CN114588257A - 一种安全且高效的全面免疫应答的纳米乳/铝凝胶复合佐剂系统及其应用 - Google Patents

一种安全且高效的全面免疫应答的纳米乳/铝凝胶复合佐剂系统及其应用 Download PDF

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罗兴
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杨赟
张泽珑
孙存
郑海林
陈婷
曾浩
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邹全明
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Abstract

本发明涉及疫苗佐剂领域，具体涉及到一种安全且高效的全面免疫应答的纳米乳/铝凝胶复合佐剂系统及其应用，所述的复合佐剂系统能够显著增强体液免疫应答且明显具有缓释特征的铝盐凝胶佐剂以及快速增强细胞免疫应答的纳米乳佐剂构成。该复合佐剂系统佐剂中的铝盐和纳米乳采用缓释和速释放制剂相结合，高效体液和细胞免疫应答相结合的协同作用能够促进树突状细胞、巨噬细胞等抗原呈递细胞递送，更高效地启动免疫应答，形成更稳定、更持久、更全面的免疫记忆。该复合佐剂系统制备工艺简单、原料易得、便于大规模产业化应用，与重组亚单位疫苗联合使用后比临床上广泛使用的单一铝盐和纳米乳佐剂效果更好。

Description

一种安全且高效的全面免疫应答的纳米乳/铝凝胶复合佐剂 系统及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种安全且高效的全面免疫应答的纳米乳/铝凝胶复合佐剂系统，还涉及该复合纳米佐剂系统应用和重组亚单位疫苗。
背景技术
疫苗在免疫防治重大感染性疾病中发挥着极其重要的作用，但作为疫苗重要组成部分的免疫佐剂由于其成分及引起的免疫应答效应相对单一，极大的限制了现代新型疫苗免疫保护作用的充分发挥。佐剂在疫苗组成中发挥重要作用。目前，铝盐凝胶和MF59为代表乳剂、高分子聚、合物微球、凝胶制剂、缓释支架和植入剂，具有药物储库作用，可以保持抗原的天然结构，并能减缓抗原的释放，达到高效低毒的免疫效果，有一定的缓释或速释作用。但上述单一佐剂系统的所激发免疫应答维持时间不够长，其疫苗的持久性和长效记忆性根本无法实现，极大的限制了疫苗的应用。单一佐剂激发机体免疫应答水平低、偏置Th1或Th2型反应、提呈递送细胞能力弱、有毒性、副作用大，故而限制了其作为另一“免疫原”辅助抗原达到双重激发抗体生成的应用发展，复合化佐剂尤其是复合佐剂系统已成为新佐剂发展趋势。
铝盐应用于临床已经有80多年的历史，它是首个被美国FDA批准可以用于人的经典佐剂。许多疫苗的成分中含有铝盐，如百白破疫苗和流感嗜血杆菌疫苗。根据制备过程的不同，以铝盐为佐剂的疫苗可以分为两种：铝吸附疫苗与铝沉淀疫苗。铝吸附疫苗是将抗原加入氢氧化铝或磷酸铝溶液；而铝沉淀疫苗是把铝剂悬浮液加入抗原溶液中。氢氧化铝或者磷酸铝是人们经常使用的铝佐剂。研究发现，铝佐剂疫苗能够减少抗原的使用量，增强机体免疫反应的强度和持久性。铝盐的作用机制至今尚不十分明确，普遍认为抗原吸附铝盐颗粒形成凝胶状态，注射入动物体内后形成抗原贮存库，这些不溶性颗粒能吸附抗原物质，增加了抗原表面积。另外，佐剂能在注射部位形成富含巨噬细胞的肉芽肿，延缓抗原的吸收，进而延长抗原的刺激时间，将在正常条件下存在数日的抗原留存数周之久，且注射部位摄取抗原的能力得到增强。研究表明，氢氧化铝作为佐剂还能激活Th2细胞分泌IL-4，诱导CD83、CD86和MHC-II类分子的表达，进而产生Th2型体液免疫应答。铝盐作为疫苗佐剂有很多优点，但是也存在不足。它虽然可以有效地诱导体液免疫应答，但是对细胞免疫不起作用，不能诱导细胞免疫应答。
意大利于1997年率先批准含MF59佐剂的流感亚单位疫苗复立达上市；2009年欧盟批准含AS03(Montanide)W/O水包油佐剂中加入维生素E制备的AS03)佐剂的H1N1疫苗上市；2009年含AS04佐剂(氢氧化铝和3-O-脱酰单磷酸类脂A制备的AS04佐剂)的人乳头瘤状病毒目前将粒径小于100nm的乳剂称为纳米乳，它由油相-水相-表面活性剂-助表面活性剂组成，连续相为水相、分散相为油相的纳米乳为O/W型，连续相为油相、分散相为水相的纳米乳剂为W/O型。纳米乳具有粒径小且均匀，易于制备，稳定性、流动性均较好，易于注射等优点，可作为药物载体应用于多种吸收方式的药物制剂中。外观呈透明或半透明的纳米乳是由油相、水相、表面活性剂和助表面活性剂按一定比例混合后自发形成的热力学稳定、各向同性、外观透明或半透明的分散体系。纳米乳可作为一种新型疫苗载体，促进疫苗蛋白分子在体内的吸收，从而提高疫苗的免疫效果，同时具有安全性高，稳定性好等优点，在增强疫苗的免疫效果方面将显示独特优势。
AS系列复合佐剂的研发策略及优势在于：在关注疫苗蛋白载药系统的同时，有效结合了包括MPL、QS21、CpG等免疫增强剂或免疫刺激分子，形成了一种成分多样、优势互补的新型复合型免疫佐剂及载药系统，既起到了疫苗接种部位缓释及抗原递送的作用，又能够充分发挥免疫增强剂刺激机体同时产生高效的保护性体液免疫与细胞免疫应答水平。众多的人体临床研究及临床前研究结果证实，具有稳定的免疫应答效果和安全、良好的免疫保护作用。其中，免疫刺激分子作为AS系列佐剂重要的组成成分，其主要的作用是能够在极目前复合佐剂的发展还比较局限，复合中药佐剂、西药复合佐剂、复合黏膜免疫佐剂、ISCOM(Immunostimulating complex)、铝盐佐剂、聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)等都有自身的一些局限性，如ISCOM只有与那些含疏水基团很多的抗原或免疫原才能形成复合体。在临床使用中，某些佐剂也存在诸多问题，引起接种动物局部炎症、肉芽肿或无菌性脓肿，接种动物出现不适、发热、佐剂性关节炎等全身反应。最重要的是，这些复合佐剂虽然能在不同程度上对疫苗的免疫应答效应有一定的增幅，但是却无法解决现在限制疫苗应用的关键性问题——免疫持久性和长效免疫记忆。因此探讨新型复合纳米乳佐剂系统对释放效果、免疫保护作用和免疫记忆的促进作用对疫苗佐剂的应用具有重要作用。全球没有将乳剂与铝盐佐剂进行联合形成复合佐剂，因此本专利将显著增强体液免疫应答的铝盐佐剂以及增强细胞免疫应答的纳米乳进行复合。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种安全且高效的全面免疫应答的纳米乳/铝凝胶复合佐剂系统，本发明的目的之二在于提供所述复合佐剂系统作为疫苗佐剂中的应用；本发明的目的之三在于提供含有所述复合佐剂系统的疫苗。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、一种安全且高效的全面免疫应答的纳米乳/铝凝胶复合佐剂系统，所述复合佐剂系统由增强体液免疫应答的铝盐佐剂和增强细胞免疫应答的纳米乳佐剂构成。
本发明中，所述铝盐佐剂包括氢氧化铝佐剂、磷酸铝佐剂、硫酸铝佐剂、铵明矾佐剂或钾明矾佐剂中的至少一种。
本发明中，所述纳米乳佐剂组成由表面活性剂、助表面活性剂和油相组成。
本发明中，所述表面活性剂为吐温-80、吐温-85、斯潘85、吐温60、聚氧乙烯氢化蓖麻油和聚氧乙烯蓖麻油中任一种或多种组合；所述助表面活性剂为：失水山梨醇脂肪酸酯、C2～C4的一元醇和C2～C4的多元醇中的任一种或多种组合；所述油相为石蜡油、乙酸乙酯、肉豆蔻异丙酯、角鲨烷、角鲨烯、油酸乙酯、辛酸/葵酸三甘油脂中任一种或多种组合。
本发明中，所述铝盐佐剂质量分数为50-80％；所述纳米乳佐剂质量分数为20-50％。
本发明中，所述复合佐剂系统由氢氧化铝佐剂和纳米乳佐剂按质量比为8：2组成，质量分数分别为80％和20％。
2、含有所述复合佐剂系统的疫苗。
优选的，所述佐剂用量为50μg/ml～1.5mg/ml，更优选为200μg/ml～800μg/ml。
3、所述疫苗抗原含量15μg/ml～1.5mg/ml，更优选为60μg/ml～240μg/ml。
4、所述疫苗为金黄色葡萄球菌重组亚单位疫苗。
本发明的有益效果在于：本发明提供了一种安全高效且全面的纳米乳/铝盐凝胶复合佐剂系统，由增强体液免疫应答的铝盐佐剂和增强细胞免疫应答的纳米乳佐剂构成，利用铝盐佐剂和纳米乳佐剂的协同作用，能够促进树突状细胞、巨噬细胞等抗原呈递细胞递送，更高效地启动免疫应答，形成更稳定持久更全面的免疫记忆。该复合佐剂系统制备工艺简单、原料易得、便于产业化应用，与重组亚单位疫苗联合使用后比临床上广泛使用的单一铝盐佐剂效果更好。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为不同复合佐剂系统联合HI抗原免疫后7天抗体滴度；
图2为不同复合佐剂系统联合HI抗原免疫后14天抗体滴度；
图3为不同复合佐剂系统处方联合HI抗原免疫后21天抗体滴度；
图4为不同复合佐剂系统处方粒度分析检测结果；
图5为不同复合佐剂系统处方吸附HI抗原结果图(注释：沉淀蛋白量；H1为NEA：Alun的质量比0：10；H2为NEA：Alun的质量比2：8；H3为NEA：Alun的质量比4：6；H4为NEA：Alun的质量比5：5；H5为NEA：Alun的质量比6：4；H6为NEA：Alun的质量比8：2；H7为NEA：Alun的质量比10：0，H8为HI)；
图6为不同复合佐剂系统处方未吸附HI抗原结果图(注释：沉淀蛋白量；H1为NEA：Alun的质量比0：10，H2为NEA：Alun的质量比2：8；H3为NEA：Alun的质量比4：6，H4为NEA：Alun的质量比5：5；H5为NEA：Alun的质量比6：4，H6为NEA：Alun的质量比8：2；H7为NEA：Alun的质量比10：0，H8为HI)；
图7为不同复合佐剂系统处方联合HI抗原免疫后7天抗体滴度；
图8为不同复合佐剂系统处方联合HI抗原免疫后14天抗体滴度；
图9为不同复合佐剂系统处方联合HI抗原免疫后21天抗体滴度；
图10为不同复合佐剂系统处方联合HI抗原免疫后Th1细胞因子；
图11为不同复合佐剂系统处方联合HI抗原免疫后Th2细胞因子；
图12为3种复合佐剂系统优化处方联合HI抗原免疫后7天抗体滴度；
图13为3种复合佐剂系统优化处方联合HI抗原免疫后14天抗体滴度；
图14为3种复合佐剂系统优化处方联合HI抗原免疫后21天抗体滴度；
图15为最优复合佐剂系统联合HI抗原免疫后7天抗体滴度；
图16为最优复合佐剂系统联合HI抗原免疫后14天抗体滴度；
图17为最优复合佐剂系统联合HI抗原免疫后21天抗体滴度；
图18为最优复合佐剂系统联合HI抗原免疫后Th1细胞因子；
图19为最优复合佐剂系统联合HI抗原免疫后Th2细胞因子。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
本发明中使用的纳米乳佐剂由表面活性剂、助表面活性剂、油相和水制得，首先按表面活性剂与助表面活性剂的质量比(Km值)为2:1、3:1、4:1、5:1混合均匀制成混合表面活性剂。再将表面活性剂与油相，按质量比9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8、1:9精密称取定量的油，置于平底玻璃烧杯中混合均匀，在室温条件下，用恒温磁力搅拌器搅拌，边搅拌边滴加蒸馏水，直至形成外观澄清透明的纳米乳；制得的纳米乳佐剂有蓝色乳光；高速离心(13 000r/m，30min)离心后，稳定不分层；平行光入射后有丁达尔现象；用透射电子显微镜、原子力显微镜和激光粒度仪，检测出纳米乳的粒径在1～100nm之间。
本实施例中表面活性剂为吐温-80、吐温-85、斯潘85、吐温60、聚氧乙烯氢化蓖麻油和聚氧乙烯蓖麻油中任一种或多种组合；助表面活性剂为失水山梨醇脂肪酸酯、C2～C4的一元醇和C2～C4的多元醇中的任一种或多种组合；所述油相为石蜡油、乙酸乙酯、肉豆蔻异丙酯、角鲨烷、角鲨烯、油酸乙酯、辛酸/葵酸三甘油脂中任一种或多种组合。也可以使用公开号为CN101961314A和CN105251002A中国专利公开的纳米乳佐剂的处方均能实现发明目的。
复合佐剂制备方法如下：所述复合佐剂制备方法如下：
(1)按处方取表面活性剂、助表面活性剂和油相，混匀后，在温度为4～37℃、转速为50-500转/分钟条件下搅拌均匀，逐滴加水，利用低能乳化法或转相法制备出澄清透明的纳米乳佐剂。
(2)根据复合佐剂用量，吸取铝盐凝胶佐剂原液和纳米乳佐剂原液(NEA)至塑料无菌和无热源的离心管中，用涡旋震荡仪(4-6档，震荡15s-1min)混合均匀、密封。
(3)4℃-25℃条件下用摇床震荡(100-200rpm)，吸附12-14h后制备而成，标记、分装、密封即形成复合佐剂。
本发明以金黄色葡萄球菌(MRSA)重组亚单位HI抗原为例。
实施例1、不同复合佐剂联合金黄色葡萄球菌(MRSA)重组亚单位疫苗HI抗原对正常小鼠免疫的应答作用检测
取在SPF环境下的BALB/c小鼠32只，平均随机分为4组，每组8只，每组分别编号为1～4，分别肌肉注射含有全面激发免疫应答反应的纳米乳/铝盐凝胶复合佐剂系统结合金黄色葡萄球菌重组(HI抗原)疫苗，4组复合佐剂的比例均为1:1。每只小鼠注射HI抗原为60μg(抗原最终浓度240μg/ml)，复合佐剂总量为200μg(佐剂最终浓度800μg/ml)，注射体积为250μL，分别在0、0、7天三次对Blab/c小鼠进行肌肉双侧各注射免疫125μl。在首免后第7天、14天、21天检测其血清特异性IgG抗体滴度，各组的复合佐剂具体配比如下表1所示。
表1、各组注射的复合佐剂具体处方表
Figure BDA0003533075320000051
Figure BDA0003533075320000061
各实验组中平均血清特异性抗体情况具体如图1～3所示。通过图1～3可见，4种复合佐剂联合金黄色葡萄球菌(MRSA)重组亚单位疫苗HI抗原后，对正常小鼠免疫的应答作用效应中，NEA/Al(OH)3较其他三种复合佐剂更能够诱导更高的免疫应答效应。
实施例2、不同复合佐剂系统处方粒度分析检测
将NEA和AL(OH)3按不同比例配制成复合佐剂后，再吸附HI抗原配制成不同抗原量、佐剂总量、佐剂比例的9种不同的处方组别，每组编号分别为F1～F9。将9种处方原液用纯水稀释200倍后检测其粒度大小，各组250μL疫苗复合佐剂抗原具体配比如下表2所示：
表2、各组粒度检测具体处方表
Figure BDA0003533075320000062
各实验组中平均粒度分析检测如图4所示。通过图4可见，与其他各组复合佐剂处方相比，第3组复合佐剂处方具有最小的粒度，在后续在实验中，粒度更小的复合佐剂处方能够更好的传递抗原和促进免疫应答效应。
实施例3、不同复合佐剂系统处方对HI抗原的吸附效率
将NEA和Al(OH)3按照不同比例制备成复合佐剂，佐剂质量比例分别为0:10、2:8、4:6、5:5、6:4、8:2、10:0，7种不同比例的复合佐剂吸附抗原120μg(抗原最终浓度：600μg/ml)、佐剂总量为40μg(佐剂最终浓度200μg/ml),。形成200μl佐剂抗原复合物后离心分离出上清和沉淀，12000r/min，分离10min。将上清用纯水稀释40倍和用200μl水重悬沉淀制备样品。将20ul样品中加入5ul的5×变性蛋白上样缓冲液，煮沸5分钟。取10μl煮沸样品与5ul蛋白预染蛋白Marker(10-245kDa，PM22010，达科为)于SDS-PAGE蛋白凝胶(蛋白凝胶试剂盒，PG12101，达科为)，恒压80V电泳至分离胶，恒压120V，直至溴酚蓝指示剂达到分离胶底部结束电泳。瞬蓝染色15-30min,过夜脱色，用蛋白凝胶电泳仪拍照，检测上清和沉淀中的HI抗原含量，评价不同比例的复合佐剂系统对HI抗原的吸附效率。
各实验组中不同复合佐剂处方对HI抗原的吸附效率如图5～6所示。通过图5～6可见，随着AL(OH)3比例减少，对HI抗原的吸附降低，当NEA：Al(OH)3质量为2:8时可以对HI抗原达到最大的吸附效率。
实施例4、不同佐剂比例的金黄色葡萄球菌(MRSA)重组亚单位疫苗(HI抗原)对正常小鼠免疫的应答作用检测
取在SPF环境下的BALB/c小鼠45只，平均随机分为9组，每组5只，每组分别编号为F1～F9，分别肌肉注射含有全面激发免疫应答反应的纳米乳/铝盐凝胶复合佐剂系统结合金黄色葡萄球菌重组(HI抗原)疫苗，9组不同复合佐剂处方如表2所示，NEA:Al(OH)3佐剂比例为2:8。注射体积为250μL，分别在0、0、7天三次对Blab/c小鼠进行肌肉双侧注射免疫(125μl/site)。在首免后第7天、14天、21天检测其血清特异性IgG抗体滴度，各实验组中平均血清特异性抗体情况具体如图7～9所示。
通过图7～9可见，不同抗原佐剂比例的重组亚单位疫苗对小鼠的免疫应答效应中，添加本发明复合佐剂抗原量在60μg(抗原最终浓度为240μg/ml)，佐剂量为50-200μg(佐剂最终浓度200-800μg/ml)，NEA:Al(OH)3比例为2:8～5:5条件下能够诱导更高的抗体滴度，其中佐剂量为50μg、抗原量为60μg、NEA:Al(OH)3佐剂处方(F3)比例为2:8时免疫抗体水平在7天、14天、21天均最高，具有更长更高的免疫应答水平。
实施例5、不同佐剂比例的金黄色葡萄球菌(MRSA)重组亚单位疫苗(HI抗原)免疫小鼠细胞因子水平检测
取在SPF环境下的BALB/c小鼠27只，平均随机分为9组，每组3只，每组分别编号为1～12，分别肌肉注射含有全面激发免疫应答反应的纳米乳/铝盐凝胶复合佐剂系统结合金黄色葡萄球菌重组(HI抗原)疫苗，各组抗原、佐剂处方如表3所示。注射体积为250μL，分别在0、0、7天三次对Blab/c小鼠进行肌肉双侧注射免疫(125μl/site)，在首免后第14天后检测其血清细胞因子水平。
表3、各组细胞因子检测具体处方表
Figure BDA0003533075320000081
各实验组中平均血清细胞因子情况具体如图10～11所示。通过的血清细胞因子图10-11可见，本发明复合佐剂抗原量在60μg，佐剂量为50-200μg，NEA:Al(OH)3比例为2:8～5:5条件下能够诱导更高的Th1细胞免疫和Th2体液免疫应答。
实施例6、复合佐剂的金黄色葡萄球菌(MRSA)重组亚单位疫苗(HI抗原)验证NEA/Al(OH)3复合佐剂的免疫应答作用
取在SPF环境下的BALB/c小鼠15只，平均随机分为3组，每组5只，每组分别编号为F1～F3，分别肌肉注射含有全面激发免疫应答反应的纳米乳/铝盐凝胶复合佐剂系统结合金黄色葡萄球菌重组(HI抗原)疫苗，每只小鼠肌肉注射250μl。分别在0天、0天、7天三次对Blab/c小鼠进行肌肉双侧注射免疫(125μl/site)。在首免后第7天、14天、21天检测其血清特异性IgG抗体滴度。各组不同比例的复合双佐剂具体配比如下表4所示；各实验组中平均血清特异性抗体情况具体如图12～14所示。
表4、各组注射的复合佐剂具体处方表
Figure BDA0003533075320000082
Figure BDA0003533075320000091
通过图12～14可见，不同比例复合佐剂系统联合HI抗原后对小鼠的免疫应答效应中，添加本发明复合佐剂的佐剂量为60μg、抗原量为200μg、NEA:Al(OH)3佐剂质量比例为2:8时能够诱导更高更全面的免疫应答效应，免疫抗体水平在7天、14天、21天均最高，具有更长更高的免疫应答水平。
实施例7、不同抗原佐剂金黄色葡萄球菌(MRSA)重组亚单位疫苗(HI抗原)验证NEA/Al(OH)3复合佐剂的免疫应答作用
取在SPF环境下的BALB/c小鼠20只，平均随机分为4组，每组5只，每组分别为HI单纯抗原对照组、Al(OH)3佐剂组、NEA佐剂组和NEA/Al(OH)3复合佐剂组。
其中HI单纯抗原组不添加任何佐剂(抗原60μg，抗原终浓度240μg/ml)
Al(OH)3佐剂组为Al(OH)3+HI抗原(佐剂：200μg，佐剂终浓度800μg/ml；抗原：60μg，抗原终浓度240μg/ml)；
NEA佐剂组为NEA+HI抗原(佐剂：200μg，佐剂终浓度800μg/ml；抗原：60μg，抗原终浓度240μg/ml)；
NEA/Al(OH)3复合佐剂组为NEA/Al(OH)3复合佐剂(质量比例为2:8)+HI抗原(佐剂：200μg，佐剂终浓度800μg/ml；抗原：60μg，抗原终浓度240μg/ml)；
在上述各组中，分别肌肉注射含有全面激发免疫应答反应的纳米乳/铝盐凝胶复合佐剂系统结合金黄色葡萄球菌重组(HI抗原)疫苗，每只小鼠肌肉注射250μl。分别在0天、0天、7天三次对Blab/c小鼠进行肌肉双侧注射免疫(125μl/site)，在首免后第7天、14天、21天检测其血清特异性IgG抗体滴度；各实验组中平均血清特异性抗体情况具体如图15-17所示。
通过图15-17可见，添加抗原的各组中，添加佐剂的各组免疫反应均比不添加佐剂的实验组免疫反应强；而在添加佐剂的各组中，添加本发明复合佐剂的免疫应答效应强于单一佐剂实验组。
实施例7、复合佐剂系统联合金黄色葡萄球菌(MRSA)重组亚单位疫苗(HI抗原)小鼠细胞因子水平检测
取在SPF环境下的BALB/c小鼠12只，平均随机分为4组，每组3只，每组分别为，HI单纯抗原对照组、Al(OH)3佐剂组、NEA佐剂组和NEA/Al(OH)3复合佐剂组。
其中HI单纯抗原组不添加任何佐剂(抗原30μg，抗原终浓度120μg/ml)；
Al(OH)3佐剂组为Al(OH)3+HI抗原(佐剂：100μg，佐剂终浓度400μg/ml；抗原：30μg，抗原终浓度120μg/ml)；
NEA佐剂组为NEA+HI抗原(佐剂：100μg，佐剂终浓度400μg/ml；抗原：30μg，抗原终浓度120μg/ml)；
NEA/Al(OH)3复合佐剂组为NEA/Al(OH)3复合佐剂(质量比例为2:8)+HI抗原。
在上述各组中，添加了复合佐剂的各组HI抗原为50μg，佐剂总量为100μg，分别肌肉注射含有全面激发免疫应答反应的纳米乳/铝盐凝胶复合佐剂系统结合金黄色葡萄球菌重组(HI抗原)疫苗，每只小鼠肌肉注射250μl。分别在0天、0天、7天三次对Blab/c小鼠进行肌肉双侧注射免(125μl/site)，在首免后第14天后检测其血清细胞因子水平；各实验组中血清细胞因子水平情况具体如图18-19所示。
通过的血清细胞因子图18-图19可见，本发明复合佐剂抗原量，优化复合佐剂能够诱导更高的Th1细胞免疫和Th2体液免疫应答。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (10)

1.一种安全且高效的全面免疫应答的纳米乳/铝凝胶复合佐剂系统，其特征在于：所述复合佐剂系统由增强体液免疫应答的铝盐佐剂和增强细胞免疫应答的纳米乳佐剂构成。
2.根据权利要求1所述的复合佐剂系统，其特征在于：所述铝盐佐剂包括氢氧化铝佐剂、磷酸铝佐剂、硫酸铝佐剂、铵明矾佐剂或钾明矾佐剂中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的复合佐剂系统，其特征在于：所述纳米乳佐剂组成由表面活性剂、助表面活性剂和油相组成。
4.根据权利要求3所述的复合佐剂系统，其特征在于：所述表面活性剂为吐温-80、吐温-85、斯潘85、吐温60、聚氧乙烯氢化蓖麻油和聚氧乙烯蓖麻油中任一种或多种组合；所述助表面活性剂为：失水山梨醇脂肪酸酯、C2～C4的一元醇和C2～C4的多元醇中的任一种或多种组合；所述油相为石蜡油、乙酸乙酯、肉豆蔻异丙酯、角鲨烷、角鲨烯、油酸乙酯、辛酸/葵酸三甘油脂中任一种或多种组合。
5.根据权利要求1所述的复合佐剂系统，其特征在于：所述铝盐佐剂质量分数为50-80％；所述纳米乳佐剂质量分数为20-50％。
6.权利要求1～5任一项所述复合佐剂系统作为疫苗佐剂中的应用。
7.含有权利要求1～6任一项所述复合佐剂系统的疫苗。
8.根据权利要求7所述的疫苗，其特征在于：所述复合佐剂用量为50μg/ml～1.5mg/ml。
9.根据权利要求7所述的疫苗，其特征在于：所述疫苗抗原含量15μg/ml～1.5mg/ml。
10.根据权利要求7所述的疫苗，其特征在于：所述疫苗为金黄色葡萄球菌重组亚单位疫苗。
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