting(Amax))로부터 오더 파라미터 (order parameter) 를 계산했다.

(실시예 19)

암포테리신 B(337.5g)을 DMSO 3375ml에 가하고 혼합기에서 암포테리신 B(100mg/ml)를 혼합하여(3시간 정도) 용해시켰다 혼합물을 스테인레스강으로 된 압력용기(51ι들이)에다 옮기고 0.22μm 필터(Sartofluor filter)와 폴리프로필렌 필터를 통과시켜 여과했다.

4ι들이 압력용기에서 염화메틸렌 50.8kg과 DMPC 225.0g 및 DMPG 99.0g을 3.5시간 혼합해서 완전히 용해시켰다. 생성된 지질용액을 0.2M²Sartofluor 0.22마이크른 테플론 필터를 통과시켜 스테인레스강으로된 처리탱크로 옮졌다. 40L들이 압력용기를 염화메틸렌 55.2kg로 세척하고 마찬가지로 여과하여 처리탱크로 넣었다. 처리탱크에서 195rpm에서 지질용액을 회전식 혼합하고 암포테리신 B DMSO 용액을 냉크로 옮졌다. 염화나트륨용액(16.2L, 0.9% USP)을 필터(0.22μm Millipak l00 polycarbonate filter) 를 통과시켜 탱크에다 가하였다.

처리탱크와 직렬로 있는 35℃로 고정된 열교환기를 사용하여 가열된 액체질소를 탱크로 통과시키고 용매를 12시간동안 제거하였다. 생성된 지질-약물 착화합물을 염화나트름(0.9% USP : 7000ml)으로 희석하고 필터(Millipak l00 0.22micron filter)를 통해 탱크로 보냈다.

생성된 HDLC를 콜로이드 밀과 회전 로우보 펌프(rotary lobe pump)로 균질화했다. HDLC를 0.5mil의 틈새를 둔 콜로이드 닐 헤드를 통해 배압 10psi로 3시간동안 통과시켜 20마이크른 이하의 입자를 얻었다. HDLC의 입자크기를 입도분석기(Malvern particle counter)로 분석했다.

(실시예 20)

클로로포름에 용해한 지질(102.6μmo1, DMPC : DMPG 몰비 70 : 30)을 500m1들이 둥근바닥 플라스크속으로 피펫으로 가하였다. 음파 파쇄기(Branson bath sonicator)중에서 음파 파쇄하여 메탄올 1.01중에 나이스태틴(500mg)을 용해시켰다(0.5mg/ml). 용해된 나이스태틴(5.0ml)을 지질을 함유한 동근바닥 플라스크에 가하고 혼합한 다음 용매를 45℃에서 15분간 회전증발법으로 제거하고 여기서 얻은 제제를 글라스 비이드와 함께 혼합하여 식염수 중에서 재수화시켰다. 광현미경 관찰로 리포좀이 확인되었다.

나이스태틴 25, 50, 75 및 100몰퍼센트 사용하여 위의 방법을 반복하였다. 동격 파쇄 전자현미경 관찰에 의하여 나이스태틴 25몰퍼센트를 함유한 제제는 비리포좀 HDLC임이 확인되었다.

(실시예 21)

지질(14.8μmo1/ml, DMPC : DMPG의 몰비 7 : 3)을 증류수중에서 수화시키고 4℃에서 항온처리해서 얻은 MLV를 LUVET법을 사용하여 두개의 필터(stacked polycarbonate filter)를 통해 2회 압출하였다.

배드 음파 파쇄기를 사용하여 농도 10.8μmo1/m1에서 증류수중에 암포테리신 B를 분산시켰다. 암포테리신 B 분산물을 지질 현탁액에 가하여 지질파 암포테리신 B의 최증농도가 각각 13.5μmo1/m1 및 0.98μmol/m1되게 하였다. 결합되지 않은 암포테리신 B를 제거하기 위하여 원심분리기(Beckman)에서 Ti 60 또는 SW27 로우터에서 22℃ 및 15,000×g에서 30분 시료를 원심분리하였다. 리포좀 폘릿을 건드리지 않고 상청액인 유리 암포테리신 B를 제거하였다. 생성된 리포좀을 준탄성 관산란법으로 측정한 결과 직경이 1.0μm 이상이었다.

150mM NaC1, 10mM Na₂PO₄, pH 7.4를 사용하여 23℃의 항온처리조건에서 위의 방법을 반복함으로써 지질을 수화시켰다.

생성된 리포좀을 준단성 관산란법으로 측정한 결과 직경이 10㎛ 이상이었다. 매체의 이온강도가 낮을 경우(증류수내 150mM NaC1) 리포좀의 암포테리신 B 흡수속도는 컸다(제17도).

제16도를 여러가지 항온처리온도 조건하에서 암포테리신 B의 DMPC : DMPG 리포좀속으로의 흡수정도를 나타낸 것이다. 23℃와 45℃에서의 흡수속도는 비슷하다. 지질이 15℃에서 정상이면 약물도 축적이 된다.

(실시예 22)

실시예 20의 물질과 방법을 사용했으나 증류수에 현탁시킨 지질을 22℃에서 암포테리신 B와 함께 항온처리하였다. 생성된 리포좀은 단일층이었고 준탄성 관산란법으로 측정된 평균적경은 약 0.1-0.2μm이었다. 제19도를 보면 MLV의 경우보다 LUV의 경우에 있어서 첫번째 두시간에서 암포테리신 B의 흡수속도가 보다 신속함을 알 수 있다.

Claims

생활성제-지질 복합체로 구성된 조성물에 있어서, 생활성제는 소수성 약물이고 복합체에서 생활성제의 농도는 6 내지 50%몰이며, 이와 같은 약물 : 지질의 비율이 큰 경우 조성물에 리포좀이 포함되어 있지 않는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 지질이 인지질로 구성된 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 인지질이 2개 포화된 아실사슬을 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
제3항에 있어서, 인지질이 포스파티딜콜린과 포스파티틸글리세롤로 구성된 것을 특징으로 하는 조성물.
제4항에 있어서, 포스파티딜콜린이 디미리스토일 포스파티딜콜린이고 포스파티딜글리세롤이 디미리스토일 포스파티틸클리세롤인 것을 특징으로 하는 조성물.
제5항에 있어서, 포스파티딜콜린과 포스파티딜클리세롤의 몰비가 7 : 3인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 복합체에는 리포좀이 포함되어 있지 않고, 생활성제는 암포테리신 B이고, 복합체에서 생활성제의 농도는 25 내지 50몰%이고 지질은 디미리스토일 포스파티딜콜린과 디미리스토일 포스파티딜글리세롤이 7 : 3몰비로 구성된 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 복합체에서 생활성제의 농도는 25-50몰%인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 생활성제가 항진균제인 조성물.
제9항에 있어서, 항진균제가 폴리엔 항생물질인 조성물.
제10항에 있어서, 항진균제가 암포테리신 B인 조성물.
제10항에 있어서, 항진균제가 나이스태린인 조성물.
제1항의 HDLC와 약제학적으로 허용되는 담체나 희석제로된 의약조성물.
제13항에 있어서, 비경구 투여용으로 적합한 것을 특징으로 하는 의약조성물.
소수성 약물과 지질로 구성된 HDLC를 만드는 방법에 있어서, a) 중간 극성을 가진 유기 용매에 지질을 용해시키고; b) 유기 용매에 약물을 용해시키고; c) b)단계로부터의 생성물과 a)단계로부터의 생성물을 혼합시키고; d) c)단계의 생성들로부터 유기 용매를 제거하고; 그리고 e)수용액에 d)단계로부터의 생성물을 첨가하는 단계로 구성되고, 이때 복합체에서 약물의 농도는 6 내지 50몰%인 것을 특징으로 하는 방법.
제15항에 있어서, 복합체에서 약물의 농도는 25 내지 50몰%인 것을 특징으로 하는 방법.
제15항에 있어서, 약물이 암포테리신 B인 것을 특징으로 하는 방법.
제15항에 있어서, 지질은 디미리스토일 포스파티딜콜린과 디미리스토일 포스파티딜글리세롤로 구성된 연지질인 것을 특징으로 하는 방법.
제15항에 있어서, 디미리스토일 포스파티딜콜린과 디미리스토일 포스파티딜글리세롤이 7 : 3몰비로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
제15항에 있어서, a)단계의 유기 용매는 클로로포름, 메탄올, 디메틸설폭시드, 메틸렌 클로라이드와 이의 혼합물로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제15항에 있어서, b)단계의 유기 용매는 산성화된 에탄올인 것을 특징으로 하는 방법.
제15항에 있어서, b)단계의 유기 용매는 디메틸설폭시드인 것을 특징으로 하는 방법.
제15항에 있어서, 약물과 지질로 구성된 이고제(paste)를 만들기 위해 d)단계에서 유기 용매를 제거하는 것을 특징으로 하는 방법.
제15항에 있어서, 약물과 지질로 구성된 박편(nake)을 만들기 위해 d)단계에서 유기 용매를 제거하는 것을 특징으로 하는 방법.
제15항에 있어서, 약물과 지질로 구성된 필름(film)을 만들기 위해 d)단계에서 유기 용매를 제거하는 것을 특징으로 하는 방법.
제15항에 있어서, e)단계로부터의 생성물은 25℃ 내지 60℃에서 적어도 10분간 가열하는 것을 특징으로 하는 방법.