JPH02502459A

JPH02502459A - リポソーム含有ニスタチン

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Publication number: JPH02502459A
Application number: JP63502721A
Authority: JP
Inventors: ロペツ　ベレスタイン　ガブリエル; メータ　リータ; ホッパー　ロイ　エル; ジュリアーノ　ルドルフ　エル
Original assignee: ボードオブリージェンツザユニヴァーシティオブテキサスシステム
Priority date: 1987-03-03
Filing date: 1988-03-02
Publication date: 1990-08-09
Anticipated expiration: 2013-01-26
Also published as: WO1988006440A3; ATE79028T1; DE3873528T2; AU1491788A; JP2703594B2; EP0348431A1; EP0348431B1; US4812312A; WO1988006440A2; DE3873528D1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】リポソーム含有二スタチン本発明の進展の一部は、ナショナル・インスチチュート・オン・ヘルス（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ）のデパートメンド・オン・ヘルス・アンド・ヒニーマン・サービス（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆＨｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｉ（ｕｍａｎ　５ｅｒｖｉｃｅ）からの契約番号ＮＩＡＩＤ −ＮＱＩ−ＡＩ４２５４７の援助を受けている。

本発明はリポソーム含有二スタチンの投与による全身性菌類感染症の治療に関する。

臨床的診断及び動物実験が宿主−菌類相互作用の理解に蓄積されてきている。菌類病に対する宿主の防御は多くの要素を含み、かつ病因に依存して変化し得ることが認識されてきている。殆んどの場合、耐性メカニズムは明確となっていないが、種々の本来の障壁及び細胞性免疫応答が第一に重要であるようだ。今の時点では耐性における抗体の役割は明確ではない。本来の防御及び細胞性免疫応答の衰弱がヒストプラズマ力ブスラタム（）Ｉｉｓｔｏｐｌａｓｍａｃａｐｓｕ　Ｉａｔｕｍ）及びコツシジオイデスイミチス　（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓｉｍａ＋１ｔｉｓ）などの菌類病原同様、クリブトコッ力スネオホルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）及びキャンタイプ（Ｃａｎｄｉｄａ）及びアスペルギラス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種などの日和見的病因に由来する重い菌類病への感染性を増加し得る。さらに、重要な宿主防御を完′全に理解することの困難さは、菌類が逆に種々の宿主免疫機能に影響し得ることを示す多くの研究により複雑なものとなった。これらの多くの実験的知見の臨床的重要性を評価するには早すぎるけれども、研究者達は菌類が好中球機能を阻害し、ＩｇＥ応答を誘導し、また細胞性免疫応答を抑制することを示してきた。

感染性増加と関連する宿主の変化は、外傷（火傷又は刺し傷なうに自己誘導的に、糖尿病、種々の先天性免疫不全症、膠原病、リンパ細網組織悪性症及びその他のタイプの腫瘍におけるように自然発生的に、又は装置（カテーテルなど）、外科手術（心臓切開手術など）又は細胞毒性薬剤（移植拒否反応の防止及び悪性病の治療におけるように）及びコルチコステロイドの使用及び広域゛　抗体の長期使用による医療的に誘導され得る。

菌類病に対する防衛を助ける化学的因子はあまり分っていない。

これらの物質の知識は基本的に臨床レベルでの状況証拠及び実験レベルでのインビトロ観察に基づいている。思春期に起きる皮膚における脂質及び脂肪酸含量のホルモン依存の増加は、思春期における変化が防御の唯一の要素ではないが、皮膚寄生真菌ミクロスポラムオウドウイエイ　（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕａ＋　ａｕｄｏｕｉｎｉｉ）により起こる頭部自群に対する耐性の増加と相関関係をもっている。血清、脳を髄液及び唾液中の物質はクリブトコッカスネオホルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）の増殖を制限し、また体液中の基本的ペプチドがカンタイプアルビカンス　（Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ）を阻害することが示された。

臨床及び実験的研究の結果は、Ｃ，アルビカンス　（ａｌｂｉｃａｎｓ）、Ｃ，ネオホルマンス（ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）　、アスペルギラスフミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｕｓｉｇａｔｕｓ）及びＣ，イミチス（ｉｎ＋ａ＋１ｔｉｓ）は、補体カスケードの別の経路を活性化することを示している。菌類細胞壁の多糖類性のため、全ての医学的に重要な菌類は補体を活性化することが期待される。このような活性化は、ある糸状菌病に対°　する防御に重要である。すなわち後期作用補体成分（Ｃ３〜Ｃ９３及びＣ，ネオホルマンス　（ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）及びＣ，アルビカンス（ａｌｂｉｃａｎｓ）などの菌類に対する感染性の増大の間に正の相関が示されている。菌類に対する耐性に食細胞が重要な役割を果していると仮定すると、補体活性化は補体フラグメントＣ３ａ及びＣ５ａの発生に際し、急性炎症応答を引き起こすことにより、また食細胞による貧食のために、オンソニンフラグメン）Ｃ３ｂ及びＣ３ｄで菌体要素をコーティングすることにより役割を果している。

ヒト及びその他の動物の全身性糸状菌病は、病因性でかつ健康な宿主に病気を起こすある菌類により、及び通常無害であるが免疫不全の患者に病気を引き起こす別の菌類（日和見的病原）により発生する。これらの菌類の中のいくつかは天然には馬主性（汚物、鳥の糞）であるが、その他のものは正常人面相の一部として存在する（共生性）、いずれの場合もヒトが唯−又は必須の宿主ではない、汚物馬主性生物の例にはヒストプラズマヵブスラタム（Ｈ４ｓｔｏｐｌａｓｓａ　ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）があり、これは一般に一地方特有の感染を起こす、遅延皮膚過敏症テストにおいて成人の８０〜９０％はヒストプラスミンと反応する０日和見的病原の例には通常口腔内、胃腸内、及びおそらく皮膚内に存在するカンタイプアルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ）がある、しかし急性白血病患者において、Ｃ，アルビカンス（ａｌｂｉｃａｎｓ）は−最に血液中に存在し、を撃性で、通常致命的な敗血症を引き起こす、他の日和見的病因は糖尿病酸性症（毛菌症）及びホジキン病（例えば酵母菌症、及ヒヒストプラズマ症）患者に見られる。これらのメカニズムの病因は不明確であるが細胞性免疫は良好な予後には必須であると思われる。

有効なワクチン又は受動免疫血清は市販調製物が出来る程十分な成功をおさめていない。

活発な病いの治療には症候的なもの（例えば鎮痛）、ときには外科的なもの（不治の損傷組織の切除及び脳水腫の修正）及び殆んど成功する化学療法（第１表）がある、一般に使用される薬剤にはヒドロキシスチルバミジンイセチオネート、アンホテリシンＢ、５−フルオロシトシン（フルシトシン）、ミコナゾール及びケトコナゾールがある。これら薬剤に対する応答は、Ｗ類、病気のタイプ及び病状に従がい変化する１例えば殆んどのＢ・デルマチチジス（ｄｅｒ■ａｔｉｔｉｄｉｓ）感染においては応答は良いが、Ａ。

フミガタス（ｆｕｓｉｉｇａｔｕｓ）により起こる殆んどの病気については応答は弱い、Ｂ・デルマチチジス（ｄｅｒｍａｔｉ　ｔｊｄｉｇ）による皮膚損傷に対する応答は、Ｃ，イミチス（ｉｍｍｉｔｉｓ）による髄膜炎よりも良く、また慢性酵母菌症の応答はｔ撃性のカンジダ症よりも良い。

第１表はいくつかの全身性糸状菌病及び一般に受は入れられている化学療法薬剤のリストを示している。

第１表全身性糸状菌病の化学療法薬剤病　　名　　　　　第１選択　　　　　　第２選択アスベ１１ス症　　　アンホテリシンＢ　　　ケトコナゾール分身ｍ症　　　　アンホテリシンＢ　　　ヒＦｏキシスチルｔｒミシンイセチオネートカンジダ症　　　アンホテリシンＢ　　フルシトシン又はケトコナゾールコクシジオイヅス症　　　アンホテリシンＢ　　　ケトコナソ゛−ル酵母菌症　　　　アンホテリシンＢ　　いずれかの草独薬剤。

フルシトシンしストプラズマ症　　　　アンホテリシンＢ　　　ケトコナゾール”毛菌症　　　　　アンホテリシンＢ　　　　ミコナゾール”パラコクシジオイヅス症　　　　ア　ンホテリ　シンＢ　　　　　スル本ンアミＦ、　ケトコナゾール本　菌類に必要な最小阻害濃度に依存する。

リンパ腫患者の５１％及び白血病患者の７５％の死亡の原因は感染である。バクテリアはこれらの感染の原因生物であるが、リンパ腫患者の致命的感染の１３％及び白血病患者の２０％以上は菌類による。菌類力ンタイダアルビカンス　（Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ）はこれらの感染の８０％以上を引き起こし、またアスベルギラス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）　ｓｐｐ、もしばしばこれら感染の原因となる。さらに類感染は先天性及び後天性免疫不全患者の病状及び死亡の主要な原因である。非常に協調のとれた努力がヒトの菌類感染の治療に有効な薬剤の探索に費やされてきた。その結果、多くの化合物が単離され抗真菌活性を有することが示されてきたが、溶解度、安定性、吸着及び毒性に関する問題はヒトの感染に関するそれらの薬剤の殆んどの治療効果を制限している。殆んどの有用な抗真菌性抗生物質は２つのカテゴリーの１つに分類される。すなわち菌類細胞膜に作用するものと細胞に取り込まれ、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はタンパク質の合成などの生細胞プロセスを阻害するものである。

第２表にはいくつかの有用な抗真菌性薬剤及びそれらの作用メカニズムをリストしである。

第２表有用な抗真菌性薬剤、それらの化学的分類及びそれらの作用メカニズムグリサン　　グリセオフルビン　　テニブリンに結合し、微小管形成を阻害する。

ポリエンマクロリド抗生物質は種々のストレプトマイセス種により生産される二次代謝産物である。これらの化合物のいくつかの共通する性質は単離されている８０種以上のポリエンを分類するのに役立つ。全ての化合物は２６〜３８個の炭素原子を含み、かつ一連の不飽和炭素原子及び水酸基を含むマクロリド環で特徴づけられる。この化合物のこれらの特徴はポリエンの両親媒性（例えば親水性及び疎水性など異なる性質をもつ官能基を含む化合物に関する性質）に帰因する。

この環状構造は内部エステル又はラクトン結合の形成により閉じられている（第１図）。共役二重結合数は各ポリエンにより異なり、またこの化合物は一般的に不飽和度により分類される。

ポリエンマクロリドの毒性効果は細胞膜ステロールへの結合に依存しているようである。従ってそれらは菌類細胞並びにその他の真核細胞（ヒト、植物及び原生動物）の膜に結合するが膜ステロールを含まないバクテリアの細胞膜には結合しない。ポリエンマクロリドとホ乳類及び菌類の膜ステロールとの相互作用は細胞内成分を流出させ細胞死を招くトランスメンブレンチャンネルを生成する。

通常、抗生物質の有用性は病原及び宿主の感受性の差によって測定される。２つの薬剤、ニスタチン及びアンホテリシンＢは比較的菌類に特異的であり、ヒトの治療に有用である。これら２つのポリエンマクロリドの相対的特異性は、ヒトの細胞膜の主要なステロールであるコレステロールと比較した菌類膜の主要ステロールであるエルゴステロールのより大きい結合活性に基づいている。

アンホテリシンＢは７個の共役炭素結合をもつヘプタエンマクロリドである（第１図参照）、この化合物は１９５６年にＳ、ノドサム（ｎｏｄｏｓｕｍ）の培地濾液から初めて単離された。他のポリエンマクロリド抗生物質と同様に、アンホテリシンＢは水に不溶性である。この溶解度の問題はその抗生物質をデオキシコール酸ナトリウム及びリン酸ナトリウムと混ぜ、この混合物を５％デキストロース溶液で水和することにより克服される。アンホテリシンＢはヒトに対し十分に非毒性であるポリエン抗生物質であるので、種々の菌類に対して効果的な量を非経口的に使用し得る。

最初にＳ、ノウルセイ　（ｎｏυｒｓｅｉ）から単離されたニスクチンはアンホテリシンＢと構造的に関連しているが、その環の共役部分が分断されており、従ってテトラエン及びジエンを形成していることからヘプタエンには分類されない（第１図参照）、この薬剤は経口的及び局所的には許容されるが、高い毒性及び水不溶性が予想されることから静脈注射による使用は行ない得ない、ニスクチンは経口錠剤（５００，０００ユニツト）又は局所的に使用する軟膏（１００，０００ユニット／ｇ）として使用し得る。これは皮膚及び粘膜の糸状菌症の治療に用いられる。

最近、患者投与前の特定薬物のりボソニムへのカプセル化がこれら化合物の薬理動力学、組織分布、代謝及び治療効果を著しく変化し得ることが示された。リポソームは乾燥脂質フィルムに水溶液を添加することによ、り自然に形成する脂質小胞と定義し得る。

さらにこの薬剤の分布及び薬理動力学はそれらがカプセル化しているリポソームの脂質組成、サイズ、荷電及び膜流動性を変化させることにより修正し得る。

最近リポソームはネズミのシーシュマニア症（二ｓ−（Ｎｅｗ）、Ｒ，Ｒ，Ｃ，等“リポソーム中にトラツブしたアンホテリシン及び他の抗菌類剤の抗し−シュマニア活性”ジャーナル・オプ・アンチマイクロービアル・ケモセラビ−（Ｊ、　Ａｎｔｉ−ｍｉｃｒｏｂ、　Ｃｈｅｍｏ−ｔｈｅｒ、）、８　　（１９８１）３７１−３８１）　、ヒストプラズマ症（ティラー（Ｔａｙｌｏｒ）、　Ｒ，Ｌ、等、“リポソーム中のアンホテリシンＢ：ヒストプラズマ症の新治療法”アメリカン・レビュー・オプ・レスビラトリー・ディシーズ（Ａｍ、　Ｒｅｖ、　Ｒｅ５ｐｉｒ、　Ｄｉｓ、）。

１２５　（１９８２）６１０−６１１）、酵母菌症（グレイビル（Ｇｒａｙｂｉｌｌ）、　Ｊ、　Ｒ，等“リポソーム含有アンホテリシンＢによるネズミ酵母菌症の治療１ジヤーナル・オン・インフェクシャス、ディシーズ（Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、）、　　１４５　（１９８２）’、　　７４８−７５２）及び糸状菌症（トレンブレー（Ｔｒｅｓｂｌａｙ）、　Ｃ，等”マウスにおける全身性糸状菌症に対するアンホテリシンＢ　（ＡＭＢ）及びリポソームＡ　Ｍ　Ｅ　（Ｉ　ｉｌ＋　−ＡＭＢ）の効果の比較９アブストラクト、１９８３１ＣＡＡＣ，７５５号（１９８３）２２２）の治療に対するアンホテリシンＢのキャリヤーとしてリポソームが用いられている。またリポソームカプセル化アンホテリシンＢは日本赤毛猿のコクシジオイデス症の治療にも使用された（グレービル（Ｇｒａｙｂｉｌｌ）　Ｊ、　Ｒ，等、“リポソーム含をアンホテリシンＢ　（ｌｉｐｏ−−ＡＭＢ）を用いた霊長動物におけるコクシジオイデス症の治療”アブストラクト１９８２１ＣＣＡＣ，４９２号（１９８２）１５２）。

最近、本発明者は、リポソームカプセル化アンホテリシンＢ（Ａ■ｐＢ）が実験マウス糸状菌症の治療（ロベス・ベレスタイン（Ｌｏｐｅｚ　　Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ）等、′ジャーナル・オン・インフェクシ中ス、ディシーズ（Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、ン、１２０，２７８−２８３（１９８４））及び白血病及びリンパ腫患者における菌類感染の治Ｎ（ｏベス・ベレスタイン（Ｌｏｐｅｚ　− Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ）等、′ジャーナル・オン・インフェクシャス、ディシーズ（Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、）＋１５１．７０４〜７ｌ−（１９８５））に使用し得ることを示した。

ポリエンなどの効果的抗真菌性薬剤の使用にもかかわらず菌類感染の治療は依然として大きな問題となっている。使用し得る殆んどのポリュン抗住物質はその臨床的応用を制限する毒性副作用を有している。テトラエン−ジエンポリエンマクロリド抗？ｔ［ｔニスタチンは非常に高い疎水性を有し、これが効果的な全身的投与を妨害している。それは種々の方法で調製したサスペンジツンとして用いられ、また患者に経口的に投与される。しかし、一般にこれらの研究は全身性の菌１ｇ染に対するニスタチン投与の有効性を示すには至らなかった。

本発明は動物中の伝染による菌類感染の治療のためのリポソーム剤に関する。このリポソーム剤は脂質及びポリエンマクロリド抗真菌性化合物二スタチンを含んでいる。このニスクチンは全身性菌類感染に有効な治療のためにリポソームに組込むか又はカプセル化される。

ニスタチンを含有するリポソームは多重う・メラ小胞であることが望ましい、リポソームはホスホモノグリセリド、ホスファチジル酸及びスフィンゴ脂質からなる群から選ばれる１個以上の脂質、好ましくはリン脂質を広く含んでいる。この脂質は１個以上のホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセリン、スフィンゴミエリン又はホスファチジル酸であることがさらに好ましい、またこの脂質はシミリストイルホスファチジルコリン、シミリストイルホスファチジルグリセリン、ホスファチジルコリン及びホスファチジルグリセリンからなる群から選ばれることが最も好ましい０本発明のリポソームはコレステロールなどのステロールを含み得る。

本発明の重要な特徴は、動物における播種性（ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ）Ｗｉ類感染の治療法に関する。この方法は、リポソーム内にカプセル化した殺菌効果量のニスタチンを伝染性菌類感染した動物に投与することを含む、リポソームは上述のように構築する。投与は殆んどの場合非経口的に行なわれることが好ましいが、もし特異的菌類コロニーに直接到達し得るならば、経口的又は局所的に行なうこともできる。その動物が伝染性菌類感染を受けたヒトである場合は非経口的治療が最も有効である。治療方法には、体Ｎｋｇ当り約ｌａｇから約２０ｍｇのニスクチン、より好ましくは体重ｋｇ当り約２．５ｍｇから約６Ｉ１ｇのニスクチンの範囲にある抗菌性効果量のリポソーム含有二スタチンの投与を含む、殆んどの好ましい態様において、その治療法は基本的に約７＝３の比のシミリストイルホスファチジルコリンとシミリストイルホスファチジルグリセリン及び約ｌ：２０の比のニスタチンとリン脂質からなるリポソー′　ムの使用を含んでいる。

第１図は、い（つかの水酸基と共役二重結合系をもつマクロリド環の共通した構造的特徴を有するアンホテリシンＢ及びニスタチンの化学構造を示している。ニスタチンは、環の共役部分がジエンとテトラエンに分割されている点でアンホテリシンＢと構造的に異なる。

第２図は、ニスタチンの高速液体クロマトグラフを示している（レダール（Ｌｅｄｅｒｌｅ））　ｅ　１０分の位置のピークは３ｐｇのニスタチンに相当する。

第３図はヒトＲＢＣに対するＭｕＮｙｓとＬ−Ｎｙｓのインビトロ毒性を示している。ヒ）ＲＢＣを３７℃で４５分間、遊離Ｎｙｓ（◇）　、Ｌ−Ｎｙｓ　（・）、空リポソーム（０）又は空すポソーム＋遊ｆｉＮｙｓ（◎）とインキュベーシヨンした。

第４図はインビボにおける遊離ＮｙｓとＬ−Ｎｙｓの急性毒性を示している。マウスに遊離Ｎｙｓ　（０）　、Ｌ−Ｎｙｓ　（・）、５％Ｄ耶Ｏ（△）又は空リポソーム（★）を静脈注射した。全脂質投与量は４００　ｍｇ／ｋｇ／マウスであった。

第５図はマウスにおける遊離Ｎｙｓの抗真菌性活性を示している。

Ｃ，アルビカンス（ａｌｂｉｃａｎｓ）感染２日後、薬剤なしく・）又は遊離Ｎｙｓ投与量ＩＢ／ｋｇ（△）　、２ｍｇ／ｋｇ　（ロ）　、４＋ａｇ／ｋｇ　（ ○）の静脈注射をマウスに行った。

第６図はマウスの単一投与処理におけるＮｙｓ抗真菌性活性に関するリポソーム化効果を示している。

Ｃ，アルビカンス（ａｌｂｉｃａｎｓ）感染２日後、その動物を薬剤なしく・）、遊離Ｎｙｓ、４ｍｇ／ｋｇ　（０）又はＬ−ＮｙＳ、２ｍｇ／ｋｇ（）　、４ｍｇ／ｋｇ　（△）　、８ｍｇ／ｋｇ　（ロ）及び１２ｍｇ／ｋｇ　（■）で処理した。

第７図はＣ，アルビカンス（ａｌｂｉｃａｎｓ）感染マウスの生存率に関する多重投与処理のＬ−Ｎｙｓの効果を示している。この動物を薬剤なしく・）、遊離Ｎｙｓ　４　ｍｇ／ｋｇ、　５回（０）又はＬ−Ｎｙｓ単一投与１２ｍｇ／ｋｇ　（○）　、１６ｍｇ／ｋｇ　（）及びＬ−Ｎｙｓ多重投与２．４ｍｇ／ｋｇ５回（◇）、６釦ｇ／ｋｇ、５回（ム）　、　８ｍｇ／ｋｇ、５回（凹）　、１２ｍｇ／ｋｇ、　５回（■）、１６−ｇ／ｋｇ、　５回（−−△）で処理した。

伝染性菌類感染の治療用の、リポソームカプセル化ニスタチン（Ｎｙｓ）の使用は、特に全身性又は伝染性菌Ｒ感染の治療に有効な新しい有効治療法としてここに報告されている。リポソームカプセル化ニスタチン（Ｌ−Ｎｙｓ）は低い全身性毒性を存し、かつ遊１ｌｉＮｙｓに比べて高い治療効果を有している。

遊離Ｎｙｓはインビトロにおいて抗真菌活性を有しているが、静脈注射した場合に毒性があり、かつ効果がない、Ｌ−Ｎｙｓについては低いインビボ毒性が観測される一方、抗真菌性は維持されていた。これらの結果は、リポソームアンホテリシンＢに関する以前の観測と類似していた。インビボにおいてＬ−Ｎｙｓは遊ｆｉＮｙｓ（Ｍ　Ｔ　Ｄ　＝　４　ｍｇ／ｋｇ）の４分の１の毒性を有することが分り（平均毒物投与量（ＭＴＤ）＝１６Ｂ／ｋｇ）　、かつ多重投与したときでさえ（８０ｍｇ／ｋｇまでの積算投与量）非毒性であった。４ｍｇ／に、のＬ −Ｎｙｓは、インビボで治療効果を示さない等投与量の遊離Ｎｙｓに比較してマウス生存率を増加する効果がある。さらにより多い投与量のＬ−Ｎｙｓを多重投与様式で投与すると、生存時間の増加が到達される。

リポソームは既知活性薬剤の治療指標を修正するのによく用いられてきた。殆んどのカプセル化薬剤を用いた観察によると、治療的指標の改善はカプセル化後遊離薬剤の毒性の減少に関している。一方ニスタチンは経口的に活性であることが示されてきたが、その疎水的性質が非経口的投与を排除している。全身的抗真菌性物質としての遊１！Ｎｙｓに見られる無効性は、作用部位への薬剤の不適当な配給によるのかもしれない、リポソームへのトラップ化はＮｙｓの全身的投与、並びに抗真菌性薬剤としての使用を可能にする０本発明はリポソームが感染部位へのアンホテリシンＢの配給を増加し、従って全身性菌類と薬剤−薬剤キャリヤとの相互作用を増加させることを示した（ロペスーベレスタイン（Ｌｏｐｅｚ− Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ）等、キャンサー・ドラッグ・デリバリ−（ＣａｎｃｅｒＤｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ）、上、１９９−２０５　（１９８６））。

本発明の最も重要な特徴は、リン脂質、場合によってはコレステロールなどの脂肪物質及びニスクチンを含むリポソーム、これ　・らリポソームの調製法及びその使用に関する０本発明のリポソームは、好ましいＮｙｓ／ｐ１重量比約０．０１／１０から約０．７　／　１０、より好ましい範囲約０．０２／１０から約０．０８／１０のニスタチン及びリン脂質を含んでいる＊Ｎｙｓはリン脂質ラメラの一部、カプセル化リポソーム内液の一部又はその両方として存在し得る。

これらのリポソームの好ましいリン脂質にはホスファチジルグリセリン、ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、ホスファチジル酸又はホスファチジルセリンが含まれ、より好ましいリン脂質はホスファチジルグリセリン、ホスファチジルコリン又はそれらの組合せ物である。最も好ましいホスファチジルグリセリンは、基本的にシミリストイルホスファチジルグリセロールからなるものであり、また最も好ましいホスファチジルコリンは基本的にシミリストイルホスファチジルコリンからなるものである０本発明のリポソームがシミリストイルホスファチジルグリセリン及びシミリストイルホスファチジルコリンを含む場合、それらは約１−１０から１０−１の、より好ましくは約３から７の比であることが望ましい。

本発明のリポソームは多重ラメラ、車−ラメラ又は不定形ラメラ構造のものである０本発明のリポソーム及び医薬的に許容し得るキャリヤーまたは希釈剤を含む医薬組成物は局所的又は全身釣菌！！感染に関する病状の治療に用いられる。

このようなリポソームは、非経口的、局部的又は経口的に投与され、また全身性又は伝染性菌類感染には非経口的投与が望ましい、一般にＬ−Ｎｙｓの非経口的投与量は、殆んどの状態で適当と考えられている、約１　ｗｇ　Ｎｙｓ／ｋｇ一体重から約２０ｓｇ　Ｎｙｓ／ｋｇ一体重の範囲の殺菌効果量が採用される。最も好ましい投与量範囲は約２．５　ｍｇ／ｋｇから約６ｍｇ／ｋｇである。もし感染した人を治療する場合、患者の症状、菌類感染のタイプ及び程度及び担当医師の診断に応じた各々のケースにより投与量は変化し得る。

、本発明の重要な点は菌類感染した宿主動物の治療法を含んでいる。この方法には、宿主に、リン脂質及び菌類阻害効果量のニスタチンを含む、ある量の本発明のリポソームを投与することが含まれる。投与法は非経口的であることが好ましく、静脈、動脈、筋肉、リンパ腺、腹膜、皮下、胸膜又は脂膜注射又は局部的塗布又は経口投与により行なわれ得る。これらの投与は、例えば２週間にわたり毎日２回など、タイムスケジュールに従って反復されることが望ましい、この治療はその菌類が排除されるまで維持され、また他の型の抗真菌治療又は補助治療と組合せて採用される。

このような非経口的投与物には、無菌等張水溶液などの医薬的に許容し得る溶液中のＬ−Ｎｙｓサスペンジッンが含まれる。これらのサスペンシヨンは全体的に調合することもできるし、また予め調製した成分から調合することもできる。当業者には知られているように、Ｌ−Ｎｙｓを調製し、医薬的に許容し得る溶液と混合して、非経口投与用のサスペンシヨンを生成し得る。

Ｌ−Ｎｙｓの局部的投与物にはサスペンション、クリーム又は軟膏など、全体的に調合されるか、ベレフトなどのＬ−Ｎｙｓ前駆体から調合しうる医薬組成物が含まれる。このような局部的投与は、例えば上皮又は粘膜など局所的菌類感染部位付近に行なわれる。

Ｎｙｓは局部的に使用しても、Ｌ−Ｎｙｓは菌類増殖をより効果的に阻害するはずである。

Ｌ−Ｎｙｓの経口投与はＬ−Ｎｙｓのカプセル化を含み、それによりカプセルからの放出以前に胃及び腸の消化活性からＬ−Ｎｙｓを保護することが望ましい。

後に例で述べるＬ−Ｎｙｓの調製法及び化蛍療法は、適当な脂質又は方法の単純な置換により、同様のリポソームの生産及びその使用法に容易に適当し得る。

ここに述べるＮｙｓ含有リポソームは天然又は合成リン脂質を含む種々の両親媒性物質から調製し得る。リポソームを住成し得ないリン脂質は多数あり、また− 船に当分野ではよく知られているのでここでは全てをリストしない、これらのリン月旨質には、これだけではないが、次のようなものが含まれる；　レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リソレクチン、リソファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、カルシオリビン、ホスファチジル酸及びセレブロシド類０本発明の特徴の態様に最も適したリン脂質には、シミリストイルホスファチジルグリセリン（ＤＭＰＧ）及びシミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）が含まれる。

１％以下から約５０％の範囲のコレステロール等のステロールをリン脂質及びニスタチンと共に含む、本発明のリポソームを生成し得る。ＤＭＰＧ及びＤＭＰＣの組合せの比は１：１０及び１０：１の間の範囲が満足とされると考えられているが、これに限定される訳ではないが約３〜７の比が好ましいことが分った。

本発明の態様においては、車−ラメラ又は多重ラメラ又はその質的に水に不溶性であるので、多重ラメラリポソームが好ましい。

Ｎｙｓはそのリポソームラメラのリン脂質二重層内に取込まれているようだ。

また本発明のリポソームカプセル化ニスタチンはＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶと命名されるヒトＴリンパ球指向レトロウィルスによる病気の予防及び、又は治療に有効であることが分った。ガロ（Ｇａｌｌｏ）が最近指摘したように、インビボにおいてＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶは単球及びマクロファージにより運搬され得る（サイエンナイフ４ツクアメリカン（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　）　、１９８７年１月、４７−５６．５１頁参照）、従ってこれらの細胞は潜在的感染性及び致命的な）ＩＴＬＶ−Ｉ［１／ＬＡＶのリザーバーの役割を果す。

最近報告された研究中の中で、シャフナ−（Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ　）等（バイオケミカルファーマコロジー（Ｂｉｏｃｈｅｓ、　Ｐｈａｒｍａｃｏ＋、　）、主５，４１１０−４１１３　（１９８６））は単球関連細胞系列Ｈ９におけるＨＴＬＶ−ｍ／ＬＡＶの複製は、いくつかの抗真菌性ポリエンマクロリドにより阻害されるというデータを示した。これらのポリエンマクロリドにはアンホテリシンＢ及びアンホテリシンＢのアスコルビン酸メチルエステルが含まれる。

単球、マクロファージ及び多形核白白球などの血渣食細胞は免疫応答以前にさえ、異物と特徴的に結合し、かつこれを摂取する。

またこれらの食細胞は循環リポソームを取り込む最初の細胞の１つである０例えば、動物へのニスタチンなどのポリエンマクロリドを含むリポソームの非経口投与は、細胞内ＨＴ　Ｌ　Ｖ　−ｍ　／ＬＡＶの増殖を阻害するのに有効であると思われる。リポソーム依存のニスタチン生活性の増加はＨＴＬＶ−Ｅｌ／ＬＡＶ感染による病気のコントロールに重要である。

以下の例は本発明の好ましいａ様及び使用法を説明するものであり請求の範囲に述べていない限り本発明を制限するものではない。例えば、シミリストイルホスファチジルコリン及びシミリストイルホスファチジルコリンがリポソームを形成するのに用いられているが、これら特定の脂質が当分野で知られている唯一の使用可能な脂質であるということでは決してない、またこれらの例の中で用いているリポソームの特定の生成法及びリポソームタイプが唯一の使用可能な方法又はリポソームタイプを表わしている訳ではない。

例１（薬剤、脂質及び試薬）ニスタチン（粉末）はレダールラボラトリース社（パールリバー、Ｎ、Ｙ、）から入手した。クロマトグラフ的に純粋なシミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）及びシミリストイルホスファチジルグリセリン（ＤＭＰＧ）はアバンチポーラーリビフズ社（バーミンガム、Ａｈａ州）から購入した。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰ　Ｌ　Ｃ）用メタノール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳ ○）、及びＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦＡ）はフィッシャーサイエンティフィンク社（フェアローン、Ｎ、　Ｊ。

州）から購入した。ヒ）ＡＢ血清はＭＡバイオププロクツ社（ウォーカーズビル、Ｍｄ州）から入手し、ヒトＲＢＣは正常なボラ′ンティアから入手した。

例２にスフチンの特徴）Ｎｙｓの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰ　Ｌ　Ｃ）はＵ６にユニバーサルＬＣインジェクター、ウォーターズ自動グラジェントコントローラー及びプログラマ−、モデル４４１波長固定吸収デイテクター及びヒューストンインスツルメント社オムニスタライブレコーダーを使用したウォーターＭ６０００Ａ及びＭ４５溶媒配給システムからなるシステムで行った０分析にはウォーターズμｍボンダバク（Ｂｏｎｄａｐａｋ）　Ｃ−１８逆相カラム（０，４５ｍＸ３０ｃｓ）を用いた。移動相はｚ１１１／ｌ１ｉｎの流速でメタノール：水（７０：３０）を用い、溶出液は２８０ｎｍの吸光度（０，０２ＡＵＰＳ）をモニターした。純度は、各クロマトグラムにおいて全ピーク面積でＮｙｓ相当ピーク面積を割った割合として計算した。

ニスクチン（レダール（Ｌｅｄｅｒｌｅ　）はメタノール（ｌｘ／ＬＯ１ＤＭＦＡ　（１５■／　ｍ　１　）及びＤＭＳ○（４０■／ＩＩＩりに可溶性である。

ＮｙｓのＨＰＬＣ分析の典型クロマトグラフを第２図に示す、この薬剤の至適分離は移動相として７０％メタノール（Ｖ／Ｖ）及びその他の指定された条件を用いて達成された。Ｎｙｓの保持時間は１０分であり、またその純度は７２％であると計算された。

例３（リポソームの調製及び標準化）多重ラメラ小胞（ＭＬＶ）は先に報告されてるいように調製した（ロペスーベレスタイン（Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ　）等、ジャーナル・オン・インフェクシャス・ディシーズ（Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、）　、１２０．２７Ｂ−２８３（１９８４））、ニスタチンはメタノールに？容かしく１＊／　５ｆｆｉ）　、４℃、暗所に保存した。一定量のリン脂質、ＤＭＰＣ：　ＤＭＰＧ　（７：　３）を種々の量の薬剤と混合し、ついでその溶媒をロータリーエバポレーターを用い減圧下でエバポレーターした。乾燥脂質−薬剤フィルムをリン酸緩衝液（Ｐ　Ｂ　Ｓ）に懸濁し、振盪することによりそのフィルムをリポソーム化した。

その後このサスペンションをフラスコから回収し、２０，０００ｙｐｓで１時間遠心した。このベレツトをＰＢＳに再懸濁し、リポソーム中に含まれているＮｙｓを３０６ｎｍの唆収で測定した。同様に９：　１の比のリン脂質及びステロールを含むリポソームも調製したａ　Ｎｙｓリポソームの安定性はＰＢＳ及びヒトＡＢ血清と等量のＬ−Ｎｙｓを３７℃でインキュベートすることにより評価した。

指示した時間間隔でサンプルを取り出し、１０，０００Ｘｇで１５分間遠心しペレット中のＮｙｓ濃度を測定した。

例４（リポソーム中のニスタチンカプセル化効率）固定量のリン脂質及び種々の量のＮｙｓで調製したバッチ毎のリポソームのカプセル化効率を第３表に示す、最高の取込み量は６００μｇＮｙｓ／１０＋ｑｒリン脂質（薬剤／リン脂質比−１：　１６．７）のとき得られ、以後減少した。

第３表リポソーム中のニスタチンカプセル化効率１０　　　　１：１０００　　　　　１０　　　　　　　１００２０　　　　１：５００　　　　　２０　　　　　　　１００４０　　　　１：２５０　　　　　４０　　　　　　　１００６０　　　　１：１６７　　　　　６０　　　　　　　１００８０　　　　１：１２５　　　　　　ｓｏ　　　　　　　　１００１００　　　　１：１００　　　　　９５　　　　　　　９５２００　　　　１：５０　　　　　１８０　　　　　　　９０４００　　　　１：２５　　　　　４００　　　　　　　１００６００　　　　１　：１６．７　　　　６００　　　　　　　１００８００　　　　１　：　１２．５　　　　６４０　　　　　　　８０１０００　　　　１　：１０　　　　　６２８　　　　　　　６２．８ａ、　リポソームは、モル比７：３のジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）及びシミリストイルホスファチジルグリセリン（ＤＭＰＧ）を含む多重ミセル小胞（ＭＬＶ）である。

ｂ、　　ｐｉはＤＭＰＣ及びＤＭＰＧ両方を含む全リン脂質である。

Ｃ１添加した全薬剤に対するＭＬＶ　（ベレフト）内にカプセル化された薬剤の割合、ニスタチン含量はメタノールに溶かした部分標本の３０６ｎｍにおける吸収で測定した。

例５（リポソーム含有二スタチン（Ｌ−Ｎｙｓ）の安定性）例４で述べたように５００μｇニスタチン／１０■リン脂質を含むリポソームを調製し、等部分標本に分割した後ＰＢＳ又はヒ）ＡＢ血清と種々の時間インキュベーションした。各時間のインキュベーション後遠心ペレット中に回収された薬剤の量を第４表に示す、リポソームはＰＢＳ中では７２時間まで安定であり、また血清中では２４時間まで安定であったが、７２時時間インキュベーション後ベレット中に回収された薬剤はわずか３０％であワた。

第４表３７℃におけるニスタチンリポソームの安定性１　　　　　　　　　１００　’ 　　　　　　　１００１６８　　　　　　　　　５Ｏ−７０ａ、　この値は０時間の同サンプルを１００％コントロールとして比較したサンプル中に回収されたニスタチンのパーセンテージ。

ｂ、　　ＰＢＳはリン酸緩衝液Ｃ１使用した血清はヒ）ＡＢ血清。

例６（インビトロにおける菌類阻害）インビトロにおける生物、培養、及び抗真菌性の検定。サボラウドテキストロース寒天（ＳＤＡ）プレート上、３７℃で一晩イーストを増殖した。胞子採取前３〜１０日間、ＳＤＡ上、３０℃で全カビを増殖した。その後この接種物を先に述べたように感受性テスト用に処理した（ホブファー（ｌｏｐｆｅｒ）等、アンチマイクロ−ビアＪレエージェントケモセラビ−（八ｎｔｉｍｉｃｒｏｂ、　ＡｇｅｎｔｓＣｈｅｍｏｔｈｅｒａｐ、）　、２５．３８７−３８９　（１９８４）＞、マイクロプレートを使用した連続２倍希釈法（シャドミー（Ｓｈａｄｏｍｙ　）等、Ｅ、Ｈ，レネト（Ｌｅｎｎｅｔｔｅ）等線、マニニアルオンクリニカルマイクロバイオロジ−（Ｍａｎｕａｌ　ｏｒ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　）第３編、アメリカンソサイアティー・オン・マイクロバイオロジー（八ｍｅｒｉｃａｎ　５ｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　）　、ワシントンＤ、Ｃ１，６４７−６５３＜１９８０）をその薬剤の最小阻害濃度（ＭＩＣ＞の測定に使用した。Ｌ−ＮｙｓのＭＩＣを遊離ＮｙｓのＭＩＣと比較した。空リポソーム及び５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）をコントロールとして使用した。

Ｃ，アルビカンス（ａｌｂｉｃａｎｓ）　３３．６株に対する遊離及びＬ−ＮｙｓのＭＩＣを第５表に示した。Ｎｙｓをステロール有無条件のリポソームにトラップした後に抗真菌性は維持されていた。薬剤サンプルに使用したものと同じ濃度の空リポソーム及びＤＭＳＯは増殖を阻害しなかった。

第５表インビトロにおける遊離及びリポソームニスタチンの抗真菌性薬　　剤　　　　　　　最小阻害濃度１（μｇ／−）遊離二スタチン１１．０リポソームニスタチンＰＬｃ１．　ＯＤＭＳＯ＝　Ｎｉｌ空リポす−ム’　　　　　　　　　　　　　　Ｎｉ１ａ、　最小阻害濃度はカンタイダアルビカンス（Ｃａｎｄ　１ｄａａｌｂｉｃａｎｓ）　３３６株に対して測定した。

ｂ、　遊離ニスタチンをＤＭＳＯに溶解し、さらに食塩水で希釈して、５％ＤＭＳＯ中１■／Ｗ１１！１度となるようにした。

Ｃ０リン脂質（ＤＭＰＣ：　ＤＭＰＧ、７　：　３）のみをリポソームｉ　　の調製に用いた。

ｄ、　リポソームは９：１の比でリン脂質及びエルゴステロールを含む。

ｅ、　リポソームは９：１の比でリン脂質及びコレステロールを含む。

ｆ、　等投与量のＤＭＳＯ及び空リポソームを、遊離又はリポソームニスタチンと同様に希釈した。

菓６表に示されているように、遊離ニスタチンと比較して、リポソームニスタチン（Ｌ−Ｎｙｓ）の最小阻害濃度（ＭＩＣ）は通常有意に低い。驚くべきことにＬ−Ｎｙｓは広範囲の菌類に対する抗真菌性毒として有効である。Ｌ−Ｎｙｓを調製し、一般に種々新しい菌類を用いた以外は本例又は先の例で述べたのと同様にテストした。対照的に遊離アンホテリシンＢ及びリポソームカプセル化アンホテリシンＢに関する先の同様の結果は、菌類に対するほぼ同じ毒性を示すか、もしくはカプセル化がアンホテリシンの毒性を減少したことを示した。（ホプフ７　　（Ｈｏｐｆｅｒ）等、アンチバクチリアルエイジ°エントアンドケモセラピー（ＡｎＬｉｂａｃｔｅｒｉａｌＡｇｅｎｔｓ　ａｎｄ　ＣｈｅｍｏｔｈｅｒａｐＹ　）　２５　、３．３８７−３８９　（１９８４））。

第６表インヒドロにおける遊離及びリポソームニスタテンの抗真菌性スペクトルカンタイダアルビカンスカンタイダトロピカリス客４　　　　　　　　　　４　　　　　　　　　　２カンタイダパラトロとカリストルロブシスプロブラタクリプトコン力スネオホルマンスアスペｌレギラスノントフミガタスアスペルギラスフミガタス　８８カルプラリア　　　　　　　２０．５７スペルギラスニガー　　　４２７スペルギラスフラバス　　１０，５フサリウム　　　　　　　　６２．５　　　　　　　　　６２．５アルテルナリア　　　　　　　２１アレシエリア　　　　　　　１６１６例７（インビトロにおけるヒトＲＢＣに対する遊ｆ４Ｎｙｓ及びＬ−Ｎｙｓの毒性）先に報告されているように（メタ（Ｍｅｈｔａ　）等、バイオケム、バイオフィズ、アクタ（Ｂｉｏｃｈｅｓ、　Ｂｉｏｐｌｙｓ、　Ａｃｔａ）　、７７０．２３０−２３４　（１９，８４））　、ヒト赤血球（ＲＢＣ）の溶解は、上清中へのヘモグロビンの放出を５５０ｎｍの測定で定量した０種々の量のＬ−Ｎｙｓを洗浄した新鮮なヒトＲＢＣと３７℃で４５分間インキュベートした。ジメチルホルムアミド（ＤＭＦＡ）に溶解した遊離Ｎｙｓを最終溶媒濃度が３％となるよう検定物に添加した。適当な溶媒コントロール、空リポソーム及び空すポソーム＋Ｍ離薬剤も各実験に含めた。水を用いた同数のヒ）ＲＢＣの低張溶解によるヘモグロビンの放出を１００％ポジティブコントロールとして測定し、一方ＰＢＳで処理した細胞をネガティブコントロールとして測定した。

６０から１２０μｇ　／　ｒａ　Ａの範囲の遊ＭＮｙｓについて、ヒトＲＢＣの溶解に線型的増加が観測され、１２０μｇ　／　ｍ　１で１００％溶解が見られた（第３図）、一方、Ｌ−Ｎｙｓは５００μｇ　／　ｍ　ｊ！まで溶解を起こさなかった。空リポソーム単独ではヒトＲＢＣには影響を与えず、またそれらはいくぶんａ　ＨＮｙｓの効果を防いだ。

空リポソームとともに遊離Ｎｙｓ３７５μｇ／ｍＡを用いるとわずか１５％の溶解であり一方、空リポソームの存在下５００μｇ／ｍＡの遊＃Ｎｙｓでは３０％の溶解が観測された。遊離Ｎｙｓに使用したものと等濃度のジメチルホルムアミドはヒトＲＢＣに影響しくインビボにおけるＮｙｓ及びＬ−Ｎｙｓの毒性）各々８匹のホールーストナーマウス（週令６〜８、体重２０〜２５ｇ、ユニバージティー・オプ・テキサスサイエンスパーク（Ｕｎｉｖ、　ｏｆ　ＴＸ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｐａｒｋ）　、バスト０７ブ、ＴＸ州）のグループに種々の投与量の遊＠ＮｙｓＣ食塩水で希釈した５％ＤＭＳＯ中）、Ｌ−Ｎｙｓ、空リポソーム又はコントロールとしての５％ＤＭＳＯを注射した。急性、亜急性及び慢性毒性についてマウスを観察し、各グループ中の各動物の生存時間を記録した。４５日後、生存する動物を殺し、血液及び組織サンプルを得た。血液の生化学試験には血中尿素窒素、アルカリホスファターゼ及び乳酸デヒドロゲナーゼが含まれる。器官（肝臓、肺臓、肺及び腎臓）を採取し１０％ホルマリン中に保存した０組織断片はへマドキシリン−エオシン染色及びゴメリメテンアミン銀染色の処理を行った。

遊離Ｎｙｓの最大許容投与量（ＭＴＤ）は４■／ｋｇ（体重）であり、４．４■ ／ｋｇの投与で全ての動物は直ちに死亡した（第４図、遊１ＩＩＮｙｓ−（）　、Ｌ−Ｎｙｓ＝　（）　、一方、リポソーム−Ｎｙｓは１６■−スタチン／ｋｇ（体重）の最大許容投与量を示した。

遊離Ｎｙｓの最高投与量に等しいＤＭＳＯ及び空リポソーム（４００■／驕）は毒性効果を示さず、かつ実験が終了するまでその動物は生存した（すなわち４５日間）、生存動物には亜急性又は慢性毒性反応は見られなかった。血液の生化学的パターンにも有意な変化は見られなかった。＆ｌｌ織病理学的研究ではこれら動物の死因を示すことができなかった。

例５（カンタイダアルビカンスによる伝染性菌１ｇ染に対する遊離Ｎｙｓ単一投与による治療）週令６〜８才のホールーストナーマウス（体重２０〜２５ｇ）をユニバーシティーオンテキサスサイエンスポーク（ｌｌｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆ　Ｔｅｘａｓ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｐａｒｋ　）　　（バスト０７ブ、ＴＸ州）から購入した。そのマウス（グループ当り８匹）に尾の静脈を介して、７×１ＯＳコロニ一形成単位（ｃｆｕ　）を含む０．２ｍ７！のＣ，アルビカンス細胞サスペンションを注射した。

この細胞濃度は４８時間後に伝染性感染を起こし、主に肝臓、肺臓、肺及び腎臓に影響するン；度である。感染マウスを１■〜４■／ｋｇ　（体重）の範囲の遊離Ｎｙｓで処理した（第５図）、これらの投与は、未処理コントロールグループと比べて感染マウスの生存率を改善しなかった。５パ一セントＤＭＳＯはマウスの生存率に影響しなかった。

例１０（カンタイダアルビカンスによる伝染性菌類感染に対する遊離Ｎｙｓ又はＬ−Ｎｙｓの羊−投与による治療）例９で述べたようにＣ，アルビカンスをマウスに感染させた。

Ｃ，アルビカンス（ａｌｂｉｅａｎｓ）注入２日後、各８匹のマウスグループに種々の投与量の遊離Ｎｙｓ、　Ｌ　−Ｎｙｓ、空リポソーム又は５％ＤＭＳＯを注射した。各グループ中の動物の生存率を記録し、未処理コントロールグループと比較した。

マウスグループを種々の投与量のＬ−Ｎｙｓ（範囲２〜１２■／躊）、遊離Ｎｙｓ（１−４■／ｋｇ）　、空リポソーム（４００■脂質／−）で処理した（第６図）。空リポソームはマウスの生存率に影響を与えなかった。Ｍ離Ｎｙｓと比較して、２■／ｋｇＬ−Ｎｙｓはマウス生存率の差は見られなかったが、４■／ｋｇ及び８■／　ｋｇの投与量は生存率の改善を示した（Ｐ各々０．０１１Ｊ下及び０．０２以下）。

さらに１２■／−の投与は遊離ＮｙｓのＭＴＤと比較した時、生存率に有意な改善を示した（Ｐｏ、００３以下）、シかし、全てのマウスは処理と無関係に１８日以内に死亡した。

例１１（Ｃ，アルビカンス（ａｌｂｉｃａｎｓ）による伝染性菌類感染に対スルＮｙｓ又はＬ−Ｎｙｓの多重投与による治療）Ｃ，アルビカンス（ａｌｂｉｃａｎｓ）の静脈注射から２日後（例９及び１０で述べたように）、そのマウスを種々の投与量の遊離Ｎｙｓ、Ｌ　−Ｎ　ｙ　ｓ　ｓ空すポソームまたは５％ＤＭＳＯコントロールで連続する５日間処理した。また多重投与グループを適当に増加する単一投与グループと比較した（例１０参照）、その後、この動物について、５日投与処理の場合の生存率又は毒性を観察した。

これらの実験は６０日間で終了し、生存する動物を殺して血液及び組織サンプルを採取した。

生存曲線をカブラン（Ｍａｐｌａｎ）及びメイアー（１’１ｅｉｅｒ　）　　（ジャーナル・オン・アメリカン・スタテイスカル・アソシエート（Ｊ。

＾ｍｅｒ、　５ｔａｔ、　Ａｓ５ｏｃ、）　　５３．４５７−４６２　　＜１９５３）＞の方法で計算し、また生存分布の差のテストは一般つイルコクソン（Ｗｉ　１ｃｏｘｏｎ）テスト（ゲハン（ｇｅｈａｎ　）バイオメトリカ（Ｂｉｏｍｅｔｒｉａ　）　％　５２−１２０３−２２３　　（１９６５））に基づいている。グループ間の応答速度の差に対する線型性及びＸｔテスト及びペアー上ｔ− テストを平均値の比較に用いた。

マウスのグループに連続する５日間、指示した投与量の遊離Ｎｙｓ　（ＭＴＤ）及びＬ−Ｎｙｓを注射した。これら多重投与を、隼−投与の遊離−又はＬ−ＮｙｓのＭＴＤと比較した。またこの実験には未処理コントロール同様、連続する５日間の注射による毎日等投与量の空リポソーム又は５％ＤＭＳＯを投与した動物のグループが含まれる（第７図）、遊ＪｉｉｌＮｙｓの単−又は多重投与処理した全てのグループの動物は、未処理コントロールと同様にすみやかに死亡した。

一方、Ｌ−Ｎｙｓはマウス生存率を有意に改善した。

１回又は公開投与（２，４■×５）で与えられた１２ｗ／ｋｇの投与は同じパターンの生存率を示した。すなわち、遊離薬剤で処理したグループよりも存意な改善が観測された（Ｐｏ、００３以下）。

５回与えられた場合、１２■／眩投与（全投与量６０■／瞳）は生存率の著しく増加させ（Ｐｏ、００７以下）、Ｌ−Ｎｙｓの単−投与及び単−又は多重投与の遊離Ｎｙｓの処理の場合の各々１８日間及び１０日間の存在時間に比べて、この条件では６０日間で７％の生存率を示した。中程度の連続投与（６■ＮｙｓＸ５）も、生存率を著しく改善した（ＰＯ，ＯＯ１以下）９．生存時間の増加はリポソーム薬剤の全投与量に比例した。またマウスは５日間の１６■／ｋｇ（体重）の投与に耐え得るが、（計８０■Ｎｙｓ／ｋｉｒ）　、それは低速度で与えられた時のみである。この投与ではこの実験を終えた６０日間でマウスの１００％生存を示した。

以下の請求Ｑ範囲で定義した本発明の概念及び範囲を逸脱することなしに、ここで述べた要素及び方法又はここで述べた方法のステップ又はこのステップの配列を変化し得る。

浄書（内容に変更なし）吸光度［２８０ｍｍ）濃［（Ｒｉｅ２）　　　　ｆＰｇ／ｍｌｌ投与ｔ／マウＸ　　ｆｍｇ／ｋｇｌ日　　　数＃　　互　　宏手続補正書（方式）％式％２、発明の名称　　　リポソーム含有二スタチン４、代理人５ｏ補正命令の日付　　自　　　発７、補正の内容　　　　別紙のとおり国際調査報告Ｏ−□嘲、ｈか１１ｈａＩ１．ｕｂ、やｕｓ、？Ｃ？／ＵＳεε１００ε二２１Ｃ０７Ｈ１７１０８Ｋ　　　　７８２２−４Ｃ裁明者　メータ　リーク　　　　アメ１゜レー二０発　明　者　　ホッパー　ロイ　エル　　　　　　アメ１゜０発　明　者　　ジュリアーノ　ルドルフ　エル　　アメ１゜ラドｊカ合衆国　テキサス州　７７０２５　　ヒユーストン　イローナ１ｌ−８７１１ｊカ合衆国　テキサス州　７７０９６　　ヒユーストン　メイプル　５１力合衆国　テキサス州　７７０９１　　ヒユーストン　ジャックウ

Claims

【特許請求の範囲】（１）ニスタチン及び脂質を含有する、動物の播種性菌類感染の治療用リボソーム薬剤。（２）脂質がリン脂質である請求の範囲（１）記載のリボソーム薬剤。（３）脂質がホスホモノグリセリド、ホスファチジル酸及びスフィンゴ脂質のうちの１又はそれ以上からなる請求の範囲（１）記載のリボソーム薬剤。（４）脂質がホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセリン、スフィンゴミエリン及びホスファチジル酸のうちの１又はそれ以上からなる請求の範囲（１）記載のリボソーム薬剤。（５）脂質がジミリストイルホスファチジルコリン、シミリストイルホスファジルグリセリン、ホスファチジルコリン及びホスファチジルグリセリンのうちの１又はそれ以上からなる請求の範囲（１）記載のリボソーム薬剤。（６）脂質が本質的にジミリストイルホスファチジルコリン及びジミリストイルホスファチジルグリセリンからなる請求の範囲（１）記載のリボソーム薬剤。（７）さらに、本質的に約１対１０から約１０対１の比率でジミリストイルホスファチジルコリン及びジミリストイルホスファチジルグリセリンを含む請求の範囲（６）記載のリボソーム薬剤。（８）脂質が本質的に約７対３の比のジミリストイルホスファチジルコリン及びジミリストイルホスファチジルグリセリンからなる請求の範囲（１）記載のリボソーム薬剤。（９）請求の範囲（１）記載のリボソーム薬剤で、さらに安定な多重ラメラ小胞であるリボソーム薬剤。（１０）さらにステロールを含む請求の範囲（１）記載のリボソーム薬剤。（１１）ステロールがコレステロールである請求の範囲（１０）記載のリボソーム薬剤。（１２）動物にニスタチン及び脂質を含む殺菌効果量のリボソームを投与することを含む動物の播種性菌類感染の治療法。（１３）脂質がリン脂質である請求の範囲（１２）記載の方法。（１４）脂質がホスホモノグリセリド、ホスファチジル酸及びスフィンゴ脂質のうちの１又はそれ以上からなる請求の範囲（１２）記載の方法。（１５）脂質がホスホモノグリセリド、ホスファチジル酸及びスフィンゴ脂質のうちの１又はそれ以上からなる請求の範囲（１２）記載の方法。（１６）脂質がホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセリン、スフィンゴミエリン及びホスファチジル酸のうちの１又はそれ以上である請求の範囲（１２）記載の方法。（１７）脂質がジミリストイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルグリセリン、ホスファチジルコリン及びホスファチジルグリセリンのうちの１つ以上からなる請求の範囲（１２）記載の方法。（１８）投与法が経口的、局部的又は非経口的である請求の範囲（１２）記載の方法。（１９）投与注が非経口的である請求の範囲（１２）記載の方法。（２０）動物がヒトである請求の範囲（１２）記載の方法。（２１）殺菌効果量が約１ｍｇニスタチン／ｋｇ体重から約２０ｍｇニスタチン／ｋｇ体重の範囲にある請求の範囲（１２）記載の方法。（２２）殺菌効果量が約２．５ｍｇニスタチン／ｋｇ体重から約６ｍｇニスタチン／ｋｇ体重の範囲にある請求の範囲（１８）記載の方法。（２３）脂質が本質的にジミリストイルホスファチジルコリン及びジミリストイルホスファチジルグリセリンからなる請求の範囲（１２）記載の方法。（２４）脂質が本質的に約７対３の比のジミリストイルホスファチジルコリン及びジミリストイルホスファチジルグリセリンからなる請求の範囲（１２）記載の方法。（２５）投与法が静脈、動脈、皮下、筋肉、リンパ腺、腹膜又は胸膜注射である請求の範囲（１２）記載の方法。（２６）リボソームが多重ラメラである請求の範囲（１２）記載の方法。（２７）脂質がリン脂質であり、かつニスタチン及びリン脂質が約０．０１／１０から約１．０／１０の範囲の重量比をもつ請求の範囲（１）記載のリボソーム薬剤又は請求の範囲（１２）記載の方法。（２８）重量比が約０．０２／１から約０．０８／１０の範囲にある請求の範囲（２６）記載のリボソーム薬剤又は方法。（２９）リボソーム内に組込まれたニスタチン及び医薬的に許容し得るキャリヤー又は希釈剤を含む医薬組成物。