CN109125291B - 复合siRNA纳米载体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种复合siRNA纳米载体，包括自体肿瘤细胞来源的外泌体脂质膜和包裹于外泌体脂质膜内的载有siRNA的阳离子化血清白蛋白，本发明还公开了上述复合siRNA纳米载体的制备方法和应用。本发明具有高转染性、癌症转移组织特异靶向性、较好生物相容性、优良稳定性以及无免疫原性等优点。

Description

复合siRNA纳米载体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医学领域。更具体地说，本发明涉及一种复合siRNA纳米载体及其制备方法和应用。
背景技术
RNA干扰是指由于目标mRNA降解或翻译抑制所引起的转录后基因沉默。siRNA可以通过RNA干扰，高效、特异地阻断体内同源基因表达，促使同源mRNA降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型并且沉默某一癌基因即RNAi法，这在几乎所有肿瘤模型中都已证明具有很好的抑癌作用。但裸siRNA在生物体内容易被核酶(RNase)降解、半衰期短、转染效率低，因而如何高效地把这种特异性沉默的siRNA在不损伤其他正常组织及 siRNA的前提下导入到靶器官中去，成为肿瘤基因治疗的关键。
外泌体(exosome)是由大多数生物细胞分泌的一种生物纳米粒子，直径约30至100nm，具有典型的脂质双分子层膜结构。外泌体具有类似于病毒的转染机制，在体内具有较高的转染效率，且它不仅具有细胞间信息传递的作用还能被开发运用于各类物质(包括siRNA) 的细胞间传输。与传统的药物载体相比，外泌体作为一种新型的，天然药物载体，显示诸如生物相容性好、生物可降解、免疫原性小等优点。
血清白蛋白(包括牛血清白蛋白、人血清白蛋白、鲑鱼血清白蛋白、蟾血清白蛋白等) 是脊椎动物血浆中含量最丰富的蛋白质，具有安全无毒、无免疫原性、生物可降解、生物相容性好等优点。早在2005年，美国FDA批准由美国生命科学公司开发的、以白蛋白为载体的紫杉醇蛋白纳米粒注射液就已经上市。此外，Kremer等研究发现，与血清白蛋白共价结合后，抗叶酸氨喋棂的毒性降低一倍，表现出更强的抗肿瘤活性。因此，以白蛋白为载体的纳米给药系统具有一定的临床实用价值。然而，血清白蛋白无法直接用作siRNA 载体，目前还存在以下几个方面的问题：
(1)天然血清白蛋白的等电点在水溶液中带负电，无法通过静电相互作用与阴性siRNA结合。
(2)外源性的血清白蛋白很大程度上会使病人产生免疫原性。
(3)合理选择化学修饰，既确保白蛋白的阳离子化程度又能确保其低毒性。
(4)单纯的血清白蛋白无法靶向肿瘤转移器官。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种自体肿瘤细胞来源的外泌体脂质膜包裹的、以载有 siRNA的阳离子化的血清白蛋白为核心的复合siRNA纳米载体。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种复合siRNA纳米载体，包括自体肿瘤细胞来源的外泌体脂质膜和包裹于外泌体脂质膜内的载有siRNA的阳离子化血清白蛋白。
优选的是，提取自体肿瘤细胞来源的外泌体的方法为：建立肿瘤原位模型，切取肿瘤细胞进行原代培养，再用差速离心法、超滤离心法、磁珠免疫法、PEG-base沉淀法、试剂盒提取法其中之一提取外泌体。
优选的是，分离自体肿瘤细胞来源的外泌体脂质膜的方法为：先将自体肿瘤细胞来源的外泌体反复冻融，再采用超声粉碎法或蔗糖梯度离心法分离出外泌体脂质膜。
优选的是，阳离子化血清白蛋白的制备过程为：称取血清白蛋白溶解于超纯水中，加入乙胺或乙二胺，再用稀盐酸调节pH，将碳二亚胺盐酸盐加入到血清白蛋白与乙胺或乙二胺的混合溶液中，随后加入N-羟基硫代琥珀酰亚胺进行反应，接着加入醋酸-醋酸钠缓冲液终止反应，最后用透析袋透析，并将透析液冷冻干燥。
优选的是，载有siRNA的阳离子化血清白蛋白的制备过程为：将阳离子化血清白蛋白与siRNA混合，其中，阳离子化血清白蛋白与siRNA的摩尔比为1:1～80，更优选的1:60。
优选的是，血清白蛋白与碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为1:100～1500，更优选的1:1500。
优选的是，用稀盐酸调节pH为4.75，加入N-羟基硫代琥珀酰亚胺后进行反应的温度为25℃。
优选的是，在载有siRNA的阳离子化血清白蛋白表面包裹自体肿瘤细胞来源的外泌体脂质膜的具体过程为：将载有siRNA的阳离子化血清白蛋白与自体肿瘤细胞来源的外泌体脂质膜在室温孵育，再用脂质体挤出器分离出复合siRNA纳米载体。
本发明还提供上述复合siRNA纳米载体的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、采用酰胺化反应制备阳离子化血清白蛋白，将阳离子化血清白蛋白与siRNA 通过静电作用相互结合；
步骤二、提取自体肿瘤细胞来源的外泌体，再分离出自体肿瘤细胞来源的外泌体脂质膜；
步骤三、在载有siRNA的阳离子化血清白蛋白表面包裹自体肿瘤细胞来源的外泌体脂质膜。
本发明还提供上述复合siRNA纳米载体在制备抗肿瘤药物方面的应用。
本发明至少包括以下有益效果：自体肿瘤细胞来源的外泌体膜包裹的、以载有siRNA 的阳离子化的血清白蛋白为核心的复合siRNA纳米载体，该复合siRNA纳米载体具有高转染性、癌症转移组织特异靶向性、较好生物相容性、优良稳定性以及无免疫原性等优点，这为实现预防癌症术后转移的个体化基因治疗提供了一种新的治疗思路。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明其中一实施例制备的复合siRNA纳米载体的透射电镜示意图；
图2为本发明其中一实施例制备的复合siRNA纳米载体的琼脂糖凝胶电泳图；
图3为本发明其中一实施例制备的复合siRNA纳米载体的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
图4为本发明其中一实施例制备的复合siRNA纳米载体的生物相容性实验对比图；
图5为本发明其中一实施例制备的复合siRNA纳米载体的在小鼠体内的靶向图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
<实施例1>
一种复合siRNA纳米载体的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、阳离子白蛋白的制备：准确称取100mg的牛血清白蛋白(BSA)，将其完全溶解在25mL的超纯水中，调整磁力搅拌的转速，避免过快产生泡沫。待其完全溶解后加入25mL的1mol/L的乙胺，充分混匀后用稀盐酸调节反应PH至4.75，然后再加入25mg 的碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCL)缓缓加入到BSA与乙胺的混合溶液中，15min后加入N- 羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)，碳二亚胺盐酸盐与N-羟基硫代琥珀酰亚胺的摩尔比为4：5， 25℃反应两小时，加入0.55mL的浓度为4M的醋酸-醋酸钠缓冲液(PH＝4.75)终止反应。将最终的反应液装入截止分子量8000-14000的透析袋中，每两小时换一次水。透析两天，然后将透析液冷冻干燥以备用。
步骤二、自身肿瘤细胞来源的外泌体的提取：首先建立原位肿瘤模型，然后模拟临床进行手术切除治疗，并将手术切除的肿瘤细胞进行原代培养。当细胞密度达到70％～80％时换无血清培养基，饥饿培养48h后，取培养液进行差速离心。具体步骤如下：①在4℃下300g离心10min，弃沉淀，去除细胞；②取上清液，2000g离心10min，弃沉淀，去除死细胞；③取上清，10000g离心30min，弃沉淀，去除细胞碎片；④取上清，100000g离心70min，所得沉淀即为外泌体；⑤弃上清，用PBS重新悬浮沉淀，100000g离心70min；⑥弃上清，用适量的PBS悬浮沉淀物，将提纯的外泌体溶液分别装入eppendorf管内，置于-80℃冰箱内保存备用。
步骤三、外泌体脂质膜的提取：首先将提取的外泌体样品在-80℃和37℃之间反复冻融3～5次，然后将反复冻融的外泌体样品与1M的蔗糖溶液及0.25M的蔗糖溶液混合。然后在4℃下，2000g离心10min。收集上清进一步在4℃下，3000g离心30min，收集外泌体脂质膜，然后用含0.25M蔗糖溶液的TM-Buffer在4℃下3000g离心30min洗去杂质，最后用适量的PBS悬浮。
步骤四、带负电的siRNA与表面阳离子化修饰的牛血清白蛋白(CBSA)结合为siRNA-CBSA复合物：带负电荷的siRNA按不同的摩尔比(1:1；1:20；1:40；1:60；1:80) 与CBSA混合25min，通过静电作用结合成为载有siRNA的阳离子化的牛血清白蛋白(下面为了简化名称缩写为siRNA-CBSA复合物)。
步骤五、肿瘤转移组织靶向的、生物相容性好的复合siRNA纳米载体的制备。将提取的外泌体脂质膜与siRNA-CBSA复合物在37℃摇床上孵育1h，然后通过脂质体挤出器分离出外泌体脂质膜包裹的、以载有siRNA的阳离子化的牛血清白蛋白为核心的复合 siRNA纳米载体。
<实施例2>
一种复合siRNA纳米载体的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、阳离子白蛋白的制备：准确称取100mg的人血清白蛋白(HSA)，将其完全溶解在25mL的超纯水中，调整磁力搅拌的转速，避免过快产生泡沫。待其完全溶解后加入25mL的1mol/L的乙胺，充分混匀后用稀盐酸调节反应PH至4.75，然后将溶解好的 25mg的碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCL)缓缓加入到BSA与乙胺的混合溶液中，15min后加入N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)，碳二亚胺盐酸盐与N-羟基硫代琥珀酰亚胺的摩尔比为4：5，37℃反应两小时，加入0.55mL的浓度为4M的醋酸-醋酸钠缓冲液(PH＝4.75) 终止反应。将最终的反应液装入截止分子量8000-14000的透析袋中，每两小时换一次水。透析两天，然后将透析液冷冻干燥以备用。
步骤二、自身肿瘤细胞来源的外泌体的提取：首先建立原位肿瘤模型，然后模拟临床进行手术切除治疗，并将手术切除的肿瘤细胞进行原代培养。当细胞密度达到70％～80％时换无血清培养基，饥饿培养48h后，取培养液采用外泌体抽提试剂盒进行提取。具体步骤如下：①收集细胞培养上清液；②4℃，3000g离心10min；③将离心后的上清与外泌体抽提试剂混合，静置2h；④4℃，1000g离心60min；⑤弃上清，用适量的PBS悬浮沉淀物，将提纯的外泌体溶液分别装入eppendorf管内，置于-80℃冰箱长期保存。
步骤三、外泌体脂质膜的提取：首先将提取的外泌体样品在-80℃和37℃之间反复冻融3～5次，然后将反复冻融的外泌体样品，通过超声粉碎分离出外泌体膜，最后用适量的PBS悬浮。
步骤四、带负电的siRNA与表面阳离子化修饰的人血清白蛋白(CHSA)结合为siRNA-CHSA复合物：带负电荷的siRNA按不同的摩尔比(1:1；1:20；1:40；1:60；1:80) 与CHSA混合25min，通过静电作用结合成为载有siRNA的阳离子化的人血清白蛋白(下面为了简化名称缩写为siRNA-CHSA复合物)。
步骤五、肿瘤转移组织靶向的、生物相容性好的复合siRNA纳米载体的制备。将提取的外泌体脂质膜与siRNA-CHSA复合物在37℃摇床上孵育1h，然后通过脂质体挤出器分离出外泌体脂质膜包裹的、以载有siRNA的阳离子化的人血清白蛋白为核心的复合 siRNA纳米载体。
<实施例3>
一种复合siRNA纳米载体的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、阳离子白蛋白的制备：准确称取100mg的牛血清白蛋白(BSA)，将其完全溶解在25mL的超纯水中，调整磁力搅拌的转速，避免过快产生泡沫。待其完全溶解后加入25mL的1mol/L的乙胺，充分混匀后用稀盐酸调节反应PH至4.75，然后将溶解好的 150mg的碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCL)缓缓加入到BSA与乙胺的混合溶液中，15min后加入N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)，碳二亚胺盐酸盐与N-羟基硫代琥珀酰亚胺的摩尔比为4：5，25℃反应两小时，加入0.55mL的浓度为4M的醋酸-醋酸钠缓冲液(PH＝4.75) 终止反应。将最终的反应液装入截止分子量8000-14000的透析袋中，每两小时换一次水。透析两天，然后将透析液冷冻干燥以备用。
步骤二、自身肿瘤细胞来源的外泌体的提取：首先建立原位肿瘤模型，然后模拟临床进行手术切除治疗，并将手术切除的肿瘤细胞进行原代培养。当细胞密度达到70％～80％时换无血清培养基，饥饿培养48h后，取培养液通过超滤离心法进行分离。具体步骤如下：首先通过正常的粗滤除去细胞和细胞碎片，然后通过切向超滤(超滤膜的截留分子量为500kD)除去小分子的蛋白，最后通过0.1μm的滤膜分离出外泌体，将提纯的外泌体溶液分别装入eppendorf管内，置于-80℃冰箱内保存备用。
步骤三、外泌体脂质膜的提取：首先将提取的外泌体样品在-80℃和37℃之间反复冻融3～5次，然后将反复冻融的外泌体样品与1M的蔗糖溶液及0.25M的蔗糖溶液混合。然后在4℃下，2000g离心10min。收集上清进一步在4℃下，3000g离心30min，收集外泌体脂质膜，然后用含0.25M蔗糖溶液的TM-Buffer在4℃下3000g离心30min洗去杂质，最后用适量的PBS悬浮。
步骤四、带负电的siRNA与表面阳离子化修饰的牛血清白蛋白(CBSA)结合为siRNA-CBSA复合物：带负电荷的siRNA按不同的摩尔比(1:1；1:20；1:40；1:60；1:80) 与CBSA混合25min，通过静电作用结合成为siRNA-CBSA复合物。
步骤五、肿瘤转移组织靶向的、生物相容性好的复合siRNA纳米载体的制备。将提取的外泌体脂质膜与siRNA-CBSA复合物在37℃摇床上孵育1h，然后通过脂质体挤出器分离出外泌体脂质膜包裹的、以载有siRNA的阳离子化的牛血清白蛋白为核心的复合 siRNA纳米载体。
<实施例4>
一种复合siRNA纳米载体的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、阳离子白蛋白的制备：准确称取100mg的人血清白蛋白(HSA)，将其完全溶解在25mL的超纯水中，调整磁力搅拌的转速，避免过快产生泡沫。待其完全溶解后加入25mL的1mol/L的乙胺，充分混匀后用稀盐酸将混合溶液的PH调节为4.75。将溶解好的150mg的碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCL)缓缓加入到BSA与乙胺的混合溶液中，15min 后加入N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)，碳二亚胺盐酸盐与N-羟基硫代琥珀酰亚胺的摩尔比为4：5，25℃反应两小时，加入0.55mL的浓度为4M的醋酸-醋酸钠缓冲液(PH＝4.75) 终止反应。将最终的反应液装入截止分子量8000-14000的透析袋中，每两小时换一次水。透析两天，然后将透析液冷冻干燥以备用。
步骤二、自身肿瘤细胞来源的外泌体的提取：首先建立原位肿瘤模型，然后模拟临床进行手术切除治疗，并将手术切除的肿瘤细胞进行原代培养。当细胞密度达到70％～80％时换无血清培养基，饥饿培养48h后，取培养液通过磁珠免疫法提取外泌体。具体方法：利用外泌体表面有其特异性标记物(如CD9，CD81，CD63，CD82，和TSG101等)，用包被抗标记物抗体的磁珠与外泌体囊泡孵育后结合，即可将外泌体吸附并分离出来。将分离的外泌体溶液装入eppendorf管内，置于-80℃冰箱内保存备用。
步骤三、外泌体脂质膜的提取：首先将提取的外泌体样品在-80℃和37℃之间反复冻融3～5次，然后将反复冻融的外泌体样品与1M的蔗糖溶液及0.25M的蔗糖溶液混合。然后在4℃下，2000g离心10min。收集上清进一步在4℃下，3000g离心30min，收集外泌体脂质膜，然后用含0.25M蔗糖溶液的TM-Buffer在4℃下3000g离心30min洗去杂质，最后用适量的PBS悬浮。
步骤四、带负电的siRNA与表面阳离子化修饰的牛血清白蛋白(CHSA)结合为siRNA-CHSA复合物：带负电荷的siRNA按不同的摩尔比(1:1；1:20；1:40；1:60；1:80) 与CHSA混合25min，通过静电作用结合成为siRNA-CHSA复合物。
步骤五、肿瘤转移组织靶向的、生物相容性好的复合siRNA纳米载体的制备。将提取的外泌体脂质膜与siRNA-CHSA复合物在37℃摇床上孵育1h，然后通过脂质体挤出器分离出外泌体脂质膜包裹的、以载有siRNA的阳离子化的人血清白蛋白为核心的复合 siRNA纳米载体。
对实施例1制备过程中得到的外泌体、外泌体脂质膜、siRNA-CBSA复合物以及复合siRNA纳米载体进行粒径和Zeta电位测试，结果如表1所示，复合siRNA纳米载体的粒径范围在260nm左右，Zeta电位大约在-30～-60mv左右。与已有的siRNA载体相比较，例如聚乙烯亚胺(PEI)是一种应用广泛的阳离子载体，但是由于其具有较高的细胞毒性从而限制了PEI在基因治疗领域的进一步发展。此外
Figure BDA0001780633830000071
2000是目前市场上应用极为广泛高转染试剂，但是作为阳离子脂质它具有很高的生物毒性，因而极大的限制了其应用范围。我们的复合物载体表面是带负电荷，极大程度上避免了阳离子载体表面的正电荷与细胞发生相互作用后造成的生物毒性问题，因而在生物相容性方面具有不可比拟的优势。
表1、粒径和Zeta电位表
Figure BDA0001780633830000081
对实施例1制备过程中得到的外泌体、外泌体脂质膜、siRNA-CBSA复合物以及复合siRNA纳米载体用透射电镜检测，如图1所示，从透射电镜扫描结果看，外泌体(图1A) 呈现圆球形，分散性较好；外泌体脂质膜(图1B)为不规则状，分散均匀；siRNA-CBSA 复合物(图1C)呈球形，分散性较好；复合siRNA纳米载体(图1D)呈现球形且可看到其核膜结构。
对实施例1制得的复合siRNA纳米载体进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示，该实验主要用来测试siRNA与CBSA之间的结合能力，从图3可以看出当siRNA与CBSA 的摩尔比为1：60时，相较其它比例，在孔内的滞留情况及亮度最佳，说明在该比例下两者结合的最好。
对实施例1制备过程中的牛血清白蛋白、阳离子化的牛血清白蛋白、外泌体以及复合 siRNA纳米载体进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果如图3所示，1泳道为牛血清白蛋白，2 泳道为阳离子化的牛血清白蛋白，3泳道为外泌体，4泳道为外泌体脂质膜，5泳道为复合siRNA纳米载体，根据泳道2和泳道1的结果可以发现阳离子化的牛血清白蛋白比牛血清白蛋白略有拖尾，说明其分子量增加，改性成功；泳道4与泳道3相比条带略有减少，而泳道5则包含了泳道4和泳道2的条带，该结果证实外泌体脂质膜成功包裹了siRNA- CBSA复合物。
对实施例1制得的复合siRNA纳米载体进行MTT实验，以测试复合siRNA纳米载体人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的毒性，用不同浓度的阳离子化的牛血清白蛋白、 siRNA-CBSA复合物以及复合siRNA纳米载体对人脐静脉内皮细胞进行试验，结果如图4 所示，a为阳离子化的牛血清白蛋白，b为siRNA-CBSA复合物，c为复合siRNA纳米载体，在复合siRNA纳米载体的作用下人脐静脉内皮细胞存活率基本在80％以上，证明该复合siRNA纳米载体具有较好的生物相容性。
通过尾静脉对小鼠注入Dio标记的复合siRNA纳米载体(该复合siRNA纳米载体的外泌体脂质膜从小鼠乳腺癌细胞来源的外泌体分离得到)，一定时间后取离体组织冰冻切片，通过共聚焦显微镜观察Dio标记的复合siRNA纳米载体在各组织的分布情况，结果如图5所示，在肝、脾、肺组织细胞中均可观察到Dio标记的复合siRNA纳米载体，说明由小鼠乳腺癌细胞来源的外泌体制得的复合siRNA纳米载体具有很好的肝、脾、肺组织靶向性。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (8)

1.复合siRNA纳米载体的制备方法，其特征在于，所述复合siRNA纳米载体包括自体肿瘤细胞来源的外泌体脂质膜和包裹于外泌体脂质膜内的载有siRNA的阳离子化血清白蛋白；
所述制备方法包括以下步骤：
步骤一、采用酰胺化反应制备阳离子化血清白蛋白，将阳离子化血清白蛋白与siRNA通过静电作用相互结合；
步骤二、提取自体肿瘤细胞来源的外泌体，再分离出自体肿瘤细胞来源的外泌体脂质膜；
步骤三、在载有siRNA的阳离子化血清白蛋白表面包裹自体肿瘤细胞来源的外泌体脂质膜；
其中，在载有siRNA的阳离子化血清白蛋白表面包裹自体肿瘤细胞来源的外泌体脂质膜的具体过程为：将载有siRNA的阳离子化血清白蛋白与自体肿瘤细胞来源的外泌体脂质膜在室温孵育，再用脂质体挤出器分离出复合siRNA纳米载体。
2.如权利要求1所述的复合siRNA纳米载体的制备方法，其特征在于，提取自体肿瘤细胞来源的外泌体的方法为：建立肿瘤原位模型，切取肿瘤细胞进行原代培养，再用差速离心法、超滤离心法、磁珠免疫法、PEG-base沉淀法、试剂盒提取法其中之一提取外泌体。
3.如权利要求2所述的复合siRNA纳米载体的制备方法，其特征在于，分离自体肿瘤细胞来源的外泌体脂质膜的方法为：先将自体肿瘤细胞来源的外泌体反复冻融，再采用超声粉碎法或蔗糖梯度离心法分离出外泌体脂质膜。
4.如权利要求1所述的复合siRNA纳米载体的制备方法，其特征在于，阳离子化血清白蛋白的制备过程为：称取血清白蛋白溶解于超纯水中，加入乙胺或乙二胺，再用稀盐酸调节pH，将碳二亚胺盐酸盐加入到血清白蛋白与乙胺或乙二胺的混合溶液中，随后加入N-羟基硫代琥珀酰亚胺进行反应，接着加入醋酸-醋酸钠缓冲液终止反应，最后用透析袋透析，并将透析液冷冻干燥。
5.如权利要求4所述的复合siRNA纳米载体的制备方法，其特征在于，载有siRNA的阳离子化血清白蛋白的制备过程为：将阳离子化血清白蛋白与siRNA混合，其中，阳离子化血清白蛋白与siRNA的摩尔比为1:1～80。
6.如权利要求4所述的复合siRNA纳米载体的制备方法，其特征在于，血清白蛋白与碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为1:100～1500。
7.如权利要求4所述的复合siRNA纳米载体的制备方法，其特征在于，用稀盐酸调节pH为4.75，加入N-羟基硫代琥珀酰亚胺后进行反应的温度为25℃。
8.如权利要求1所述的复合siRNA纳米载体在制备抗肿瘤药物方面的应用。
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