CN105363029A - 一种关于hpv病毒的新型佐剂疫苗组合物 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种关于HPV病毒的新型佐剂疫苗，及该疫苗的制备方法。具体而言，本发明的新型佐剂为PLGA-CaP复合颗粒，该佐剂疫苗PLGA-CaP复合颗粒能够对体内免疫产生应答，属于开发高效的HPV蛋白疫苗组合物。

Description

一种关于HPV病毒的新型佐剂疫苗组合物

技术领域

本发明涉及以磷酸钙-聚合物复合颗粒为佐剂的疫苗组合物，及该疫苗组合物的制备方法及其在药中的用途。本发明尤其针对由HPV蛋白制成的疫苗组合物及其在治疗或预防HPV病毒药物中的应用。

背景技术

人乳头瘤病毒(Humanpapillomaviruses，HPV)是无囊膜的双链DNA病毒，主要由病毒外壳和基因组DNA组成(King，Adamsetal.2012)。HPV病毒外壳是由360个L1蛋白(形成72个五聚体)和至多72个L2蛋白构成的二十面体结构，直径55-60nm(HowleyandLowy2007)。病毒外壳蛋白具有自组装特性，在体外L1蛋白单独或与L2蛋白共同自组装形成类病毒样颗粒(Virus-likeParticle，VLP)(Chen，Garceaetal.2000，ClementsandGriffiths2002，Chen，Nietal.2011，WangandRoden2013)。目前的HPV疫苗都是以VLP作为靶抗原，已有两种基于HPVL1VLP预防性疫苗上市，均以铝盐为佐剂(JansenandShaw2004，HowleyandLowy2007，Buonaguro，Torneselloetal.2009，Harper2009，Frazer，Leggattetal.2011，Hariri，Dunneetal.2011，Malagon，Droletetal.2012，LehtinenandDillner2013，Shaw2013)。2006年6月8日，美国食品与药品管理局(FDA)正式批准美国Merck公司生产的GardasilHPV预防性疫苗上市；它是由酿酒酵母表达并纯化的HPV16/18/6/11L1VLP四价宫颈癌预防性疫苗，以无定形羟基磷酸铝硫酸盐(amorphousaluminumHydroxyphosphatesulfate，AAHS)为佐剂，被批准用于预防6～26岁女孩和妇女HPV16、18、6、11型感染所引起的宫颈癌、癌前病变和生殖器疣，这是FDA通过的世界上第一个肿瘤疫苗(Villa，Costaetal.2005，Villa，Aultetal.2006，Bryan2007，Olsson，Villaetal.2007，GoldstoneandVuocolo2012)。随后英国葛兰素史克(GSK)公司生产的商品名为Cervarix的HPV预防性疫苗也成功上市，它是由来源于昆虫表达系统的HPV16/18L1VLP二价宫颈癌预防性疫苗，采用AS04佐剂(氢氧化铝复合MPL)(Paavonen，Jenkinsetal.2007，Garcon，Moreletal.2011，Kreimer，Gonzalezetal.2011，Szarewski2012)。

佐剂是指能非特异性地改变或增强机体对抗原的特异性免疫应答，而本身并无抗原性的物质，又称免疫佐剂或抗原佐剂。传统疫苗直接来源于细菌和病毒，具有较高的免疫原性，但存在较大的安全性问题。随着生物技术的高速发展，利用基因重组、生物合成及化学合成获得的亚单位疫苗、合成肽疫苗等，结构简单，易于纯化，安全稳定，但是抗原的免疫原性减弱，难以诱导良好的免疫保护性应答，必须添加免疫佐剂来增强免疫效果(SinghandSrivastava2003，Zepp2010)。

目前，磷酸钙、MF59、铝佐剂在欧洲许多国家已经被批准用于人类疫苗(Singh，Carlsonetal.1998，He，Mitchelletal.2000)。铝佐剂是目前应用最为广泛的一类佐剂，也是长期以来一度是被美国食品和药品监督管理局(FDA)批准用于人类疫苗的唯一佐剂(Glenny，Popeetal.1926，GuptaandSiber1995，Gupta1998，Baylor，Eganetal.2002，ClementsandGriffiths2002，Lindblad2004，Lindblad2004)。尽管铝佐剂可以有效增强免疫应答，但也存在一些不足。铝佐剂仅在注射部位形成贮库效应(Gupta，Changetal.1996，Hem2002，Verdier，Burnettetal.2005，HemandHogenEsch2007，Noe，Greenetal.2010)，通过炎症反应吸引树突状细胞(DC)(Morefield，Sokolovskaetal.2005，Kool，Soullieetal.2008，Sharp，Ruaneetal.2009，Flach，Ngetal.201l，Ghimire，Bensonetal.2012)、巨噬细胞(Hamilton，Byrneetal.2000，Jordan，Millsetal.2004，Rimaniol，Grasetal.2004，Rimaniol，Grasetal.2007)等抗原呈递细胞(antigen-presentingcell，APC)，这些细胞通过吞噬作用摄取抗原并经NLRP3炎性小体激活免疫应答(DeGregorio，Trittoetal.2008，Dostert，Petrillietal.2008，Eisenbarth，Colegioetal.2008，FranchiandNunez2008，Kool，Petrillietal.2008，Li，Willinghametal.2008，Cassel，Jolyetal.2009，Demento，Eisenbarthetal.2009，Duewell，Konoetal.2010，Davis，Wenetal.2011)。同时，铝佐剂通过刺激IL-10分泌等机制对细胞免疫产生抑制作用(Chen，Nietal.2011)，而对于病毒感染而言，细胞免疫效果将发挥更好地免疫保护和免疫防治作用(O′HaganandValiante2003，Demento，Cuietal.2012，LevitzandGolenbock2012，Olive2012，Cain，Sandersetal.2013，HogenEsch2013)。而且，铝佐剂可引起IgE介导的过敏反应(如注射部位肉芽肿)以及神经系统不良反应等，从而引起人们对铝佐剂安全性的担忧(Petrik，Wongetal.2007，Bystrianyk2009，ShawandPetrik2009，Munks，McKeeetal.2010，TomljenovicandShaw2011)。另外，铝佐剂对流感(AtmarandKeitel2009)、疟疾(Lew，Andersetal.1988，Schwartz，Brownetal.2012)、单疱疹病毒(Geerligs，Weijeretal.1989)诱导的佐剂免疫效应比较微弱。为此，需要针对HPV抗原的候选疫苗开发新型免疫佐剂(CampoandRoden2010，MarianiandVenuti2010，Chen，Nietal.2011，Foged2011，Gattoc，Nairetal.2013，Koff，Burtonetal.2013，Shaw2013，Tomlenovic，Spinosaetal.2013)。新型免疫佐剂的设计思路应具有较低的副作用，增强免疫耐受，同时诱导体液免疫应答、细胞免疫应答和粘膜免疫应答。而且具备生物可降解性，相容性，安全性的优点，且易于制备。另外，理想的佐剂可以有选择性的激发免疫应答，例如由CD4⁺T细胞介导的Th1型细胞免疫应答和由CD8⁺T介导的细胞免疫应答，并具有对抗原的广谱性和等效适用性(He，Mitchelletal.2000)。

磷酸钙作为天然骨骼的主要矿物成分，具有优越的的生物相容性、生物可降解性、生物活性(deGroot1983，Aoki1991，Goto，Katoetal.1993，LeGeros2008)。在欧洲一些国家，磷酸钙已经作为佐剂，已经被批准用于疫苗佐剂(Aggerbeck，Fengeretal.1995，Gupta1998，Jiang，Premachandraetal.2004)，例如用于预防白喉、破伤风疾病，以及过敏原的脱敏治疗。磷酸钙佐剂可以诱导有效的细胞免疫应答和细胞毒性T淋巴细胞免疫效应，从而弥补铝盐佐剂只能诱导微弱的或抑制细胞免疫方面的不足。而且Goto等人研究结果表明注射磷酸钙凝胶和悬液，局部肌肉组织炎症反应到第四周完全停止，而注射氢氧化铝凝胶和悬液引起的局部肌肉刺激一直持续至第八周(Goto，Katoetal.1997)。与铝佐剂相比，磷酸钙佐剂在注射部位不会引起明显的IgE超敏反应(Relyveld1985，GuptaandSiber1994，He，Mitchelletal.2000)，而且磷酸钙诱导了相比铝佐剂更高效的IgG2a抗体反应和更弱的IgE介导的过敏反应，可以有效抵抗单纯疱疹病毒2(HSV-2)病毒的感染(He，Mitchelletal.2000，He，Mitchelletal.2000，He，Mitchelletal.2002)。磷酸钙佐剂复配CpG用于流感疫苗，有效诱导了小鼠脾CD4+T细胞和CD8+T细胞中IFN-γ的分泌(Rimaniol，Grasetal.2007)。

佐剂的粒径对其免疫效应具有很重要的影响。近年来大量文献证实，体内可生物降解的聚合物纳微球通过包埋抗原，可将其转化为颗粒型抗原，有利于被抗原提呈细胞摄取，进而在胞内释放抗原，通过后续抗原加工、提呈，增强免疫应答强度和水平(Langer，Clelandetal.1997，Johansen，Menetal.2000，Sahay，Alakhovaetal.2010，DeTemmerman，Rejmanetal.2011，Danhier，Ansorenaetal.2012)。例如，TorresM.P.等人制备了聚苷类微球，以卵清蛋白(OVA)为模型抗原，研究微球的佐剂效果，结果表明微球能够提高抗原提呈细胞表面MHC分子表达和相关细胞因子分泌，显示其具有一定的佐剂效应(Torres，Wilson-Welderetal.2011)；又如UtoT.等人制备了生物可降解的聚谷氨酸纳微球(γ-PGANPs)并从机制上研究了其佐剂性能，揭示此微球能通过TLR4(Toll样受体)和MyD88信号通路诱发强有力的固有和获得性免疫应答反应(Uto，Akagietal.2011)。研究表明，上述携载抗原的微粒型佐剂使可溶性抗原变成颗粒型抗原，而颗粒型抗原被APC摄取后，可以改变抗原的提呈途径，不仅可以激活CD4⁺T细胞，而且可以激活CD8⁺T细胞，大大提升细胞免疫功能，实现胞内感染的彻底清除，是有前景的病毒感染疫苗佐剂与递送系统(WangandSingh2011，Dierendonck，DeKokeretal.2012)。此外，生物可降解聚合物微球可以提供大量抗原并保护其免受在生理条件下的快速降解，通过微球对所包埋抗原的持续或脉冲释放行为，有效模拟传统疫苗多次免疫程序，减少接种次数和免疫原的使用总量，因而改进了病人的适应性、降低了用药成本(Langer，Clelandetal.1997，Johansen，Estevezetal.2000，DeTemmerman，Rejmanetal.2011，Demento，Cuietal.2012)。

近些年来，研究者一直专注于开发一种新型的由生物可降解的高分子聚合物结合磷酸钙的复合纳微球作为药物递送载体，保持了磷酸钙材料的所具有的的生物活性、生物相容性；扩大了磷酸钙材料的生物可降解性；解决了聚乳酸材料在降解过程中出现的酸性炎症反应，集中两者的优势，克服两者的局限性，从而有希望成为一个优良的药物递送载体，为医疗事业服务。

发明内容

本发明第一方面提供一种粒径分布在100nm～100μm之间的磷酸钙与聚合物的复合颗粒，其中磷酸钙是一个包含钙离子和磷酸根离子的生物材料，可具有不同的Ca与P摩尔比，例如Ca∶P为0.1-5∶1。聚合物为带负电，且zeta电位最小至-30mV的直链或有支链的聚合物、均聚物、生物聚合物、共聚物，或以上的混合物。例如：聚合物材料包括但不限于聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)，PMMA，PEG，聚乳酸(PLA)，PLLA，PCL，或以上的混合物。复合颗粒的zeta电位范围是-5mV到+30mV。

其中磷酸钙与聚合物的质量比为1∶0.1-100，优选1∶1-10。

本发明第二方面提供一种疫苗组合物，包含佐剂和抗原，抗原与佐剂的比例为0.01-80μg/mg，优选1-40μg/mg，所述佐剂包括磷酸钙与聚合物的复合颗粒，所述抗原包含HPV蛋白。进一步的，HPV蛋白吸附于复合颗粒表面，以粒径分布在100nm～100μm之间的纳微球悬浮液形式存在。

本发明所述佐剂中进一步包含小分子免疫佐剂：CpG、MPLA、咪喹莫特、PolyI:C等中一种或几种的组合。

本发明所述抗原HPV蛋白包括HPVL1蛋白、HPVL2蛋白、或HPVL1+L2蛋白。上述的HPV蛋白包括但不限于1～4，6，7，10，11，16，18，26～29，31，33，35，39，49，51，52，56，58，59和68型之一的HPV，优选HPV6、11、16、18、31、33、35、45、52或58型的HPVL1、HPVL2、或HPVL1+L2的VLP、五聚体或多聚体。

本发明第三方面提供一种磷酸钙与聚合物的复合颗粒的制备方法，制备方法为A方法或B方法：

A方法：用含钙离子的水溶液为内水相(W1)，PLGA溶于有机溶剂为油相(O)，将所述内水相与油相按1∶1-50，优选1∶2-10体积比混合，制成油包水型(W1/O)初乳，将此初乳按1∶1-50，优选1∶2-10体积比加入含表面活性剂的外水相(W2)中，搅拌，制得W1/O/W2型预复乳液，将所述W1/O/W2型预复乳液反复压过滤膜得到尺寸均一的W1/O/W2型乳液，将W1/O/W2型乳液固化，过程中按Ca∶P摩尔为0.1-5∶1的比例加入包含磷酸根离子的溶液混合，洗涤、干燥后制成PLGA-CaP复合颗粒；

B方法：将PLGA溶于有机溶剂为油相(O)，含表面活性剂的溶液为外水相(W)，两相按1∶1-50，优选1∶2-10体积比混合，制成水包油型(O/W)预乳液，将所述W/O型预乳液反复压过膜得到尺寸均一的O/W型乳液，将O/W型乳液固化，洗涤、干燥后制成PLGA颗粒，然后先用包含钙离子的水溶液与PLGA颗粒混合，再按Ca∶P摩尔为0.1-5∶1的比例与包含磷酸根离子的水溶液混合，洗涤、干燥后得到PLGA-CaP复合颗粒。

上述复合颗粒的制备方法中包含钙离子和磷酸根离子的矿物质家族，钙离子为羟基磷灰石、无定型磷酸钙、磷酸三钙、磷酸八钙、磷酸氢钙、四水合硝酸钙或氯化钙等可溶性钙盐，或者为它们的混合物。磷酸根离子为磷酸氢二铵，磷酸氢二钾，磷酸氢二钠和正磷酸中之一或其混合物。

所述油相为常温下呈液体且与水不互溶的油性物质，优选为乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷、三氯甲烷或上述至少两种以上的混合物。

在本发明具体实施例中上述方法所述的含有表面活性剂的外水相(W2或W)为含有0.001-10％的PVA水溶液，其醇解度为87～90％，聚合链节数为1700-1750；或为含有0.001-10％的PVA-PEG混合水溶液，PVA与PEG的质量百分比为20-80∶30-90。

在本发明的具体的实施例中，混合方法包括但不限于通过均质、超声或搅拌等方式。

在本发明的具体的实施例中，乳液反复压过滤膜是指乳液在0.5KPa作用下反复压过5.3微米的微孔膜。

在本发明的具体的实施例中固化方式为溶剂蒸发法或溶剂萃取法。

在本发明的具体的实施例中，固化时间为1h-12h。

本发明第四方面提供一种疫苗组合物的制备方法，将复合颗粒作为佐剂悬浮于缓冲液体系，HPV蛋白作为抗原溶于缓冲液体系，然后将两缓冲液体系混合，配制成含有HPV抗原的微球悬液，制得HPV疫苗组合物。

疫苗组合物制备方法中缓冲液体系为磷酸、硼酸、Tris、HEPES或MOPS缓冲液，pH值范围4-10。

在本发明的具体的实施例中的疫苗组合物，还包括可药用载体，例如赋形剂、稀释剂、稳定剂、缓冲液或替代性物质。

本发明的疫苗组合物通过口服、皮下、肺部、鼻内、腹腔、淋巴、真皮内或肌肉给药施用。

在本发明的具体的实施例中的疫苗组合物，还可以包含其他生理学可接受的组分，例如缓冲液、生理盐水或蔗糖(如纤维二糖)、其他盐和/或聚山梨酸酯。

在本发明的具体的实施例中疫苗组合物或组合物，优选PLGA-CaP颗粒粒径分布在100nm-100μm，尤其是100nm-5μm。

在本发明的具体实施例中本发明的疫苗组合物HPVVLPs吸附在PLGA-CaP表面，以粒径分布在100nm～100μm，尤其是100nm-5μm之间的纳微球悬液形式存在。

本发明第五方面提供一种HPV疫苗组合物在制备治疗或预防HPV病毒感染药物中的应用。

本发明所公开的磷酸钙-聚合物复合颗粒，可以作为药物的递送载体与佐剂系统，具备生物可降解性、相容性、安全性、并且是骨骼的主要矿物成分，在生物医学方面越来越受到关注。

本发明的涉及的磷酸钙-PLGA复合颗粒，被应用到疫苗佐剂方面，与传统铝盐佐剂相比，注射部位炎症反应轻，而且可以诱导高效的免疫应答尤其是细胞免疫应答，有效防护病毒感染；另外，磷酸钙-PLGA复合颗粒佐剂不会引起明显的IgE介导的过敏反应(如注射部位肉芽肿)等。

本发明涉及的磷酸钙-PLGA复合颗粒的制备方法是简单的、可靠的、经济。磷酸钙-PLGA复合颗粒的形成是通过表面反应使得磷酸钙包被到PLGA颗粒上。这一技术可以使带负电的PLGA颗粒表面电荷升高，对于抗原携载和细胞摄取具有显著优势。另外，本发明所制备的磷酸钙-聚合物复合颗粒具有尺寸可控、尺寸分布均匀和稳定性好等特点，是一种适合规模化生产的制备方法，对扩展磷酸钙类生物材料的制备与应用具有重要的科学意义和应用价值。

本发明的具体实施例中磷酸钙-PLGA复合颗粒是一个磷酸钙包被内部带负电荷的颗粒，其中磷酸钙中的钙离子主要吸附在带负电的颗粒的表面，磷酸根离子与钙离子结合形成磷酸钙，这一颗粒可用于药物递送与疫苗佐剂。

附图说明

图1：实施例1中PLGA-CaP的SEM照片

图2：实施例2中PLGA的SEM照片

图3：实施例2中PLGA-CaP的SEM照片

图4：HPV16L1VLP两种佐剂的中和抗体结果比较图

图5：HPV16L1VLP两种佐剂的结合抗体结果比较图

图6：HPV16L1VLP两种佐剂的胞内细胞因子分泌结果比较图

图7：HPV疫苗不同剂量佐剂免疫小鼠后二免和三免的中和抗体结果比较

图8：HPV疫苗不同剂量佐剂免疫小鼠后二免和三免的结合抗体结果比较

图9：实施例9中PLA-CaP微球的SEM照片

具体实施方式如下

实施例1：磷酸钙与聚合物PLGA的复合颗粒的制备

将100mg的PLGA溶于20mL的二氯甲烷中作为油相(O)，配制0.2mL的0.1M的氯化钙溶液作为内水相(W1)，配制1.0％的PVA溶液作为外水相(W2)；将0.2mL的内水相(W1)加入到油相(O)中，通过均质乳化方法制备初乳W1/O，将初乳液加入到60mL的外水相中制备预复乳液(W1/O/W2)，将此预复乳液采用快速膜乳化的方法反复压过膜制备得到粒径均一的水包油包水的复乳液(W1/O/W2)；然后向此复乳液中添加0.1mL的0.05M磷酸氢二钠溶液，利用固化过程中内外水相的溶质扩散使内外溶质在乳液界面处接触反应结晶析出，从而制备得到CaP-PLGA微球。图1即是制备得到的PLGA-CaP微球的SEM(冷场扫描电镜)照片，直径约为1μm。

实施例2：磷酸钙与聚合物PLGA的复合颗粒的制备

将100mg的PLGA溶于20mL的二氯甲烷中作为油相(O)，配制1.0％的PVA溶液作为外水相(W2)，将油相(O)加入至50mL的外水相(W2)中，制备得到水包油型的预乳液(W2/O)，将此预复乳液采用快速膜乳化的方法反复压过膜制备得到粒径均一的水包油包水的复乳液(W1/O/W2)；固化3h，离心洗涤，冻干，得到干燥的PLGA微球，PLGA的SEM照片如图2所示。然后将制备得到的PLGA微球悬浮于10mL超纯水中得到PLGA微球悬液，配制0.2M的氯化钙溶液和0.1M的磷酸氢二钠溶液各0.2mL，先将0.2mL的0.2M的氯化钙溶液加入10mL的PLGA微球悬液中，然后再将0.1M的磷酸氢二钠溶液缓慢加入，搅拌10h，离心洗涤冻干，制备得到CaP-PLGA微球，图3即是制备得到的PLGA-CaP微球的SEM(冷场扫描电镜)照片，直径约为1μm。

实施例3：磷酸钙与聚合物PLGA的复合颗粒的制备

将100mg的PLGA溶于20mL的二氯甲烷中作为油相(O)，配制0.2mL的0.6M的氯化钙溶液作为内水相(W1)，配制1.0％的PVA溶液作为外水相(W2)；将0.2mL的内水相(W1)加入到油相(O)中，通过均质乳化方法制备初乳W1/O，将初乳液加入到60mL的外水相中制备预复乳液(W1/O/W2)，将此预复乳液采用快速膜乳化的方法反复压过膜制备得到粒径均一的水包油包水的复乳液(W1/O/W2)；然后向此复乳液中添加0.1mL的0.3M磷酸氢二钠溶液，利用固化过程中内外水相的溶质扩散使内外溶质在乳液界面处接触反应结晶析出，从而制备得到CaP-PLGA微球。

实施例4：HPV疫苗组合物的制备

取实施例1或2制备得到的CaP-PLGA微球悬浮于0.8mL的pH＝5、含10mMPBS缓冲溶液中，得20mg/mL的CaP-PLGA微球悬液；取一定量的HPV溶于0.8mL的pH＝5、含10mMPBS缓冲溶液中，得20μg/mL的HPV抗原溶液，将两者等体积混合，吸附过夜，得到1.6mL吸附有HPV抗原的CaP-PLGA悬液，即为HPV疫苗组合物。

实施例5：HPV疫苗的免疫实验

取实施例4制备得到的HPV疫苗组合物免疫BALB/c小鼠，采用Merck公司的Gardasil铝佐剂作为对照。免疫程序为免疫两针，间隔四周，每只小鼠每次注射0.1mL，第0天初免后，在第28天以相同的免疫剂量加强免疫，且初免后2周、4周，以及加强免疫后1周采血样检测抗体应答水平和细胞因子水平；第35天时随机选取小鼠中每组5只进行后续杀鼠取出脾细胞，进行脾细胞培养上清及脾细胞ICS免疫评价实验。结果见图4和图5，表明PLGA-CaP组能诱导与Merck公司的Gardasil铝佐剂相当水平的IgG抗体反应和IFN-γ反应，说明PLGA-CaP组可以诱导与Merck公司的Gardasil铝佐剂相当水平的体液免疫应答和显著高于Gardasil铝佐剂的细胞免疫应答。

实施例6：电位测定实验

将实施例1、2和3冻干之后的PLGA-CaP微球称取1mg悬浮于5mL超纯水中混匀，取约1mL缓慢注入干净的电位杯(英国Malvern公司的NanoZetasizer仪器)中，避免气泡，选择合适的参数进行测定，测定结果为实施例1中制备得到的PLGA-CaP微球的zeta电位为-2.043mV，实施例2制备得到的PLGA微球的Zeta电位为-12mV左右，冻干之后的PLGA-CaP的zeta电位为-2.0187mV左右，实施例3中制备得到的PLGA-CaP微球的zeta电位是-0.863mV，这说明磷酸钙镀层到PLGA微球上，使得PLGA的Zeta电位值升高。

实施例7：Ca与P元素的定量测定实验

将实施例1、2和3制备得到的PLGA置于酸中，将其降解成包含可溶性的钙离子和磷酸根离子的澄清溶液，取样用于元素含量测定，仪器为美国Perkin-Elmer公司的电感耦合等离子体原子发射光谱仪(ICP-OES)，仪器型号为Optima5300DV，实施例1测得结果为，1mgPLGA-CaP中钙元素含量为0.0201mg，磷元素含量为0.0119mg，Ca/P质量比为1.688；实施例2测得结果为，1mgPLGA-CaP中钙元素含量为0.02374mg，磷元素含量为0.014647mg，Ca/P质量比为1.621；实施例3测得结果为，1mgPLGA-CaP中钙元素含量为0.0431mg，磷元素含量为0.0276mg，Ca/P质量比为1.56。

实施例8：HPV疫苗佐剂剂量优化实验

取实施例1制备得到的CaP-PLGA微球悬浮于1mL的pH＝5、10mMPBS缓冲溶液中，得到浓度分别为20mg/mL、6mg/mL和1.6mg/mL的CaP-PLGA微球悬液；取HPV溶于1mL的pH＝5、10mMPBS缓冲溶液中，得20ug/mL的HPV抗原溶液，将两者等体积混合，吸附过夜，得到2mL吸附有HPV抗原的CaP-PLGA悬液，即为HPV疫苗组合物。将以上制备得到的不同佐剂含量的HPV疫苗组合物分别以每只小鼠每次注射100μL的剂量免疫BALB/c小鼠，采用Merck公司的Gardasil铝佐剂作为对照。免疫程序为免疫两针，间隔四周，每只小鼠每次注射0.1mL，第0天初免后，在第28天以相同的免疫剂量加强免疫，且初免后2周、4周，以及加强免疫后1周采血样检测抗体应答水平和细胞因子水平。结果如图7和图8所示，结果表明，不同微球量之间中和抗体无明显差异，但与Merck组Gardasil铝佐剂相比，400μgPLGA-CaP+1μgHPV组可以诱导与其相当水平的中和抗体水平；且400μgPLGA-CaP+1μgHPV组结合抗体水平显著高于80μgPLGA-CaP+1μgHPV组和1000μgPLGA-CaP+1μgHPV组，说明PLGA-CaP佐剂的优化剂量为400μg/dose，HPV与PLGA-CaP佐剂的优选比例为2.5μg/mg。

实施例9：磷酸钙与PLA聚合物的复合颗粒的制备

将100mg的PLA溶于20mL的二氯甲烷中作为油相(O)，配制1mL的0.1M的氯化钙溶液作为内水相(W1)，配制1.0％的PVA溶液作为外水相(W2)；将0.2mL的内水相(W1)加入到油相(O)中，通过均质乳化方法制备初乳W1/O，将初乳液加入到60mL的外水相中制备预复乳液(W1/O/W2)，将此预复乳液采用快速膜乳化的方法反复压过膜制备得到粒径均一的水包油包水的复乳液(W1/O/W2)；然后向此复乳液中添加0.1mL的0.05M磷酸氢二钠溶液，利用固化过程中内外水相的溶质扩散使内外溶质在乳液界面处接触反应结晶析出，从而制备得到CaP-PLA微球。图9即是制备得到的PLA-CaP微球的SEM(冷场扫描电镜)照片，直径约为1μm。

实施例10：以PLGA-CaP为佐剂，加纤维二糖，吸附HPV蛋白的抗原组合物制备

将实施例1或2制备得到的PLGA-CaP微球悬浮于1mL的pH＝5、含10mMPBS缓冲溶液中，得20mg/mL的CaP-PLGA微球悬液；将纤维二糖溶于1mL的pH＝5、含10mMPBS缓冲溶液中，得到0.1M的纤维二塘；取HPV溶于1mL的pH＝5、含10mMPBS缓冲溶液中，得20ug/mL的HPV抗原溶液，将三者混合，吸附过夜，得到2.5mL包含有纤维二糖且吸附HPV抗原的PLGA-CaP悬液，即为HPV疫苗组合物。

Claims (15)

1.一种具有佐剂作用的复合颗粒，其特征在于该复合颗粒为粒径分布在100nm～100μm之间的磷酸钙与聚合物组成的复合颗粒，其中磷酸钙是Ca与P摩尔比为0.1-5∶1的化合物或混合物；聚合物为带负电，且zeta电位最小至-30mV的直链或有支链的聚合物、均聚物、生物聚合物、共聚物，或其混合物；复合颗粒的zeta电位范围是-5mV到+30mV。

2.一种疫苗组合物，包含佐剂和抗原，其特征在于抗原与佐剂的比例为0.01-80μg/mg，所述佐剂包括如权利要求1所述的复合颗粒，所述抗原为HPV蛋白。

3.如权利要求2所述的疫苗组合物，其特征在于HPV蛋白吸附于复合颗粒表面，以粒径分布在100nm～100μm之间的纳微球形式存在。

4.如权利要求3所述的疫苗组合物，其特征在于该组合物包含小分子免疫佐剂CpG、MPLA、咪喹莫特、PolyI:C中一种或几种的组合。

5.如权利要求3所述的疫苗组合物，其特征在于该组合物所述抗原HPV蛋白为HPVL1蛋白、HPVL2蛋白、或HPVL1+L2蛋白。

6.如权利要求5所述的疫苗组合物，其特征在于该组合物所述HPV蛋白包括但不限于1～4，6，7，10，11，16，18，26～29，31，33，35，39，49，51，52，56，58，59和68型之一的HPV的VLP、五聚体或多聚体。

7.如权利要求1所述的复合颗粒的制备方法，其特征在于制备方法为A方法或B方法：

A方法：用含钙离子的水溶液为内水相(W1)，PLGA溶于有机溶剂为油相(O)，将所述内水相与油相按1∶1-50，优选1∶2-10体积比混合，制成油包水型(W1/O)预乳液，将此预乳液按1∶1-50，优选1∶2-10体积比加入含表面活性剂的外水相(W2)中，搅拌，制得W1/O/W2型预复乳液，将所述W1/O/W2型预复乳液反复通过滤膜得到尺寸均一的W1/O/W2型乳液，将W1/O/W2型乳液固化，过程中按Ca：P摩尔为0.1-5∶1的比例加入包含磷酸根离子的溶液混合，洗涤、干燥后制成PLGA-CaP复合颗粒；

B方法：将PLGA溶于有机溶剂为油相(O)，含表面活性剂的溶液为外水相(W)，两相按1∶1-50，优选1∶2-10体积比混合，制成水包油型(O/W)预乳液，将所述W/O型预乳液反复过膜得到尺寸均一的O/W型乳液，将O/W型乳液固化，洗涤、干燥后制成PLGA颗粒，然后先用包含钙离子的水溶液与PLGA颗粒混合，再按Ca∶P摩尔为0.1-5∶1的比例与包含磷酸根离子的水溶液混合，洗涤、干燥后得到PLGA-CaP复合颗粒。

8.如权利要求7所述的复合颗粒的制备方法，其特征在于制备方法中所述的钙离子钙离子为羟基磷灰石、无定型磷酸钙、磷酸三钙、磷酸八钙、磷酸氢钙、四水合硝酸钙或氯化钙等可溶性钙盐，或者为它们的混合物。

9.如权利要求7所述的复合颗粒的制备方法，其特征在于制备方法中所述的磷酸根离子为磷酸氢二铵，磷酸氢二钾，磷酸氢二钠和正磷酸中之一或其混合物。

10.如权利要求7所述的复合颗粒的制备方法，其特征在于制备方法中所述的油相为为乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷、三氯甲烷或上述至少两种以上的混合物。

11.如权利要求7所述的复合颗粒的制备方法，其特征在于制备方法中所述的含有表面活性剂的外水相(W2或W)为含有0.001-10％的PVA水溶液，其醇解度为87～90％，聚合链节数为1700-1750；或为含有0.001-10％的PVA-PEG混合水溶液，PVA与PEG的质量百分比为20-80∶30-90。

12.如权利要求7所述的复合颗粒的制备方法，其特征在于制备方法中所述的混合方法包括但不限于通过均质、超声或搅拌方式。

13.如权利要求2、3、4、5或6所述的一种疫苗组合物的制备方法，其特征在于该方法为将复合颗粒作为佐剂溶于缓冲液体系，HPV蛋白作为抗原溶于缓冲液体系，将两缓冲液体系混合，配制成含有HPV抗原的微球悬液，制得HPV疫苗组合物。

14.如权利要求13所述的一种疫苗组合物的制备方法，其特征在于该方法缓冲液体系为磷酸、硼酸、Tris、HEPES或MOPS缓冲液，pH值范围4-10。

15.如权利要求2、3、4、5或6所述的疫苗组合物在制备治疗或预防HPV病毒感染药物中的应用。