JPH08503966A - 新規な抗真菌性組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ナタマイシンのようなポリエンタイプの抗真菌性化合物を含む改良した抗真菌性組成物の調製方法を提供し、該抗真菌性化合物が組成物に増大した活性を示す形態で、例えば溶液の形態及び／又は改質した多形形態で組み込まれる。

Description

【発明の詳細な説明】 新規な抗真菌性組成物 本発明はナタマイシン（natamycin）のようなタイプのポリエンの抗真菌性化 合物を含有する組成物の調製、及び食品又は農産物を処理するため、もしくは医 薬の目的のためのそのような組成物の使用に関する。発明の背景 ２０年以上の間、チーズ及びソーセージのカビの生育を阻害するためにナタマ イシンが用いられてきた（参考文献１−１２）。 チーズは、ナタマイシンの水の懸濁液に浸漬することによって、又はポリマー の含ナタマイシン水性エマルジョン、一般にポリ酢酸ビニルの水性エマルジョン でコートすることによって、処理する。ソーセージは、主にナタマイシンの水の 懸濁液に浸漬するか、又はスプレーコーティングすることによって処理する。浸 漬処理に用いるナタマイシンの水溶性懸濁液は、通常ナタマイシンを０．１〜０ ．２％w/v含んでいる一方、ナタマイシンを含むコーティングのためのポリマー エマルジョンではナタマイシン含量が０．０１〜０．０５％w/vである。 主に、これらの処理はカビによる腐敗を予防するのに大いに有効である。しか し、ナタマイシンの溶解度が低いので、ナタマイシンに対し比較的低い感受性を 有する真菌類による腐敗を完全に阻害できないため、いまだに腐敗が生じ得る。 本発明はカビに対するポリエン抗真菌性化合物、特にナタマイシンの活性を改 良するための方法、及びその方法によって調製される組成物に関する。特に、そ のような組成物は、ポリエンタイプの抗真菌性化合物の作用に対し通常比較的耐 性のある酵母及び真菌類を除去するのに有用である。発明の概要 予期し得ないことであったが、酵母及び真菌類に対するナタマイシンのような ポリエンタイプの抗真菌性化合物の活性が、次の方法のうちの１つによって著し く増加することができることを見出した。 （１）多形形態の改質 第１に、ポリエンタイプの化合物を溶媒に接触させることによって、その化合物 を溶媒化合物形態へと転化することができる。そのような溶媒化合物の例として ナタマイシンメタノール溶媒化合物が挙げられる。 第２に、溶媒化合物化溶媒分子を溶媒化合物の結晶格子から除去してもよい。 そのような化合物の例としてδ−ナタマイシンが挙げられ、その化合物はナタマ イシンメタノール溶媒化合物を五酸化リン上で減圧することによって得ることが できる。 第３に、結晶格子の『空』隙を他の溶媒分子、例えば『空』化合物をある溶媒 又はその蒸気に接触させることによって再充填してもよい。そのような化合物の 例として、次の溶媒によるナタマイシンの溶媒化合物が挙げられる。メタノール 、エタノール、ｎ−プロパノール、ｎ−ブタノール、メトキシ−エタノール、ジ クロロメタン、1,2-ジクロロエタン、ギ酸メチル、ギ酸エチル、アセトニトリル 、ホルムアミド、N,N-ジメチルホルムアミド、及びジメチルスルホキシドである 。 最後に、ポリエン抗真菌性化合物の新しい多形形態が、『空』結晶格子を有す る化合物を湿気のある条件にさらすことによって得ることができる。例えば、δ −ナタマイシンを７６％ＲＨにさらすと、新しい３水和物結晶態種が得られる。 この新しい化合物はγ−ナタマイシンと呼ぶが、オリジナルのα−ナタマイシン （これもナタマイシンの３水和物形態である（参考文献１４の520頁を参照）） の作用に通常比較的耐性のある種に対して増加した活性を有する。 （２）食品処理組成物又は医薬調剤に抗真菌性化合物を組み込む前に、該抗真 菌性化合物を適当な溶媒系に溶解する。 殺カビ剤を溶解する好適な溶媒系は低級アルコール、例えば１〜４個の炭素原 子を有する低級アルコール、氷酢酸、水性酸及びアルカリ溶液、並びに、これら の適当な混合物である。好適なアルコールの例として、メタノール、エタノール 、n-プロパノール、イソプロパノール、エチレングリコール、エトキシエタノー ル、プロピレングリコール、及びグリセロールが挙げられる。好適な酸溶液の例 として、塩酸、クエン酸、及び酢酸の水性溶液が挙げられる。好適な水性アルカ リ溶液の例として、アンモニア、アルカリ金属水酸化物、及びエタノールアミン の水 溶液が挙げられる。 （３）アルカリ土類金属塩の調製：例として、ナタマイシンのバリウム及びカ ルシウム塩が挙げられる。 （４）坦体への塗布。例として、ヒュームドシリカ上のナタマイシンが挙げら れ、これはナタマイシンのメタノール溶液をヒュームドシリカと混合し、減圧下 で溶媒を蒸発させて除去することによって調製することができる。実施例１で記 載する方法で測定すると、本発明による調剤及び組成物は非改質ポリエンと比較 して、抗真菌性化合物の高い解放プロファイル（release profile）によって特 徴づけられる。 ゆえに、本発明はポリエンタイプの抗真菌性化合物を含む抗真菌性組成物の調 製方法に関し、非改質抗真菌性化合物と比較して該抗真菌性化合物が増大した解 放プロファイルを示す改質形態で該抗真菌性化合物が組成物に組み込まれること に特徴を有する調製方法に関する。該抗真菌性化合物を改質形態で、例えば多形 形態に改質することによって、及び／又は、好適な溶液に該化合物を加えること によって、組み込むことができる。非改質形態とはメルクインデックス（'Merck Index'）（化学、薬剤、及び生物学又は製造がメルクインデックスに記載され る辞典）に記載される形態をいう。 本発明のある面によると、新規なナタマイシン形態及び／又は化合物を開示す る。この化合物は次の群から選ばれるのが好ましい。 窒素ガス及び／又は−３０℃で貯蔵することによって安定化したナタマイシン メタノール溶媒化合物；δ−ナタマイシン；γ−ナタマイシン；ナタマイシンの カルシウム塩；ナタマイシンのバリウム塩；次の溶媒とのナタマイシンの溶媒化 合物：エタノール、１-プロパノール、１-ブタノール、２-メトキシエタノール 、ギ酸メチル、ギ酸エチル、アセトン、ジクロロメタン、アセトニトリル、ジメ チルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、及びホルムアミド：及び坦体として のヒュームドシリカ上のナタマイシン。 これらの化合物はすべて非改質α−ナタマイシンと比較して、抗真菌性化合物 として改良された解放性を有する。 したがって、本発明は、次の工程を有する真菌類又は酵母細胞の生育阻害につ いて抗真菌性組成物の効能の評価方法をも提供する。 （i）組成物のサンプルを坦体に塗布する； （ii）該坦体を組成物が、酵母又は真菌性細胞を含む寒天培地表面に接触する ように、該寒天培地プレートの表面に装着する； （iii）該細胞の生育を阻害するような温度で寒天培地プレート及び坦体を培 養する； （iv）寒天培地から坦体を除去する； （v）該細胞が生育するような条件下で寒天培地を培養する；及び、 （vi）組成物サンプルから解放された殺カビ剤の存在により寒天培地における 細胞生育の阻害を測定する。 特に、この方法は、表面処理用調剤物からの活性抗真菌性成分の解放有効性を 測定するのに好適である。さらに、この方法は水に対する溶解度が低い活性抗真 菌性成分の溶解を測定するのに特に好適である。 活性化した殺カビ剤を含む調剤は、ポリエン殺カビ剤の作用に対し通常比較的 耐性のある真菌類の生育を阻害するのに有用である。ナタマイシンに対して比較 的低い感受性を有する真菌類の例として、バーティシリウム・シンナバリヌム（Verticillium cinnabarinum ）、ボトリチス・シネレア（Botrytis cinerea）、 及びトリコフィートン（Trichophyton）種が挙げられる。アスペルギルス（Aspe rgillus ）、フザリウム（Fusarium）、及びぺニシリン（Penicillin）種中でも 、ナタマイシンに対し比較的高い耐性を示す種が見出すことができる。そのよう な種の例として、ぺニシリウム・エチヌラツム・バー・ディスカラー（Penicill ium echinulatum var．discolor ）が挙げられる。 したがって、本発明のある面では、上記の方法のうちの一つによって活性化し たポリエンタイプの抗真菌性化合物を含む抗真菌性組成物の調製方法を提供する 。さらなる面では、本発明はそのように調製された組成物も提供する。 また他の面では、本発明は、本発明の組成物を塗布する工程を有し、食品又は 農産物を処理して酵母又は真菌類の生育を阻害する方法を提供する。 主に、ポリエンタイプの抗真菌性化合物の溶液を、チーズやソーセージのよう な食品を処理する、又は果物、野菜、及び種子のような農産物を処理するのに好 適なすべて種類の調剤に組み込むことができる。チーズやソーセージのような食 品を処理するのに好適な調剤としては、例えばブラッシングするか又はスプレー 装置を用いることによって塗布することができるコーティングエマルジョン、及 び浸漬処理に用いることができる液体調剤が挙げられる。好ましくは、食品又は 農産物処理のための本発明による調剤のｐＨは１〜１０であるのがよく、より好 ましくは２〜８、最も好ましくは３．５〜７．５であるのがよい。また、本発明 はそのように処理された食品及び農産物に関する。 最後に、ポリエンタイプの活性化した殺カビ剤を医薬調剤に、例えば局所施用 調剤に対して組み込むこともできる。好適な医薬調剤の例として、ローション、 クリーム、及び軟膏が挙げられる。 図の説明 図１（チーズ上にいくつかのナタマイシンの組成物を塗布）は、ナタマイシン を２５０ｐｐｍ及び５００ｐｐｍ含むいくつかの組成物のペニシリウム・エチヌ ラツム・バー・ディスカラー に対するカビ阻害特性をブランク組成物（組成物Ｅ ）と比較して示す。組成物Ｃ及び組成物Ｄは対照物である一方、Ａ及びＢは本発 明による組成物である。 図２（チーズ上にいくつかの組成物を塗布）は、ナタマイシンのグリセロール 溶液のペニシリウム・エチヌラツム・バー・ディスカラーに対する阻害効果を、 対照物（組成物 Ｄ）、並びに、本発明（組成物 Ｂ）及びメタノールのみを含 むコーティングエマルジョン（組成物 Ｆ）による調剤と比較して示す。 図３（チーズ上にいくつかのナタマイシン調剤を塗布）は、氷酢酸の溶液とし てコーティングに加えたナタマイシンを含むコーティングエマルジョン（組成物 Ｇ）のペニシリウム・エチヌラツム・バー・ディスカラーに対する阻害効果を 、対照物（組成物 Ｄ）及びブランクエマルジョン（組成物 Ｅ）と比較して示 す。 図４（チーズ上にいくつかのナタマイシン調剤を塗布）は、γ−ナタマイシン （組成物 Ｊ）又はδ−ナタマイシン（組成物 Ｋ）を含むコーティングエマル ジョンのペニシリウム・エチヌラツム・バー・ディスカラーに対する阻害効果を 、α−ナタマイシンを含む対照コーティングエマルジョン（組成物 Ｄ）及びブ ランクコーティングエマルジョン（組成物 Ｅ）と比較して示す。 図５（チーズ上にいくつかのナタマイシン調剤を塗布）は、ナタマイシンのカ ルシウム塩（組成物 Ｌ）又はナタマイシンのバリウム塩（組成物 Ｍ）を含む コーティングエマルジョンのペニシリウム・エチヌラツム・バー・ディスカラー に対する阻害効果を、α−ナタマイシンを含む対照コーティングエマルジョン（ 組成物 Ｄ）及びブランクコーティングエマルジョン（組成物 Ｅ）と比較して 示す。 図６（チーズ上にいくつかのナタマイシン調剤を塗布）は、氷酢酸の溶液とし てコーティングに加えたナタマイシンを含むコーティングエマルジョン（組成物 Ｇ）のアスペルギルス・オカラセウス（Aspergillus ochracheus）に対する阻 害効果を、対照物（組成物 Ｄ）及びブランクコーティングエマルジョン（組成 物 Ｅ）と比較して示す。発明の詳細な説明 本発明は、食品及び／又は農産物のカビによる腐敗を防ぐため、並びに医薬と して用いるための新規なタイプのポリエン抗真菌性調剤及び組成物を提供する。 この組成物は、そのような化合物に対して通常比較的高い許容性を示す種に対す るポリエン殺カビ剤の増大した抗真菌性活性によって特徴づけられる。上述のよ うに、ナタマイシンに対し比較的耐性を有する真菌類の例として、バーティシリ ウム・シンナバリヌム 、ボトリチス・シネレア、及びトリコフィートン種が挙げ られる。アスペルギルス、フザリウム、及びペニシリウム種のうち、ナタマイシ ンに対して比較的高い許容性を示す種が見出すことができる。そのような種の例 として、ペニシリウム・エチヌラツム・バー・ディスカラーが挙げられる。 本発明の組成物の増大した活性は、改良された溶解度によりもたらされる抗真 菌性化合物、例えばナタマイシンの改良した有効性によるものと思われる。一般 に、溶液中の殺カビ剤だけが抗真菌性活性を発揮する。ゆえに、溶解度が低い殺 カビ剤の場合、次の３つの要因が最終的な殺カビ剤の効果に影響を与える。殺カ ビ剤の溶解性、溶解した殺カビ剤の感染部位への拡散、及び溶解した殺カビ剤の 脱離である。例えばナタマイシンは光の作用による分解又は加水分解によって非 活性となり得る（参考文献２）。ナタマイシンはほとんどの食品（foodborn）の 真菌類に対して１０ｐｐｍ未満のＭＩＣ（最小発育阻止濃度）を有する一方、そ の水への溶解性は３０〜５０ｐｐｍである（参考文献１３）。ほとんどの場合、 そのような真菌類に対する従来の抗真菌性調剤中のナタマイシンの効能は、可溶 化及び拡散の要因によって著しく限定されないであろう。その理由は、溶解度が ＭＩＣ値よりかなり大きいからである。溶解したナタマイシンの脱離が、溶解し ていないナタマイシンの溶解及び溶解したナタマイシンの感染サイトへの拡散に よって十分に補償されるであろう。 ポリエン殺カビ剤に対して感受性が比較的低い真菌類、例えばペニシリウム・ エチヌラツム・バー・ディスカラー の場合、そのような殺カビ剤の可溶化及び拡 散によりその阻害作用にさらに限定した効果を与える。ナタマイシンを含む従来 の殺カビ調剤を用いたとき、抗真菌性化合物の溶解及び拡散によって脱離が十分 に補償されないため、平衡状態でのナタマイシンの平均溶解部分は有効濃度以下 に落ちるのであろう。通常、この種の問題は、適当な溶媒を選択することによる か又はより小さな粒子サイズを用いるかにより、可溶化の速度を改良し、処理す べき表面上の粒子分散の密度を増加させることにより拡散限界を補償することに より、有効成分の溶解度を改良することにより解決することができる。しかし、 水性懸濁液にナタマイシンを適用する場合、これらの既知の方法では所望の効果 が得られない。 ナタマイシンをグリセロールのような溶媒中で、例えばペニシリウム・エチヌ ラツム・バー・ディスカラー を接種したチーズ表面上に塗布すると、真菌類の生 育を十分に抑制することができない。また、超微粉砕したサンプルの使用は、超 微粉砕していないサンプルの使用と比較すると、結果にほとんど改良が見られな い。 最初のケースで、多分チーズ表面上の有効ナタマイシンの濃度があまりに低い ので、溶解したナタマイシンがチーズにあまりに速く拡散した結果、真菌類の生 育を効果的に抑制することができない。第２のケースでは、可溶化速度の改良が 抗真菌性活性の点で所望の改良を得る程十分でない。 驚くことに、ナタマイシンをまず溶媒に溶解し、その後第２の組成物成分を含 む水性組成物と組み合わせると、ナタマイシンに低い感受性を有する真菌類種に 対する殺カビ剤の活性を著しく改良するということが見出された。 このように、本発明による組成物は、食品又は農産物への適用に好適な調剤中 の化合物と組み合わせる前に、又は、該化合物を医薬賦形剤と組み合わせて、例 えば局所への使用するような医薬組成物を提供する前に、ポリエンタイプの抗真 菌性化合物を好適な溶媒系に溶解することにより、調製する。 好適な溶媒系は、メタノール、エタノール、プロパノール、エチレングリコー ル、ポロピレングリコール、及びグリセロールのような低級アルコール、並びに これらの混合物が挙げられる。 また、好適なアルコール溶媒で、１以上のヒドロキシ基がエステル結合によっ て脂肪酸と結合するか、又はエーテル結合によって他のアルコール基と結合する こととしてもよい。このような溶媒の例として、メトキシメタノール及びエトキ シエタノールが挙げられる。 好適な溶媒系は、また氷酢酸と水性酸とアルカリ溶液、及びそのような溶媒と 上述のアルコール溶媒との混合物が挙げられる。好適な水性酸及びアルカリ溶液 の例として、塩酸及びクエン酸の水溶液、並びにアルカリ金属水酸化物の水溶液 が挙げられる。界面活性剤のようなさらなる可溶化剤はポリエン殺カビ剤を溶媒 系に溶解するのに有利であろう。好適な可溶化剤の例として、ラウリル硫酸ナト リウム、スルホコハク酸ジオクチル、塩化カルシウム、又は非イオンタイプの界 面活性剤、例えばブランド名で、ツィーン（Tween）、スパン（Span）、ブリッ ジ（Brij）、及びミージュ（Myrj）として知られるものが挙げられる。 抗真菌性化合物の溶液は、調剤の溶液に加えるか又はその逆により、最終組成 物に接種することとしてもよい。原則として、抗真菌性化合物の溶液を、食品及 び／又は農産物を処理するのに好適、又は医薬のために好適であると知られてい るある種類の組成物と組み合わせてもよい。 本発明による組成物は、実施例１に記載する方法により測定すると、特徴的な 殺カビ剤解放プロファイルを有する。この実施例に記載した、抗真菌性組成物か らの殺カビ剤、例えばナタマイシンの放出を測定する方法もまた本発明の特徴で ある。この方法で、試験すべき抗真菌性組成物のサンプルは、坦体、例えばフィ ルタペーパーディスクに塗布し、殺カビ剤はその後、ある一定時間かつ細胞生育 が阻害される温度で、組成物サンプルから酵母又は真菌類を加えた寒天培地に移 動させる。実施の期間は例えば２４時間である。しかし他の時間を選択してもよ い。坦体を新鮮な寒天培地プレートに移した後、第１の寒天培地において、坦体 から寒天培地に解放された殺カビ剤は、既知の微生物学的方法、例えば３０℃で ２４時間培養し、阻害ゾーンを測定することにより、決定することができる。こ の工程を繰り返すことにより、殺カビ剤がもはや坦体から解放されなくなくまで 、酵母又は真菌類生育を阻害する殺カビ剤の有効性を測定することができる。 このように、さらにある側面では、本発明は、ある表面での真菌類又は酵母細 胞生育を阻害する抗真菌性組成物の効能の評価方法であって、次の工程を有する ものを提供する。 （i）組成物のサンプルを坦体に塗布する； （ii）塗布した坦体を、酵母又は真菌類細胞を含む寒天培地プレートの表面に 組成物が寒天培地表面に接触するように装着する； （iii）寒天培地プレート及び坦体を前記細胞の生育が阻害されるような温度 で培養する； （iv）寒天培地プレートから坦体を除去する； （v）寒天培地プレートを前記細胞に対して生育が許される条件で培養する； 及び （vi）組成物サンプルから解放された殺カビ剤の存在による、寒天培地中の細 胞生育の阻害を測定する。 好ましくは、坦体は規則的にある寒天培地プレートから他のプレートに移動で きるものを採用するのがよい。好ましくは、坦体は、微生物学的測定を妨げるこ となく、少なくとも１０〜１５回の毎日の移動に耐えるべきである。 特に、この方法は表面処理用調製物からの活性抗真菌性成分の有効性を測定す るのに特に好適である。また、この方法は水に対し低い溶解度しか有さない活性 抗真菌性成分の溶解の測定に特に好適である。 実施例１の方法の試験条件下で、ナタマイシンの水の懸濁液、又はポリ酢酸ビ ニルエマルジョンは通常、初期ナタマイシン解放速度が約１〜２μｇ／日である 。同じ条件下で、本発明による組成物は、殺カビ剤解放速度を少なくとも最初の 日 で少なくとも約３μｇ／日を示す。約２０μｇ／日又はこれより高い殺カビ剤解 放速度が観測され得る。 また、多形形態を改質することにより、感受性が低い種に対するポリエン抗真 菌性化合物の活性を増大することができることが予期し得ず見出された。例えば 、実施例１の方法により測定した場合、ナタマイシンのメタノール溶媒化合物は 、元来よく知られているナタマイシン３水和物のそれと比較して改良した溶解プ ロファイルを有することがわかった（例えば参考文献１４に記載された既知のナ タマイシン３水和物はまたα−ナタマイシンとよぶことにする）。 いくつかのポリエン抗真菌性化合物の多形形態が知られている。例えば参考文 献１５には、ポリエン抗真菌性化合物のさまざまなバッチ間での急性毒性値の不 一致、特にメパートリシン（mepartricin）とナイスタチン（nystatin）との不 一致は、多形形態によるとすることができると記載された。他方、メパートリシ ンの異なる多形形態又はナイスタチンの異なる多形形態間では、微生物学的活性 に違いが観察されなかった。 参考文献１４（538頁）には、異なる文献からのナタマイシンの溶解度のデー タの大きな不一致は、溶媒混合物の形成によるとすることができると記載された 。ナタマイシンのメタノール初期溶解度と自発的な結晶化後に溶液に残るナタマ イシンとの差を例示として用いる。この現象は難溶性メタノール溶媒化合物（メ タノール中）が形成されるからと説明された。しかし、水と接触すると、結晶は 即座に元の形態に戻り、水性溶媒から単離した結晶と同じＸ線回折パターンを有 した（519頁）。水と接触するとメタノール溶媒化合物が即座に元の３水和物に 転化するため、水性条件下でナタマイシンメタノール溶媒化合物の低い感受性を 有する種に対する活性の増加は、あまり期待できない。また、ナタマイシンメタ ノール溶媒化合物は不安定な物質であり（参考文献１４、542頁）、よって実際 に用いるのには適切ではない。このように、本発明の特徴は不活性ガス及び／又 は冷凍条件下、例えば窒素及び／又は−３０℃で保持すれば、この物質を少なく とも３カ月間分解させずに貯蔵することができることを見出したことにもある。 示差走査熱量（ＤＳＣ）測定、熱重量及び示差熱分析（ＴＧ／ＤＴＡ）、及び核 磁気共鳴（ＮＭＲ）分析により、ナタマイシンメタノール溶媒化合物はナタマイ シン １モル当りメタノールを約２モル及び水を約０．５モル含むことがわかった。 熱分析により示されたことであるが、ナタマイシンメタノール溶媒化合物は、 五酸化リン上減圧下にさらされると、メタノールを完全に放出する。Ｘ線分析で は、その結果からナタマイシンの新しい結晶態種であることがわかり、それをさ らにδ−ナタマイシンと呼ぶことにする。δ−ナタマイシンを３カ月以上分解さ せずに密閉したボトル中に貯蔵することができる。但し、白色物質の色は黄色に 変色しがちである。しかし、冷凍及び／又は不活性条件下で、その物質は３カ月 以上変色せずに保持することができる。驚くことに、これは、密閉したボトル中 に貯蔵したとき、五酸化リン上真空にさらすことにより非常に乾燥したナタマイ シン３水和物が４８時間以内にその活性の１５％を失うことによるものである（ 参考文献１４、542頁）。驚くことに、δ−ナタマイシンは改良した溶解を有し 、さらにナタマイシンに対し低い感受性を有する種に対して増大した活性を有す る。 このように本発明は、例えば五酸化リンのような水結合剤（water biding age nt）上で減圧下にさらすことにより、又は、窒素のような不活性ガスの少流量を 伴う減圧下におくことにより、溶媒化合物化した抗真菌性化合物の結晶格子から 溶媒化合物化した溶媒（の一部）を取り除くことにより得られる物質をも包含す る。 ７６％ＲＨで貯蔵したδ−ナタマイシンは、ナタマイシン１モル当り水を３モ ル含む結晶態種に転化する。しかし、Ｘ線分析に示されるように新しい結晶の形 態は元のα−態種のものと異なる。 現在までナタマイシン３水和物の多形性は知られていない（参考文献１４、51 8頁）。よって、この態種は新規な化合物であり、γ−ナタマイシンとよぶ。γ −ナタマイシンは、白色の安定な物質であり、その色は環境条件下で貯蔵すると ゆっくりと黄色に変化する。しかし、不活性ガス下で、例えば窒素下で貯蔵する と、色は白色のままである。 また、改良した溶解性によって示されるようにγ−ナタマイシンは、低い感受 性を有する種に対し、α−態種と比較して、増大した活性をも有する。 さらに、δ−ナタマイシンは、さまざまな溶媒の蒸気の影響下にさらされると 、 さまざまな溶媒化合物に転化することができる。このように本発明の特徴は、ポ リエン抗真菌性化合物の『空の』結晶態種を溶媒の蒸気でさらすことにより得ら れる物質でもある。 最後に、ナタマイシンのようなポリエン抗真菌性化合物の多形形態は、α−、 δ−、γ−態種を溶媒と接触することにより得ることができる。この多形形態を 調製する好適な溶媒は、低級（多価）アルコール、脂肪族ケトン、ハロゲン化脂 肪族炭化水素、脂肪族シアノ炭化水素、脂肪族エーテル、及び脂肪族エステル、 又はこれらの混合物の群に属するものである。好適な溶媒の例として、メタノー ル、エタノール、メトキシエタノール、クロロホルム、塩化メチレン、アセトニ トリル、ジオキサン、アセトン、及び酢酸エチルが挙げられる。溶媒系中に１％ までの少量の水蒸気が存在していてもよい。 本発明の他の特徴として、予期し得なかったことであるが、ポリエン抗真菌性 化合物をアルカリ土類金属塩に転化することにより、その活性が増大することが 見出された。金属錯体及びポリエン抗真菌性化合物のナトリウム塩は既知であり 、それらの改良した活性について主張されているが、アルカリ土類金属塩は知ら れていない。さらに、これらの化合物の活性の改良は水性系における物質の溶解 度の改良を主に基礎とする一方、低い感受性を有する種に対する本発明による塩 の増大した活性は、アルカリ土類金属塩の改良した溶解性、特にカルシウム塩及 びバリウム塩の溶解によるものである。米国特許第3957754号には、多価カチオ ンとのポリエン抗生物質の錯体の調製が記載されている。安定性、及び水の溶解 度がよいため３価カチオンとの錯体が好ましい。米国特許第3476856号には、ナ イスタチン及び他のポリエン抗生物質のナトリウム塩の調製が記載されている。 ナトリウム塩は水溶性である。 最後に、米国特許第3740424号には、ポリエンマクロライド（macrolide）抗生 物質−ホウ酸錯体の調製が記載されている。これは改良した水の溶解度を有する 。 本発明の最後の特徴は、ポリエン抗真菌性化合物の活性が、この化合物を坦体 に塗布することにより改良され得ることを見出したことである。好適な坦体は、 ヒュームドシリカ；アビセール（Avicel）（登録商標）タイプのような微結晶質 粉末及びフィルタレード（filteraid）として用いられる粉末が挙げられる。例 えば坦体上に抗真菌性物質の溶液をスプレーコーティングする技術により、又は 、抗真菌性及び坦体の溶液の混合物から溶媒を蒸発させることにより、ポリエン をそれ自体既知の方法で坦体に塗布する。好適な溶媒としてメタノール、エタノ ール、メトキシエタノール、エトキシエタノール、クロロホルム、及びこれらの 混合物が挙げられる。 実施例１の方法によって測定すると、ポリエン抗真菌性化合物の改良した溶解 によってサンプルは特徴づけられる。 チーズ又はソーセージのような食品の処理に用いることができる本発明による 組成物は、例えば、浸漬及び／又はスプレーによる処理のための液体、又はポリ 酢酸ビニルタイプ、もしくはオイル−イン−水（ｏ／ｗ）又は水−イン−オイル （ｗ／ｏ）タイプのようなコーティングエマルジョンとすることができる。 花の球根、（穀粒）穀物、及び野菜のような農産物の処理のための本発明の組 成物は、例えばそれ自体既知の方法、例えば浸漬又はスプレーに用いることがで きる水性系が挙げられる。 ポリエン殺カビ剤の溶液を組み込むことができる局所施用のための医薬組成物 の例として、ローション、クレーム、及び軟膏が挙げられる。 ポリエン抗真菌性剤にはナタマイシン、ルセンソマイシン（lucensomycin）、 ナイスタチン、又はアンホテリシンＢ（amphotericin B）が有り得る。好ましい ポリエンはナタマイシン及びルセンソマイシンである。 浸漬処理のための液体組成物中の殺カビ剤、例えばナタマイシンの量は、０． ０１％〜２％w/vとするのがよい。量を０．０１％〜１％w/vとするのが好ましい 。原則として、浸漬液はあらゆる種類のものでよい。水性系が用いられるとき、 界面活性剤を加えることは好適であり得、特に疎水性表面を有する物質を処理す るのに好適である。 本発明によるコーティングエマルジョンにおいて、殺カビ剤、例えばナタマイ シンの量を、０．００５％〜２％w/vにするとよく、０．０１％〜１％w/vである のが好ましく、より好ましくは０．０１％〜０．５％w/vであるのがよい。コー ティングエマルジョンはｏ／ｗ、ｗ／ｏタイプのものとすることができる。特 に好ましいのは、食品工業に一般に用いられるコーティングエマルジョンから調 製するエマルジョンがよい。例えば、硬いチーズを処理するのにポリ酢酸ビニル タイプの水性ポリマーエマルジョンが用いることができる。 上記のように、食品又は農産物の処理のための本発明による組成物のｐＨは、 １〜１０であるのが好ましく、より好ましくは２〜８がよく、最も好ましくは３ ．５〜７．５であるのがよい。そのような組成物のｐＨは当業界で既知のいかな る方法、例えば酸性又は塩基性化合物を加えるか、又は緩衝系を用いることによ って、調整することができる。この目的のために用いられる酸として、例えばク エン酸、乳酸、塩酸、リン酸、硫酸、及び酒石酸が挙げられる。代わりに用いる ことができる有用な塩基性化合物として、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリ ウム、アンモニア、及び水酸化カルシウムが挙げられる。本発明の組成物中に用 いることができる有用な緩衝系として、例えばリン酸及びクエン酸タイプのもの が挙げられる。 本発明を次の実施例によって詳細に説明する。ＤＳＣ及びＴＧ／ＤＴＡ測定 一般的工程 DSC120及びTG/DTA220炉を提供するセイコー（Seiko）社のSSC5200系を用いて ＤＳＣ及びＴＧ／ＤＴＡ測定を行った。所望のデータを得るのに標準的な工程を 用いた。カバーに孔を有するシールした（UFO型）パン（Ａ１）を選択し、サン プルコンテナとして用いた。カバーの孔は標準ニードルを用いることにより再現 性を得た。 ＤＳＣ プログラム温度：−３５〜２７０℃ 加熱速度：５℃／分 サンプリング：０．５秒 雰囲気：窒素（８０ｍｌ／分） 対照物：カバーに孔を有するシールした（UFO型）パン（Ａ１）１．１５４ｍｇ サンプルサイズ：１．２０±０．１５ｍｇ サンプルコンテナ：カバーに孔を有する シールしたサンプルコンテナ（Ａ１）１５μｌ ＴＧ／ＤＴＡ プログラム温度：２２〜２７０℃ 加熱速度：２．５℃／分 サンプリング：０．５秒 雰囲気：窒素（１０ｍｌ／分） 対照物：空、オープンＰｔパン サンプルサイズ：±５ｍｇ サンプルコンテナ：オープンＰｔパンＸ線分析 異なるナタマイシン結晶のＸ線パターンを、ＣｕＫα線を用いてモノクロメー ターを有するギニエ（Guinier）カメラ、ヨハンソン（Johansson）タイプで測定 した。実施例１ 本実施例は、抗真菌性組成物からの抗真菌性成分の有効性を決定する微生物学 的方法を記載する。本実施例において、ナタマイシンが有効成分である。 直径０．６ｃｍのフィルターペーパーディスク（Ｓ＆Ｓ抗生物質試験ディスク no．3121260）に、各々のディスクにナタマイシンが４０μｇ含まれるように試 験する調剤を添加した。例えばナタマイシンを８００ｐｐｍ含むサンプル５０μ ｌをディスクに塗布した。その後、サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomy ces cerevisiae ）ATCC 9763をシードした寒天培地上にディスクを置いた。寒天 培地を含むペトリ皿をその後２４時間６℃で貯蔵し、ナタマイシンを寒天培地中 に解放した。この条件下で、サッカロミセスは生育しなかった。対照として、水 性メタノールに溶解したナタマイシンを既知量範囲でディスクを新たに装着し た。 翌日、サンプルディスクをサッカロミセス・セレビシアエをシードした寒天培 地を含むペトリ皿に移動した。溶解したナタマイシンを既知量の範囲で新たに装 着した新しいディスクを対照として用いるために調製した。サンプルディスク及 び新しい対照物の新しいディスクを６℃で２４時間貯蔵し、解放したナタマイシ ンを含む古いディスクは３０℃で２４時間培養した。 阻害ゾーンのサイズは、サンプルディスクから解放したナタマイシンの測定で ある。解放したナタマイシンの量は、それ自体が既知の方法で計算することがで きる。この工程を繰り返すことにより、解放したナタマイシンを日毎に測定する ことができる。他の解放時間を代わりに選択することもできる。実施例２ α−ナタマイシンの精製 工業精度のナタマイシン１１ｇを攪拌しながら水６４０ｍｌ及びn-プロパノー ル１６０ｍｌの混合液に懸濁した。濃縮アンモニアを加えてｐＨを９．９にあわ せた。得られた溶液をその後カーボンブラック１１ｇで処理し、ザイツ（Seitz ）フィルターで濾過した。酢酸５０％の溶液を用いて濾液のｐＨを６．５に合わ せて、ナタマイシンを結晶化させた。 濾過で結晶を集めて、水で洗浄した。結晶質物質を水４００ｍｌに再懸濁させ て、濾過して、続いて水５０ｍｌ及びアセトン５０ｍｌで洗浄した。ベンチレー ションボックス内で終夜４０℃で乾燥後、ナタマイシン７．７８ｇを得た。この 材料を７６％相対湿度で平衡させてα−ナタマイシン７．８３ｇを得た。 特定のＤＳＣデータは、吸熱Ｔ_top４５．２、６５．９、及び１０４．７℃（ 水）、並びに、Ｔ_top２０５．６℃での発熱にすぐに続く吸熱２２１．２℃（分 解）であった。 得られた材料の結晶学的データ（α−ナタマイシンとして同定された）を表Ｉ に示した。データは先に得られたデータと合致した（参考文献１４、520頁）。実施例３ ナタマイシンのメタノール溶媒化合物の調製 攪拌しながら、精製したα−ナタマイシン２５ｇをメタノール２．５１に懸濁 し、加熱還流した。１５分後、加熱マントルを除去し、懸濁液を終夜攪拌した。 結晶を濾過して、メタノール５００ｍｌで洗浄した。結晶質材料をその後１時間 室温で真空乾燥し、ナタマイシンメタノール溶媒化合物２１．９ｇを得た。 メタノールの存在をＮＭＲ分析で証明した。ＤＳＣ熱量測定ではＴ_top５３． ４℃及び７１．５℃での２つの吸熱（メタノール）、並びに、１２３．５℃での １つの吸熱（水）、１８１．２℃及び１８６．１℃でのそれぞれ発熱にすぐに続 く吸熱（分解）が示された。メタノール溶媒化合物の調製は前加熱なしで室温で 、かつより高い濃度で、例えばメタノール１１中ナタマイシン１００ｇを用いて 、行うこともできる。このケースにおいて、メタノール溶媒化合物の形成の前に クリアな溶液を得ることができない。通常、α−ナタマイシンのメタノール溶媒 化合物への転化は、１５分以内で完了する。 得られたナタマイシンメタノール溶媒化合物の結晶学的データを表Ｉに示す。 ナタマイシンメタノール溶媒化合物の安定度 ナタマイシンメタノール溶媒化合物１００ｍｇのサンプルを空気又は窒素雰囲 気中で、それぞれ２０℃、４℃、及び−３５℃で貯蔵した。 窒素下及び／又は低温で貯蔵するとナタマイシンメタノール溶媒化合物の分解 速度はかなり減少する。 メタノール溶媒化合物を空気雰囲気下室温で２日間貯蔵した後、変色は観察さ れなかった。ＤＳＣ分析では材料はそのままであった。５日間貯蔵後、少し黄色 の生成物が得られ、それはむしろひどく分解していた。４℃でのメタノール溶媒 化合物は１２日間貯蔵後でもそのままであったが、１９日間貯蔵後で分解が確認 された。 −３５℃の冷凍下で貯蔵したとき、３カ月経った後でもメタノール溶媒化合物 はいまだ変色せず、分解の形跡も見られなかった。窒素雰囲気下で貯蔵すること により、メタノール溶媒化合物の安定度は大きく改善した。室温での３カ月経過 後変色又は分解が観察されなかった。実施例４ δ−ナタマイシンの調製 精製したα−ナタマイシン１０ｇをメタノール１００ｍｌに懸濁し、室温で攪 拌した。１５分後α−ナタマイシンのメタノール溶媒化合物への転化が完了し、 そのことは顕微鏡で板状のものが針状に完全に転化したことを検知することがで きた。２時間攪拌後、結晶を濾過しメタノール１００ｍｌで洗浄した。結晶質物 質を２０時間Ｐ₂Ｏ₅上室温で真空乾燥することによりメタノールが完全に除去さ れ、δ−ナタマイシン８．８３ｇを得た。ＤＳＣ分析では、Ｔ_top１２６．７℃ での吸熱（水０．５モルに対応することがＴＧＡ分析で示された）及び１８２． ４℃及び１８６．８℃でのそれぞれ発熱にすぐに続く吸熱（分解）が示された。 得られたδ−ナタマイシンの結晶学的データを表Ｉに示す。 ナタマイシンメタノール溶媒化合物のδ−ナタマイシンへの転化は、Ｐ₂Ｏ₅ を用いずに材料を５２℃で真空下１９時間加熱することによって、又はメタノー ル溶媒化合物を室温で７２時間、減圧下かつ窒素ガスの少量の連続流にさらされ ることによっても得ることができる。 δ−ナタマイシンの安定度 δ−ナタマイシン１８０ｍｇのサンプルを空気又は窒素雰囲気中で、それぞれ ２０℃、４℃、及び−３５℃で貯蔵した。 δ−ナタマイシンは、対応するメタノール溶媒化合物よりももっと安定である ことがわかった。ＤＳＣで示されるように、室温で空気雰囲気下３カ月貯蔵した δ−ナタマイシンは、分解の痕跡が全くなかった。ほんの少しであるが変色が観 察された。実施例５ γ−ナタマイシンの調製 精製したα−ナタマイシン１０ｇをメタノール１００ｍｌに懸濁した。室温で ２４時間攪拌した後、結晶質を濾過しメタノール１００ｍｌで洗浄した。１時間 室温で真空乾燥後、ナタマイシンメタノール溶媒化合物９．９８ｇを得た。その 後材料を常温で２３時間Ｐ₂Ｏ₅上で真空にさらすことにより、δ−ナタマイシン ８．８４ｇを得た。最後にδ−ナタマイシンを相対湿度７６％の雰囲気に３日間 さらすことによって、γ−ナタマイシン９．６７ｇを得た。 ＤＳＣ熱量分析では、Ｔ_top４２．８℃、６０．３℃、及び１２４．８℃での ３つの吸熱（水）、並びに、１８２．５℃及び１８６．８℃でのそれぞれ発熱に すぐに続く吸熱（分解）が示された。 γ−ナタマイシンの結晶学的データを表Ｉに示す。実施例６ メタノール溶媒化合物からのα−ナタマイシンの調製 常温でナタマイシンメタノール溶媒化合物１．０ｇを脱イオン水１００ｍｌに 懸濁した。懸濁液を２５時間攪拌した。結晶を濾過し水２５ｍｌ及びアセトン５ ０ｍｌでそれぞれ洗浄し、その後ベンチレーションボックス中３５℃で終夜乾燥 した。材料０．８１ｇが得られ、そのＤＳＣ熱量分析によりα−ナタマイシンと 同定された。典型的なデータは、Ｔ_top４４．６℃、６８．４℃、及び９７．９ ℃での３つの吸熱（水）、並びに、２１６．２℃及び２３０．０℃でのそれぞれ 発熱にすぐに続く小さな吸熱（分解）が示された。実施例７ γ−ナタマイシンからのα−ナタマイシンの調製 γ−ナタマイシン１．０ｇを脱イオン水２５０ｍｌに懸濁し懸濁液を室温で７ 日間攪拌した。結晶を濾過し、水２０ｍｌ及びアセトン２０ｍｌでそれぞれ洗浄 し、その後ベンチレーションボックス中３０℃で終夜乾燥することによりα−ナ タマイシン０．９２ｇを得た。これをＤＳＣ分析で確認した。Ｔ_top４５．２℃ 、６７．８℃、及び１００．３℃での吸熱（水）、並びに、２１４．３℃及び２ ２６．９℃でのそれぞれ発熱にすぐに続く小さな吸熱（分解）であった。実施例８ δ−ナタマイシンからのα−ナタマイシンの調製 δ−ナタマイシン１．０ｇを脱イオン水１００ｍｌに懸濁し２４時間攪拌した 。結晶を濾過により集めて、水２５ｍｌ及びアセトン５０ｍｌでそれぞれ洗浄し 、ベンチレーションボックス中３５℃で乾燥することによりα−ナタマイシン１ ．０２ｇを得た。これをＤＳＣ分析で確認した。Ｔ_top４３．３℃、６７．８℃ 、及び１００．３℃での吸熱（水）、並びに、２１５．０℃及び２２６．８℃で のそれぞれ発熱にすぐに続く吸熱（分解）であった。実施例９ γ−ナタマイシンからのδ−ナタマイシンの調製 γ−ナタマイシン１．０ｇをＰ₂Ｏ₅上で２４時間真空乾燥してδ−ナタマイシ ン０．９ｇを得、これをＤＳＣ分析で確認した。Ｔ_top１２５．４℃での吸熱（ 水）、並びに、１８２．４℃及び１８６．８℃でのそれぞれ発熱にすぐに続く吸 熱（分解）であった。実施例１０ ナタマイシンのカルシウム塩の調製 ３０分間窒素ガス流を水酸化カルシウムの脱イオン水飽和溶液で濾過したもの １５０ｍｌに通した。次にα−ナタマイシン３．０ｇを加え、混合物を終夜室温 で攪拌した。結晶を濾過し脱イオン水１５０ｍｌ及びアセトン５０ｍｌでそれぞ れ洗浄した。結晶質材料をベンチレーションボックス中３５℃で乾燥して、カル シウムナタマイシネート２．３４ｇを得、これをＮＭＲ分析で確認した。カルシ ウム含量は２．９３％であり、これはナタマイシン１モルに対しＣａ０．５モル に対応した。 ＤＳＣデータは、Ｔ_top８９．７℃及び１２８．５℃での吸熱（後者はＴＧＡ 分析によると６．７４％の水全体の減少で、２．０７％の水の減少を示す）、並 びに、１７９．３℃及び１９４．９℃でのそれぞれ発熱にすぐに続く小さな吸熱 （分解）であった。得られたナタマイシンのカルシウム塩を表Ｉに示す。実施例１１ ナタマイシンのバリウム塩の調製 水酸化バリウム３２ｇをメタノール８００ｍｌに溶解した。窒素ガスをこの溶 液に通した。その後、濁った溶液を濾過して窒素下で貯蔵した。窒素ガス流を溶 液に通しているとき、精製したα−ナタマイシン５．０ｇを透明な水酸化バリウ ム溶液１００ｍｌに溶解した。次にガスフリーの脱イオン水２５０ｍｌをゆっく りと加えた。水４０ｍｌを加えた後、沈澱物が形成した。３０分後結晶を濾過し メタノールと水の１：１（v/v）混合物２００ｍｌで洗浄した。生成物をベンチ レーションボックス中３５℃で乾燥してナタマイシンのバリウム塩３．７６ｇを 得た。元素分析によると、得られた材料のバリウム含量は８．１４％であり式バ リウムジナタマイシナートに対応した。 ＤＳＣ熱量分析によると、Ｔ_top９４．２℃での吸熱及びＴ_top１９４．５℃を 有する１７２．６℃から始まる分解発熱を有する。ＴＧ／ＤＴＡ分析では水の含 量が６．５８％を検知した。 得られたナタマイシンのバリウム塩（長方形板状からなる）の結晶学的データ を表Ｉに示す。実施例１２ δ−ナタマイシンからのナタマイシンメタノール溶媒化合物の調製 対応するメタノール溶媒化合物を５２℃で１９時間真空乾燥することによって 調製したδ−ナタマイシン１．０ｇをデシケーター中に貯蔵しメタノール蒸気に １１３時間さらすことにより、ナタマイシンメタノール溶媒混合物１．１２ｇ得 た。ＤＳＣ分析では、Ｔ_top５５．９℃及び７４．０℃での吸熱（メタノール） 、並びにＴ_top１８１．１℃及び１８６．１℃でのそれぞれ発熱にすぐに続く吸 熱（分解）を示した。実施例１３ δ−ナタマイシンにいくつかの溶媒の蒸気を作用させることによるδ−ナタマイ シンからのナタマイシンの溶媒化合物の調製 δ−ナタマイシン１００ｍｇのサンプルを８ｍｌバイアルに入れた。オープン バイアルをその後溶媒を少量含んでいる１２５ｍｌフラスコに置いた。次にフラ スコを閉じて、常温で暗所に７日間貯蔵した。この方法で、δ−ナタマイシンの サンプルをいくつかの溶媒の蒸気の作用にさらした。次の溶媒でナタマイシンの 溶媒混合物を得た。 エタノール（６モル） １−プロパノール（２．５モル） １−ブタノール（１．５モル） ２−メトキシエタノール（２．５モル） ギ酸エチル（１モル） アセトン（２モル） ジクロロメタン（１．３モル） アセトニトリル（３モル） ジメチルフォルムアミド（４．５モル） 括弧間のナタマイシン１モル当りの溶媒の量（モル）は、ＮＭＲ分光分析で分 析したことで与えた。実施例１４ ナタマイシンを溶媒に接触させることによるδ−ナタマイシンからのナタマイシ ンの溶媒化合物の調製 ６ｍｌの閉じたバイアル（スナップキャップ（snapcap））にδ−ナタマイシ ン２００ｍｇのサンプルを入れ、溶媒２ｍｌと３２℃で２４時間攪拌した。結晶 質材料をその後濾過し、加えた溶媒で洗浄して、フィルター上で窒素ガス流下乾 燥するまで乾燥した。最後に結晶をフィルタ上で少量のアセトン又はジエチルエ ーテルで洗浄した。この方法を用いて次の溶媒でのナタマイシンの溶媒混合物を 得た。メタノール、エタノール、１-プロパノール、１-ブタノール、２-メトキ シエタノール、ギ酸メチル、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、及びホル ムアミドである。δ−ナタマイシンから溶媒化合物への転化をＤＳＣ分析で確認 した。実施例１５ ナタマイシンを溶媒に接触させることによるα−ナタマイシンからのナタマイシ ンの溶媒化合物の調製 ６ｍｌの閉じたバイアル（スナップキャップ）に精製したα−ナタマイシン２ ００ｍｇのサンプルを入れ、溶媒２ｍｌと３２℃で２４時間攪拌した。結晶質材 料をその後濾過し、加えた溶媒で洗浄して、フィルター上で窒素ガス流下乾燥す るまで乾燥した。最後に結晶をフィルタ上で少量のアセトン又はジエチルエーテ ルで洗浄した。この方法を用いて次の溶媒でのナタマイシンの溶媒混合物を得た 。メタノール、エタノール、及び２-メトキシエタノールである。転化をＤＳＣ 分析で確認した。実施例１６ 坦体としてのヒュームドシリカ上でのナタマイシンの調製 α−ナタマイシン１００ｍｇをメタノール２５ｍｌに入れて溶液を調製した。 この溶液１ｍｌをヒュームドシリカ（登録商標エアロジル200V（Aerosil 200V） ）２００ｍｇと混合した。メタノールの大部分を減圧下５０℃で３０分間加熱し て蒸発させた。その後ナタマイシン溶液１ｍｌを再度加えて、混合物を混合後、 メタノールの殆ど大部分を減圧下５０℃で３０分間加熱して再度除去した。メタ ノール溶液５ｍｌ全部を加えるまでこの工程を繰り返した。最後に混合物を約５ ０℃で乾燥器中終夜乾燥して粉砕後、得られた粉末を密閉容器中窒素下で貯蔵し た。 ナタマイシンの解放速度は、実施例１で記載した方法を用いて測定した。この 目的のため、サンプル４０ｍｇを水５ｍｌに懸濁させて、得られた懸濁液をペー パーフィルタディスク上に塗布した。さらに実施例１の工程を続けた。測定の結 果を表ＩＩにまとめた。実施例１７ 水性懸濁液からのいくつかのナタマイシンサンプルの解放速度 実施例１に記載した方法を用いて、いくつかのナタマイシン調製の解放速度プ ロファイルを各々比較した。 ナタマイシン調剤の懸濁液を、各々の懸濁液がそれ自体精製ナタマイシン８０ ０ｐｐｍ含むように調製した。各々の混合液をペーパーフィルタディスクに塗布 し、実施例１の方法を用いて解放速度を分析した。 その結果を表ＩＩにまとめた。 超微粉砕したナタマイシンの解放速度は超微粉砕していないナタマイシンと同 等である一方、改質ナタマイシンタイプは長期間高い解放速度を有する。実施例１８ プラスチコート（登録商標）からのいくつかのナタマイシンサンプルの解放速度 既述と同じ方法を用いて、実施例１８でもプラスチコート（登録商標）からの 解放速度を測定した。ナタマイシンの濃度自体は各々のケースにおいて８００ｐ ｐｍであった。各々の混合物５０μｇをペーパーフィルタディスクに塗布し、実 施例１の方法を用いて解放速度を分析した。その結果を表ＩＩＩにまとめた。 超微粉砕したプラスチコート（登録商標）からのナタマイシンの解放速度は超 微粉砕していないナタマイシンと同等である一方、改質ナタマイシンタイプは長 期間高い解放速度を有する。実施例１９ プラスチコート（登録商標）エマルジョン添加前にナタマイシンを溶媒系に懸濁 するか、又は懸濁しない、プラスチコート（登録商標）からのナタマイシンの解 放速度 α−ナタマイシンをそれぞれ水（１％ w/v）、メタノール（１％ w/v）、氷 酢酸（１％ w/v）、プロピレングリコール（１．５％ w/v）、エタノールアミ ン２０ｇ／ｌ含むエタノール（１％ w/v）に懸濁した。各々の混合物を１に対 してプラスチコート（登録商標）１９を混合した。ただし、プロピレングリコー ルの溶液に対しては例外をなし、この場合プラスチコート（登録商標）２９を混 合した。異なるプラスチコート（登録商標）混合物８０μｌをペーパーフィルタ ディスクに塗布し、実施例１の方法を用いて解放速度を分析した。その結果を表 ＩＶにまとめた。 ナタマイシンを溶媒系に溶解する前工程によって調製したプラスチコート（登 録商標）エマルジョンからのナタマイシンの解放速度は、ナタマイシンをまず水 に懸濁したものより高い。実施例２０ 本実施例では、コーティングエマルジョンの添加の前にナタマイシンをメタノ ールに溶解することによる本発明によって調製したナタマイシン組成物がチーズ 上のペニシリウム・エチヌラツム・バー・ディスカラーに対して効果があること を、抗真菌性化合物を溶解する前工程がない従来の方法で調製したナタマイシン 組成物の効果と比較することにより示す。 実験において、５つのコーティング組成物を用いた。 組成物Ａ及びＢは本発明によって調製した組成物であった。α−ナタマイシン をまずメタノールに溶解した（１％ w/v）。この溶液をその後プラスチコート （登録商標）（ナショナル・スターチ＆ケミカル Ｂ．Ｖ．（National Starch & Chemical B.V.）から供給されたポリ酢酸ビニルの水性エマルジョン）に、ナ タマイシンを各々２５０ｐｐｍ及び５００ｐｐｍ含むコーティングエマルジョン が得られるように加えた。 メタノールの溶液に代えて、まず水（１％ w/v）にα−ナタマイシンを懸濁 させることによって組成物Ｃ及びＤを調製した。この懸濁液を、ナタマイシンを それぞれ２５０ｐｐｍ及び５００ｐｐｍ含むコーティングエマルジョンが再度得 られるように、プラスチコート（登録商標）に加えた。最後に、ナタマイシンを 有さないコーティングエマルジョンをコントロール（組成物Ｅ）として用いた。 コーティング組成物を次の工程に沿ってゴーダチーズの断片の表面に塗布した 。 塩水に漬けたばかりの円板状のゴーダチーズを最初は水平に２つに切った。各 々を５×５×５ｃｍに切った。平坦な表皮を有する断片だけを実験に用いた。チ ーズの断片を８０℃で融解したパラフィン浴に、表皮がパラフィンにさらされな いようにする一方で、他の５面を凝固したパラフィンの薄膜で覆われるように浸 漬した。 その後、表皮にペニシリウム・エチヌラツム・バー・ディスカラー（ＣＢＳ番 号611.92、612.92、及び613.92）の３つの株の胞子の混合物を約６×１０³ＣＦ Ｕ／ｃｍ²で接種した。接種は約１０⁶ＣＦＵ／ｍｌを含む胞子懸濁液０．１５ｍ ｌをチーズ断片表面に塗布することによって行った。接種物を胞子懸濁液で飽和 した無菌綿棒によって表面上に均等に広がらせた。 密閉したプラスチックの箱に６℃で終夜放置した後、チーズ断片を異なる組成 物で処理した。各々の処理で、５つのチーズ断片を用いた。各々の断片でプラス チコート（登録商標）組成物０．８ｍｌを塗布し、約２×５ｃｍの無菌プラスチ ック長方形態のものでチーズ表面に均等に広がらせた。周囲条件で２時間放置し た後、チーズ断片に１５℃及び相対湿度９５％で接種した。 毎日各々のチーズ断片に形成される、観察されるコロニーの数を数え、各々の 処理に対しての断片当りの平均数を計算した。チーズ断片上のコロニーの数を３ ０を越えたとき、チーズ断片は完全にカビに覆われたと判断した。 この結果を図１にまとめた。 プラスチコート（登録商標）のみで処理した断片（コントロール組成物 Ｅ） は６日以内でカビに完全に覆われた。水の懸濁液として加えたナタマイシンを含 む対照プラスチコート（登録商標）組成物（組成物 Ｃ及びＤ）で処理した断片 は、それぞれ６日間及び８日間はカビがはえなかったが、その後コロニーの平均 数が徐々に増加した。１１日から１２日後、コロニーの数はそれぞれ２０及び１ ６コロニーに達した。 本発明による組成物（Ａ及びＢ）で処理した断片は、１０日までカビがはえな かった。ナタマイシンを２５０ｐｐｍ含む組成物（Ａ）で処理した断片は、接種 の約１５日後で、１個あたり最大平均コロニー数は１１コロニーまで達した。ナ タマイシンを５００ｐｐｍ含む組成物Ｂで処理した断片に形成した平均コロニー 数は、接種後２１日まで５個以下であった。 この結果から本発明による組成物が他の試験した組成物より優秀であることが 明らかにされた。実施例２１ 実施例１９に記載したのと同じ実験で、α−ナタマイシン５００ｐｐｍのグリ セロール及びメタノール５％（v/v）を含むコーティングエマルジョン溶液（組 成物 Ｆ）を用いてチーズサンプルを処理した。図２には、これらの処理の結果 を対照組成物Ｄによる処理及び本発明による組成物（組成物 Ｂ）による処理と 比較して示す。これらの結果から、溶解したナタマイシンでの処理は対照組成物 での処理より劣っていることがわかる。また、組成物Ｄに適用したのと同じ濃度 のメタノールを含むコーティングエマルジョンの効果は、対照組成物のそれより も劣っている。実施例２２ 実施例１９に記載したのと同じように、プラスチコート（登録商標）エマルジ ョンを用いて、ナタマイシンをエマルジョンに加える前に氷酢酸（１％ w/v） に溶解させたナタマイシン５００ｐｐｍ（組成物 Ｇ）を含むチーズサンプルを 処理する実験を行った。対照としてナタマイシンを有さないプラスチコート（登 録商標）エマルジョン（組成物 Ｅ）、及びコーティング組成物に１％（w/v） の水のエマルジョンとして加えたα−ナタマイシン５００を含むプラスチコート （登録商標）エマルジョン（組成物 Ｄ）を用いた。 この結果を表３に示す。これから、本発明による組成物のペニシリウム・エチヌ ラツム・バー・ディスカラー に対するカビ阻害特性が対照組成物Ｄ及びＥのそれ より良いことがわかる。実施例２３ ゴーダチーズの断片を実施例１９に記載したのと同様の方法で調製し、その後 表皮にペニシリウム・エチヌラツム・バー・ディスカラー（ＣＢＳ番号611.92、 612.92、及び613.92）の３つの株の胞子の混合物を約６×１０³ＣＦＵ／ｃｍ²で 接種した。 密閉したプラスチックの箱に６℃で終夜放置した後、チーズ断片をブランクの プラスチコート（登録商標）エマルジョン、並びに、それぞれα−ナタマイシン を５００ｐｐｍ（組成物 Ｄ）、γ−ナタマイシンを５００ｐｐｍ（組成物 Ｊ ）、及びδ−ナタマイシンを５００ｐｐｍ（組成物 Ｋ）を含むプラスチコート （登 録商標）エマルジョンで処理した。プラスチコート（登録商標）に添加する前に ナタマイシン調剤を水（１％ w/v）に懸濁した。各々の処理のために５つのチ ーズ断片を用いた。各々の断片にプラスチコート（登録商標）組成物０．８ｍｌ を塗布し、約２×５ｃｍの無菌プラスチック長方形状のものでチーズ表面に均等 に広がらせた。周囲条件で２時間放置した後、チーズ断片に１５℃及び相対湿度 ９５％で接種した。カビ阻害効果を実施例１９で記載したのと同じ方法で評価し た。 この結果を図４に示す。組成物Ｊ又はＫで処理したチーズ断片は１０日間カビが 生えなかった一方、対照物で処理した断片はカビが生えなかったのが７日間だけ しかなかった。実施例２４ ゴーダチーズの断片を実施例１９に記載したのと同様の方法で調製し、その後 表皮にペニシリウム・エチヌラツム・バー・ディスカラー（ＣＢＳ番号611.92、6 12.92、及び613.92）の３つの株の胞子の混合物を約６×１０³ＣＦＵ／ｃｍ²で 接種した。 密閉したプラスチックの箱に６℃で終夜放置した後、チーズ断片をブランクの プラスチコート（登録商標）エマルジョン、並びに、それぞれα−ナタマイシン を５００ｐｐｍ（組成物 Ｄ）、カルシウムジナタマイシナートを５００ｐｐｍ （組成物 Ｌ）、及びバリウムジナタマイシナートを５００ｐｐｍ（組成物 Ｍ ）を含むプラスチコート（登録商標）エマルジョンで処理した。ナタマイシン調 剤を水にまず懸濁し（１％ w/v）、得られた懸濁液を１９倍のプラスチコート （登録商標）と混合することによりナタマイシン調剤を含むプラスチコート（登 録商標）エマルジョンを調製した。各々の処理のために５つのチーズ断片を用い た。各々の断片にプラスチコート（登録商標）組成物０．８ｍｌを塗布し、約２ ×５ｃｍの無菌プラスチック長方形状のものでチーズ表面に均等に広がらせた。 周囲条件で２時間放置した後、チーズ断片に１５℃及び相対湿度９５％で接種し た。カビ阻害効果を実施例１９で記載したのと同じ方法で評価した。 この結果を図５に示す。カルシウム塩又はバリウム塩（それぞれ組成物Ｌ及び組 成物Ｍ）で処理したチーズ断片は１０日間カビが生えなかったが、対照断片はカ ビが生えなかったのが７日間だけしかなかった。実施例２５ ゴーダチーズの断片を実施例１９に記載したのと同様の方法で調製し、その後 表皮にアスペルギルス・オカラセウス（ＣＢＳ番号659.93）の胞子を、２×１０⁶ ＣＦＵ／ｍｌを含む胞子懸濁液０．１５ｍｌをチーズ断片の表面に塗布するこ とにより、約１．２×１０⁴ＣＦＵ／ｃｍ²で接種した。密閉したプラスチックの 箱に６℃で終夜放置した後、チーズ断片を３つの異なるプラスチコート（登録商 標）エマルジョンで処理した。即ち、ブランクのプラスチコート（登録商標）エ マルジョン、エマルジョンと混合する前に水に懸濁させた（１％ w/v）α−ナ タマイシンを５００ｐｐｍ含むプラスチコート（登録商標）エマルジョン、及び 、プラスチコート（登録商標）への添加前に氷酢酸（１％ w/v）に溶解したナ タマイシンを５００ｐｐｍ含むプラスチコート（登録商標）エマルジョンの３つ である。各々の処理のために５つのチーズ断片を用いた。各々の断片にプラスチ コート（登録商標）組成物０．８ｍｌを塗布し、約２×５ｃｍの無菌プラスチッ ク長方形状のものでチーズ表面に均等に広がらせた。周囲条件で２時間放置した 後、チーズ断片に１５℃及び相対湿度９５％で接種した。毎日チーズ断片に形成 される、観察されるコロニーの量を数え、断片当りの平均数を計算した。チーズ 断片上のコロニーの量が５０を越えたとき、チーズ断片は完全にカビに覆われた と判断した。 この結果を図６にまとめた。 本発明による組成物（組成物 Ｇ）での処理はアスペルギルス・オカラセウスの 生育に対して保護されることがわかり、これはブランク（組成物）での処理、又 は水性懸濁液でコーティングエマルジョンに添加したナタマイシンでの処理と比 較して著しく良いことがわかる。 参考文献 １．Jedrychowski，L.；Reps，A.；Jarmul，I.，Babuchowski，A. “Use of natamycin for a protection of semihard cheeses against moulding ” Brief communications of the XXIII International Dairy Congress，Montreal ，October 8-12，1990，Vol．I． ２．Daamen，C.B.G．and Berg，G.van den； “Prevention of mould growth on cheese by means of natamycin” Voedingsmiddelentechnologie，18（2），26-29，（1985） ３．Neviani，E.；Emaldi，G.C.；Carini，S,； “Use of pimaricin as a fungicide on cheese rind：technology and the eff ects on the cheese surface flora” Latte，6（5），335-343，（1981） ４．Morris，H.A.；Castberg，H.B.； “Control of surface growth on Blue cheese using pimaricin” Cultured Diary Products Journal，15（2），21-23，（1980） ５．Baldini，P.；Palmia，F.；Raczynski，R.G.；Campanini，M.； “Use of pimaricin for preventing mould growth on Italian cured meat pro ducts” Industria Conserve，54（4），305-307，（1979） ６．Weiss，G.； “Preservation of dairy products with chemicals” Deutsche Molkerei Zeitung 91（50）,2351-2356，（1970） ７．Holley，R.A.； “Effect of sorbate and pimaricin on surface mould and ripening of Itali an dry salami” Lebensmittel Wissenschaft und Technologie 19（1），59-65，（1986） ８．Ruig，W.G.；Berg，G．van den； “Influence of the fungicides sorbate and natamycin in cheese coatings o n the quality of the cheese” Netherlands Milk and Dairy Journal，39（3），165-172，（1985） ９．Holley，R.A.； “Prevention of surface mould growth on Italian dry sausage by natamycin and potassium sorbate” Applied and Environmental Microbiology，41（2），422-429，（1981） 10．Lueck，H.；Cheesman，C.E.； “Mould growth on cheese as influenced by pimaricin（natamycin）or sorba te treatments” South African Journal of Dairy Technology，10（3），143-146，（1978） 11．Mattson N.； “Mould control on cheese.Experience with potassium sorbate（added to br ine）and pimaricin for surface treatment of hard cheese” Svenska Mejeritidningen 69（3），14-15，（1977） 12．Verma，H.S.；Yadav，J.S.；Neelakantan，S.； “Preservative effect of selected antifungal agents on butter and cheese ” Asian Journal of Dairy Research 7（1），34-38，（1988） 13．Clark，W.L.；Shirk，R.J.；Kline E.F.； “Pimaricin，anew food fungistat” Micrbial lnhibitors in Food，Edition N．Molin，167-184，（1964） 14．Brik，H.； “Natamycin” Analytical Profiles of Drug Substances 10，513-561，（1981） 15．Ghielmetti，G.；Bruzzese，T.；Bianchi，C.；Recusani，F.； “Relationship between Acute Toxicity in MIce and Polymorphic Forms of P olyene Antibiotics” Journal of Pharmaceutical Sciences 65（6），905-907，（1976）

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 スタルク ヤコブス オランダ国 エヌエル―3069ゼットエム ロッテルダム ヨースト ファン オスパ ト 31 (72)発明者 タン ホン シェン オランダ国 エヌエル―2665テーヘー ブ レイスウェイク バイゼルトストラート 94 (72)発明者 ファン ズースト ウィーレム ヨハン オランダ国 エヌエル―3121イックスイェ ー シーダム クークークスラーン 11 (72)発明者 バレンドス ニコラース コルネリス マ リア エマニュエル オランダ国 エヌエル―2635ハーセー デ ン ホールン プリンセス ベアトリクス ストラート ５

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ポリエンタイプの抗真菌性化合物を含む抗真菌性組成物の調製方法であって 、該抗真菌性化合物が、非改質抗真菌性化合物と比較して前記抗真菌性化合物が 増大した解放プロファイルを示す改質形態で組成物中に組み込まれることを特徴 とする抗真菌性組成物の調製方法。 ２．前記抗真菌性化合物の改質形態が、抗真菌性化合物の多形形態を改質するこ とにより得られる請求項１記載の方法。 ３．前記改質形態が、抗真菌性化合物を組成物に組み込む前に、好適な溶媒に溶 解することによって得られる請求項２記載の方法。 ４．前記抗真菌性化合物がナタマイシン、ルセンソマイシン、ナイスタチン、及 びアンホテリシンＢから選ばれる請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方 法。 ５．前記改質抗真菌性化合物がナタマイシンの改質形態であって、好ましくは、 窒素ガス下及び／又は−３０℃で貯蔵することにより安定化したナタマイシンメ タノール溶媒化合物；δ−ナタマイシン；γ−ナタマイシン；ナタマイシンのカ ルシウム塩；ナタマイシンのバリウム塩；エタノール、１−プロパノール、１− ブタノール、２−メトキシエタノール、ギ酸メチル、ギ酸エチル、アセトン、ジ クロロメタン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド 、及びホルムアミドとのナタマイシンの溶媒化合物：及び坦体としてのヒューム ドシリカ上のナタマイシンからなる群から選ばれるナタマイシン化合物である請 求項１又は請求項２記載の方法。 ６．前記抗真菌性化合物の溶媒が、 （ｉ）１種以上の低級アルコールを含有するアルコール系溶媒、 （ｉｉ）水性酸、 （ｉｉｉ）水性アルカリ、 （ｉｖ）氷酢酸、及び （ｖ）（ｉ）の溶媒と（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、又は（ｉｖ）の溶媒との混合物 から選ばれる請求項３記載の方法。 ７．前記溶媒が１〜４個の炭素分子を有する低級アルコールである請求項６記載 の方法。 ８．抗真菌性化合物の溶液がさらに可溶化剤を含む請求項３、請求項６、又は請 求項７のいずれか１項記載の方法。 ９．抗真菌性化合物の溶液をコーティングエマルジョン又は液体調剤と合わせて 、食品及び／又は農産物を処理するのに好適な抗真菌性組成物を提供する請求項 ３又は請求項６乃至請求項８のいずれか１項記載の方法。 10．前記溶液を水性ポリマーエマルジョン、好ましくはポリ酢酸ビニルの水性エ マルジョンと合わせる請求項９記載の方法。 11．抗真菌性化合物の改質形態を医薬賦形剤と合わせて局所施用に好適な医薬組 成物を提供する請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載の方法。 12．請求項１乃至請求項１１のいずれか１項記載の方法により調製した抗真菌性 組成物。 13．６℃で、直径０．６ｃｍの寒天培地表面を、抗真菌性化合物４０μｇを含有 する坦体上に接触させたとき最初の２４時間で少なくとも約３μｇ／２４時間の 解放速度を示す請求項１２記載の抗真菌性組成物。 14．直径０．６ｃｍの寒天培地表面を、抗真菌性化合物４０μｇを含有する坦体 上に接触させたとき最初の２４時間で少なくとも４〜２０μｇ／２４時間の解放 速度を示す請求項１３記載の抗真菌性組成物。 15．請求項１２記載の組成物を塗布した食品又は農産物。 16．窒素ガス下及び／又は−３０℃で貯蔵することにより安定化したナタマイシ ンメタノール溶媒化合物；δ−ナタマイシン；γ−ナタマイシン；ナタマイシン のカルシウム塩；ナタマイシンのバリウム塩；エタノール、１−プロパノール、 １−ブタノール、２−メトキシエタノール、ギ酸メチル、ギ酸エチル、アセトン 、ジクロロメタン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキ シド、及びホルムアミドとのナタマイシンの溶媒化合物；及び坦体としてのヒュ ームドシリカ上のナタマイシンからなる群から選ばれるナタマイシン化合物。 17．食品又は農産物に請求項１２記載の組成物を塗布する工程を有する酵母又は 真菌類の生育を阻害するための食品又は農産物の処理方法。 18．食品又は農産物に前記組成物を塗布した後に抗真菌性化合物用溶媒を除去す る請求項１７記載の方法。 19．（ｉ）組成物のサンプルを坦体に塗布する； （ｉｉ）組成物が寒天培地表面と接触するように、坦体を酵母又は真菌類細 胞を含む寒天培地プレートの表面に装着する； （ｉｉｉ）前記細胞の生育が阻害されるような温度で寒天培地プレート及び 坦体を培養する； （ｉｖ）寒天培地プレートから坦体を除去する； （ｖ）前記細胞が生育する条件下で寒天培地プレートを培養する；及び （ｖｉ）組成物サンプルから解放された殺カビ剤の存在により、寒天培地中 の細胞生育の阻害を測定する；工程を有する真菌類又は酵母細胞生育を阻害する 抗真菌性組成物の効能を評価する方法。