CN114306623B - 一种核壳磷酸钙多肽复合纳米疫苗及其制备方法 - Google Patents
一种核壳磷酸钙多肽复合纳米疫苗及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114306623B CN114306623B CN202111510094.3A CN202111510094A CN114306623B CN 114306623 B CN114306623 B CN 114306623B CN 202111510094 A CN202111510094 A CN 202111510094A CN 114306623 B CN114306623 B CN 114306623B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- polypeptide
- cap
- core
- phosphate
- calcium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 118
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 118
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 110
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 title claims abstract description 73
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 title claims abstract description 66
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 title claims abstract description 66
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 title claims abstract description 66
- 239000011258 core-shell material Substances 0.000 title claims abstract description 41
- 239000002131 composite material Substances 0.000 title claims abstract description 29
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 29
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 53
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 24
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 24
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 23
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims abstract description 20
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims abstract description 17
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 17
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 22
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 15
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims description 15
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 15
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 13
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 claims description 13
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 13
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 11
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 10
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 9
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 claims description 7
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- 230000033558 biomineral tissue development Effects 0.000 claims description 6
- ZCCIPPOKBCJFDN-UHFFFAOYSA-N calcium nitrate Chemical compound [Ca+2].[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O ZCCIPPOKBCJFDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- -1 diamine hydrogen phosphate Chemical class 0.000 claims description 6
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 5
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 4
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- FNAQSUUGMSOBHW-UHFFFAOYSA-H calcium citrate Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O.[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O FNAQSUUGMSOBHW-UHFFFAOYSA-H 0.000 claims description 3
- 239000001354 calcium citrate Substances 0.000 claims description 3
- MKJXYGKVIBWPFZ-UHFFFAOYSA-L calcium lactate Chemical compound [Ca+2].CC(O)C([O-])=O.CC(O)C([O-])=O MKJXYGKVIBWPFZ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 239000001527 calcium lactate Substances 0.000 claims description 3
- 229960002401 calcium lactate Drugs 0.000 claims description 3
- 235000011086 calcium lactate Nutrition 0.000 claims description 3
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 238000003760 magnetic stirring Methods 0.000 claims description 3
- 238000010907 mechanical stirring Methods 0.000 claims description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 3
- 235000013337 tricalcium citrate Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 abstract description 10
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 abstract description 8
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 abstract description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 7
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 8
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 6
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 6
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- 239000011246 composite particle Substances 0.000 description 4
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 3
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 3
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 239000010413 mother solution Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 2
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- ONDPHDOFVYQSGI-UHFFFAOYSA-N zinc nitrate Chemical compound [Zn+2].[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O ONDPHDOFVYQSGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XXMFJKNOJSDQBM-UHFFFAOYSA-N 2,2,2-trifluoroacetic acid;hydrate Chemical compound [OH3+].[O-]C(=O)C(F)(F)F XXMFJKNOJSDQBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 1
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- PMZXXNPJQYDFJX-UHFFFAOYSA-N acetonitrile;2,2,2-trifluoroacetic acid Chemical compound CC#N.OC(=O)C(F)(F)F PMZXXNPJQYDFJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000012792 core layer Substances 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 229940023041 peptide vaccine Drugs 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 239000013557 residual solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
本发明公开了一种核壳磷酸钙多肽复合纳米疫苗及其制备方法，核壳磷酸钙多肽复合纳米疫苗，包含CaP@多肽@CaP@CpG纳米颗粒，多肽为在中性溶液中带负电的抗原多肽；本发明的方法得到的疫苗的核壳结构磷酸钙具有巧妙的结构，实现可满足抗原多肽和佐剂分子共运输的要求，可有效保护抗原多肽；本发明得到的纳米颗粒具有很好的颗粒稳定性，不产生明显的聚集；且对于带负电的多肽具有较高的包封率；制备方法简单、纯水相合成，绿色安全。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别是一种核壳磷酸钙多肽复合纳米疫苗及其制备方法。
背景技术
肿瘤免疫治疗被认为是一项极具前景的技术。通过抗原递呈细胞，尤其是作为免疫第一防线的树突状细胞(DC)吞噬抗原并将多肽加工递呈到其表面，与MHCⅠ类分子或者Ⅱ类分子结合，从而有效的激活T细胞，诱导和产生强大的CD8+和CD4+T细胞，进而有效的杀伤肿瘤细胞。然而单一的裸肽疫苗由于在体内容易被分解，往往面临着免疫原性低的局限。因此发展适合的抗原分子递送系统具有重要的应用价值。
磷酸钙(CaP)是人体内骨骼的主要成分之一，具有很好的生物相容性及安全性。磷酸钙纳米颗粒被认为是一种极具前景的递送系统，尤其在核酸类物质递送领域有着巨大的应用前景。磷酸钙本身具有几个特点：1)本身带有较强正电荷，因此可以有效的复合核酸类物质，例如siRNA、mRNA、dsDNA等。2)磷酸钙耐碱不耐酸，因此当磷酸钙纳米颗粒被DC细胞吞噬，它会在酸性的内涵体或者溶酶体中分解，由于内涵体内离子浓度的升高，造成内涵体破裂，从而有效的将负载的分子释放到细胞质中。
然而，不同于核酸类物质，多肽抗原尤其是新生抗原，多肽性质各异，多肽本身不具有核酸类物质天然的与磷酸钙的结合优势。目前，基于磷酸钙的多肽复合纳米疫苗尚未得到系统的开发。现有技术有用磷酸钙颗粒原位包裹蛋白质，并未共负载可以进一步刺激免疫原性的佐剂分子。此外，磷酸钙颗粒由于表面具有较多的参与电荷，因此容易发生凝聚或者聚集，无法得到稳定分散的悬液。为此人们常采用磷脂双分子层修饰或者高分子层修饰CaP的策略，然而复杂的操作步骤以及引入的有机溶剂无疑不利于CaP复合载体系统的开发；市场需要一种具有核壳结构磷酸钙的巧妙结构，可满足抗原多肽和佐剂分子共运输的要求；方法简单、纯水相合成，绿色安全的核壳磷酸钙多肽复合纳米疫苗，本发明解决这样的问题。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种核壳磷酸钙多肽复合纳米疫苗及其制备方法，本发明的疫苗的核壳结构磷酸钙具有巧妙的结构，实现可满足抗原多肽和佐剂分子共运输的要求，具有很好的颗粒稳定性，不产生明显的聚集；且对于带负电的多肽具有较高的包封率。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一种核壳磷酸钙多肽复合纳米疫苗，包含CaP@多肽@CaP@CpG纳米颗粒。
前述的一种核壳磷酸钙多肽复合纳米疫苗，多肽为在中性溶液中带负电的抗原多肽。
前述的一种核壳磷酸钙多肽复合纳米疫苗，CpG的序列为：TCC ATG ACG TTC CTGACG TT SEQ NO 03。
一种核壳磷酸钙多肽复合纳米疫苗的制备方法，包括如下步骤：
步骤一，将抗原多肽分子及钙盐水溶液混合，并在室温下放置10min-60min；
步骤二，将磷酸盐水溶液逐滴加入到上述多肽/钙盐混合液中，并通过搅拌方式在室温下反应10min-120min，得到CaP@peptide颗粒；
步骤三，由于多肽分子可以参与CaP的矿化过程，因此该步骤可以将多肽分子包裹到CaP内部；
步骤四，通过高速离心的方式收集CaP@peptide颗粒，并将该颗粒重新分散到钙盐水溶液中，并在室温下放置10min-60min之后，继续加入磷酸盐溶液，得到CaP@多肽@CaP颗粒；
步骤五，加入佐剂分子水溶液，通过静电吸附的方式使佐剂分子吸附到壳层CaP表面，得到CaP@多肽@CaP@CpG纳米颗粒。
前述的一种核壳磷酸钙多肽复合纳米疫苗的制备方法，多肽为DDD-VNYIKGFRYELYCLARTARTPLK-DDD SEQ NO 01。
前述的一种核壳磷酸钙多肽复合纳米疫苗的制备方法，钙盐包括：氯化钙、柠檬酸钙、碳酸钙、硝酸钙、乳酸钙中的一种。
前述的一种核壳磷酸钙多肽复合纳米疫苗的制备方法，磷酸盐包括：磷酸氢二胺、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、磷酸胺中的一种。
前述的一种核壳磷酸钙多肽复合纳米疫苗的制备方法，步骤二中的搅拌方式为磁力搅拌、机械搅拌、振荡搅拌中的一种。
前述的一种核壳磷酸钙多肽复合纳米疫苗的制备方法，步骤四中的高速离心的离心速度范围是8000rpm-15000rpm。
前述的一种核壳磷酸钙多肽复合纳米疫苗的制备方法，佐剂分子为带负电的非甲基化的胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤。
本发明的有益之处在于：
本发明疫苗的核壳结构磷酸钙具有巧妙的结构，实现可满足抗原多肽和佐剂分子共运输的要求，核层和壳层的CaP起到物理保护作用，可有效保护抗原多肽；
表面吸附的佐剂分子除了佐剂作用之外还能起到提高颗粒分散稳定性的作用，CpG不仅可以有效的吸附到壳层CaP表面(改变了颗粒表面物理性质)，而且具有很好的颗粒稳定性，不产生明显的聚集。
由于带负电的多肽可以与带正电的钙离子有效复合，因此多肽可以产生矿化的作用，从而达到磷酸钙颗粒原位包裹多肽的目的，且本方法不仅可以达到包裹抗原多肽的目的，而且对于带负电的多肽具有较高的包封率；
本发明制备方法简单、纯水相合成，绿色安全。
附图说明
图1为核壳磷酸钙多肽复合纳米疫苗的示意图；
图2是本发明实施例1的CaP@P1纳米颗粒的场发射扫描电镜(SEM)照片；
图3是本发明实施例1的CaP@P1@CaP@CpG纳米颗粒的场发射扫描电镜(SEM)照片；
图4是本发明实施例1的CaP@P1以及核壳结构复合颗粒的粒径分布图(横坐标为粒径，纵坐标是数量)；
图5是本发明实施例1的未负载CpG(圆形)以及共负载CpG(三角形)的核壳结构纳米颗粒的粒径分布图(横坐标为粒径，纵坐标是数量)。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
如图1所示，一种核壳磷酸钙多肽复合纳米疫苗的制备方法，包括如下步骤：
步骤一，将抗原多肽分子及钙盐水溶液混合，并在室温下放置10min-60min；
作为一种优选，多肽为在中性溶液中带负电的抗原多肽，作为进一步优选，多肽为：DDD-VNYIKGFRYELYCLARTARTPLK-DDD SEQ NO 01。需要说明的是这里的多肽序列不是穷举，只要是在中性溶液中带负电的抗原多肽都可以应用于本发明。
作为一种优选，钙盐包括：氯化钙、柠檬酸钙、碳酸钙、硝酸钙、乳酸钙中的一种。
步骤二，将磷酸盐水溶液逐滴加入到上述多肽/钙盐混合液中，并通过搅拌方式在室温下反应10min-120min，得到CaP@peptide颗粒；作为一种优选，搅拌方式为磁力搅拌、机械搅拌、振荡搅拌中的一种。作为一种优选，磷酸盐包括：磷酸氢二胺、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、磷酸胺中的一种。
步骤三，由于多肽分子可以参与CaP的矿化过程，因此该步骤可以将多肽分子包裹到CaP内部；
步骤四，通过高速离心的方式收集CaP@peptide颗粒，并将该颗粒重新分散到钙盐水溶液中，并在室温下放置10min-60min之后，继续加入磷酸盐溶液，得到CaP@多肽@CaP颗粒；作为一种优选，步骤四中的高速离心的离心速度范围是8000-15000rpm。由于CaP@peptide颗粒表面具有负zeta电位，无法有效的吸附带负电的佐剂分子，因此本专利提出继续构建壳层CaP的策略，使得CaP@peptide@CaP颗粒表面带有正电荷。
步骤五，加入佐剂分子水溶液，通过静电吸附的方式使佐剂分子吸附到壳层CaP表面，得到CaP@多肽@CaP@CpG纳米颗粒。作为一种优选，CpG的序列为：TCC ATG ACG TTC CTGACG TT SEQ NO 03。佐剂分子为带负电的非甲基化的胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(CpG)。
以下通过如下过程的实施例1-2制备出样品：
实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售产品。
其中，部分试剂和原料购买情况如下：
抗原多肽：杭州肽佳生物科技有限公司，多肽序列DDD-VNYIKGFRYELYCLARTARTPLK-DDD SEQ NO 01，(简写P1,等电点pH＝4.18)、DVNYIKGFRYELYCLARTARTPLKD SEQ NO 02(简写P2，等电点pH＝9.45)。
CpG：(5'-3')TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT SEQ NO 03，金斯瑞生物科技股份有限公司定制。
氯化钙(CaCl2)：阿拉丁试剂(上海)有限公司
磷酸氢二钠(Na2HPO4)：硝酸锌标准溶液|0.01000mol/L|伟业计量。
水：自制注射用水
实施例一，一种核壳结构磷酸钙多肽复合纳米疫苗的制备方法。具体通过如下步骤制备：
1)配制1M CaCl2母液：使用微量分析天平称取554.9mg CaCl2至15ml规格的离心管中，加入5ml去离子水，得到浓度为1M的钙盐溶液S(CaCl2)。
2)配制5mM Na2HPO4母液：使用微量分析天平称取35.4mg Na2HPO4至50ml规格的离心管中，加入50ml去离子水，得到5mM的磷酸盐溶液S(Na2HPO4)。
3)配制1mg/ml的P1多肽母液：使用微量分析天平称取1.0mg P1多肽至4ml规格的玻璃瓶中，加入1ml去离子水，得到1mg/ml的P1多肽溶液S(P1)。
4)配制1mg/ml的CpG母液：使用微量分析天平称取1.0mg CpG多肽至4ml规格的玻璃瓶中，加入1ml去离子水，得到1mg/ml的CpG溶液S(CpG)。
5)取100μl的S(P1)以及200μl的S(CaCl2)加入到1.5ml规格的玻璃小瓶中，在常温下放置10min，之后将S(Na2HPO4)逐滴加入到上述混合液中，并用磁力搅拌器以700rpm的速度搅拌120min。反应完毕之后通过台式高速离心机以12000rpm的速度，离心得到CaP@P1颗粒,并保留上清液用于P1多肽包封率定量。接着将CaP@P1颗粒加入到200μl的S(CaCl2)，并在室温下放置10min之后，继续加入200μl的S(Na2HPO4)溶液，然后用磁力搅拌器以700rpm的速度搅拌60min，得到CaP@P1@CaP颗粒。最后在超声的同时，向上述溶液里加入100μl的S(CpG),最终通过高速离心机以12000rpm的速度，离心得到CaP@P1@CaP@CpG纳米颗粒，将该颗粒重新分散于水溶液中以备后续测试。
实施例二、一种核壳结构磷酸钙多肽复合纳米疫苗的制备方法。具体通过如下步骤制备：
1)配制1M CaCl2母液：使用微量分析天平称取554.9mg CaCl2至15ml规格的离心管中，加入5ml去离子水，得到浓度为1M的钙盐溶液S(CaCl2)。
2)配制5mM Na2HPO4母液：使用微量分析天平称取35.4mg Na2HPO4至50ml规格的离心管中，加入50ml去离子水，得到5mM的磷酸盐溶液S(Na2HPO4)。
3)配制1mg/ml的P2多肽母液：使用微量分析天平称取1.0mg P2多肽至4ml规格的玻璃瓶中，加入1ml去离子水，得到1mg/ml的P1多肽溶液S(P2)。
4)配制1mg/ml的CpG母液：使用微量分析天平称取1.0mg CpG多肽至4ml规格的玻璃瓶中，加入1ml去离子水，得到1mg/ml的CpG溶液S(CpG)。
5)取100μl的S(P2)以及200μl的S(CaCl2)加入到1.5ml规格的玻璃小瓶中，在常温下放置10min，之后将S(Na2HPO4)逐滴加入到上述混合液中，并用磁力搅拌器以700rpm的速度搅拌120min。反应完毕之后通过台式高速离心机以12000rpm的速度，离心得到CaP@P2颗粒，并保留上清液用于P2多肽包封率定量。接着将CaP@P2颗粒加入到200μl的S(CaCl2)，并在室温下放置10min之后，继续加入200μl的S(Na2HPO4)溶液，然后用磁力搅拌器以700rpm的速度搅拌60min，得到CaP@P2@CaP颗粒。最后在超声的同时，向上述溶液里加入100μl的S(CpG),最终通过高速离心机以12000rpm的速度，离心得到CaP@P2@CaP@CpG纳米颗粒，将该颗粒重新分散于水溶液中以备后续测试。
使用以上两个实施例的样品进行本发明的技术效果的实验验证：
实验一：
实验名称：验证核壳结构CaP的结构及形貌；
实验设备：马尔文动态光散射仪(DLS)；ZEISS Gemini扫面电镜(SEM)；
实验材料：实施例1中核壳CaP复合纳米颗粒及其合成步骤中的中间产物，包括CaP@P1，CaP@P1@CaP、CaP@P1@CaP@CpG。
实验过程：将CaP@P1及CaP@P1@CaP@CpG纳米颗粒样品通过真空烘箱去除残留溶剂，之后将粉末样品粘贴在导电胶上，用于SEM形貌拍摄，其中，设置参数为WD 9.5mm，加速电压3kV。将原合成得到的CaP@P1、CaP@P1@CaP、CaP@P1@CaP@CpG悬液分别稀释到1ml。用规格为10mm*10mm*40mm的石英比色皿做样品皿，用DLS测试其粒径大小，测试连续测试2次，间隔30s，最终取两次测试的平均值做最终数据。
实验结果：
为了验证本专利方法的可行性，首先我们对实施例一中的中间产物CaP@P1(图2)以及核壳结构产物CaP@P1@CaP@CpG(图3)进行了扫描电镜照片的拍摄，结果显示CaP@P1尺寸大小约为40～50nm，而CaP@P1@CaP@CpG大小约为50～60nm。由于扫描电镜样品存在荷电可能会影响尺寸大小的精确判断，因此为了再次验证其尺寸大小，我们对这两种样品进行了DLS的测试。如图4所示，包裹有P1多肽的磷酸钙颗粒呈现出约68nm的颗粒尺寸，而核壳结构的多肽复合颗粒呈现出约90nm的颗粒尺寸。综合扫描电镜和DLS的测试结果，我们可以清楚的了解到，核壳结构的多肽复合颗粒相比CaP@P1具有更大的颗粒尺寸，该结果符合核壳颗粒的生长逻辑，因此说明了用本专利方法可以合成得到具有核壳结构的磷酸钙纳米颗粒。
此外由于磷酸钙颗粒表面带有正电荷，因此可以通过静电吸附的原理，吸附佐剂CpG分子，使CaP颗粒具有共负载抗原多肽和佐剂分子的能力。同时表面吸附的CpG还能起到降低磷酸钙表面能，从而提升颗粒稳定性的能力。如图5所示，对比实施例一中未负载CpG(图5圆形散点线)和共负载CpG(图5三角形散点线)样品，未负载CpG样品产生明显的聚集，具有大于2微米的颗粒尺寸，而共负载CpG的样品具有约90nm的颗粒尺寸。这不仅证明了CpG可以有效的吸附到壳层CaP表面(改变了颗粒表面物理性质)，还证明了本专利方法制备得到的核壳磷酸钙多肽复合颗粒具有很好的颗粒稳定性，不产生明显的聚集。
实验二：
实验名称：验证核壳结构CaP颗粒可以有效的负载抗原多肽
实验设备：安捷伦型号为1260的液相色谱，同时配有型号为Unitary C18 5μm100A4.6×150mm的色谱柱。
实验材料：实施例一CaP@P1@CaP@CpG样品制备过程中保留的多肽上清液、实施例二CaP@P2@CaP@CpG样品制备过程中保留的多肽上清液、未包裹的P1多肽、未包裹的P2多肽。
实验过程：用0.1％三氟乙酸水溶液分别溶解未包裹P1多肽和P2多肽，分别配置成250μg/ml、125μg/ml、62.5μg/ml、31.25μg/ml、15.625μg/ml标准溶液。使用型号为安捷伦1260的液相色谱(流动相A0.1％TFA水，流动相B 0.1％TFA乙腈，测试方法20分钟内阶梯30％-40％流动相B)分别测试其谱图，并绘制标准曲线。之后将实施例一CaP@P1@CaP@CpG样品制备过程中保留的多肽上清液以及实施例二CaP@P2@CaP@CpG样品制备过程中保留的多肽上清液，进行样品浓度测定。最后通过投料多肽浓度和上清液中多肽浓度相减，计算得到实施例一和实施例二中多肽的包封率，如表1所示。
表1
由于带负电的多肽可以与带正电的钙离子有效复合，因此多肽可以产生矿化的作用，从而达到磷酸钙颗粒原位包裹多肽的目的。由于该矿化机理在学术上已有很多成熟的研究，因此本专利不再赘述。
如表1所示，实施例一中P1多肽(酸性多肽)的包封率为78.4％，而实施例二中P2多肽(非酸性多肽)的包封率仅为17.2％，这不仅说明本发明方法可以达到包裹抗原多肽的目的，并且指出了本方法的适用性，即对于带负电的多肽具有较高的包封率。
综上所述，本发明的核壳结构磷酸钙多肽复合纳米疫苗可以实现可满足抗原多肽和佐剂分子共运输的要求，可有效保护抗原多肽；CpG不仅可以有效的吸附到壳层CaP表面(改变了颗粒表面物理性质)，而且具有很好的颗粒稳定性，不产生明显的聚集；本发明对于带负电的多肽具有较高的包封率；制备方法简单、纯水相合成，绿色安全。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。
Claims (6)
1.一种核壳磷酸钙多肽复合纳米疫苗的制备方法，其特征在于，包含CaP@多肽@CaP@CpG纳米颗粒，所述多肽为在中性溶液中带负电的抗原多肽，所述CpG的序列为：TCC ATGACG TTC CTG ACG TT，SEQ NO .03，所述多肽为DDD-VNYIKGFRYELYCLARTARTPLK-DDD，SEQNO 01；
所述制备方法包括如下步骤：
步骤一，将抗原多肽分子及钙盐水溶液混合，并在室温下放置10min-60min；
步骤二，将磷酸盐水溶液逐滴加入到上述多肽/钙盐混合液中，并通过搅拌方式在室温下反应10min-120min，得到CaP@peptide颗粒；
步骤三，由于多肽分子可以参与CaP的矿化过程，因此该步骤可以将多肽分子包裹到CaP内部；
步骤四，通过高速离心的方式收集CaP@peptide颗粒，并将该颗粒重新分散到钙盐水溶液中，并在室温下放置10min-60min之后，继续加入磷酸盐溶液，得到CaP@多肽@CaP颗粒；
步骤五，加入佐剂分子水溶液，通过静电吸附的方式使佐剂分子吸附到壳层CaP表面，得到CaP@多肽@CaP@ CpG纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的一种核壳磷酸钙多肽复合纳米疫苗的制备方法，其特征在于，所述钙盐包括：氯化钙、柠檬酸钙、碳酸钙、硝酸钙、乳酸钙中的一种。
3.根据权利要求1所述的一种核壳磷酸钙多肽复合纳米疫苗的制备方法，其特征在于，所述磷酸盐包括：磷酸氢二胺、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、磷酸胺中的一种。
4.根据权利要求1所述的一种核壳磷酸钙多肽复合纳米疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤二中的搅拌方式为磁力搅拌、机械搅拌、振荡搅拌中的一种。
5.根据权利要求1所述的一种核壳磷酸钙多肽复合纳米疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤四中的高速离心的离心速度范围是8000rpm-15000rpm。
6.根据权利要求1所述的一种核壳磷酸钙多肽复合纳米疫苗的制备方法，其特征在于，所述佐剂分子为带负电的非甲基化的胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111510094.3A CN114306623B (zh) | 2021-12-10 | 2021-12-10 | 一种核壳磷酸钙多肽复合纳米疫苗及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111510094.3A CN114306623B (zh) | 2021-12-10 | 2021-12-10 | 一种核壳磷酸钙多肽复合纳米疫苗及其制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114306623A CN114306623A (zh) | 2022-04-12 |
| CN114306623B true CN114306623B (zh) | 2023-08-22 |
Family
ID=81051458
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111510094.3A Active CN114306623B (zh) | 2021-12-10 | 2021-12-10 | 一种核壳磷酸钙多肽复合纳米疫苗及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114306623B (zh) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005126335A (ja) * | 2003-10-21 | 2005-05-19 | Cell-Medicine Inc | リン酸カルシウム微粒子 |
| CN105363029A (zh) * | 2014-08-12 | 2016-03-02 | 张世艳 | 一种关于hpv病毒的新型佐剂疫苗组合物 |
| CN109998998A (zh) * | 2019-04-19 | 2019-07-12 | 中国科学院长春应用化学研究所 | 一种纳米疫苗及其制备方法 |
| CN110124018A (zh) * | 2018-02-09 | 2019-08-16 | 复旦大学 | 一种模拟坏死肿瘤细胞的磷酸钙-脂质纳米疫苗及其应用 |
| KR20190131797A (ko) * | 2018-05-17 | 2019-11-27 | 경희대학교 산학협력단 | 인산칼슘을 포함하는 pH 감응형 복합 나노입자, 이의 제조방법 및 상기 나노입자를 이용한 생체활성 물질 담지 및 방출을 위한 지능형 전달체 |
-
2021
- 2021-12-10 CN CN202111510094.3A patent/CN114306623B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005126335A (ja) * | 2003-10-21 | 2005-05-19 | Cell-Medicine Inc | リン酸カルシウム微粒子 |
| CN105363029A (zh) * | 2014-08-12 | 2016-03-02 | 张世艳 | 一种关于hpv病毒的新型佐剂疫苗组合物 |
| CN110124018A (zh) * | 2018-02-09 | 2019-08-16 | 复旦大学 | 一种模拟坏死肿瘤细胞的磷酸钙-脂质纳米疫苗及其应用 |
| KR20190131797A (ko) * | 2018-05-17 | 2019-11-27 | 경희대학교 산학협력단 | 인산칼슘을 포함하는 pH 감응형 복합 나노입자, 이의 제조방법 및 상기 나노입자를 이용한 생체활성 물질 담지 및 방출을 위한 지능형 전달체 |
| CN109998998A (zh) * | 2019-04-19 | 2019-07-12 | 中国科学院长春应用化学研究所 | 一种纳米疫苗及其制备方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Dominik Damm 等.Calcium Phosphate Nanoparticle-Based Vaccines as a Platform for Improvement of HIV-1 Env Antibody Responses by Intrastructural Help.《Nanomaterials (Basel) 》.2019,第9卷(第10期),1389. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114306623A (zh) | 2022-04-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Sonmez et al. | Synthesis and applications of Fe3O4/SiO2 core-shell materials | |
| CN109549933B (zh) | 一种pH响应的纳米载体及其制备方法与应用 | |
| US20100040693A1 (en) | Silica capsules having nano-holes or nano-pores on their surfaces and method for preparing the same | |
| WO2021128504A1 (zh) | 一种利用介孔二氧化硅包裹纳米颗粒的复合纳米材料及其制备方法与应用 | |
| Yu et al. | Poly (ethylene glycol)-mediated mineralization of metal–organic frameworks | |
| WO2013012268A2 (ko) | 균일한 크기의 실리카 나노입자 대량 제조 방법 | |
| KR20070028478A (ko) | 비응집성 코어/쉘 나노복합 입자 | |
| TWI383808B (zh) | 磷脂質包覆中孔洞二氧化矽奈米球的合成與其生醫應用 | |
| CN109125291B (zh) | 复合siRNA纳米载体及其制备方法和应用 | |
| CN108434122B (zh) | 聚电解质杂化中空二氧化硅纳米颗粒及其制备方法与应用 | |
| CA3082682A1 (en) | Particulate material production process | |
| WO2009010494A2 (en) | Micro-particles, blood-substitute and method for forming same | |
| CN112891549B (zh) | 一种共递送岩藻黄素和槲皮素的高粱醇溶蛋白-岩藻多糖复合物 | |
| CN113975235A (zh) | 一种递送岩藻黄素的褐藻寡糖-介孔二氧化硅纳米复合物 | |
| Zhang et al. | Reaction inside a viral protein nanocage: Mineralization on a nanoparticle seed after encapsulation via self-assembly | |
| CN108272770B (zh) | 层层自组装载双亲药物微胶囊及其制备方法 | |
| Bergman et al. | On the Complexity of Electrostatic Suspension Stabilization of Functionalized Silica Nanoparticles for Biotargeting and Imaging Applications. | |
| CN109276560B (zh) | 一种含乳铁蛋白的pH响应型微囊及其制备方法和应用 | |
| RU2600841C2 (ru) | Вещества, включающие керамические частицы для доставки биомолекул | |
| CN114306623B (zh) | 一种核壳磷酸钙多肽复合纳米疫苗及其制备方法 | |
| Tu et al. | Preparations of bifunctional polymeric beads simultaneously incorporated with fluorescent quantum dots and magnetic nanocrystals | |
| CN114778836A (zh) | 一种基于亲和素和生物素结合作用的纳米颗粒非特异性捕获外泌体的方法 | |
| Tian et al. | Nuclease-responsive DNA–PEI hollow microcapsules for bio-stimuli controlled release | |
| CN103239729B (zh) | 含超支化聚合物与磷脂的纳米载体及其制备方法和应用 | |
| CN103006565B (zh) | 一种纳米颗粒药物组合物及其制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |