CN111939254B - 表面覆盖磷脂及环二核苷酸分子的铝纳米粒疫苗佐剂-传递系统及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物药物技术领域，公开了一种表面覆盖磷脂及环二核苷酸分子的铝纳米粒(PLAN‑CDN)构建的疫苗佐剂‑传递系统(VADS)及其制备方法，其佐剂为纳米铝，在铝纳米粒(AN)表面覆盖有磷脂(PL)双分子层，且由环二核苷酸(cyclic di‑nucleotide,CDN)分子修饰。该VADS对于接种部位刺激性小，安全性高，运载疫苗能够通过多种途径接种，提高疫苗诱导机体形成体液及细胞免疫效力，产生高滴度抗原特异性抗体及高水平细胞毒性T淋巴细胞，是一种安全、高效VADS。

Description

表面覆盖磷脂及环二核苷酸分子的铝纳米粒疫苗佐剂-传递 系统及其制备方法
技术领域
本发明属于生物制剂领域，具体涉及一种基于铝亲磷性构建的表面覆盖磷脂及环二核苷酸分子的铝纳米粒(PLAN-CDN)疫苗佐剂-传递系统(VADS)及其制备方法。
背景技术
疫苗是能够诱导机体产生抗体的免疫原物质，是用于防治传染性疾病、肿瘤、自身免疫性疾病的生物制剂。目前疫苗从主要成分性质上分类，包括如下5种类型。1)灭活疫苗：是采用物理或化学方法直接杀灭病原体，再添加适当辅助成分制成疫苗制剂。此种疫苗进入机体后不能生长繁殖，对机体刺激时间短，要获得持久免疫力需多次重复接种，或加入疫苗佐剂。2)减毒活疫苗：用人工定向诱变方法消除病原体致病性，或从自然界筛选出无毒力的活微生物制成活疫苗。如卡介苗(BCG，结核病)、麻疹疫苗、脊髓灰质炎疫苗(小儿麻痹症)等。接种后在体内有生长繁殖能力，接近于自然感染，可激发机体对病原的持久免疫力。减毒活疫苗的免疫诱导效果较好，但存在基因突变产生致病性的风险，安全性较差。3)核酸疫苗：包括RNA、DNA两种疫苗，是将蛋白抗原的表达基因克隆在表达载体上，注入体内，使其抗原在体内表达后激发机体产生免疫反应，也存在安全性较低等弱点。4)类毒素(外毒素)：是将细菌外毒素经处理消除毒性而保留免疫原性，成为类毒素，通常加适量磷酸铝和氢氧化铝制备为疫苗制剂。常用的类毒素疫苗有白喉、破伤风等类毒素制剂等，一般用作治疗目的。5)亚单位疫苗(纯抗原组分疫苗)：将诱导机体产生免疫的病原体抗原制备为疫苗。亚单位疫苗免疫原性低，需要疫苗佐剂-传递系统。
各种不同类型疫苗各具特点与优势，但也均存在自身缺陷，概括而言突出表现为以下两方面。1)安全性问题，主要表现在疫苗变异或恢复致病性，而发展亚单位疫苗是提高疫苗安全性有效措施，但亚单位疫苗免疫诱导效力较弱。2)效力问题，尤其是亚单位疫苗，由于只含有抗原成分，缺乏病原体原有的保护成分、病原体相关分子模式等，免疫诱导效力较弱。
针对上述安全性及效力两个问题，疫苗研究人员发展了一些应对策略。其中，发展新型疫苗佐剂-传递系统(adjuvantsystem,VADS)，为提高疫苗效力的有效措施。除传统佐剂铝盐外，皂角苷，角鲨烯，CpG-ODN，cGAMP，乳剂，脂质体，无机纳米粒，高分子纳米载体(如GLPA纳米粒)等，均为目前积极研究的新型VADS。而多种佐剂活性分子与纳米粒子组合形成的VADS兼具佐剂、传递功能，受到广泛重视。这些VADS有效地保护了疫苗抗原(Ag)，提高了疫苗免疫诱导功能，有效地维护了人类健康。但现有疫苗及其佐剂传递系统也存在一些不足，在疫苗诱导效力、稳定性方面，有待于进一步提高。
铝盐是常用的VADS，应用于临床已经有90多年的历史，许多疫苗含有铝盐VADS，如百白破疫苗、流感嗜血杆菌疫苗等。铝佐剂虽然能激活Th2细胞分泌IL-4，进而促进Th2型体液免疫应答产生抗体，但难以有效诱导细胞免疫应答，无法促进机体产生细胞毒性T细胞。此外，铝佐剂还具有的局部刺激性较强等显著弱点此外，传统铝佐剂还有一个突出弱点是，具有较强局部刺激性，常导致接种部位出现炎症反应(Hem SL,Hogenesch H.,Relationship between physical and chemical properties of aluminum-containingadjuvants and immunopotentiation.Expert Rev Vaccines.2007Oct；6(5):685-98.)。
综上，铝盐作为疫苗佐剂，在安全性和免疫刺激效力方面都有待进一步研发优化。
发明内容
针对上述领域的需求和存在的问题，本发明构建了表面覆盖磷脂双分子层的环二核苷酸修饰铝纳米粒(PLAN-CDN)，用作安全、高效疫苗佐剂-传递系统(VADS)。具体技术方案概括如下：
一种表面覆盖磷脂及环二核苷酸分子的铝纳米粒疫苗佐剂-传递系统，其特征在于：具铝纳米粒为载体，在铝纳米粒(AN)表面覆盖有磷脂(PL)双分子层，且由环二核苷酸(cyclic di-nucleotide,CDN)分子修饰。
优选地，所述磷脂为磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰丝氨酸(PS)、鞘磷脂(SP)中一种或多种，优选磷脂酰胆碱。
优选地，所述环二核苷酸选自环二单磷酸鸟苷(c-di-GMP，cyclic dimericguanosine monophosphate)，环二单磷酸腺苷(c-di-AMP，cyclic dimeric adenosinemonophosphate)，环单磷酸鸟苷-单磷酸腺苷(cGAMP，cyclic GMP-AMP)中的一种或多种；进一步优选2’,3’-cGAMP。
优选地，所述磷脂双分子层中还嵌有胆固醇或荷电脂质分子；
优选地，所述荷电脂质分子为十八胺或1，2-二油酰-3-三甲铵基丙烷(DOTAP)；
优选地，所述磷脂与荷电脂质的质量比为6～10:1。
上述任一疫苗佐剂-传递系统，其特征在于：所述铝纳米粒为磷酸铝或氧化铝或氢氧化铝纳米粒；
所述铝纳米粒粒径为100纳米以下；优选平均粒径为35-85纳米；
优选地，所述铝纳米粒为氧化铝纳米粒α结晶型。
优选地，铝纳米粒/环二核苷酸/磷脂的质量比为40:x:(10-x)，x＝1～2
本发明的另一方面，还提供上述疫苗佐剂-传递系统的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制得环二核苷酸修饰的铝纳米粒：取铝纳米粒水溶液，在搅拌条件下加入环二核苷酸水溶液，搅拌均匀，即形成环二核苷酸修饰的铝纳米粒；
(2)与磷脂材料混合：在搅拌且温度高于磷脂相变温度以上的条件下，与磷脂材料混合，继续搅拌至混合均匀，即得疫苗佐剂-传递系统PLAN-CDN；
优选地，磷脂材料是附着于容器壁的磷脂薄膜、或磷脂的乙醇溶液、或脂质体溶液；
优选地，其中铝纳米粒、环二核苷酸、磷脂的质量比为40:x:(10-x)，x＝1～2。
本发明的再一方面，提供一种VADS运载疫苗，其特征在于：是在权利要求1至5任一项所述的疫苗佐剂-传递系统的分子上连接或吸附有疫苗成分。
优选地，疫苗成分为病原体抗原(Ag)或灭活病原体；
优选地，所述VADS运载疫苗的剂型为液体制剂或冷冻干燥获得的冻干品；
本发明也提供上述VADS运载疫苗的制备方法，其特征在于：
获得任一前述的疫苗佐剂-传递系统PLAN-CDN；
然后将病原体抗原吸附于PLAN-CDN表面；
优选地，AN/CDN/PL质量比为40:x:(10-x)，x＝1～2，AN/Ag质量比为40:1～4；
本发明也提供上述VADS运载疫苗的另一种制备方法，其特征在于：
(1)制得环二核苷酸修饰的铝纳米粒：取铝纳米粒水溶液，在搅拌条件下加入环二核苷酸水溶液，搅拌均匀，即形成环二核苷酸修饰的铝纳米粒；
(2)吸附抗原：将病原体抗原吸附于环二核苷酸修饰的铝纳米粒表面；
(3)与磷脂材料混合：在搅拌且温度高于磷脂相变温度以上的条件下，与磷脂材料混合，继续搅拌至混合均匀；
优选地，AN/CDN/Ag/PL质量比为40:x:y:(10-x-y)，x＝1～2，y＝1～4。
本发明利用铝亲磷性，以传统佐剂铝盐(Alum)为基础，利用了磷脂在水溶液中由于疏水作用能够自排形成双分子层结构的特性，以及铝具有强烈的亲磷性质能够与含有磷酸基团的分子形成牢固的结合载体的特性，构建了表面覆盖磷脂双分子层的环二核苷酸修饰铝纳米粒(phospholipid bilayer-coated aluminum nanoparticles modified withCDN，PLAN-CDN),以磷脂酰胆碱及cGAMP为例，本发明的VADS的结构示意图如图1所示。
在细胞内，磷脂在载体表面形成双分子层保护活性成分、提高安全性及促进细胞摄取作用；铝纳米粒具有改善佐剂作用,以发挥提高安全性、促进细胞摄取、及增强与改善诱导免疫应答功能。实验数据表明，如实施例1的数据显示，与等剂量、不同方式接种的两对照组小鼠相比较，接种本发明VADS运载疫苗的小鼠，其抗原特异性抗体水平分别提高了4.1倍和2.2倍，产生细胞毒性T细胞(CTL)提高了5.5倍和2.3倍，干扰素γ(IFN-γ)水平提高了3.4倍和2.1倍，可见，本发明VADS运载疫苗是有效的多功能VADS，运载抗原能够高效诱导接种鼠产生Th1/Th2混合型免疫应答。实施例2的数据显示，本发明构建的疫苗传递佐剂系统适于多途径接种。
综上，本发明的有益效果是：本发明构建的疫苗传递佐剂系统适于多途径接种：可以通过腔道粘膜接种，也可以通过皮下、皮内、肌肉注射接种。
安全性高：磷脂双分子层具有良好生物相容性，并且能够促进细胞摄取VADS。免疫诱导效力强：铝纳米粒激活免疫系统产生体液免疫，而环二核苷酸(CDN)能够激活STING通路，诱导Th1免疫反应，促进细胞免疫。
附图说明
图1是以磷脂酰胆碱及2’,3’-cGAMP为例描述本发明的VADS结构示意图。
图2为实施例1中接种不同处方疫苗小鼠血清抗体IgG水平(n＝5)；AM为传统氢氧化铝佐剂；AN为氢氧化铝纳米粒；cGAMP为2’3’-cGAMP；***p<0.01。
图3为实施例1中接种不同疫苗小鼠产生的抗原特异性细胞毒性T细胞(anti-AgCTL)(n＝5)；AM为传统氢氧化铝佐剂；AN为氢氧化铝纳米粒；cGAMP为2’3’-cGAMP；***p<0.01。
图4为实施例1中接种不同处方疫苗小鼠脾细胞再次受到抗原刺激产生IFN-γ水平(n＝5)；AM为传统氢氧化铝佐剂；AN为氢氧化铝纳米粒；cGAMP为2’3’-cGAMP；***p<0.01。
图5为实施例2中接种不同处方疫苗小鼠血清IgG及肺灌洗液(BALF)IgA抗体水平(n＝5)；AM为传统氢氧化铝佐剂；AN为氧化铝纳米粒；cGAMP为2’3’-cGAMP；***p<0.01。
图6为实施例2中接种不同处方疫苗小鼠产生抗原特异性CTL水平(n＝5)；AM为传统氢氧化铝佐剂；AN为氧化铝纳米粒；cGAMP为2’3’-cGAMP，***p<0.01。
图7为实施例2中接种不同处方疫苗小鼠脾细胞再次受到抗原刺激产生IFN-γ水平(n＝5)；AM为传统氢氧化铝佐剂；AN为氧化铝纳米粒；cGAMP为2’3’-cGAMP，***p<0.01。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
本专利涉及的词语缩写：CDN，cyclic di-nucleotide(环二核苷酸)；c-di-GMP，(环二单磷酸鸟苷)；c-di-AMP，(环二单磷酸腺苷)；2’,3’-cGAMP，(2’,3’-环鸟腺单磷酸苷)；3’,3’-cGAMP，(3’3’-环鸟腺单磷酸苷)；PLAN-CDN,phospholipid bilayer-coatedaluminum nanoparticles modified with CDN(表面覆盖磷脂双分子层的环二核苷酸修饰铝纳米粒)，疫苗佐剂-传递系统(vaccine adjuvant-delivery system,VADS)。SPC,soyphosphatidylcholine(豆磷脂酰胆碱)；PE,phosphatidylethanolamine(磷脂酰乙醇胺)；DOPG,1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol)(1,2-二油酰磷脂酰甘油)；DOTAP,1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane(1，2-二油酰-3-三甲铵基丙烷)；CHO，cholesterol(胆固醇)。
试剂与材料来源：
磷酸铝纳米粒：采用微乳化-混合法自制，具体见参考文献(J.Li,Y.C.Chen,Y.C.Tseng,S.Mozumdar,L.Huang,Biodegradable calcium phosphate nanoparticlewith lipid coating for systemic siRNA delivery,J.Control.Release,142(3)(2010),pp.416-421)。
氢氧化铝纳米粒：采用酸碱中和法自制，具体见参考文献(Li X,Aldayel AM,CuiZ.2014.Aluminum hydroxide nanoparticles show a stronger vaccine adjuvantactivity than traditional aluminum hydroxide microparticles.J ControlRelease.173:148–157.)。
氧化铝纳米粒：采用铝氧化法制备，具体见参考文献(M Changmai,J Priyesh,MPurkait,Al2O3 nanoparticles synthesized using various oxidizing agents:Defluoridation performance,J Sci:Adv Mater device 2017,Volume 2,Issue 4,December 2017,Pages483-492.)。
环二单磷酸鸟苷(c-di-GMP)：购自InvivoGen(San Diego,CA,USA)，货号tlrl-nacdg，CAS NO:61093-23-0。
环二单磷酸腺苷(c-di-AMP)：购自InvivoGen(San Diego,CA,USA)，货号tlrl-nacda，CAS NO:54447-84-6。
2’,3’-环鸟腺单磷酸苷(2’,3’-cGAMP)：购自InvivoGen(San Diego,CA,USA)，货号tlrl-nagpap,CAS NO:1441190-66-4。
3’3’-环鸟腺单磷酸苷(3’,3’-cGAMP)：购自InvivoGen(San Diego,CA,USA)，货号tlrl-napgpa，CAS NO:20137-01-3。
卵清蛋白(ovalbumin,OVA):购自Sigma-Aldrich(中国上海)，货号A5378-10G。
豆磷脂酰胆碱(soy phosphatidylcholine,SPC)：购自艾伟拓(上海)医药科技有限公司，CAS号8030-76-0。
磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine,PE)：购自艾伟拓(上海)医药科技有限公司，CAS号4004-05-1。
1,2-二油酰磷脂酰甘油(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol),DOPG)：购自艾伟拓(上海)医药科技有限公司，CAS号62700-69-0。
1,2-二油酰基-三甲胺基丙烷(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane,DOTAP)：购自艾伟拓(上海)医药科技有限公司，CAS号132172-61-3。
传统磷酸铝佐剂(
Figure BDA0002632080690000062
adjuvant)：购自InvivoGen(San Diego,CA,USA)，货号vac-phos-250。
传统氢氧化铝佐剂
Figure BDA0002632080690000061
购自InvivoGen(San Diego,CA,USA)，货号vac-alu-250。
其余试剂如未表明，均为本领域常规试剂，可商购获得。
实施例1：表面覆盖SPC/DOTAP/cGAMP氢氧化铝纳米粒疫苗佐剂-传递系统及其构建的亚单位疫苗(抗原结合于PLAN-CDN载体表面)
取含有氢氧化铝纳米粒(AN，平均粒径80纳米)的水溶液(1％，w/v)适量，在25℃、200rpm(200转/分钟)搅拌条件下，按照AN/cGAMP＝20:1质量比，缓慢滴加2’,3’-cGAMP水溶液，继续搅拌20min，得到AN-cGAMP水溶液。
另按照SPC/DOTAP质量比8:1取脂质材料，置于梨形玻璃瓶，加氯仿溶解，35℃旋转蒸发除去有机溶剂，形成SPC/DOTAP薄膜。
以AN-cGAMP水溶液水化附着于容器内壁的SPC/DOTAP薄膜，控制AN/SPC质量比例为5:1，在25℃、200rpm搅拌20分钟，形成PLAN-cGAMP。
再按照质量比AN/OVA＝10:1，在25℃、200rpm搅拌条件下，缓慢滴加模型抗原卵清蛋白(ovalbumin,OVA)，继续搅拌20分钟，形成OVA-PLAN-cGAMP；加入HEPES(羟乙基哌嗪乙硫磺酸)缓冲液调为等渗，即制备为OVA-PLAN-cGAMP亚单位疫苗。
动态光散射(DLS)检测表明：平均粒径为80纳米氢氧化铝AN，制备得到的OVA-PLAN-cGAMP平均粒径为96纳米。动态光散射检测条件为25℃，水介质，90度角，仪器为Zetasizer Nano ZS90(Malvern Panalytical公司)。
采用micro-Bradford protocol方法，对于OVA进行定量测定(具体步骤见参考文献(S Zuo,P Lundahl,A micro-Bradford membrane protein assay,Anal Biochem 284(1)(2000)162-4.)，以下列公式计算包封率(载体表面结合率)AE为91％。
AE(％)＝(总OVA-游离OVA)/总OVA×100％
按照2μg/50μL OVA剂量，通过肌肉注射给小鼠接种。
接种3周后，检测实验组和对照组小鼠(OVA+商品传统氢氧化铝佐剂、OVA+氢氧化铝纳米粒)免疫应答反应，包括ELISA检测小鼠血清抗原特异性抗体(IgG)水平，流式细胞分析检测细胞毒性T细胞(CTL,即荧光标记SIINFEKLH-I+CD8+T cell)水平，以及ELISA检测抗原再刺激免疫鼠脾细胞分泌IFN-γ水平(各参数具体检测方法见参考文献(Wang N,ZhenY,Jin Y,Wang X,Li N,Jiang S,Wang T.Combining different types ofmultifunctional liposomes loaded with ammonium bicarbonate to fabricatemicroneedle arrays as a vaginal mucosal vaccine adjuvant-dual delivery system(VADDS).J Control Release.2017 Jan28；246:12-29.)。检测结果如图2、3、4所显示。
图2为接种不同处方疫苗小鼠血清抗体IgG水平(n＝5)；AM，为氢氧化铝佐剂(aluminum microparticles)；AN，为氢氧化铝纳米粒；cGAMP，为2’3’-cGAMP；检测时血清进行1:3200倍稀释，***p<0.01。
图3为接种不同疫苗小鼠产生的抗原特异性细胞毒性T细胞(anti-AgCTL)(n＝5)；AM，为氢氧化铝佐剂(aluminum microparticles)；AN，为氢氧化铝纳米粒；cGAMP，为2’3’-cGAMP；检测时血清进行1:3200倍稀释，***p<0.01。
图4为接种不同处方疫苗小鼠脾细胞再次受到抗原刺激产生IFN-γ水平(n＝5)。AM，为氢氧化铝佐剂(aluminum microparticles)；AN，为氢氧化铝纳米粒；cGAMP，为2’3’-cGAMP；检测时血清进行1:3200倍稀释，***p<0.01。
可以看出，与等剂量、同样方式接种的两对照组小鼠相比较，接种本发明OVA-PLAN-cGAMP的小鼠，其抗原特异性抗体水平分别提高了4.1倍和2.2倍，产生细胞毒性T细胞(CTL)提高了5.5倍和2.3倍，干扰素γ(IFN-γ)水平提高了3.4倍和2.1倍。
可见，PLAN-cGAMP是有效的多功能VADS，运载抗原能够高效诱导接种鼠产生Th1/Th2混合型免疫应答。
实施例2:表面覆盖SPC/cGAMP氧化铝纳米粒疫苗佐剂-传递系统及其构建的亚单位疫苗(抗原吸附于AN表面)
取含有平均粒径50纳米的α晶型氧化铝纳米粒(AN)的水溶液(1％，w/v)适量，在25℃、200rpm搅拌条件下，按照AN/cGAMP＝20:1质量比，缓慢滴加2’,3’-cGAMP水溶液，继续搅拌20min，得到AN-cGAMP水溶液。
将得到AN-cGAMP水溶液，按照质量比AN/OVA＝10:1，在25℃、200rpm搅拌条件下，缓慢滴加模型抗原OVA，继续搅拌20分钟，得到OVA-AN-cGAMP水溶液。
另取1％(w/v)SPC脂质体水溶液(薄膜分散法制备)，按照AN/SPC质量比8:1，与以上得到的得到OVA-AN-cGAMP水溶液混合，在25℃、200rpm条件下搅拌20分钟，形成OVA-PLAN-cGAMP；加入HEPES缓冲液调为等渗，即制备为OVA-PLAN-cGAMP亚单位疫苗。
按照实施例1方法对OVA-PLAN-cGAMP进行表征，DLS检测表明，平均粒径为50纳米氧化铝AN，制备得到OVA-PLAN-cGAMP平均粒径为63纳米，对于OVA的AE为98％。
按照5μg/50μL OVA剂量，通过吸入肺黏膜给小鼠接种。
接种3周后，按照实施例1方法检测实验组和对照组小鼠(OVA+商品传统氢氧化铝佐剂，通过肌肉注射接种；OVA+氧化铝纳米粒，通过吸入接种)免疫应答反应，包括检测小鼠血清IgG水平，肺灌洗液(Broncho-alveolar Lavage Fluid，BALF)IgA，细胞毒性T细胞(CTL,即荧光标记SIINFEKLH-I+CD8+T cell)水平，以及IFN-γ水平，检测结果如图5、6、7所显示。
图5为接种不同处方疫苗小鼠血清IgG及肺灌洗液(BALF)IgA抗体水平(n＝5)；AM为氢氧化铝佐剂(aluminum microparticles)；AN为氧化铝纳米粒；cGAMP为2’3’-cGAMP；检测时血清进行1:3200倍稀释，BALF进行100倍稀释，***p<0.01。
图6为接种不同处方疫苗小鼠产生抗原特异性CTL水平(n＝5)；AM为氢氧化铝佐剂(aluminum microparticles)；AN为氧化铝纳米粒；cGAMP为2’3’-cGAMP，***p<0.01。
图7为接种不同处方疫苗小鼠脾细胞再次受到抗原刺激产生IFN-γ水平(n＝5)；AM为氢氧化铝佐剂(aluminum microparticles)；AN为氧化铝纳米粒；cGAMP为2’3’-cGAMP，***p<0.01。
可以看出，与等剂量、不同方式接种的两对照组小鼠相比较，接种本发明OVA-PLAN-cGAMP的小鼠，其血清抗原特异性抗体IgG水平分别提高了3.3倍和2.1倍，其肺部灌洗液抗原特异性抗体IgA水平分别提高了14.5倍和2.4倍，产生细胞毒性T细胞(CTL)提高了4.0倍和2.3倍，干扰素γ(IFN-γ)水平提高了3.7倍和2.6倍。
可见，PLAN-cGAMP是有效的多功能VADS，运载抗原适用于不同接种方式，能够高效诱导接种鼠产生Th1/Th2混合型免疫应答。
(注：由于普通氢氧化铝佐剂呈现凝胶状，吸入肺部阻塞小鼠呼吸，引起死亡，故采用肌肉注射接种做对照)。
实施例3:表面覆盖DOPG的c-di-AMP修饰氢氧化铝纳米粒疫苗佐剂-传递系统
取含有氢氧化铝纳米粒(平均粒径65纳米)的水溶液(1％，w/v)适量，在25℃、搅拌条件下，按照AN/c-di-AMP＝40:1最终质量比，滴加c-di-AMP水溶液，继续搅拌20min；再按照AN:OVA质量比20:1，在25℃、搅拌条件下，加入模型抗原OVA，继续搅拌20分钟，得到OVA-AN-c-di-AMP水溶液；在25℃、搅拌条件下，将2％(w/v)DOPG脂质体水溶液滴入OVA-AN-c-di-AMP水溶液中，至AN/DOPG质量比为40:7，继续搅拌20分钟，形成OVA-PLAN-c-di-AMP；加入HEPES缓冲液调为等渗，即制备为以PLAN-c-di-AMP为VADS的亚单位疫苗。
动态光散射(DLS)检测表明，OVA-PLAN-c-di-AMP平均粒径为78纳米，对于OVA包封率为99％。
按照2μg/50μLOVA剂量，通过皮下注射给小鼠接种，3周后按照实施例1方法检测实验组和等剂量、同样方式接种的对照组小鼠(OVA+传统氢氧化铝佐剂、OVA+氢氧化铝纳米粒)的免疫应答反应。
检测结果显示，与两对照组相比较，接种本发明的OVA-PLAN-c-di-AMP的小鼠，其血清抗原特异性抗体IgG水平分别提高了4.1倍和2.9倍，产生细胞毒性T细胞(CTL)分别提高了3.4倍和1.4倍，IFN-γ水平分别提高了1.8倍和1.4倍。可见，PLAN-c-di-AMP是有效的多功能VADS，运载抗原能够高效诱导接种鼠产生Th1/Th2混合型免疫应答。
实施例4:表面覆盖SPC/CHO的2’,3’-cGAMP修饰氧化铝纳米粒疫苗佐剂-传递系统
取含有氧化铝纳米粒(平均粒径35纳米，α-晶型)的水溶液(1％，w/v)适量，在25℃、搅拌条件下，按照AN/cGAMP＝40:1.5最终质量比，滴加2’,3’-cGAMP水溶液，继续搅拌20min，形成AN-cGAMP；再按照AN/OVA质量比40:1.5，在25℃、搅拌条件下，加入抗原OVA，继续搅拌20分钟，得到OVA-AN-cGAMP水溶液。另按照SPC:CHO质量比8:1取材料，置于梨形玻璃瓶，加氯仿溶解，35℃旋转蒸发除去有机溶剂，形成SPC/CHO脂质薄膜。
在40℃、搅拌条件下，以OVA-AN-cGAMP水溶液水化附着于容器内壁的SPC/CHO脂质薄膜，控制AN/SPC/CHO质量比例为40:5:2，保持温度、继续搅拌20分钟，形成OVA-PLAN-cGAMP；加入HEPES缓冲液调为等渗，即制备为以PLAN-cGAMP为VADS的亚单位疫苗。
动态光散射(DLS)检测表明OVA-PLAN-cGAMP平均粒径为47纳米，对于OVA包封率为100％。
按照4μg/50μL OVA剂量，通过吸入小鼠肺部黏膜接种，3周后按照实施例1的方法检测实验组和对照组小鼠(OVA+传统氢氧化铝佐剂，等剂量肌肉注射接种；OVA+氧化铝纳米粒，等剂量吸入肺部接种)的免疫应答反应。
检测结果显示，与两对照组小鼠相比较，接种OVA-PLAN-cGAMP的小鼠，其血清抗原特异性抗体IgG水平分别提高了5.7倍和3.4倍，CTL提高了4.3倍和2.1倍，IgG2a/IgG1比值提高了2.2倍和1.7倍，IFN-γ提高了1.9倍和1.3倍；同时在鼠肺洗液均检测到了IgA，其平均滴度水平分别是对照组的7.7倍和3.9倍，表明小鼠既产生了系统免疫应答，也产生了粘膜免疫应答。
实施例5:表面覆盖SPC的3’,3’-cGAMP修饰氧化铝纳米粒疫苗佐剂-传递系统
取含有氧化铝纳米粒(平均粒径35纳米，α-晶型)的水溶液(1％，w/v)适量，在25℃、搅拌条件下，按照AN/cGAMP＝20:1最终质量比，滴加3’,3’-cGAMP水溶液，继续搅拌20min，形成AN-cGAMP；再按照AN/OVA质量比10:1，在25℃、搅拌条件下，加入模型抗原OVA，继续搅拌20分钟，得到OVA-AN-cGAMP水溶液；在25℃、搅拌条件下，将SPC脂质体水溶液滴入OVA-AN-cGAMP水溶液，控制AN/SPC质量比例为10:1，保持温度、继续搅拌20分钟，形成OVA-PLAN-cGAMP；加入HEPES缓冲液调为等渗，即制备为以PLAN-cGAMP为VADS的亚单位疫苗。
动态光散射(DLS)检测表明，OVA-PLAN-cGAMP平均粒径为45纳米，对于OVA包封率为99.7％。
按照1μg/50μL OVA剂量，通过雌性小鼠生殖道黏膜接种，3周后检测实验组与等剂量、同样方式接种的两对照组(OVA+氢氧化铝传统佐剂、OVA+氧化铝纳米粒)的免疫应答反应。
结果显示，接种本发明OVA-PLAN-cGAMP的小鼠，其血清抗原特异性抗体IgG水平分别提高了4.5倍和2.3倍，CTL提高了3.9倍和2.2倍，IgG2a/IgG1比值提高了2.1倍和1.5倍，IFN-γ提高了1.6倍和1.3倍；同时在生殖道冲洗液均检测到了IgA，其平均滴度水平分别是对照组的8.2倍和4.7倍，表明小鼠既产生了系统免疫应答，也产生了粘膜免疫应答。
实施例6:表面覆盖SPC/CHO的2’,3’-cGAMP修饰氧化铝纳米粒冻干品疫苗佐剂-传递系统
将实施例3得到的PLAN-cGAMP-OVA溶液，加入蔗糖，蔗糖终浓度达到5％(w/v)，通过冷冻干燥获得冻干品，冷冻保藏。
取出冷冻保藏的冻干品进行实验，接种前，加入与冻干前相同体积的纯水水化，获得PLAN-cGAMP-OVA溶液，动态光散射(DLS)检测VADS粒径、包封率无变化。
按照2μg/50μL OVA剂量，通过皮下注射给小鼠接种，3周后检测实验组与等剂量同样方式接种的两对照组(OVA+传统氢氧化铝佐剂、OVA+氧化铝纳米粒)的免疫应答反应。
结果发现，接种本发明冻干品的小鼠，相对于对照组，产生的OVA特异性抗体水平提高了3.8倍和3.1倍，CTL提高了4.2倍和1.9倍，IgG2a/IgG1比值提高了2.0倍和1.6倍，IFN-γ提高了1.9倍和1.5倍，表明接种鼠产生Th1/Th2混合型免疫应答。

Claims (5)

1.一种基于表面覆盖磷脂及环二核苷酸分子的铝纳米粒疫苗佐剂-传递系统的亚单位疫苗，其特征在于，采用以下步骤制得：
取含有平均粒径80纳米且w/v浓度为1%的氢氧化铝纳米粒AN的水溶液适量，在25℃、200 rpm搅拌条件下，按照质量比AN/cGAMP 等于20:1，缓慢滴加2’,3’-cGAMP水溶液，继续搅拌20 min，得到AN-cGAMP水溶液；
另按照SPC/DOTAP 质量比8:1取脂质材料，置于梨形玻璃瓶，加氯仿溶解，35℃旋转蒸发除去有机溶剂，形成SPC/DOTAP薄膜；
以AN-cGAMP水溶液水化附着于梨形玻璃瓶内壁的SPC/DOTAP薄膜，控制AN/SPC质量比例为5 : 1，在25℃、200 rpm搅拌20分钟，形成PLAN-cGAMP；
再按照质量比AN/OVA为10:1，在25℃、200 rpm搅拌条件下，缓慢滴加模型抗原卵清蛋白，继续搅拌20分钟，形成OVA-PLAN-cGAMP；加入HEPES缓冲液调为等渗，即制备为OVA-PLAN-cGAMP亚单位疫苗。
2.一种基于表面覆盖磷脂及环二核苷酸分子的铝纳米粒疫苗佐剂-传递系统的亚单位疫苗，其特征在于，采用以下步骤制得：
取含有平均粒径50纳米且w/v浓度为1%的α晶型氧化铝纳米粒AN的水溶液适量，在25℃、200 rpm搅拌条件下，按照质量比AN/cGAMP 为 20:1，缓慢滴加2’,3’-cGAMP水溶液，继续搅拌20 min，得到AN-cGAMP水溶液；
将得到的AN-cGAMP水溶液，按照质量比AN/OVA为10:1，在25℃、200 rpm搅拌条件下，缓慢滴加模型抗原OVA，继续搅拌20分钟，得到OVA-AN-cGAMP水溶液；
另取w/v浓度为1%的以薄膜分散法制备得到的SPC脂质体水溶液，按照AN/SPC质量比8:1，与所述OVA-AN-cGAMP水溶液混合，在25℃、200 rpm条件下搅拌20分钟，形成OVA-PLAN-cGAMP；加入HEPES缓冲液调为等渗，即制备为OVA-PLAN-cGAMP亚单位疫苗。
3.一种基于表面覆盖磷脂及环二核苷酸分子的铝纳米粒疫苗佐剂-传递系统的亚单位疫苗，其特征在于，采用以下步骤制得：
取含有平均粒径65纳米且w/v浓度为1%的氢氧化铝纳米粒AN的水溶液适量，在25℃、搅拌条件下，按照最终质量比AN/c-di-AMP为40:1，滴加c-di-AMP水溶液，继续搅拌20 min；
再按照AN : OVA 质量比20 : 1，在25℃、搅拌条件下，加入模型抗原OVA，继续搅拌20分钟，得到OVA-AN-c-di-AMP水溶液;
在25℃、搅拌条件下，将w/v 为2%的DOPG脂质体水溶液滴入所述OVA-AN-c-di-AMP水溶液中，至AN/DOPG质量比为40:7，继续搅拌20分钟，形成OVA-PLAN-c-di-AMP；加入HEPES缓冲液调为等渗，即制备为以PLAN-c-di-AMP为VADS的亚单位疫苗。
4.一种基于表面覆盖磷脂及环二核苷酸分子的铝纳米粒疫苗佐剂-传递系统的亚单位疫苗，
其特征在于，采用以下步骤制得：
取含有平均粒径35纳米且w/v浓度为1%的α-晶型氧化铝纳米粒AN的水溶液适量，在25℃、搅拌条件下，按照最终质量比AN/cGAMP 为40:1.5，滴加2’,3’-cGAMP水溶液，继续搅拌20 min，形成AN-cGAMP；
再按照AN/OVA质量比40:1.5，在25℃、搅拌条件下，加入抗原OVA，继续搅拌20分钟，得到OVA-AN-cGAMP水溶液;
另按照SPC : CHO 质量比8:1取材料，置于梨形玻璃瓶，加氯仿溶解，35℃旋转蒸发除去有机溶剂，形成SPC/CHO脂质薄膜；
在40℃、搅拌条件下，以OVA-AN-cGAMP水溶液水化附着于梨形玻璃瓶内壁的SPC/CHO脂质薄膜，控制AN/SPC/CHO质量比例为40:5:2，保持温度、继续搅拌20分钟，形成OVA-PLAN-cGAMP；加入HEPES缓冲液调为等渗，即制备为以PLAN-cGAMP为VADS的亚单位疫苗。
5.一种基于表面覆盖磷脂及环二核苷酸分子的铝纳米粒疫苗佐剂-传递系统的亚单位疫苗，
其特征在于，采用以下步骤制得：
取含有平均粒径35纳米且w/v浓度为1%的α-晶型氧化铝纳米粒AN的水溶液适量，在25℃、搅拌条件下，按照最终质量比AN/cGAMP 为20:1，滴加3’,3’-cGAMP水溶液，继续搅拌20min，形成AN-cGAMP；
再按照AN/OVA质量比10:1，在25℃、搅拌条件下，加入模型抗原OVA，继续搅拌20分钟，得到OVA-AN-cGAMP水溶液；
在25℃、搅拌条件下，将SPC脂质体水溶液滴入OVA-AN-cGAMP水溶液，控制AN/SPC质量比例为10:1，保持温度、继续搅拌20分钟，形成OVA-PLAN-cGAMP；加入HEPES缓冲液调为等渗，即制备为以PLAN-cGAMP为VADS的亚单位疫苗。
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